Abstract
Kanser hücreleri, bir adezyon reseptörlerinin oluşan koordine, hiyerarşik bir mekano-kimyasal sistem ve ilişkili sinyal transdüksiyon zar proteinleri, hücre iskeleti mimarisini, ve moleküler motorlar, 1, 2 ile karmaşık bir şekilde, mekanik sertliği matris yanıt. Mechanosensitivity farklı kanser hücrelerinin in vitro olarak olmayan primer insan kanser hücrelerinin ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri veya murin türetilmiş birincil hücreler, öncelikle incelenmiştir. Bu nedenle, çok az, in vitro olarak, birincil insan kolon kanseri hücrelerinin mechanosensitivity şey bilinmektedir. Burada, optimize edilmiş bir protokol, sağlıklı ve kanserli cerrahi insan doku örnekleri primer insan kolon hücrelerinin izolasyonu açıklayan geliştirilmiştir. İzole kolon hücreleri daha sonra fibronektin (hücre dışı matris tarafından fonksiyonlandırılmış yüzeylerde poliakrilamid hidrojeller ve sert polistiren (~ 3.6 GPa sertlik) (10 kPa sertliği) (2 kPa sertliği), yumuşak ve sert başarıyla kültürebu durumda). Floresan mikro-hücre kültürü yüzeye yakın yumuşak jeller gömülür, ve çekiş tahlil özgür açık erişim yazılımı kullanarak hücresel kasılma stresleri değerlendirmek için yapılır. Buna ek olarak, farklı sertlik yüzeylerde immunofloresan mikroskopi substrat sertlik bir fonksiyonu olarak odak yapışıklıkların içeren birincil hücre morfolojisi, sitoskeleton organizasyon ve vinkülin hakkında yararlı bilgiler sağlar.
Introduction
Mekanik mikro-ortamında, biyo-kimyasal faktörlerin yanı sıra, hücre fonksiyonlarını düzenlemede önemli bir rol oynadığını Son yıllarda giderek daha belirgin hale gelmiştir. Hücreler duyu ve 3-7 (2D kültüründe olduğu gibi) uyulması ya da (3D kültür gibi) çevrili olan substrat sertlik yanıt verebilir. Böyle yaparak, hücreler farklılaşma 3, morfolojisi 4, göç / motilite 5, biyo-fiziksel özelliklerini 6, büyümeyi 7 ve diğer işlemler modüle.
Kanser hücreleri aynı zamanda bir yapışma reseptörlerinin koordine, hiyerarşik mekano kimyasal bileşimini ve ilgili sinyal iletim membran proteinleri, hücre iskeleti mimarisi ve moleküler motorlar 1, 2 kullanarak 2D ve 3D matris sertliği cevap. Örneğin, meme epitel hücreleri (MECs) 150 Pa yüzeylere kültüre zaman sertlik benzer normal asiner parankimi formuSağlıklı meme dokusunun. İlginç bir şekilde, bir tümör stromasında 8 sertliğini taklit katı substratlar (> 5000 Pa) üzerinde kültürlenmiştir, yapısal ve transkripsiyonel hem gelişen tümör diğerlerinden ayıran, arzetmektedir. Buna ek olarak, başka bir deney, meme tümör oluşumu kolajen çapraz bağlama ECM 9 sertleştirme ile birlikte göstermektedir. Son deneyler onlar fizyolojik ilgili sertliği (20-47 kPa) olan 2B yüzeylerde kültürlü, ama (3.6 GPa) yüzeylerde çok sert değil, insan kolon karsinoma (HCT-8) hücreleri fenotip (MLP) gibi metastazı görüntüler olduğunu göstermektedir 10- 12 .Bu hücreler ilk bir şekilde tümör-benzeri hücre kümeleri ve daha sonra çevre başlayarak birbirinden ayırmak. Değişim onlar hücre-hücre ve hücre-ECM yapışma azaltmak ve göçmen olmak, çoğalırlar, meydana (R geçiş E) yuvarlak morfolojik bu epitel gibi. Bu sergilemeyen çok sert polistren yüzeylere HCT-8 hücre kültürlerindemalign özellikleri. Böylece HCT-8 hücre nedeniyle uygun mikro-çevre maruz kaldıkları metastatik hale öne sürülmüştür. Bu deneylerin primer insan kanser hücrelerinin ölümsüzleştirilmiş kanser hücresi çizgileri veya murin türetilmiş birincil hücreler, ile gerçekleştirilmektedir kayda değerdir.
