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Bioengineering

Isolierung von primären humanen Colon Tumorzellen von Surgical Gewebe und Kultivierung sie direkt auf weiche elastische Substrate für Traction Cytometry

doi: 10.3791/52532 Published: June 4, 2015

Abstract

Krebszellen reagieren auf mechanische Steifigkeit in komplexer Weise die Matrix unter Verwendung eines koordinierten hierarchischen mechanochemische System Adhäsionsrezeptoren zusammensetzt und assoziierten Signaltransduktion Membranproteine, die Zytoskelett Architektur und molekulare Motoren 1, 2. Tastsinns von verschiedenen Krebszellen in vitro vorwiegend mit immortalisierten Zelllinien oder primäre Zellen murine abgeleitet, mit primären humanen Krebszellen untersucht. Daher ist wenig über die Mechanosensitivität primärer humaner Kolonkarzinomzellen in vitro bekannt. Hier wird ein optimiertes Protokoll entwickelt, das die Isolierung von primären menschlichen Darmzellen von gesunden und kanzerösen chirurgischen menschlichen Gewebeproben beschrieben. Isoliert Doppelpunkt Zellen werden dann auf weichen (2 kPa Steifigkeit) und steif (10 kPa Steifigkeit) Polyacrylamid-Hydrogele und Polystyrol (~ 3,6 GPa Steifigkeit) Substrate durch eine extrazelluläre Matrix funktionalisiert (Fibronektin erfolgreich kultiviertin diesem Fall). Fluoreszierende Mikrokügelchen werden in weiche Gele in der Nähe der Zellkulturoberfläche eingebettet ist, und Traktion Test wird durchgeführt, um zelluläre Kontraktionsspannungen mit dem kostenlosen Open-Access-Software zu bewerten. Außerdem Immunfluoreszenzmikroskopie auf verschiedenen Substraten Steifigkeit liefert nützliche Informationen über primäre Zellmorphologie, Zellskelett Organisation und Vinculin enthält fokalen Adhäsionen als Funktion der Substratsteifigkeit.

Introduction

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In den letzten Jahren wurde es immer deutlicher, dass eine mechanische Mikroumgebung, zusätzlich zu bio-chemische Faktoren spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zellfunktionen. Zellen können Erkennen und Reagieren auf das Substrat Steifigkeit auf dem sie bis 3-7 eingehalten (wie in 2D Kultivierung) oder umgeben (wie in 3D-Kultur). Dadurch können die Zellen ihre Differenzierung 3, Morphologie 4, Migration / Motilität 5, biophysikalischen Eigenschaften 6. Wachstums 7 und andere Prozesse zu modulieren.

Krebszellen in den 2D und 3D-Matrix Steifigkeit mit einem koordinierten hierarchischen mechano-chemische Kombination von Adhäsionsrezeptoren und assoziierte Signaltransduktion Membranproteine, die Zytoskelett Architektur und molekulare Motoren 1, 2 reagieren auch z. B. Brustepithelzellen (MEC) bilden normale acinar Parenchym, wenn auf 150 Pa Substraten kultiviert, die ähnlich der Steifigkeitvon gesundem Brustgewebe. Interessanterweise weisen sie die Merkmale eines Entwicklungs Tumor, sowohl strukturelle als auch Transkriptions, wenn auf steifer Untergründen (> 5000 Pa), die die Steifigkeit eines Tumorstroma 8 imitieren kultiviert. Zusätzlich zeigt ein weiteres Experiment, dass die Brusttumorgenese durch Kollagenvernetzung und ECM Versteifung 9 verbunden. Kürzlich durchgeführte Experimente zeigen, dass menschliche Kolonkarzinom (HCT-8-Zellen) anzuzeigen Metastasierung Phänotyp (MLP), wenn sie auf Substrate mit 2D physiologisch relevanten Steifigkeit (20-47 kPa) kultivierten, jedoch nicht auf sehr steif (3,6 GPa) Substrate 10- 12 .Diese Zellen erste Form tumorartige Zellcluster dissoziieren dann voneinander, ausgehend von der Peripherie. Da diese epithelialen abgerundete morphologischen (E bis R Übergang) Änderung auftritt, sie vermehren, zu reduzieren Zell-Zell- und Zell-ECM-Adhäsion und werden Migrations. HCT-8-Zellen, die auf sehr harten Polystyrol-Substrate weisen nicht diese kultiviertbösartige Züge. So wurde die Hypothese aufgestellt, dass HCT-8-Zellen werden metastasierendem aufgrund ihrer Exposition gegenüber geeigneter Mikroumgebung. Es ist erwähnenswert, dass diese Versuche werden mit immortalisierten Krebszelllinien oder primäre Zellen murine abgeleiteten, nicht mit primären menschlichen Krebszellen durchgeführt.

