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Bioengineering

सर्जिकल ऊतकों से प्राथमिक मानव पेट के ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव और ट्रैक्शन Cytometry के लिए शीतल लचीला substrates पर उन्हें सीधे संवर्धन

Published: June 4, 2015 doi: 10.3791/52532
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2College of Medicine, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Provena Covenant Medical Centre, 4Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign

Abstract

कैंसर की कोशिकाओं को एक आसंजन रिसेप्टर्स से बना समन्वित, श्रेणीबद्ध Mechano-रासायनिक प्रणाली और संबद्ध संकेत पारगमन झिल्ली प्रोटीन, cytoskeletal वास्तुकला, और आणविक मोटर्स 1, 2 का उपयोग कर एक जटिल तरीके से यांत्रिक कठोरता मैट्रिक्स का जवाब। Mechanosensitivity विभिन्न कैंसर कोशिकाओं के लिए इन विट्रो में हैं नहीं प्राथमिक मानव कैंसर कोशिकाओं के साथ अमर सेल लाइनों या murine व्युत्पन्न प्राथमिक कोशिकाओं, के साथ मुख्य रूप से जांच की। इसलिए, थोड़ा इन विट्रो में प्राथमिक मानव पेट के कैंसर की कोशिकाओं की mechanosensitivity के बारे में जाना जाता है। इधर, एक अनुकूलित प्रोटोकॉल स्वस्थ और कैंसर शल्य चिकित्सा मानव ऊतकों के नमूनों से प्राथमिक मानव पेट के कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है कि विकसित की है। पृथक बृहदान्त्र कोशिकाओं तो फ़ाइब्रोनेक्टिन (एक बाह्य मैट्रिक्स से क्रियाशील substrates के polyacrylamide हाइड्रोजेल और कठोर polystyrene (~ 3.6 GPa कठोरता) (10 किलो पास्कल कठोरता) (2 किलो पास्कल कठोरता) नरम और कठोर पर सफलतापूर्वक संवर्धित कर रहे हैंइस मामले में)। फ्लोरोसेंट microbeads सेल संस्कृति की सतह के पास सॉफ्ट जैल में एम्बेडेड रहे हैं, और कर्षण परख मुक्त ओपन एक्सेस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सेलुलर सिकुड़ा तनाव का आकलन करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, विभिन्न कठोरता substrates पर immunofluorescence माइक्रोस्कोपी सब्सट्रेट कठोरता के एक समारोह के रूप में फोकल adhesions युक्त प्राथमिक सेल आकृति विज्ञान, cytoskeleton संगठन और vinculin के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करता है।

Introduction

यांत्रिक सूक्ष्म पर्यावरण, जैव-रासायनिक कारकों के अलावा, सेल functionalities के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि हाल के वर्षों में यह तेजी से स्पष्ट हो गया है। प्रकोष्ठों भावना और वे 3-7 (2 डी संस्कृति के रूप में) का पालन किया या (3 डी संस्कृति के रूप में) से घिरे हैं, जिस पर सब्सट्रेट कठोरता का जवाब कर सकते हैं। ऐसा करके, कोशिकाओं को उनके भेदभाव 3, आकृति विज्ञान 4, माइग्रेशन / गतिशीलता 5, जैव-भौतिक गुणों 6, विकास 7, और अन्य प्रक्रियाओं न्यूनाधिक कर सकते हैं।

कैंसर कोशिकाओं को भी एक आसंजन रिसेप्टर्स की समन्वित, श्रेणीबद्ध Mechano-रासायनिक संयोजन और संबद्ध संकेत पारगमन झिल्ली प्रोटीन, cytoskeletal वास्तुकला, और आणविक मोटर्स 1, 2 का उपयोग कर 2 डी और 3 डी मैट्रिक्स कठोरता का जवाब। उदाहरण के लिए, स्तन उपकला कोशिकाओं (MECS) 150 पा substrates पर सुसंस्कृत जब कठोरता के समान है कि सामान्य कोष्ठकी पैरेन्काइमा फार्मस्वस्थ स्तन के ऊतकों की। दिलचस्प बात यह है कि वे एक ट्यूमर स्ट्रोमा 8 की कठोरता है कि नकल में stiffer substrates के (> 5,000 पा) पर जब सुसंस्कृत संरचनात्मक और ट्रांसक्रिप्शनल दोनों एक विकासशील ट्यूमर की पहचान, दिखा रहे हैं। इसके अलावा, एक और प्रयोग स्तन tumorigenesis के कोलेजन crosslinking और ईसीएम 9 stiffening के साथ है कि पता चलता है। हाल के प्रयोगों वे physiologically प्रासंगिक कठोरता (20-47 किलो पास्कल) होने 2D substrates पर संवर्धित कर रहे हैं, लेकिन (3.6 GPA) substrates पर बहुत कठोर नहीं जब मानव बृहदान्त्र कार्सिनोमा (HCT-8) कोशिकाओं फेनोटाइप (MLP) जैसे मेटास्टेसिस प्रदर्शित बताते हैं कि 10- 12 ये कोशिकाओं पहले फार्म ट्यूमर की तरह सेल समूहों और फिर परिधि से शुरू, एक दूसरे से अलग कर देना। परिवर्तन वे सेल सेल और सेल ईसीएम आसंजन को कम करने, और प्रवासी हो जाते हैं, पैदा करना होता है, (आर संक्रमण के लिए ई) गोल रूपात्मक करने के लिए इस उपकला के रूप में। इन प्रदर्शन नहीं करते हैं बहुत मुश्किल polystyrene के substrates पर HCT-8 कोशिकाओं सुसंस्कृतघातक लक्षण। इस प्रकार यह HCT-8 कोशिकाओं के कारण उचित सूक्ष्म वातावरण के लिए अपने जोखिम को मेटास्टेटिक बन धारणा रही है कि। यह इन प्रयोगों नहीं प्राथमिक मानव कैंसर कोशिकाओं के साथ अमर कैंसर कोशिका लाइनों या murine व्युत्पन्न प्राथमिक कोशिकाओं, के साथ बाहर किया जाता है कि ध्यान देने योग्य है।