Yeni bir çalışmada, arttırılmış hücre bir gerilim metastatik hücreler 13 .The çalışma poliakrilamid jeller farklı insan kanser hücre çizgileri için çekme kuvveti ölçme içerir için potansiyel biyofiziksel imza olarak kullanılabilir önermektedir. Bu metastatik kanser hücrelerinin her durumda 13 metastatik olmayan hücreler ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek bir gerilim meydana getirebilmektedir bulunmuştur. Ancak, bu sonuçlar direkt olarak fare kaynaklı meme kanseri hücre hatlarında 14 daha önce yayınlanmış bulgularını çelişmektedir. Ayrıca, yeni bir çalışma onların iskelet remodeling pro içinde immortal ve birincil insan hücreleri arasındaki dikkat çekici farklılıkları vurgulamaktadırtein profil ve hücre sağkalım protein ifadesi 15. Bu nedenle, birincil insan kanser hücreleri için çekiş dahil olmak üzere biyo-fiziksel deneyler birçok yeniden önemlidir. Birincil hücreler immortal kanser hücre hatları çekiş trendi özetlemek ister bu soruyu ele alacak.
Burada açıklanan protokol ve yumuşak yüzeylerde (poliakrilamid hidrojeller) yanı sıra ilgili Petri kutularına bunları kültürlenmesi için (sağlıklı ve hem kanserli hem de): Primer insan kolon hücrelerin izolasyonu için optimize edilmiştir. Protokol sindirim ve tek bir hücre süspansiyonu 16 içine cerrahi doku örneğinin sonucu enzimatik ayrılma dayanmaktadır. Bildiğimiz kadarıyla, bu doğrudan sitometri çekiş için gömülü floresan mikro yumuşak hidrojel yüzeylerde izole primer kolon tümörü ve normal hücreleri kültür ilk göstergesidir. Şeffaf jel yüzeyler de immün izin verir. Bu deney ortaya F-aktin organizasyon ve farklılıklarYüzey sertliği değişiklikleri gibi birincil insan kolon hücrelerinde fokal yapışıklıklar. Bu hücre kültürü platformu kanser prognoz maddeleri için parametre olarak hücre sertliği ve çekiş olarak birincil insan hücrelerinin çeşitli biyofiziksel özelliklerini keşfetmek olasılığını açılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan protokol UIUC insan araştırma etik komitesinin kuralları izler.
1. Toplama ve Cerrahi Doku Örneği sindirimi
- Sağ kolon rezeksiyonu (Şekil 1A ve 1B) sonra tümör dokusu örneği toplayın. Hem de bitişik sağlıklı sitesinden doku toplayın.
- 12 mi HBSS çözeltisi ihtiva eden 15 ml'lik bir şişeye, hemen doku aktarın. Yalıtılmış bir köpük kutu içinde buz üzerinde şişe tutun.
- 45 dakika içinde daha fazla işlem için bir doku kültürü başlık doku ihtiva eden şişe taşıma. Kaput içinde bir buz bloğu üzerinde şişe tutun.
- Bir pipet kullanılarak HBSS çözeltisi 6-7 ml ihtiva eden bir 6 yuvalı plaka içine verilen doku dökün.
Not: oyuk başına doku miktarı, bu durulama adımında kritik öneme sahip değildir. - Bir buz bloğu üzerine 6 plaka tutun. İki kez HBSS çözeltisi içinde doku durulayın.
- Steril SCI'larının ayrılmış bölüme temiz doku Kessor. Küçük bölümlere kıyma doku steril bir neşter bıçağı ile boyutunda 1-2 mm 3 daha büyük.
- Doku transfer etmeden önce (% 0.1 tripsin solüsyonu 1 ml ihtiva eden), etiketlenmiş bir% 0.1 tripsin şişe tartılır. Bir pipet ile% 0.1 tripsin viallerin her birine ~ 20 mg doku aktarın.
- Tripsin daha seyreltme önlemek için tripsin şişenin içine HBSS transferini en aza indirmek için deneyin.
- Doku transferinden sonra tripsin şişeleri tartın; doku kitlesi olarak farkı belgelemek.
