Abstract
Es gibt viele verschiedene Tiermodelle zum Untersuchen der Pathogenese von menschlichen entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), die jeweils ihre eigenen Vor- und Nachteile vorhanden. Wir beschreiben hier eine experimentelle Colitis-Modell, das durch adoptiven Transfer von syngenen Milz CD4 + CD45RB hoch -T-Zellen in T-und B-Zell-defizienten Mäusen Empfänger eingeleitet wird. Die CD4 + CD45RB hoch T-Zellpopulation, die größtenteils aus naiven Effektorzellen induzieren kann chronische Darmentzündung, sehr ähnlich wichtige Aspekte der menschlichen IBD. Dieses Verfahren kann manipuliert werden, um Aspekte der Krankheit Beginn und Fortschreiten zu untersuchen. Zusätzlich kann es für die Funktion der angeborenen, adaptive und regulatorische Immunzellpopulationen, und die Rolle von Umweltfaktoren, das heißt, die Mikroflora im Darmentzündung zu untersuchen. In diesem Artikel erläutern wir die Methode zur Induzierung ulcerosa mit einer Schritt-für-Schritt-Protokoll. Diese includes eine Video-Demonstration der wichtigsten technischen Aspekte erforderlich, um diese Mausmodell der experimentellen Kolitis zu Forschungszwecken erfolgreich zu entwickeln.
Protocol
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Tier Protokolle werden von und in Übereinstimmung mit Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Vorschriften und der National Research Council Handbuch für die Pflege und Verwendung von Labortieren zugelassen. Spendermäusen kann entweder männlich oder weiblich ist, aber Empfängermäuse sollte männlich. Wenn weibliche Empfänger zu verwenden sind, müssen die Spendermäuse female 5 sein. Pflegen Kolonien regelmäßig, unsteril Betten und nicht angesäuerten Wasser mit, da diese die Darmflora auswirken, und damit die Colitis Phänotyp der Mäuse 5,6.
1. Versuchsvorbereitung
- Verwenden eiskalte Medien und Puffer. Halten Zellen auf Eis während des Experimentes.
- Führen Sie das Experiment in sterile Biohazard Haube mit steriler Technik.
2. Isolierung von Milz-T-Zellen
- Einschläfern Spendermaus / Mäuse in CO 2 Kammer durch zervikale Dislocatio gefolgtn. Spray Abdomen mit 70% Ethanol.
- Machen Sie einen horizontalen Schnitt im Bauch und abziehen Haut Bauchfell aus. Halten Bauchfell entfernt von der inneren Organe mit der Zange und einen Einschnitt in der linken Bauchfell zu entlarven und die Milz herausschneiden.
- Legen Sie die Milz in 10 ml Komplett Medien in einer Petrischale. Entfernen und entsorgen Sie überschüssiges Gewebe von Milz.
- Verwenden Sie 2 sterilisiert Glasobjektträger zu zerkleinern und necken neben der Milz in Einzelzellsuspension. Filterzellensuspension durch ein 70 um Sieb in einem 50 ml konischen Röhrchen und spülen Sieb mit 5 ml Vollmedium. Platzieren Sie bis zu 5 Milz in einem 50 ml konischen Röhrchen.
- Zentrifuge Zellen bei 450 g für 7 min. Überstand verwerfen durch Abgießen oder durch Vakuumsauger in Abfallbehälter geben.
- Vorsichtig resuspendieren Zellen in 5 ml pro Milz Lysispuffer an Erythrozyten für 10 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Gleiches Volumen Vollmedium (5 ml pro Milz) zu dem Rohr.
- Vorsichtig in 10 ml Labeling Buffer resuspendieren Zellen.
- Zählen von Zellen durch Trypanblau-Ausschluss.
- Entfernen Sie 20 ul Zellsuspension und fügen Sie 180 ul Trypanblau auf ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und gut mischen. Nach 5 Minuten, fügen Sie 10 ul markierte Zellen zu Hämozytometer und zählen nicht-blauen Zellen unter dem Mikroskop. Ermittlung der Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen. Entsorgen Sie Zell / Trypanblau-Mix.