एक ताजा अध्ययन में संवर्धित सेलुलर कर्षण तनाव मेटास्टैटिक कोशिकाओं 13 .इस अध्ययन polyacrylamide जैल पर अलग मानव कैंसर कोशिका लाइनों के लिए कर्षण बल को मापने शामिल है के लिए एक संभावित जैवभौतिक हस्ताक्षर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रस्ताव है। यह मेटास्टेटिक कैंसर की कोशिकाओं को सभी मामलों में 13 में गैर metastatic कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक कर्षण तनाव लागू कर सकते हैं कि पाया जाता है। हालांकि, इन परिणामों सीधे murine व्युत्पन्न स्तन कैंसर कोशिका लाइनों 14 पर पहले प्रकाशित निष्कर्षों के विरोध। इसके अलावा, हाल ही में एक अध्ययन उनके cytoskeletal remodeling के समर्थक में अमर और प्राथमिक मानव कोशिकाओं के बीच उल्लेखनीय मतभेदों पर प्रकाश डाला गयाTein रूपरेखा और सेल अस्तित्व प्रोटीन अभिव्यक्ति 15। इसलिए, यह प्राथमिक मानव कैंसर कोशिकाओं के लिए कर्षण सहित जैवभौतिक assays के कई फिर से आना जरूरी है। प्राथमिक कोशिकाओं अमर कैंसर कोशिका लाइनों कर्षण प्रवृत्ति पुनरावृत्ति है कि क्या इस सवाल को संबोधित करेंगे।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल, और नरम substrates (polyacrylamide हाइड्रोजेल) के साथ ही पर पेट्री डिश पर उनके संवर्धन के लिए (स्वस्थ और कैंसर दोनों) प्राथमिक मानव पेट के कोशिकाओं के अलगाव के लिए अनुकूलित है। प्रोटोकॉल पाचन और एकल कक्ष निलंबन 16 में शल्य ऊतक के नमूने के फलस्वरूप enzymatic पृथक्करण पर आधारित है। हमारे ज्ञान करने के लिए, यह सीधे cytometry के कर्षण के लिए एम्बेडेड फ्लोरोसेंट microbeads के साथ नरम हाइड्रोजेल substrates पर पृथक प्राथमिक पेट के ट्यूमर और सामान्य कोशिकाओं संवर्धन का पहला प्रदर्शन है। पारदर्शी जेल substrates के भी immunostaining के लिए अनुमति देते हैं। यह परख पता चला एफ actin संगठन में मतभेद औरसब्सट्रेट कठोरता परिवर्तन के रूप में प्राथमिक मानव बृहदान्त्र कोशिकाओं में फोकल adhesions। यह सेल संस्कृति मंच इस तरह के कैंसर prognostics के लिए मानकों के रूप में सेल कठोरता और कर्षण के रूप में प्राथमिक मानव कोशिकाओं के विभिन्न biophysical गुणों की खोज की संभावना को खोलता है।

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Protocol

नीचे वर्णित प्रोटोकॉल UIUC मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशा निर्देशों का पालन करती है।