Eine neue Studie schlägt vor, dass Augmented zellulären Zugspannung kann als Potential biophysikalischen Signatur für metastatischen Zellen 13 .Die Untersuchung umfaßt das Messen Zugkraft für verschiedene menschliche Krebszelllinien auf Polyacrylamidgelen verwendet werden. Es wird festgestellt, dass metastatische Krebszellen deutlich höhere Zugspannung im Vergleich zu nicht-metastatischen Zellen in allen Fällen 13 auszuüben. Allerdings sind diese Ergebnisse direkt im Widerspruch zu den früher veröffentlichten Ergebnisse auf murine abgeleitet Brustkrebs-Zelllinien 14. Auch eine aktuelle Studie zeigt deutliche Unterschiede zwischen immortalisierte und primäre menschliche Zellen in ihrer Zytoskelett Umgestaltung proProtein-Profiling und das Überleben der Zellen Protein-Expression 15. Daher ist es wichtig, viele der biophysikalischen Untersuchungen, wie Traktion für primäre menschliche Krebszellen zu überdenken. Dies wird auf die Frage eingegangen, ob die Primärzellen rekapitulieren immortalisierten Krebszelllinien Traktion Trend.

Das hier beschriebene Protokoll wird für die Isolierung von primären menschlichen Darmzellen (beide gesund und Krebs), und für die Kultivierung sie auf weichen Substraten (Polyacrylamid-Hydrogele) sowie auf Petrischalen optimiert. Das Protokoll basiert auf der Verdauung und daraus enzymatische Dissoziation des chirurgischen Gewebeprobe in Einzelzellsuspension 16 basierend. Unseres Wissens ist dies die erste Demonstration der Kultivierung isolierten primären Dickdarmtumorzellen und normalen Zellen direkt auf weiche Hydrogel-Substrate mit integrierten Leuchtstoffmikroperlen für Traktion Zytometrie. Transparentes Gel Substrate erlauben auch Immunfärbung. Dieser Test zeigte Unterschiede in der F-Actin-Organisation undfokalen Adhäsionen in primären menschlichen Darmzellen als Substrat Steifigkeitsänderungen. Diese Zellkultur-Plattform eröffnet die Möglichkeit zu erforschen biophysikalischen Eigenschaften von primären humanen Zellen, wie Zelle Steifigkeit und Traktion als Parameter für die Krebs Prognostik.

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Protocol

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Die nachstehend beschriebene Protokoll folgt den Richtlinien der UIUC menschlichen Forschungsethikkommission.