- ~ 20 mg doku ve 24 yuvalı plakanın her oyuğuna tripsin 1 ml dökün.
- 16-20 saat boyunca 4 ° C'de buzdolabında çalkalayıcı üzerinde 24 oyuklu plaka koyun. Bu bekleme döneminde veya daha önceki bir zamanda, poliakrilamid jel malzemenin hazırlanması ve 3. bölümünde açıklandığı gibi ECM proteinleri ile işlerlik.
2. Enzimatik tek bir hücre süspansiyonu içine doku numunesinin aynşması ile ECM Fonksiyonel Elastik substrat üzerinde kültürlenmesi İzole hücreleres ve Sert polistiren Yemekleri
- Çalkalayıcı üzerinde 4 ° C 'de de tripsin inkübasyon 16-20 saat sonra, bir pipet kullanılarak, (tam büyüme ortamı 2-3 ml ihtiva eden), 4 ° C tam büyüme ortamı şişeye 4 ° C tripsin doku aktarın. Büyüme ortamı içine tripsin minimal transferini sağlamak.
Not: tam büyüme ortamı formülasyonu aşağıdaki gibidir:% 10 ve penisilin-streptomisin toplam çözeltinin% 1 bir son konsantrasyona kadar at serumu ile takviye edilmiş RPMI 1640 taban ortamı. - 12-15 dakika boyunca 37 ° C'de sıcak su banyosu içinde ortam flakon içeren doku yerleştirin.
- Bir pipet kullanarak HBSS çözeltisi içeren 15 ml flakon doku aktarın, hafifçe sallayın.
- 2.3 tekrarlayın.
- HBSS çözeltisi ve 1 ml solüsyon içeren flakon (HBSS içinde) transferi% 0.1 kollajenaz çözüm doku çıkarın. Nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 45 ° C'de 37 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 ortamında inkübe edin. Bekleme süresi, sıcak growt sırasında15 ml h ortam su banyosu içinde 37 ° C 'de şişesine yerleştirilir.
- Pipet minimize kollajenaz taşınmadan kaynaklanan içine tüm doku parçaları dışarı çekin. Önceden ısıtılmış kültür ortamı şişeleri içine sadece doku parçaları çıkarın.
- 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna 40 mikron iyi uç filtre yerleştirin. 1 ml hücre kültür ortamı ile filtreyi nemlendirin.
- Doku tamamen ayrışmış kadar 10 ml'lik bir cam pipet ile birkaç kez ortam içinde öğütün dokusudur.
- Şişe tabanına mümkün olduğunca yakın pipet koruyun.
- Enkaz ve ayrışmamış parçalarını kaldırmak için filtrenin üzerine çözüm yatırın.
- Santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 x g'de medya hücre süspansiyonu filtre edildi.
- Sonradan Süpernatantı ve 2 ml taze kültür ortamı ile hücre pelletini.
- Hemasitometre (gerekirse) kullanarak hücreleri saymak. Tohum ekstrasellüler matriks (ECM) Fonksiyonlu jeller ve istenilen konsantrasyonda polistiren yemekleri birincil hücreler izole edilmiştir.
3. Hazırlama ve Farklı Sertlik Poliakrilamid (PA) jeller ve Polistiren Yüzeyler işlevselleştirilmesi
Not: Bölüm 3 görsel gösteri için izleyiciler / okuyucular Visualized Experiments son Journal (vallahi) 17 nci adlandırılır.
- Benimseyen yayınlanmış protokoller 18, 19, 12 mm 2 cam kapak hidrojelin kovalent sağlamak için kimyasal olarak aktive fişleri.
- İlk olarak, tedavi cam kapak RT'de 7 dakika 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) ile sığar.
- DI su ile durulanmıştır tamamen ATS çıkarın ve tedavi kapağı (70% glutaraldehit stok çözeltisinden PBS içinde seyreltilmiş)% 0.5'lik glütaraldehid, 30 dakika boyunca solüsyon ile kayar.
- / Hac akrilamid çözeltisi ve% 0.05, N, 10 mM HEPES-tamponlu salin 20 N '-methylenebisacrylamide (bis) çözeltisine% 5 w karıştırılarak 2 kPa jel çözüm elde edilir. / V akrilamid ve 0.13 w% 8 kullanınN% 10 kPa jeli 20, 10 mM HEPES-tamponlu tuzlu su içinde N '-methylenebisacrylamide (bis) çözeltisi eklendi.