1. संग्रह और शल्य चिकित्सा ऊतक नमूना की पाचन

  1. सही पेट के लकीर (चित्रा 1 ए और 1 बी) के बाद ट्यूमर के ऊतक नमूना ले लीजिए। के रूप में अच्छी तरह से एक बगल स्वस्थ साइट से ऊतक लीजिए।
  2. 12 एमएल HBSS समाधान युक्त एक 15 मिलीलीटर की शीशी को तुरंत ऊतक स्थानांतरण। एक अछूता फोम बॉक्स के अंदर बर्फ पर शीशी रखें।
  3. 45 मिनट के भीतर आगे की प्रक्रिया के लिए एक टिशू कल्चर हुड के लिए ऊतक युक्त शीशी परिवहन। हुड के अंदर एक बर्फ ब्लॉक पर शीशी रखें।
  4. एक विंदुक का उपयोग HBSS समाधान के 6-7 मिलीग्राम से युक्त एक 6 अच्छी तरह से थाली में आपूर्ति की ऊतक डालो।
    नोट: अच्छी तरह से प्रति ऊतक की राशि इस rinsing चरण में महत्वपूर्ण नहीं है।
  5. एक बर्फ ब्लॉक पर 6 अच्छी तरह से थाली रखें। दो बार HBSS समाधान में ऊतक कुल्ला।
  6. बाँझ Scis के साथ अलग वर्गों में सफाई से ऊतक में कटौतीSor। छोटे वर्गों में कीमा ऊतक एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड के साथ आकार में 1-2 मिमी 3 से बड़ा नहीं।
  7. ऊतक स्थानांतरित करने से पहले (0.1% trypsin समाधान के 1 मिलीलीटर युक्त) एक लेबल 0.1% ट्रिप्सिन शीशी वजन। एक विंदुक के साथ 0.1% trypsin के शीशियों में से प्रत्येक में ~ 20 मिलीग्राम ऊतक स्थानांतरण।
  8. Trypsin के आगे कमजोर पड़ने से बचने के लिए ट्रिप्सिन शीशी में HBSS के हस्तांतरण को कम करने की कोशिश करें।
  9. ऊतक स्थानांतरण के बाद ट्रिप्सिन शीशियों वजन; ऊतक जन के रूप में फर्क दस्तावेज़।
  10. ~ 20 मिलीग्राम ऊतक और एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में trypsin 1 मिलीलीटर डालो।
  11. 16-20 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में एक प्रकार के बरतन पर 24 अच्छी तरह से थाली रखो। इस प्रतीक्षा अवधि के दौरान या एक समय में पहले, polyacrylamide जेल substrates के लिए तैयार है और धारा 3 में वर्णित के रूप में ईसीएम प्रोटीन के साथ उन्हें functionalize।

2. एंजाइमी एकल कक्ष निलंबन में ऊतक नमूना की हदबंदी और ईसीएम Functionalized लचीला substrat पर संवर्धन अलग कक्षोंतों और कठोर Polystyrene व्यंजन

  1. प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से trypsin में ऊष्मायन के 16-20 घंटे के बाद, एक विंदुक का उपयोग (पूर्ण विकास मीडिया के 2-3 मिलीलीटर युक्त) 4 डिग्री सेल्सियस पूरा विकास मीडिया शीशी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस ट्रिप्सिन से ऊतक हस्तांतरण। विकास मीडिया में trypsin के न्यूनतम हस्तांतरण सुनिश्चित करें।
    नोट: पूर्ण विकास मीडिया निर्माण इस प्रकार है: 10% और पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन कुल समाधान के 1% के अंतिम एकाग्रता के लिए घोड़े सीरम के साथ पूरक 1640 RPMI आधार मध्यम।
  2. 12-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म पानी के स्नान में मीडिया शीशी युक्त ऊतक रखें।
  3. एक विंदुक का उपयोग HBSS समाधान युक्त एक 15 मिलीलीटर शीशी के लिए ऊतक स्थानांतरण, धीरे से हिला।
  4. 2.3 दोहराएँ।
  5. HBSS समाधान और 1 मिलीलीटर समाधान युक्त शीशी (HBSS में) स्थानांतरण 0.1% करने के लिए collagenase समाधान से ऊतक निकालें। एक humidified सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 45 से 37 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम और 5% सीओ 2 पर्यावरण के लिए सेते हैं। प्रतीक्षा अवधि, गर्म growt के दौरानएक 15 मिलीलीटर में एच मीडिया नहाने के पानी में 37 डिग्री सेल्सियस पर शीशी।
  6. पिपेट न्यूनतम collagenase carryover में सभी ऊतक टुकड़े बाहर खींचो। पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया शीशियों में सिर्फ ऊतक टुकड़े निकालें।
  7. एक 6 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में एक 40 माइक्रोन अच्छी तरह से डालने फिल्टर रखें। 1 मिलीलीटर सेल संस्कृति मीडिया के साथ फिल्टर गीला।
  8. ऊतक पूरी तरह से अलग है जब तक एक 10 मिलीलीटर कांच पिपेट कई बार साथ मीडिया में महीन चुर्ण बनाना ऊतक।
  9. शीशी के आधार करने के लिए संभव के रूप में करीब विंदुक टिप बनाए रखें।
  10. मलबे और undissociated भागों को दूर करने के लिए फिल्टर पर समाधान जमा।
  11. अपकेंद्रित्र आरटी पर 5 मिनट के लिए 150 XG पर मीडिया में सेल निलंबन फ़िल्टर्ड।
  12. बाद में सतह पर तैरनेवाला निकालें और 2 मिलीलीटर ताजा संस्कृति मीडिया के साथ सेल गोली resuspend।
  13. एक hemocytometer (यदि आवश्यक) का उपयोग कोशिकाओं की गणना। बीज बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) क्रियाशील जैल और वांछित एकाग्रता में polystyrene के बर्तन पर प्राथमिक कोशिकाओं को अलग किया।