1. Erhebung und Verdauung der chirurgischen Gewebeprobe

  1. Sammeln Sie die Tumorgewebeprobe direkt nach dem Doppelpunkt Resektion (1A und 1B). Sammeln Gewebe von einem benachbarten gesunden Website als gut.
  2. Übertragen des Gewebes sofort in ein 15 ml Fläschchen mit 12 ml HBSS-Lösung. Die Durchstechflasche auf Eis innerhalb einer isolierten Schaumkasten.
  3. Transportieren Sie das Fläschchen, die Gewebe mit einem Gewebekultur Haube für die Weiterverarbeitung innerhalb von 45 min. Die Durchstechflasche auf einem Eis-Block innerhalb der Haube.
  4. Gießen Sie die mitgelieferten Gewebe in eine 6-Well-Platte, die 6-7 ml HBSS-Lösung mit einer Pipette.
    Hinweis: Gewebemenge pro Vertiefung ist nicht kritisch in diesem Spülschritt.
  5. Halten Sie die 6-Well-Platte auf einem Eisblock. Spülen Sie das Gewebe in HBSS-Lösung zweimal.
  6. Schneiden Gewebe sauber in getrennten Abschnitten mit sterilem scissor. Mince Gewebes in kleinere Abschnitte nicht mehr als 1-2 mm 3 in der Größe mit einem sterilen Skalpell.
  7. Wiegen eines markierten 0,1% Trypsin Phiole (enthaltend 1 ml 0,1% iger Trypsin-Lösung) vor dem Überführen des Gewebes. Übertragen ~ 20 mg Gewebe in jeder der 0,1% Trypsin Fläschchen mit einer Pipette.
  8. Versuchen, die Übertragung von HBSS in das Trypsin Phiole zu minimieren, um eine weitere Verdünnung von Trypsin zu vermeiden.
  9. Wiegen Sie die Trypsin-Fläschchen nach Gewebetransfer; dokumentieren den Unterschied, wie der Gewebemasse.
  10. Gießen ~ 20 mg Gewebe und 1 ml Trypsin in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen.
  11. Legen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen auf Schüttler im Kühlschrank bei 4 ° C für 16-20 Stunden. Während dieser Wartezeit oder zu einem früheren Zeitpunkt, bereiten Polyacrylamidgel Substrate und funktionalisieren sie mit ECM-Proteine, wie in Kapitel 3 beschrieben.

2. Enzymatische Dissoziation von Gewebeprobe in Einzelzellsuspension und Kultivieren isolierten Zellen auf ECM Funktionalisierte Elastic Substrat-es und Polystyrol-Geschirr

  1. Nach 16-20 h Inkubation in Trypsin und bei 4 ° C auf einem Schüttler, Transfer Gewebe von 4 ° C Trypsin bis 4 ° C vollständige Wachstumsmedien Fläschchen (mit 2-3 ml komplettem Wachstumsmedium) mit einer Pipette. Stellen Sie sicher, minimale Übertragung von Trypsin in Wachstumsmedien.
    Hinweis: Gesamt-Wachstumsmedienformulierung ist wie folgt: RPMI 1640-Grundmedium mit Pferdeserum auf eine Endkonzentration von 10% und Penicillin-Streptomycin 1% der gesamten Lösung.
  2. Legen Sie die haltigen Medien Fläschchen in einem warmen Wasserbad bei 37 ° C für 12-15 min Gewebe.
  3. Übertragen Sie das Gewebe mit einem 15 ml Fläschchen mit HBSS-Lösung mit einer Pipette, leicht schütteln.
  4. Wiederholen 2.3.
  5. Entfernen Sie Gewebe von HBSS-Lösung und Transfer zum 0,1% Collagenase-Lösung (in HBSS) Fläschchen mit 1 ml Lösung. Inkubieren für 45 min bei 37 ° C und 5% CO & sub2; -Umgebung in einem befeuchteten Zellkulturbrutschrank. Während der Wartezeit, warm growth Medium in einem 15 ml Röhrchen bei 37 ° C im Wasserbad.
  6. Alle Gewebefragmente Ziehen in Pipetten Minimierung Kollagenase Verschleppung. Werfen Sie einfach die Gewebefragmente in vorgewärmten Kulturmedien Fläschchen.
  7. Legen Sie eine 40 um gut Filtereinsatz in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Befeuchten Sie den Filter mit 1 ml Zellkulturmedien.
  8. Man reibt Gewebe in Medien mit einem 10 ml Glaspipette mehrmals, bis Gewebe vollständig dissoziiert.
  9. Pflegen Sie die Pipettenspitze so nah wie möglich an der Basis des Fläschchens.
  10. Zahlen Sie die Lösung auf dem Filter, um Schmutz und undissoziierten Teile zu entfernen.
  11. Zentrifuge filtriert Zellsuspension in Medium bei 150 xg für 5 Minuten bei RT.
  12. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren danach Zell-Pellet mit 2 ml frischem Kulturmedien.
  13. Zähle die Zellen unter Verwendung eines Hämocytometers (falls erforderlich). Seed isoliert primären Zellen auf extrazellulären Matrix (ECM) funktionalisiert Gele und Polystyrol Gerichte gewünschte Konzentration.