- Zentrifuge Zellen in 10 ml Markierungspuffer bei 450 × g für 7 min. Überstand verwerfen durch Abgießen oder durch Vakuumsauger in Abfallbehälter geben.
3. Anreicherung von CD4 + T-Zellen
Hinweis: Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für bestimmte Produkte in diesem Abschnitt verwendet.
- Vorsichtig resuspendieren Zellen zu einer Einzelzell-Suspension von 20 x 10 6 Zellen / ml in kaltem Etikettening Buffer.
- Mit 5 & mgr; l pro 1 × 10 6 Zellen von biotinyliertem CD4 T-Zell-Anreicherung Antikörper. Inkubieren Zellen auf Eis für 15 min.
- Fügen 10x Volumen Labeling Buffer. Zentrifuge Zellen bei 450 · g für 7 min. Sorgfältig absaugen all des Überstandes mit Vakuumsauger in Abfallbehälter geben.
- Gründlich vortexen Streptavidin-konjugierten magnetischen Partikeln. Mit 5 ul der Teilchen pro 1 x 10 6 Zellen.
- Mischen Sie gründlich, aber vorsichtig. Halten Gemisch bei 6-12 ° C für 30 min.
- Hinzufügen Markierungspuffer auf eine Konzentration von 20-80 x 10 6 Zellen / ml. Übertragung von bis zu 1,0 ml pro 12 x 75 mm Rund Reagenzglas markierten Zellen (als "positive-Bruch Rohr" bezeichnet).
- Platzieren Sie jede positive Fraktion Rohr auf Magneten für 6-8 min.
- Mit den positiven Fraktion Rohre noch auf den Magneten, Überstand vorsichtig Transfer vom positiven Bruchrohr mit Glas Pasteur-Pipette in ein neues steriles 50 ml konischen Röhrchen (referred als "angereicherte Fraktion"). Diese angereicherte Fraktion enthält CD4 + T-Zellen. Achten Sie darauf, um die markierten Zellen mit dem Magneten angezogen zu stören.
- Die Zellen in der positiven Fraktion Rohre in dem gleichen Volumen des Markierungspuffer durch Auf- und Abpipettieren kräftig nach links, wie in Schritt 3.6. Zeigen positive Fraktion Rohr wieder auf Magneten für 6-8 min.
- Mit positiven Bruchrohre noch auf den Magneten, sorgfältig überStand (angereicherte Fraktion, CD4 +) von positiv-Bruchrohr mit Glaspasteurpipette auf 50 ml ohne Unterbrechung Zellen Magneten befestigt sterile konische Röhrchen aus Schritt 3.8.
- Die Schritte 3,9-3,10 um die Ausbeute an CD4 + T-Zellen erhalten erhöhen. Weiter Protokoll mit angereicherten Fraktion (CD4 + Zellen).
4. Beschriften und Sortieren von Zellen 7
- Zentrifuge angereicherten Zellen bei 450 g für 7 min. Überstand verwerfen durch Abgießen oder Vakuum SUCTIonen in die Abfallbehälter.
- Zellen in 1 ml Markierungspuffer. Entfernen Aliquot von Zellen zu zählen und um die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluss, wie in Schritt 2.9 zu beurteilen.
- Hinzufügen eines Volumens von Markierungspuffer bis 10 x 10 6 Zellen / ml; Wenn Zellen bereits <10 x 10 6, Zentrifuge bei 450 · g für 7 min, verwerfen Stand durch Abgießen oder Vakuumansaugung in den Abfallbehälter und fügen Volumen Markierungspuffer bis 10 x 10 6 Zellen / ml.
- Getrennte Teilmengen von etwa 5-10 x 10 5 Zellen je Set für ungefärbte, Isotyp-gefärbt und einzelne befleckten Kontrollzellen in Mikrozentrifugenröhrchen.
- Mit 5 & mgr; g / ml CD4-FITC und 1 ug / ml CD45RB-PE an Zellen. Hinzufügen Isotypkontrolle Flecken und einzelne Flecken in der gleichen Konzentration zu Aliquots in Mikrozentrifugenröhrchen eignen. Gut mischen, aber sanft und Inkubation auf Eis vor Licht für 30 Minuten geschützt.