3. तैयार करना और विभिन्न कठोरता Polyacrylamide (पीए) जैल और polystyrene Substrates के functionalization

नोट: धारा 3 के दृश्य प्रदर्शन के लिए, दर्शकों / पाठकों कल्पना प्रयोगों के हाल के एक जर्नल (जौव) अनुच्छेद 17 में भेजा जाता है।

  1. गोद लेने प्रकाशित प्रोटोकॉल 18, 19, 12 मिमी 2 गिलास को कवर हाइड्रोजेल के बंधन सहसंयोजक सुनिश्चित करने के लिए रासायनिक निकल जाता है को सक्रिय करें।
    1. सबसे पहले, इलाज के गिलास को कवर आरटी पर 7 मिनट के लिए 3 Aminopropyltrymethoxysilane (एटीएस) के साथ निकल जाता है।
    2. डि पानी कुल्ला के साथ पूरी तरह से एटीएस निकालें और इलाज कवर (70% glutaraldehyde शेयर समाधान से पीबीएस में पतला) 0.5% glutaraldehyde 30 मिनट के लिए समाधान के साथ निकल जाता है।
  2. / वी acrylamide समाधान और 0.05% एन, 10 मिमी HEPES बफर खारा 20 में 'एन -methylenebisacrylamide (बीआईएस) समाधान डब्ल्यू 5% के मिश्रण से 2 किलो पास्कल जेल समाधान प्राप्त करते हैं। / वी एक्रिलामाइड और 0.13 डब्ल्यू 8% का प्रयोग करें% एन, 10 किलो पास्कल जेल में 20 के लिए 10 मिमी HEPES बफर खारा में 'एन -methylenebisacrylamide (बीआईएस) समाधान।
    1. 200 अमोनियम persulfate (w / 10% V) और 1: दोनों ही मामलों में, 1 उपयोग 2,000 एन, एन, एन ',' एन क्रमशः polymerization की प्रक्रिया के लिए सर्जक और उत्प्रेरक के रूप में -tetramethylethylenediamine (TEMED)।
    2. इसके अलावा, प्रत्ययी मार्करों 21, 22 के रूप में 2 किलो पास्कल जेल समाधान करने के लिए 100 μl फ्लोरोसेंट मोती जोड़ें।
  3. 20 μl 12 मिमी 2 सक्रिय गिलास को कवर पर्ची पर पूर्व बहुलक पीए जेल समाधान की एक बूंद जमा। ड्रॉप पर एक और 12 मिमी 2 नियमित गिलास को कवर पर्ची रखें। बूंद कारण कपिलैरिटि को कवर फिसल जाता है के बीच फैलता है कि सुनिश्चित करें। 2 किलो पास्कल जैल मोतियों की सबसे सेल संस्कृति की सतह के पास आते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए सैंडविच उलटें।
  4. आरटी पर 45 मिनट के लिए पीए जेल इलाज।
  5. एक एकल बढ़त रेजर का उपयोग शीर्ष कवर पर्ची दूर छील।
    नोट: छीलने के दौरान, सेना की टुकड़ी एक किनारे से आयसैंडविच की। जेल सक्रिय गिलास स्लाइड के अनुयायी बनी हुई है।
  6. उपयोग करने से पहले पीबीएस समाधान में जैल स्टोर।
  7. 50 माइक्रोग्राम / एमएल प्रकाशित निम्न विधियों में से 23 की एकाग्रता में पीए जैल और ईसीएम अणु, मानव फ़ाइब्रोनेक्टिन के साथ कांच functionalize।
    1. संक्षेप में, 2 मिलीलीटर शुद्ध hydrazine हाइड्रेट हे / एन के साथ substrates सेते हैं।
    2. Hydrazine हाइड्रेट निकालें और डि पानी से अच्छी तरह substrates के कुल्ला।
    3. 30 मिनट के लिए 5% एसिटिक एसिड के साथ substrates धो लें।
    4. एसिटिक एसिड निकालें और डि पानी से अच्छी तरह substrates के कुल्ला।
    5. 30 मिनट के लिए डि पानी में डूब substrates के रखें।
    6. 50 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में 35 मिनट के लिए ऑक्सीकरण फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ substrates सेते हैं।
    7. 10 मिनट के लिए कम rpm पर एक प्रकार के बरतन पर पीबीएस के साथ substrates कुल्ला।
    8. चढ़ाना कोशिकाओं से पहले 30 मिनट के लिए 2-3 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया में 37 डिग्री सेल्सियस पर सभी substrates सेते हैं।
      नोट: थाली कोशिकाओं को एक कम आबाद मेंडी ढंग (1,000-3,000 कोशिकाओं / 2 सेमी)। प्रत्येक जेल से ढके कांच पर्ची एक 35 मिमी पेट्री डिश में समाहित किया जाना चाहिए। कोशिकाओं को किसी भी माइक्रोस्कोपी (कम से कम हे / एन) से पहले पूरी तरह से पालन करने की अनुमति दें।