3. Herstellung und Funktionalisierung von unterschiedlicher Steifigkeit Polyacrylamid (PA) Gels und Polystyrol Gründe

Hinweis: Für die visuelle Demonstration von Abschnitt 3, die Zuschauer / Leser einer aktuellen Journal of Visualized Experiments (JoVE) Artikel 17 Absatz.

  1. Annahme veröffentlichten Protokollen 18, 19, 12 mm 2 aktivieren Deckgläsern chemisch kovalente Bindung des Hydrogels zu gewährleisten.
    1. Zuerst rutscht treat Glasabdeckung mit 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) für 7 min bei RT.
    2. Entfernen Sie die ATS vollständig mit DI-Wasser spülen und zu behandeln, Deckgläser mit 0,5% Glutaraldehyd (in PBS von 70% Glutaraldehyd Stammlösung verdünnt) Lösung für 30 min.
  2. Erhalt von 2 kPa Gellösungen durch Mischen von 5% w / v Acrylamid und 0,05% N, N 'Methylenbisacrylamid (Bis) -Lösung in 10 mM HEPES-gepufferter Kochsalzlösung 20. Verwenden von 8% w / v Acrylamid und 0,13% N, N 'Methylenbisacrylamid (Bis) -Lösung in 10 mM HEPES-gepufferter Kochsalzlösung für 10 kPa Gel 20.
    1. In beiden Fällen nutzen 1: 200 Ammoniumpersulfat (10% w / v) und 1: 2000 N, N, N ', N "Tetramethylethylendiamin (TEMED) als Initiator und Katalysator für die Polymerisation sind.
    2. Fügen Sie außerdem 100 ul fluoreszierende Kügelchen bis 2 kPa Gel-Lösung als Bezugsmarkierungen 21, 22.
  3. Zahlen Sie einen Tropfen von 20 & mgr; pre-Polymer PA-Gel-Lösung auf dem 12 mm 2 aktiviert Deckglas. Stellen Sie ein weiteres 12 mm 2 Standard-Deckglas auf den Drop. Stellen Sie sicher, dass der Tropfen breitet sich zwischen den Deckgläsern aufgrund der Kapillarwirkung. Invertieren des Sandwich für 2 kPa Gele zu gewährleisten, dass die meisten der Perlen kommen in der Nähe der Zellkulturoberfläche.
  4. Härten des PA-Gel 45 min bei RT.
  5. Ziehen Sie weg der oberen Deckglas mit einer einzigen Kante Rasierer.
    Hinweis: Während der Peeling, geht Loslösung von einer Kanteder Sandwich. Das Gel bleibt Anhänger der aktivierten Glasobjektträger.
  6. Lagern Sie die Gele in PBS-Lösung vor dem Gebrauch.
  7. Funktionalisieren PA-Gelen und Glas mit ECM-Moleküle, humanem Fibronektin mit einer Konzentration von 50 ug / ml nach veröffentlichten Verfahren 23.
    1. Kurz gesagt, inkubieren Substraten mit 2 ml reinem Hydrazinhydrat O / N.
    2. Entfernen Hydrazinhydrat und spülen die Substrate gründlich mit DI-Wasser.
    3. 30 min Waschen der Substrate mit 5% Essigsäure.
    4. Entfernen Essigsäure und spülen die Substrate gründlich mit DI-Wasser.
    5. Halten Sie die Substrate in DI-Wasser für 30 Minuten eingetaucht.
    6. Inkubieren der Substrate mit oxidierter Fibronektin für 35 min bei einer Konzentration von 50 ug / ml.
    7. Spülen der Substrate mit PBS auf Schüttler bei niedriger Drehzahl für 10 min.
    8. Alle Substrate inkubieren bei 37 ° C in 2-3 ml Kulturmedium für 30 Minuten vor dem Ausplattieren der Zellen.
      Hinweis: Tafel-Zellen in einem dünn populated Weise (1000-3000 Zellen / cm 2). Jedes Gel bedeckten Glasschleif muss in einer 35 mm Petrischale enthalten sein. Erlauben Zellen vollständig vor jedem Mikroskopie (mindestens O / N) zu halten.