- 200 amonyum persülfat (% 10 a / h) ile 1: Her iki durumda da, 1 kullanmak 2.000 N, N, N ', N', sırasıyla, polimerizasyon işlemi için başlatma maddesi ve katalizör gibi tetrametiletilendiamin (TEMED).
- Ayrıca, mutemet belirteçler 21, 22 olarak 2 kPa jel çözeltisine 100 ul floresan boncuk ekleyin.
- 20 ul 12 mm 2 aktive cam kapak slip üzerindeki pre-polimer PA jel çözümü bir damla yatırın. Damla başka 12 mm 2 normal cam kapak kayma yerleştirin. Düşmesi, kılcallık kapak fişleri arasında yayılır emin olun. 2 kPa jeller boncuk çoğu hücre kültürü yüzeyine yakın gelecek sağlamak için sandviç ters çevirin.
- Oda sıcaklığında, 45 dakika süre ile PA jel Cure.
- Tek bir kenar jilet kullanarak üst kapak kayma soyulabilir.
Not: soyulması sırasında dekolmanı, bir kenarından devamsandviç. Jel aktif cam slayt yapışık kalır. - Kullanmadan önce, PBS çözeltisi içinde jeller saklayın.
- 50 ug / ml yandaki yöntemlerin 23 arasında bir konsantrasyonda PA jeller ECM moleküllerinin insan fibronektin cam işlevselleştirilmesi.
- Kısaca, 2 ml saf hidrazin hidrat O / N ile yüzeylerde kuluçkaya yatmaktadır.
- Hidrazin hidrat çıkarın ve DI su ile iyice durulayın yüzeylerde.
- 30 dakika için% 5 asetik asit ile alt-tabakaların yıkayın.
- Asetik asit çıkarın ve DI su ile iyice durulayın yüzeylerde.
- 30 dakika boyunca DI suya batırılır substratlar tutun.
- 50 ug / ml'lik bir konsantrasyonda 35 dakika süreyle oksitlenmiştir fibronektin ile alt-tabakaların inkübe edin.
- 10 dakika boyunca düşük devirde çalkalayıcı üzerinde PBS ile yüzeylerde durulayın.
- Hücrelerin kaplama önce 30 dakika boyunca 2-3 ml kültür ortamı içinde 37 ° C 'de, tüm alt-tabakaların inkübe edin.
Not: Plaka hücreleri seyrek populate içinded şekilde (1,000-3,000 hücre / cm 2). Her jel kaplı cam kayma 35 mm petri içerdiği gerekmektedir. Hücreler herhangi mikroskobu (en azından O / N) önce tamamen uyması izin verin.
4. Çekiş Kuvvet Mikroskobu ve İmmünofloresan Mikroskopi Tahliller
- Traksiyon Kuvvet Mikroskobu Deneyi
- 10 dakika süre ile bir su banyosunda 37 ° C 'de sıcak bir% 0.25 tripsin-EDTA /% 10 SDS çözeltisi çekiş deneyleri başlamadan önce.
- Bir defada hücre kültürü inkübatör tek jel çıkarın ve floresan ters mikroskop sahne (32X büyütme) üzerine yerleştirin.
- Görüş alanında tek bir hücre bulun. Petri kabı kapağını çıkarın.
- Hücrenin bir faz kontrast görüntü (örneğin Şekil 3) alın.
- Floresans ve uygun filtreyi seçmek için görüntüleme moduna geçiş. Bu süre içinde mikroskop sahne veya örnek hareket ettirmeyin.
- Floresan boncuk displac bir görüntü alınHücresel çekiş (Şekil 4C) tarafından ed.
- Jelden hücre ayırmak için Petri kabı 1 ml tripsin / SDS çözeltisi ekleyin. Bu süre içinde mikroskop sahne veya örnek hareket ettirmeyin. Ayrıca, jelden tam olarak çıkarılmasının sağlanması için hücrenin bir kontrol resmi alır.
- Hücre çıkarıldıktan sonra boncuklar referans (sıfır güç) görüntü almak.
- Diğer tüm jeller için adımları yineleyin 4.1.2-4.1.8.