4. कर्षण बल माइक्रोस्कोपी और immunofluorescence माइक्रोस्कोपी Assays

  1. कर्षण बल माइक्रोस्कोपी परख
    1. 10 मिनट के लिए पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म 0.25% trypsin-EDTA / 10% एसडीएस समाधान कर्षण प्रयोगों के शुरू होने से पहले।
    2. एक समय में सेल संस्कृति इनक्यूबेटर से एक जेल निकालें और फ्लोरोसेंट औंधा माइक्रोस्कोप मंच (32X बढ़ाई) पर जगह है।
    3. देखने के क्षेत्र में एक एकल कोशिका का पता लगाएं। पेट्री डिश ढक्कन निकालें।
    4. सेल के एक चरण विपरीत छवि (जैसे, चित्रा 3) ले लो।
    5. प्रतिदीप्ति और उपयुक्त फिल्टर का चयन करने के लिए इमेजिंग मोड स्विच। इस समय के दौरान खुर्दबीन मंच या नमूना कदम नहीं है।
    6. फ्लोरोसेंट मोती displac की एक छवि ले लोसेलुलर कर्षण (चित्रा 4C) द्वारा एड।
    7. जेल से सेल को अलग करने के लिए पेट्री डिश के लिए 1 मिलीग्राम / trypsin एसडीएस समाधान जोड़ें। इस समय के दौरान खुर्दबीन मंच या नमूना कदम नहीं है। इसके अलावा, जेल से पूरी तरह हटाने सुनिश्चित करने के लिए सेल के नियंत्रण छवि ले।
    8. सेल निकाल दिया जाता है के बाद मोतियों की एक संदर्भ (शून्य बल) छवि ले लो।
    9. अन्य सभी जैल के लिए चरणों को दोहराएँ 4.1.2-4.1.8।
    10. प्रत्येक मामले के लिए कदम 4.1.6 और 4.1.8 में अधिग्रहीत दो छवियों से ImageJ का उपयोग एक छवि ढेर बनाओ। ढेर के ढेर → छवियाँ → छवि: छवि ढेर उत्पन्न करने के लिए, छवियों खोलने के बाद ImageJ में आज्ञा का पालन अनुक्रम का उपयोग करें।
    11. । विस्थापन क्षेत्र और कर्षण प्राप्त करने के लिए प्रकाशित तरीकों 21, 22 निम्नलिखित ImageJ plugins का उपयोग नीचे दिए गए लिंक का उपयोग कर इन plugins के लिए कोड और विस्तृत ट्यूटोरियल प्राप्त करें: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins।
      1. 'खाका मिलान' प्लगइन का उपयोग ढेर में छवियों को संरेखित। → ठीक है ढेर में प्लगइन्स → टेम्पलेट मिलान संरेखित स्लाइस →: चरण 4.1.10 में उत्पन्न छवि ढेर खोलने के बाद ImageJ में आदेशों का अनुक्रम निम्न का उपयोग। फलस्वरूप छवि ढेर बचाओ। निम्न चरणों में इस नई छवि ढेर का उपयोग करें।
      2. PIV (कण छवि velocimetry) प्लगइन (चित्रा 4D) का उपयोग कर विस्थापन क्षेत्र प्राप्त करते हैं। कदम 4.1.11.1 में सहेजे छवि ढेर खोलने के बाद आज्ञाओं का अनुक्रम निम्न का उपयोग: प्लगइन्स → PIV → चलने का PIV (बेसिक) → → ठीक है ठीक है → इस PIV और उत्पादन को स्वीकार करें। मूल छवि ढेर के रूप में एक ही निर्देशिका में PIV उत्पादन को बचाने के। अगले चरण में निवेश के रूप में इसका प्रयोग करें।
      3. अंत में FTTC कर्षण नक्शा (चित्रा 4E) प्राप्त करने के लिए प्लगइन (फूरियर cytometry के कर्षण परिणत) का उपयोग करें। आज्ञाओं का प्रयोग निम्न क्रम: प्लगइन्स → FTTC → आईएनएसईआरटी सामग्री गुण, यानी, यंग मापांक और पीए जेल → ठीक है → पॉसों के अनुपात ठीक है → कदम 4.1.11.2 में सहेजे PIV आउटपुट फ़ाइल का चयन करें। सहेजें FTTC छवि ढेर और PIV उत्पादन में के रूप में एक ही निर्देशिका में यह परिणाम है।
  2. Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी Assays
    1. लामिना हुड के लिए immunostained होने के लिए substrates के ले लो और संस्कृति मीडिया को हटा दें।
    2. पीबीएस के साथ substrates कुल्ला और आरटी पर 20 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक।
    3. 3 बार (5 मिनट प्रत्येक समय) के लिए पीबीएस के साथ substrates धो लें। नतीजतन, 30 मिनट के लिए 500 μl संकेत बढ़ाने के साथ substrates सेते हैं और पीबीएस के साथ कुल्ला।
    4. आरटी पर 45 मिनट के लिए पीबीएस में 250 कमजोर पड़ने: एक 1 पर मोनोक्लोनल विरोधी vinculin एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। 3 बार (5 मिनट प्रत्येक समय) के लिए पीबीएस के साथ substrates धो लें।
    5. 200 कमजोर पड़ने: एक 1 पर माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा Fluor 488 बकरी विरोधी माउस आईजीजी के साथ नमूने सेते30 मिनट के लिए आरटी पर पीबीएस में। 3 बार (5 मिनट प्रत्येक समय) के लिए पीबीएस के साथ substrates धो लें।
    6. एफ actin संरचना कल्पना, TRITC आरटी पर 45 मिनट के लिए एक एकाग्रता 50 माइक्रोग्राम / एमएल conjugates के phalloidin के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। 3 बार (5 मिनट प्रत्येक समय) के लिए पीबीएस के साथ substrates धो लें।
    7. छवि कोंफोकल स्कैनिंग लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नमूने (चित्रा 5 ए - 5D)।