4. Traktionskraftmikroskopie und Immunfluoreszenzmikroskopie Assays

  1. Traction Force Microscopy Assay
    1. Warm 0,25% Trypsin-EDTA / 10% SDS-Lösung bei 37 ° C im Wasserbad für 10 Minuten bevor die Schlupf Experimente beginnen.
    2. Entfernen Sie eine Gel aus dem Zellkulturbrutschrank bei einer Zeit und Ort auf dem Leucht invertierten Mikroskoptisch (32-fache Vergrößerung).
    3. Finden Sie eine einzelne Zelle in Sichtfeld. Entfernen Sie die Petrischale Deckel.
    4. Nehmen Sie ein Phasenkontrastbild der Zelle (zB Abbildung 3).
    5. Schalten Sie den Aufnahmemodus zur Fluoreszenz und wählen Sie entsprechende Filter. Den Mikroskoptisch oder Proben während dieser Zeit nicht bewegen.
    6. Nehmen Sie ein Bild von der fluoreszierenden Kügelchen displacdurch zelluläre Traktion (4C) ed.
    7. 1 ml Trypsin / SDS-Lösung auf Petrischale, um die Zelle von Gel zu lösen. Den Mikroskoptisch oder Proben während dieser Zeit nicht bewegen. Werfen Sie auch einen Kontrollbild der Zelle, um die vollständige Entfernung von Gel zu gewährleisten.
    8. Werfen Sie einen Verweis (null Kraft) Bild der Perlen, nachdem die Zelle entfernt wird.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2-4.1.8 für alle anderen Gelen.
    10. Vereinbaren Sie einen Bildstapel mit ImageJ aus den beiden Bildern in Schritt 4.1.6 und 4.1.8 für jeden Fall übernommen. Um den Bildstapel zu erzeugen, verwenden Sie folgende Befehlsfolge in ImageJ nach dem Öffnen der Bilder: Bild → Stapel → Bilder zu stapeln.
    11. Um das Verschiebungsfeld und Traktion zu erhalten, verwenden ImageJ Plugins folgenden veröffentlichten Verfahren 21, 22 erhalten Codes und detaillierte Anleitungen für diese Plugins mit dem folgenden Link:. https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
      1. Richten Sie die Bilder in den Stapel mit dem "Template Matching 'plugin. Verwenden Sie folgende Befehlsfolge in ImageJ nach dem Öffnen des Bildstapels in Schritt 4.1.10 erzeugt: Plugins → Template Matching → Align Slices in Stack → OK. Speichern Sie das Bild Stapel damit. Verwenden Sie diese neue Bildstapel in den folgenden Schritten.
      2. Besorgen Sie sich die Verschiebungsfeld mit der PIV (Particle Image Velocimetry) Plugin (4D). Verwenden Sie folgende Befehlssequenz nach dem Öffnen der in Schritt 4.1.11.1 gespeicherten Bildstapel: Plugins → → Iterative PIV PIV (Basic) → OK → Übernehmen Sie diese PIV und Ausgangs → OK. Speichern Sie die PIV-Ausgang in das gleiche Verzeichnis wie im Originalbild Stack. Verwenden Sie diese als Eingabe im nächsten Schritt.
      3. Schließlich verwenden die FTTC (Fourier-Transformation Traktion Zytometrie) Plugin, um die Traktion Karte (4E) zu erhalten. Verwenden Sie folgende Befehlsfolge: Plugins → FTTC → Insert Materialeigenschaften, dh E-Modul und das Verhältnis der PA-Gel → OK → Poisson-Wählen Sie die in Schritt 4.1.11.2 → OK gespeichert PIV Ausgabedatei. Speichern FTTC ergibt sich im selben Verzeichnis wie im Bilderstapel und PIV-Ausgang.
  2. Immunfluoreszenz-Assays
    1. Nehmen Sie die Substrate an den laminaren Haube immungefärbt werden, und entfernen Sie den Kulturmedien.
    2. Spülen der Substrate mit PBS und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 20 min bei RT.
    3. Für 3-mal (jeweils 5 min) Waschen der Substrate mit PBS. Folglich Inkubation der Substrate mit 500 ul Signalverstärker für 30 Minuten und spülen Sie mit PBS.
    4. Zellen, die mit monoklonalen Anti-Vinculin-Antikörpern inkubieren bei einer 1: 250 Verdünnung in PBS für 45 min bei RT. Für 3-mal (jeweils 5 min) Waschen der Substrate mit PBS.
    5. 200-Verdünnung: die Proben mit sekundärem Antikörper Alexa Fluor 488 Ziege-Anti-Maus-IgG bei einem 1 inkubierenin PBS bei RT für 30 min. Für 3-mal (jeweils 5 min) Waschen der Substrate mit PBS.
    6. Um die F-Aktin-Struktur sichtbar zu machen, zu inkubieren Zellen mit Phalloidin-TRITC-Konjugaten bei einer Konzentration 50 ug / ml für 45 min bei RT. Für 3-mal (jeweils 5 min) Waschen der Substrate mit PBS.
    7. Bild die Proben mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (5A - 5D).