- Her iki durum için adım 4.1.6 ve 4.1.8 elde iki görüntüleri ImageJ kullanarak bir görüntü yığını olun. Yığını Yığınları → Görüntüler → Görüntü: Görüntü yığını oluşturmak için görüntüleri açtıktan sonra ImageJ aşağıdaki komut dizisi kullanın.
- . Deplasman alanını ve çekiş elde etmek için, yayınlanmış yöntemlere 21, 22 aşağıdaki ImageJ eklentileri kullanabilirsiniz alttaki linki kullanarak bu eklentileri kodları ve ayrıntılı öğreticiler edinin: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
- 'Şablon Eşleştirme' eklentisi kullanarak yığının görüntüleri hizalayın. → Tamam Yığın Eklentiler → Şablon Eşleştirme Hizala Dilimleri →: adım 4.1.10 oluşturulan görüntü yığını açtıktan sonra ImageJ komutların sırası aşağıdaki Kullanımı. Dolayısıyla görüntü yığını kaydedin. Aşağıdaki adımlarda, bu yeni görüntü yığını kullanın.
- PIV (partikül görüntü velosimetri) eklentisi (Şekil 4D) kullanarak değiştirme alanını edinin. Adım 4.1.11.1 kaydedilen görüntü yığını açtıktan sonra komut dizisi aşağıdaki Kullanımı: Eklentiler → PIV → iteratif PIV (Temel) → → Tamam Tamam → bu PIV ve çıkış kabul edin. Orijinal görüntü yığınında aynı dizine PIV çıkışını kaydedin. Bir sonraki adımda girdi olarak kullanın.
- Nihayet FTTC çekiş haritası (Şekil 4E) elde etmek için eklenti (Fourier sitometri çekiş dönüşümü) kullanın. Komutların kullanımı aşağıdaki dizisi: Eklentiler → FTTC → Insert malzeme özellikleri, yani Young modülü ve PA jel → OK → Poisson oranı → Tamam adımda 4.1.11.2 kaydedilen PIV çıktı dosyasını seçin. Kaydet FTTC görüntü yığını ve PIV çıktı aynı dizinde sonuçlanır.
- İmmünofloresan Mikroskopi Tahliller
- Laminer kaput boyanmış olan substratlar alın ve kültür ortamı çıkarın.
- PBS ile durulayın ve alt tabakaları oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile hücrelerin tespit.
- 3 kez (her biri 5 dakika süre) boyunca PBS ile alt-tabakaların yıkayın. Sonuç olarak, 30 dakika boyunca 500 ul sinyal arttırıcı ile alt-tabakaların inkübe edildi ve PBS ile durulayın.
- Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca PBS içinde 250 seyreltme: 1 monoklonal anti-vinkulin antikor ile inkübe hücreleri. 3 kez (her biri 5 dakika süre) boyunca PBS ile alt-tabakaların yıkayın.
- 200 seyreltme: 1 ikincil antikor Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG'si ile inkübe edin30 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde. 3 kez (her biri 5 dakika süre) boyunca PBS ile alt-tabakaların yıkayın.
- F-aktin yapı görselleştirmek için, TRITC oda sıcaklığında 45 dakika boyunca bir konsantrasyon 50 ug / ml'de konjugatlar falloidinle hücreleri inkübe edin. 3 kez (her biri 5 dakika süre) boyunca PBS ile alt-tabakaların yıkayın.
- Resim konfokal tarama laser mikroskop kullanılarak numuneleri (Şekil 5A - 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokol başarıyla kurumsal inceleme kurulu kuralları uyarınca dört farklı hastalarda birden fazla doku örnekleri (n = 12) için kullanılır. Şekil 1A sağ hücre kültürleri için doku kesitleri elde edildiği ameliyat sonrası temsili kolorektal tümör göstermektedir. Daha sonraki işlemler için laminer başlık transfer edildikten sonra HBSS çözeltisi içinde tipik bir doku kesiti Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Sindirim ve tek bir hücre süspansiyonu içine cerrahi doku numunesi enzimatik ayrışma bir şeması, Şekil 2 'de gösterilmiştir.