- Fügen 10x Volumen Labeling Buffer, um Zellen und Steuers. Zentrifuge 450 g für 7 min. Überstand verwerfen durch Vakuumansaugung in Abfallbehälter geben.
- Resuspendieren in Markierungspuffer zu Volumen in Schritt 4.5. Zentrifuge 450 g für 7 min. Überstand verwerfen durch Vakuumansaugung in Abfallbehälter geben.
- Resuspendieren in Markierungspuffer auf 10 x 10 6 Zellen / ml. Pass Zellen durch 70 & mgr; m Sieb in FACS-Röhrchen. Halten Sie auf dem Eis vor Licht geschützt, bis sie zur FACS.
- Einzurichten und zu bestimmen, eine angemessene Entschädigung für die Zellsortierer mit ungefärbten Zellen und Single-gefärbten Kontrollen.
- Ausschließen nonviable Zellen mit Vorwärts- und Seitenstreuung Gating (1A). Up Gating für CD4 + und CD45RB + -Zellen mit Isotyp-gefärbten Bedienelemente ein. Gate-Zellen auf CD4 + -Population.
- Sortieren CD4 + Zellen in CD45RB hoch und niedrig CD45RB Populationen mit einem einfachen Histogramm für PE-gefärbten Zellen in Röhrchen mit 2 ml Komplett Medien. Die CD45RB hoch + CD45RB + -Zellen (CD45RB hoch), und die CD45RB niedrig Bevölkerung ist die untersten 20% der CD4 + CD45RB + -Zellen (CD45RB niedrig; 1B).
Abbildung 1: Repräsentative Durchflusszytometrie Plots von CD4 + CD45RB T-Zell-Populationen während der FACS-Analyse (A - C) FITC CD4- und PE CD45RB-gefärbten Splenozyten aus Spender C57BL / 6-Mäuse wurden durch FACS sortiert in CD4 + CD45RB hoch und CD4 +. CD45RB geringe T-Zell-Populationen. (A) Doublet Ereignisse auf der vorderen Streudiagramm ausgeschlossen. (B) Lymphozyten wurden in Vorwärts- und Seitenstreudiagramm gated. (C) CD4 + (D) CD4 + CD45RB + T-Zellen wurden auf einer PE gegen Events Histogramm aufgetragen. CD4 + CD45RB niedrigen Zellen wurden als die niedrigste 20% der CD45RB + Zellen sein. CD4 + CD45RB hoch Zellen wurden als die höchste 40% CD45RB + -Zellen bestimmt.
- Führen Sie ein Aliquot jeder Zellpopulation auf dem FACS-Maschine, um die Reinheit der Bevölkerung zu bewerten.
- Zentrifuge sortierten Zellen bei 450 g für 7 min. Resuspendieren in 1 ml PBS. Entfernen Aliquot von Zellen zu zählen und um die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluss, wie in Schritt 2.9 zu beurteilen.
5. Die Injektion von Zellen in Empfänger
- Resuspendieren sortierten Zellen auf 4 x 10 6 Zellen / ml (CD45RB hoch) oder 2 x 10 6 Zellen / ml (CD45RB niedrig) in PBS.
- Übertragen Sie 100 ul von CD45RB hoch Zellen pro Empfänger zu neuen sterilen Röhrchen. Geben Sie 100 ul PBS proEmpfänger dieser Röhre. So ist die Gesamtinjektionsmenge pro Tier 200 ul und Gesamtbetrag der Zellen pro Empfänger 4 x 10 5 CD4 + CD45RB hoch naiven T-Zellen.
- Wenn Versuchsgruppe, die regulatorischen T-Zellen erwünscht ist, dann 100 ul der CD45RB hoch Zellen pro Empfänger zu neuen sterilen Röhrchen. 100 l CD45RB niedrigen Zellen pro Empfänger auf die gleiche Röhre. Gesamtinjektionsmenge pro Tier ist 200 ul; Verhältnis von CD45RB hoch: CD45RB niedrigen Zellen ist 2: 1.
- Injizieren Sie 100 ul von CD45RB hoch oder CD45RB hoch / niedrig CD45RB CD4 + Zellen intraperitoneal in der rechten und linken Seite des Bauches (insgesamt 200 ul) jedes Empfängers.