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Representative Results

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Das oben beschriebene Protokoll ist erfolgreich für mehrere Gewebeproben (n = 12) von vier verschiedenen Patienten unter Richtlinien der Ethikkommission eingesetzt. 1A veranschaulicht eine repräsentative kolorektalen Tumor direkt nach der Operation aus dem die Gewebeschnitte für Zellkulturen gewonnen werden. Ein typischer Gewebeschnitt in HBSS-Lösung nach der Übertragung auf den laminaren Abzugshaube für die weitere Verarbeitung ist in 1B gezeigt. Eine schematische Darstellung der enzymatischen Verdauung und Dissoziation von chirurgischen Gewebeprobe in Einzelzellsuspension wird in Abbildung 2 dargestellt.

Nach erfolgreicher Gewebedissoziation werden isolierte primäre humane Zellen auf PA-Gelen und Polystyrol-Schalen ausgesät. Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen (3A und 3B) zeigen die repräsentative Morphologie von primären humanen Dickdarmkrebszellen und normalen Zellen als eine Funktion der Substrat Steifigkeit. Es ist offensichtlich, daßPrimärdarmzellen (beide gesund und Krebs) verteilt mehr auf Polystyrol Gerichte im Vergleich zu den PA-Gelen (3A und 3B).

Traction-Tests werden auf ECM (Fibronektin) nach der Bestätigung der invasive Adenokarzinome von pathologischen H & E-Färbung (4A) beschichtet soft 2 kPa Gelen durchgeführt. PA Gele werden gleichmäßig mit Fibronektin beschichtet, wie in 4B gezeigt. Um Vergleiche zu erleichtern, sollten alle Traktions Experimente zur Tumor und gesundem Darmzellen gleichzeitig durchgeführt werden. 4C zeigt eine Momentaufnahme der nanoskaligen fluoreszierenden Kügelchen in dem Gel eingebettet sind. Von den Vertriebenen und Referenzraupe Bilder werden die Verschiebungsfelder mit dem ImageJ Plugin PIV 21, 22 erhalten. Ein Vertreter Wulst Verschiebungsfeld durch invasive Dickdarmtumorzellen auf 2 kPa Gel erzeugt wird, in 4D dargestellt. 4E zeigt Traktion stress erhalten mit ImageJ FTTC-Plugin entsprechend Bereich in 4D 21, 22 Hubraum.