Başarılı doku ayrışma sonrasında izole primer insan hücreleri PA jeller ve polistiren yemekleri numaralı seribaşı. Faz kontrast mikrograflan (Şekil 3A ve 3B), alt-tabaka sertliği bir fonksiyonu olarak, birincil insan kolon kanseri ve normal hücrelerin temsili morfolojisini göstermektedir. Bu açıktır(sağlıklı ve kanserli hem de) Birincil kolon hücreleri PA jeller (Şekil 3A ve 3B) ile karşılaştırıldığında polistiren yemekler fazla yayıldı.
Çekiş deneyleri patolojik H & E boyama (Şekil 4A) den invaziv adenokarsinom onayından sonra yumuşak 2 kPa jeller kaplı ECM (fibronektin) yapılmaktadır. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, PA jeller eşit fibronektin ile kaplanır. Karşılaştırılmasında kolaylık sağlamak üzere, tümör ve sağlıklı kolon hücreleri için tüm çekiş deneyler aynı zamanda yapılmalıdır. Şekil 4C jel içine gömülü nano ölçekli flüoresan boncuklar bir görüntüsünü gösterir. Yerinden ve referans boncuk görüntüleri, deplasman alanları ImageJ PIV eklentisi 21, 22 kullanılarak elde edilir. 2 kPa jel invaziv kolon tümör hücreleri tarafından üretilen bir temsilci boncuk deplasman alan Şekil 4D görüntülenir. Şekil 4E çekiş stre gösterirss Şekil 4D 21, 22 alan değiştirmesine karşılık gelen ImageJ FTTC eklentisi kullanarak elde edilmiştir.
Şekil 5 yumuşak 2 kPa jeller ve sert polistren yüzeylere birincil insan kolon hücrelerinin fokal yapışıklıkları içeren F-aktin ve vinkulin gösterir. Hiçbir aktin fiber yumuşak jeller (- 5A2 Şekil 5A1) daha az yayılmış hücreleri mevcuttu. Odak yapışıklıkların içeren noktasal vinkulin yumuşak jeller (- 5B2 Şekil 5B1) bulunurlar. Tersine, birincil hücreler de yayılmış morfoloji, iyi tanımlanmış aktin stres lifleri ve sert polistren yüzeylere ayrı uzatılmış odak yapışıklıklar (- 5D Şekiller 5C) göstermektedir.
Kolon rezeksiyonu sonrası Şekil 1. (A) Tümör. Hücre izolasyonu için tümörden (B) Doku kesitleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil sindirim ve tek hücre süspansiyonu içine cerrahi doku örneğinin enzimatik ayrılma 2. şematik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. başarılı primer insan kolon hücre kültürü (kanser hem normal) farklı gerilme jelleri üzerinde ve polistiren bulaşık. Faz kontrast görüntüleri ty göstermektedir(A) Tümör hücreleri ve farklı sertlik yüzeylerde (B) Normal hücrelerin Pical morfolojisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Invaziv adenokarsinom teyit Şekil 4. (A) H & E boyama. (B) Fibronektin boyama jeller eşit ECM molekülleri ile kaplı olduğunu ortaya koymaktadır. (C) Nano boncuk mütevelli belirteç olarak jel içinde gömülü. (D) 4.1.11.2 açıklandığı gibi ImageJ PIV eklentisi kullanarak yumuşak PA jel üzerinde tümör hücresi tarafından oluşturulan Temsilci deplasman alanı. (E) Çekme gerilmesi FTTC fiş yoluyla elde edilen (D) alanı değiştirmesine karşılık gelen yumuşak jel üzerinde tümör hücresi tarafından uygulanan 4.1.11.3 açıklandığı gibi ImageJ içinde. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yumuşak bir jel ve sert polistren substratlar F-aktin ve vinkülin Şekil 5. immünofloresan boyama. Resim aktin lif oldukça yumuşak 2 kPa jelleri üzerinde daha az yayılır (A1), tümör hücresi ya da (A2) normal hücre mevcuttu. Odak yapışıklıkların içeren noktasal vinkulin yumuşak jeller üzerinde mevcut (B1 - B2). (- C2 C1) ve ayrık uzatılmış odak yapışıklıklar (D1 - D2) sert polistren yüzeylere Tersine, birincil hücreler de yayılmış morfoloji, iyi tanımlanmış aktin stres lifleri göstermektedir.2 / 52532fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücresel çekiş stres geçenlerde metastatik devletinin 13 potansiyel biyofiziksel göstergesi olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, primer tümör hücreleri ile deneysel çekiş verileri güncel literatürde bulunmaktadır. Ayrıca, farklı sertlik poliakrilamid jeller doğrudan kültüre izole primer kolon hücreleri henüz bildirilmemiştir. Dolayısıyla, jeller ve polistiren (Şekil 2) bir optimize edilmiş primer kolon hücre kültürü şartlarını da belirlemektedir. Yumuşak jel hazırlanması sırasında hücre kültürü yüzeye yakın Floresan mikroboncuklar kapsülleme deplasman alan ve birincil insan hücrelerinin (Şekil 4C, 4D ve 4E) tarafından üretilen çekiş ölçüm sağlar. Buna ek olarak, immunofloresan deneyleri sitoskeleton organizasyon ve alt tabaka sertlik değişiklikleri gibi fokal yapışıklıklar (- 5D Şekil 5A) ile ilgili önemli bilgiler sağlayabilir. Farklı kanser ve normal ölümsüzleşmiş hücreyi Nothatları da yayılan, aktin stres paket oluşumunu artar ve artan substrat sertlik 4 24-25 ile uzun odak yapışıklıkların olgun göstermektedir.