6. Überwachung der Krankheitsprogression in Empfängertiere
- Um den klinischen Zustand der Empfängertiere zu bewerten, weisen Gesamt klinischen Scores für das folgende parameters 8 am Tag der Injektion, danach wöchentlich und bei der Opferung:
- Bestimmen Sie verschwenden durch Messung Gewichtsverlust: 0 - keine Gewichtsabnahme; 1 - 0,1 bis 10% Verlust der ursprünglichen Körpergewichts; 2 - mehr als 10% Verlust der ursprünglichen Körpergewichts (Abbildung 2A).
Abbildung 2: Klinische und pathologische Anzeichen einer Entzündung nach der Übertragung von Wildtyp-CD4 + CD45RB hoch -T-Zellen in Rag1 auftreten - / - und NRDKO Empfängermäuse 11 (A) NRDKO Empfänger verloren im Durchschnitt 10% ihres ursprünglichen Körpergewicht um 5. Wochen nach der Übertragung, während Rag1- / - Empfänger nicht klinischen Anzeichen einer Krankheit aufweisen, zu diesem Zeitpunkt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert Prozentsatz der anfänglichen Körpergewicht für die Kohorte ± SEM. ** P <0.005. (B) Einige Mäuse entwickelten eine schwere Darmentzündung, wie durch die Anwesenheit von Rektumprolaps demonstriert. Dies ist ein repräsentatives Bild der Darmvorfall in einem NRDKO Empfängermaus. (C) Stark, Doppelpunkte sowohl Rag1 - / - und NRDKO Empfängermäuse sind verdickt und verkürzt im Vergleich zu Doppelpunkte von Rag1 - / - und NRDKO Mäuse ohne T-Zell-adoptiven Transfer. Colons von NRDKO Empfängermäuse zeigen schwere Entzündung und erhöhte Dickgewichte (Daten nicht gezeigt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
- Bestimmen Sie die Qualität des Stuhls, indem Tier in sauberen Behälter, bis sie durchlaufen hatHocker: 0 - keine; 1 - weicher Stuhl; 2 - tränende und / oder Blut im Stuhl.
- Bestimmen Sie die allgemeine Gesundheit des Tieres durch die Anwesenheit der folgenden Anzeichen einer Krankheit: 0 - keine gekrümmte Haltung, Borsten Fell oder Hautläsionen; 1 - einem der folgenden vorhanden: gekrümmte Haltung, Borsten Fell oder Hautveränderungen.
- Bestimmen Vorhandensein Rektumprolaps: 0 - nicht vorhanden; 1 - vorhanden ist (2B).
- Opfern Tiere durch CO 2 Inhalation gefolgt durch Genickbruch, wenn sie 20% ihres Ausgangskörpergewicht verloren gehen oder in gewünschten Zeitpunkt, je nachdem was zuerst eintritt. Klinischen Erkrankung ist in der Regel erkennbar ab Woche 5 post Fülle.
- Beurteilen der Schwere der Erkrankung, wie oben beschrieben 5,7.
- Vergeben klinischen Scores, wie in Schritt 6.1 8.
- Messen Kolon Länge und das Gewicht (2C).
- Führen Sie die histologische Analyse der Entzündung5.
- Bestimmen spontane Zytokinexpression in Darmgewebe Explantatkulturen 9, Mesenteriallymphknoten 10 und / oder Serum 11.
- Kurz gesagt, für Explantatkulturen 9, entfernen Sie Doppelpunkte nach der Tötung offenen Längsrichtung, und sauber mit PBS. Doppelpunkte Inkubieren auf einem Orbitalschüttler bei 250 Upm in vollständige Medien für 30 Minuten bei Raumtemperatur eingestellt.
- Hacken Sie Gewebe in kleine Stücke und bei 37 ° C in vollständige Medien für 24 Stunden inkubiert. Die überstehende Flüssigkeit und verwenden Sie für die Quantifizierung von Zytokinen auf 100 mg Gewebe mittels ELISA.
- Führen ex vivo Charakterisierung der T-Zell-Phänotypen und / oder Funktion 10.