Abbildung 5 zeigt die F-Actin und Vinculin enthält fokalen Adhäsionen von primären humanen Kolon-Zellen auf weichem 2 kPa Gele und Polystyrol-Hartsubstraten. Kein Aktin Faser war in den weniger ausgebreiteten Zellen auf weiche Gele (Abbildung 5A1 - 5A2) vorhanden. Punctata vinculin enthält fokalen Adhäsionen sind weiche Gele (Abbildung 5B1 - 5B2) vorhanden. Umgekehrt primären Zellen zeigen auch Ausbreitung Morphologie, gut definierte Aktin-Stressfasern und diskreten länglichen fokalen Adhäsionen auf Polystyrol-Hartsubstraten (5C - 5D).

Abbildung 1
Abbildung 1. (A) Tumor nach Kolonresektion. (B) Die Gewebeschnitte aus dem Tumor zur Zellisolierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Verdauung und enzymatische Spaltung von chirurgischen Gewebeprobe in Einzelzellsuspension. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Erfolgreiche primären humanen Kolon-Zellkultur (sowohl Krebs und normal) auf verschiedenen Gelen und Steifigkeit auf Polystyrolschale. Phasenkontrastbilder zeigen tyPical Morphologie (A) Tumorzellen und (B) Normale Zellen auf unterschiedlichen Steifigkeitsgründen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4 (A) H & E-Färbung bestätigt invasive Adenokarzinome. (B) Fibronectin-Färbung zeigt, dass Gele werden gleichmäßig mit ECM-Molekülen beschichtet sind. (C) Nanokügelchen im Inneren Gel als treuhänderische Markierungen eingebettet. (D) Vertreter Verschiebungsfeld von Tumorzellen auf weichem PA gel mit PIV-Plugin in ImageJ wie in 4.1.11.2 beschrieben. (E) Traction Stress durch Tumorzellen ausgeübt auf weiches Gel entsprechend Feld in (D) Verschiebung über FTTC Stecker erhalten in in ImageJ wie in 4.1.11.3 beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5. Immunfluoreszenzfärbung von F-Actin und Vinculin auf weiches Gel und auf der Fest Polystyrol Substraten. Kein Aktin-Fasern war bei der weniger verbreitet (A1) Tumorzelle oder (A2) normale Zelle auf weichem 2 kPa Gelen vor. Punctata vinculin enthält fokalen Adhäsionen auf weiche Gele vorliegen (B1 - B2). Umgekehrt primären Zellen zeigen auch Ausbreitung Morphologie, gut definierte Aktin-Stressfasern (C1 - C2) und diskrete längliche fokalen Adhäsionen (D1 - D2) auf Polystyrol-Hartsubstraten.2 / 52532fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Cellular Zugspannung wurde kürzlich als eine mögliche biophysikalische Indikator des metastasierten Zustand 13 entstanden. , In der Literatur keine experimentellen Daten Traktion mit primären Tumorzellen besteht jedoch auf dem Laufenden. Auch direkt Kultivierung isolierten primären Darmzellen auf unterschiedlichen Steifigkeit Polyacrylamidgelen noch nicht gemeldet. Damit schaffen wir eine optimierte Primärdoppelpunkt Zellkulturbedingungen auf Gelen und Polystyrol (Abbildung 2). Fluoreszierenden Mikroperlen Kapselung in der Nähe von Zellkulturoberfläche während weiches Gel Vorbereitung ermöglicht die Messung von Verschiebungsfeld und Traktion durch primäre menschliche Zellen (4C, 4D und 4E) erzeugt. Darüber hinaus können Immunfluoreszenztests wichtige Informationen zu Zytoskelett Organisation und fokalen Adhäsionen als Substrat Steifigkeitsänderungen (- 5D 5A) bereitzustellen. Beachten Sie, dass verschiedene Krebs und normalen immortalisierte ZellLinien zeigen auch vermehrt verbreiten, Aktin-Stress-Bundle Bildung und reifen länglichen fokalen Adhäsionen mit erhöhter Steifigkeit Substrat 4, 24-25.