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक संस्थागत समीक्षा बोर्ड के दिशा निर्देशों के तहत चार अलग-अलग मरीजों से कई ऊतकों के नमूनों (एन = 12) के लिए कार्यरत है। चित्रा 1 ए सही सेल संस्कृतियों के लिए ऊतक वर्गों प्राप्त कर रहे हैं, जिसमें से सर्जरी के बाद एक प्रतिनिधि कोलोरेक्टल ट्यूमर को दिखाता है। आगे की प्रक्रिया के लिए लामिना हुड के लिए स्थानांतरण के बाद HBSS समाधान में एक ठेठ ऊतक खंड चित्रा 1 बी में दिखाया गया है। पाचन और एकल कक्ष निलंबन में शल्य ऊतक के नमूने के enzymatic पृथक्करण का एक योजनाबद्ध चित्रा 2 में दिखाया गया है।

सफल ऊतक हदबंदी के बाद, पृथक प्राथमिक मानव कोशिकाओं पीए जैल और polystyrene बर्तन पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। चरण विपरीत micrographs (चित्रा 3 ए और 3 बी) सब्सट्रेट कठोरता के एक समारोह के रूप में प्राथमिक मानव पेट के कैंसर और सामान्य कोशिकाओं के प्रतिनिधि आकृति विज्ञान वर्णन। यह स्पष्ट है कि(स्वस्थ और कैंसर दोनों) प्राथमिक बृहदान्त्र कोशिकाओं पीए जैल (चित्रा 3 ए और 3 बी) की तुलना में polystyrene के व्यंजन के बारे में अधिक फैल गया।

ट्रैक्शन assays के रोग एच एंड ई धुंधला (चित्रा -4 ए) से आक्रामक ग्रंथिकर्कटता की पुष्टि के बाद मुलायम 2 किलो पास्कल जैल लेपित ईसीएम (फ़ाइब्रोनेक्टिन) पर प्रदर्शन कर रहे हैं। 4B चित्रा में दिखाया गया है पीए जैल समान रूप से फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ लेपित हैं। तुलना की आसानी के लिए, ट्यूमर और स्वस्थ बृहदान्त्र कोशिकाओं के लिए सभी कर्षण प्रयोगों एक ही समय में किया जाना चाहिए। चित्रा 4C जेल के अंदर एम्बेडेड के nanoscale फ्लोरोसेंट मोतियों की एक स्नैपशॉट को दर्शाता है। विस्थापित और संदर्भ मनका छवियों से, विस्थापन क्षेत्रों ImageJ PIV प्लगइन 21, 22 का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं। 2 किलो पास्कल जेल पर आक्रामक पेट के ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न एक प्रतिनिधि मनका विस्थापन क्षेत्र चित्रा 4D में प्रदर्शित किया जाता है। चित्रा 4E कर्षण stre से पता चलता हैएस एस चित्रा 4D 21, 22 में क्षेत्र के विस्थापन के लिए इसी ImageJ FTTC प्लगइन का उपयोग कर प्राप्त की।