protokolü kolay değişik insan organları ya da diğer hayvanların cerrahi dokulardan primer hücrelerin izolasyonu için modifiye / benimsenebilir. Tripsin ve kolajenaz - - ayrışma maddeleri doku inkübasyon süresi, her bir uygulama için deneysel olarak optimize edilmesi gerekmektedir. Buna ek olarak, enkaz ve ayrışmamış doku parçalarının çıkarılması için filtre boyutu askıya alma durumunda beklenen maksimum hücre boyutu (Bu protokol 40 mikron) dayalı seçmeniz önemli bir parametre de olduğunu.
Yöntemin bir sınırlaması birkaç yumuşak jeller olumsuz ölçümlerin (Bölüm 4.1) sitometri aşağıdaki çekiş etkileyebilir hücre kültürü yüzey (Kısım 3.3) yakın floresan boncuk tutarlı lokalizasyonu yoksun olmasıdır. Bu kolayca inceleyerek atlatılabilmişlerdirHücre kültürü önce floresan mikroskopi kullanılarak boncuk yoğunluğu ve dağıtım için jel yüzey. Sonuç olarak, nispeten homojen olmayan boncuk dağılımına sahip jeller çıkarılabilir. Bir başka yaklaşım hücre kültürü yüzeyine 17 yakın boncuk kesin lokalizasyon izin veren yeni önerilen yöntem kullanmaktır.
Dikkat tercihen 45 dakika içinde, alınan en kısa sürede, cerrahi örnekleri işleme başlamak için önlem alınmalıdır. protokolünde çok önemli bir adımdır henüz yeterli hücre canlılığını muhafaza izolasyon verimi elde etmek için Tripsin ve kolajenaz solüsyon içerisinde bulunan dokunun optimum maruz zamandır. Yumuşak hidrojeller üzerinde hücreleri kültür önce, boncuk yoğunluk ve dağılım floresan mikroskopi kullanılarak teyit edilmesi gerekmektedir. Ayrıca, boş kuvvet görüntü hücresi tamamen jel yüzeyinde kopuk olduğunu onayladıktan sonra edinilen gerekiyor.
Özet olarak, bir protokol bu yeniden açıklanansults cerrahi kanserli / normal doku örneğinden tek hücre süspansiyonu ayrışmış. Yumuşak ve sert yüzeylerde kendi kültür ve ardından cerrahi örneklerden tek birincil tümör hücrelerinin Bu izolasyon, çeşitli aşağı biyofizik ölçümler sağlar, örneğin, AFM kullanılarak hücre sertliği, hücre içi reoloji microinjected parçacıklar, hücre göçü / motilite ve vezikül dinamikleri analizi kullanılarak. Bu ölçümler kanseri prognoz için kullanılabilmektedir. protokol başarıyla yanı sıra 26 kemirgen kardiyomiyositlerinin çıkarma ve kültürü için kullanılır olmuştur. Burada sunulan yöntem ile doğrudan mechanobiology çalışmaları için farklı sertlik alt-tabaka üzerinde çeşitli organların ameliyat dokularından ve kültür için onları primer insan hücreleri izole etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N-methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 | |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
- Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
- Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
- Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