Das Protokoll kann leicht angenommen werden / für die Isolierung von primären Zellen aus chirurgischen Gewebe verschiedener menschlicher Organe oder andere Tiere verändert. Die Inkubationszeit von Gewebe in der Dissoziation Mittel - Trypsin und Collagenase - muss empirisch für jede Anwendung optimiert werden. Darüber hinaus ist die Filtergröße zum Entfernen von Trümmern und undissoziierten Gewebeteile ebenfalls ein wichtiger Parameter, um auf den erwarteten maximalen Zellgröße im unterbrochenen Zustand (40 & mgr; m in diesem Protokoll) basierend auszuwählen.

Eine Einschränkung des Verfahrens besteht darin, dass ein paar weiche Gele können konsistente Lokalisierung der fluoreszierenden Kügelchen in der Nähe von Zellkulturoberfläche (Abschnitt 3.3), die sich nachteilig auf die folgende Traktion Zytometrie Messungen (Abschnitt 4.1) fehlt. Dies kann leicht durch die Untersuchung umgangen werdendie Gel-Oberfläche für Wulst Dichte und Verteilung unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie vor Zellkultur. Folglich können Gele mit relativ nicht-homogene Kornverteilung sind verworfen. Ein weiterer Ansatz ist, ein vor kurzem vorgeschlagenes Verfahren, die eine genaue Lokalisierung der Kügelchen in der Nähe der Zellkulturoberfläche 17 ermöglicht den Einsatz.

Sollte die Bearbeitung der chirurgischen Proben zu beginnen, sobald sie empfangen werden, vorzugsweise innerhalb von 45 Minuten Vorsicht eingenommen werden. Der wichtigste Schritt im Protokoll ist die optimale Belichtungszeit des Gewebes in dem Trypsin und Collagenaselösung auf Isolationsausbeute zu erreichen, und dennoch mit ausreichender Zelllebensfähigkeit. Vor dem Kultivieren der Zellen auf weichem Hydrogele, die Wulst Dichte und Verteilung muss mit Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Außerdem muss ein Nullbildkraft, nach der Bestätigung, daß die Zelle vollständig aus dem Gel Oberfläche abgelöst erworben werden.

Zusammenfassend wird ein Protokoll beschrieben, dass die Wiedernisse dissoziiert Einzelzellen-Suspension aus chirurgischen Krebs / Normalgewebeprobe. Diese Isolierung der einzelnen Primärtumorzellen von chirurgischen Proben, gefolgt von ihrer Kultur auf weichen und harten Untergründen ermöglicht verschiedene Downstream biophysikalische Messungen, zum Beispiel Zell Steifigkeit mit AFM, intrazelluläre Rheologie mit mikroinjiziert Teilchen, Zellmigration / Motilität und Vesikel Dynamikanalyse. Diese Messungen können zur Krebsprognose verwendet werden. Das Protokoll wurde erfolgreich für die Extraktion und die Kultur von murinen Kardiomyozyten sowie 26 eingesetzt. Die hier vorgestellte Methode kann verwendet werden, um primäre menschliche Zellen aus chirurgischen Gewebe verschiedener Organe und Kultur sie direkt auf andere Steifigkeit Substrat für Mechanobiologie Studien zu isolieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
HBSS Life technologies 14175-095
PBS Lonza 17-516F
Trypsin Worthington LS003736
Collagenese Worthington LS004176
3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)  Sigma-Aldrich 281778
Glutaraldehyde Polysciences, Inc. 01201-5
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
N-methylenebisacrylamide (bis) Sigma-Aldrich M1533
HEPES buffer solution Sigma-Aldrich 83264
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
Human fibronectin BD biosciences 354008
Hydrazine hydrate Sigma-Aldrich 18412 Hazardous
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences RT15710
Signal enhancer Life technologies I36933
Monoclonal anti vinculin antibody  Sigma-Aldrich V9131
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life technologies A11001
TRITC phalloidin conjugates  Sigma-Aldrich P1951
0.1 µm fluroscent beads Life technologies F8801
0.25% Trypsin-EDTA Life technologies 25200-056
Materials
12 mm2 glass cover slips Corning 2865-12

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References

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Isolierung von primären humanen Colon Tumorzellen von Surgical Gewebe und Kultivierung sie direkt auf weiche elastische Substrate für Traction Cytometry
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Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).More

Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).

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