चित्रा 5 मुलायम 2 किलो पास्कल जैल और कठोर polystyrene के substrates पर प्राथमिक मानव पेट के कोशिकाओं के फोकल adhesions युक्त एफ actin और vinculin पता चलता है। कोई एक्टिन फाइबर सॉफ्ट जैल (- 5A2 चित्रा 5A1) पर कम प्रसार कोशिकाओं में मौजूद था। फोकल adhesions युक्त कबरा vinculin सॉफ्ट जैल (- 5B2 चित्रा 5B1) पर मौजूद हैं। इसके विपरीत, प्राथमिक कोशिकाओं अच्छी तरह से फैल आकृति विज्ञान, अच्छी तरह से परिभाषित एक्टिन तनाव फाइबर और कठोर polystyrene के substrates पर असतत लम्बी फोकल adhesions (- 5D आंकड़े 5C) दिखा।

चित्र 1
पेट के लकीर के बाद चित्रा 1 (ए) ट्यूमर। सेल अलगाव के लिए ट्यूमर से (बी) के ऊतक वर्गों। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा पाचन और एकल कक्ष निलंबन में शल्य ऊतक के नमूने के enzymatic हदबंदी 2. योजनाबद्ध। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. सफल प्राथमिक मानव पेट के सेल संस्कृति (कैंसर और सामान्य दोनों) अलग कठोरता जैल पर और polystyrene पर पकवान। चरण विपरीत छवियों Ty दिखाने(ए) ट्यूमर कोशिकाओं और विभिन्न कठोरता substrates पर (बी) सामान्य कोशिकाओं की pical आकृति विज्ञान। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
आक्रामक ग्रंथिकर्कटता की पुष्टि चित्रा 4 (ए) एच एंड ई धुंधला हो जाना। (बी) फ़ाइब्रोनेक्टिन धुंधला जैल समान रूप से ईसीएम अणुओं के साथ लेपित हैं कि पता चलता है। (सी) नेनो मोती प्रत्ययी मार्कर के रूप में जेल के अंदर एम्बेडेड। (डी) 4.1.11.2 के रूप में वर्णित ImageJ में PIV प्लगइन का उपयोग कर नरम पीए जेल पर ट्यूमर सेल द्वारा उत्पन्न प्रतिनिधि विस्थापन क्षेत्र। (ई) ट्रैक्शन तनाव FTTC प्लग के माध्यम से प्राप्त (डी) में क्षेत्र के विस्थापन के लिए इसी मुलायम जेल पर ट्यूमर सेल द्वारा लगाए जाने वाले 4.1.11.3 के रूप में वर्णित ImageJ में है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
मुलायम जेल पर और कड़ी polystyrene के substrates पर एफ actin और vinculin चित्रा 5. Immunofluorescent धुंधला। कोई एक्टिन फाइबर मुलायम 2 किलो पास्कल जैल पर कम प्रसार (ए 1) ट्यूमर सेल या (ए 2) सामान्य कोशिका में मौजूद था। फोकल adhesions युक्त कबरा vinculin सॉफ्ट जैल पर मौजूद हैं (बी 1 - बी 2)। (- सी 2 सी 1) और असतत लम्बी फोकल adhesions (डी 1 - डी 2) कठोर polystyrene के substrates पर इसके विपरीत, प्राथमिक कोशिकाओं अच्छी तरह से फैल आकृति विज्ञान, अच्छी तरह से परिभाषित एक्टिन तनाव फाइबर दिखा।2 / 52532fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सेलुलर कर्षण तनाव हाल ही में मेटास्टैटिक राज्य के 13 में से एक संभावित जैवभौतिक संकेतक के रूप में उभरा है। हालांकि, प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं के साथ कोई प्रयोगात्मक कर्षण डेटा तारीख को साहित्य में मौजूद है। इसके अलावा, विभिन्न कठोरता polyacrylamide जैल पर सीधे संवर्धन पृथक प्राथमिक बृहदान्त्र कोशिकाओं अभी तक रिपोर्ट नहीं है। इसलिए, हम जैल और polystyrene (चित्रा 2) पर एक अनुकूलित प्राथमिक पेट के सेल संस्कृति शर्तों की स्थापना। मुलायम जेल तैयारी के दौरान सेल संस्कृति की सतह के पास फ्लोरोसेंट microbeads encapsulation के विस्थापन क्षेत्र और प्राथमिक मानव कोशिकाओं (चित्रा 4C, 4D और 4E) द्वारा उत्पन्न कर्षण की माप के लिए सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस assays के cytoskeleton संगठन और सब्सट्रेट कठोरता परिवर्तन के रूप में फोकल adhesions (- 5D चित्रा 5A) के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं। अलग है कि कैंसर और सामान्य अमर सेल नोटलाइनें भी फैल एक्टिन तनाव बंडल गठन संवर्धित और बढ़ सब्सट्रेट कठोरता 4, 24-25 के साथ लम्बी फोकल adhesions परिपक्व दिखा।

प्रोटोकॉल आसानी से अलग मानव अंगों या अन्य जानवरों की शल्य चिकित्सा के ऊतकों से प्राथमिक कोशिकाओं के अलगाव के लिए संशोधित / अपनाया जा सकता है। ट्रिप्सिन और collagenase - - हदबंदी एजेंटों में ऊतक के ऊष्मायन समय प्रत्येक आवेदन के लिए अनुभव से अनुकूलित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, मलबे और undissociated ऊतक भागों को दूर करने के लिए फिल्टर आकार निलंबित अवस्था में उम्मीद की अधिकतम सेल आकार (इस प्रोटोकॉल में 40 माइक्रोन) के आधार पर चयन करने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर भी है।

विधि की एक सीमा कुछ नरम जैल प्रतिकूल माप (धारा 4.1) cytometry निम्नलिखित कर्षण को प्रभावित कर सकता है, जो सेल संस्कृति सतह (धारा 3.3) के पास फ्लोरोसेंट मोतियों की लगातार स्थानीयकरण की कमी हो सकती है। यह आसानी से परीक्षण करके उन्हें धोखा दिया जा सकता हैसेल संस्कृति से पहले फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग मनका घनत्व और वितरण के लिए जेल की सतह। नतीजतन, अपेक्षाकृत गैर समरूप मनका वितरण के साथ जैल खारिज किया जा सकता है। एक और दृष्टिकोण सेल संस्कृति की सतह से 17 के पास मोतियों की सटीक स्थानीयकरण अनुमति देता है एक हाल ही में प्रस्तावित विधि का उपयोग करने के लिए है।

सावधानी वे अधिमानतः 45 मिनट के भीतर, प्राप्त कर रहे हैं के रूप में जल्द ही के रूप में शल्य चिकित्सा नमूने प्रसंस्करण शुरू करने के लिए लिया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम अभी तक पर्याप्त सेल व्यवहार्यता को बनाए रखना है, अलगाव उपज प्राप्त करने के लिए trypsin और collagenase समाधान में ऊतक के अधिकतम लोगों तक पहुंचाने के लिए समय है। मुलायम हाइड्रोजेल पर संवर्धन कोशिकाओं से पहले, मनका घनत्व और वितरण फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग होने की पुष्टि करने की जरूरत है। इसके अलावा, एक शून्य बल छवि सेल पूरी तरह से जेल सतह से अलग है कि इस बात की पुष्टि के बाद का अधिग्रहण किया जाना चाहिए।

सारांश में, एक प्रोटोकॉल है कि फिर से वर्णन किया गया हैsults शल्य कैंसर / सामान्य ऊतक के नमूने से एकल कक्षों निलंबन अलग। मुलायम और हार्ड substrates पर उनकी संस्कृति द्वारा पीछा शल्य नमूनों से ही प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं के इस अलगाव के बहाव के विभिन्न जैवभौतिक माप की अनुमति देता है जैसे, AFM के उपयोग करते हुए सेल कठोरता, इंट्रासेल्युलर rheology microinjected कण, सेल प्रवास / गतिशीलता, और पुटिका गतिशीलता विश्लेषण का उपयोग। इन मापों कैंसर रोग का निदान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक के रूप में अच्छी तरह से 26 murine cardiomyocytes की निकासी और संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ प्रस्तुत विधि सीधे mechanobiology अध्ययन के लिए विभिन्न कठोरता सब्सट्रेट पर विभिन्न अंगों की शल्य चिकित्सा के ऊतकों से और संस्कृति के लिए उन्हें प्राथमिक मानव कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
HBSS Life technologies 14175-095
PBS Lonza 17-516F
Trypsin Worthington LS003736
Collagenese Worthington LS004176
3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)  Sigma-Aldrich 281778
Glutaraldehyde Polysciences, Inc. 01201-5
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
N-methylenebisacrylamide (bis) Sigma-Aldrich M1533
HEPES buffer solution Sigma-Aldrich 83264
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
Human fibronectin BD biosciences 354008
Hydrazine hydrate Sigma-Aldrich 18412 Hazardous
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences RT15710
Signal enhancer Life technologies I36933
Monoclonal anti vinculin antibody  Sigma-Aldrich V9131
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life technologies A11001
TRITC phalloidin conjugates  Sigma-Aldrich P1951
0.1 µm fluroscent beads Life technologies F8801
0.25% Trypsin-EDTA Life technologies 25200-056
Materials
12 mm2 glass cover slips Corning 2865-12

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References

  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
  3. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  4. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
  5. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
  6. Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
  7. Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
  8. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  9. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
  10. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
  11. Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
  12. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
  13. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
  14. Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
  15. Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
  16. Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
  17. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
  18. Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  19. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
  21. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
  23. Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
  24. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
  25. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
  26. Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 100 प्राथमिक मानव पेट के ट्यूमर कोशिकाओं शीतल लचीला Substrates कर्षण बल माइक्रोस्कोपी Mechanobiology immunofluorescence माइक्रोस्कोपी सेल यांत्रिकी
सर्जिकल ऊतकों से प्राथमिक मानव पेट के ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव और ट्रैक्शन Cytometry के लिए शीतल लचीला substrates पर उन्हें सीधे संवर्धन
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Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).

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