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Representative Results
Ca. 10 x 10 6 CD4 + CD45RB hoch -T-Zellen aus 10 Milz von erwachsenen C57BL / 6 Spendermäusen sind zuverlässig isoliert. Diese Anzahl wird in Abhängigkeit von dem Alter und dem Stamm des Spendermaus und dem Können des Forschers variiert. Beim 4 x 10 5 C57BL / 6 CD4 + CD45RB hoch -T-Zellen in C57BL / 6 Rag1 übertragen - / - Empfängermäuse, klinischen Anzeichen einer Krankheit entstehen rund 5 Wochen nach der Sättigung oder früher, wenn Mäuse sind genetisch anfällig für schwerere Krankheit ( Figur 2, 3) 11,12. CD3 + T-Zellen gesehen werden, der sich in der Doppelpunkte Rag1 - / - Empfänger schon nach 3 Wochen (3A) 12.
Abbildung 3: Übertragung von Wildtyp-CD4 + CD45RB hoch -T-Zellen in Rag1 - / - und RKO / δ KD Empfänger induziert chronische Darmentzündung 12 (A) (Original Vergrößerung 10X, H & E und CD3 Immunhistochemie).. H & E Färbung (obere Tafeln) zeigt epitheliale Hyperplasie, Entzündungszellen infiltriert und Kryptenabszesse (Pfeil) im RKO / δ KD Empfänger vorhanden, aber nicht Rag1 - / - Empfänger. Colons von RKO / δ KD Empfängermäuse zeigten deutliche Ansammlung von CD3 + T-Zellen durch CD3 IHC (Bodenplatten) im Vergleich zu Doppelpunkte von Rag1 - / - Empfänger. (B) Colons von RKO / δ KD Empfängermäuse zeigten mehr schwere Entzündung im Vergleich zu Doppelpunkte from Rag1 - / - Empfängermäuse als histologisch Scoring bestimmt. (C, D) Colonic Explantatkulturen von RKO / δ KD Empfängermäuse abgesondert weniger IL-10 (C) und IL-12p40 (D) als getan Kolon Explantatkulturen von Rag1 - / -. Empfängermäuse Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Abbildung.
Wir zuvor veröffentlichten, dass Adoptiv T-Zell-Transfer in Nfil3 - / - / Rag1 - / - Doppel-Knockout-Empfänger (NRDKO) entwickeln schwerer Colitis Vergleich zu Rag1 - / - Empfängermäuse (Abbildung 2) 11. NFIL3 negativ reguliert IL-12p40 in murine Kolon Makrophagen unabhängig von seiner IL-10-induzierende Wirkung 13. Dysregulation IL-12p40 und IL-10 ist in dem Weg gebrachtogenesis menschlicher IBD 1. Somit ungeprüften IL-12p40-Produktion in adoptiven Transfer NDRKO Empfängermäusen führt schnelleren Fortschreiten der Krankheit, wie durch den Gewichtsverlust (2A) gezeigt. Einige NRDKO Empfängermäuse entwickelte schwere Krankheit, was zu Darmvorfall (2B). Grob, Doppelpunkte aus NRDKO Empfängermäuse sind verdickt und verkürzt wird, die eine große Einwandern von Entzündungszellen in das Kolon, im Vergleich zu Rag1 - / - Empfängermäuse (2C).
Vergleichsweise in Rag1 - / - Mäuse mit einem nicht-funktionellen katalytische p110 & dgr PI3K Einheit in nicht-Lymphozytenpopulationen (RKO / δ KD), CD4 + CD45RB hoch T-Zellen induziert repletion einen ähnlich schnellen und ernsten klinischen Verlauf der Krankheit im Vergleich mit NRDKO Mäusen ( 3) 12. Die histologische Analyse nach 3 Wochen zeigt Kolongewebe Hypertrophie, EntzündungenTory Zellinfiltrate und Kryptenabszesse (Pfeil) im RKO / δ KD Empfänger im Vergleich zu Rag1 - / - Empfänger (3A). Empfängermäuse in diesem Experiment wurden 3 Wochen aufgrund einer signifikanten Zahl, die 20% ihres ursprünglichen Gewichts verloren hatten euthanasiert. Histologischen Scores, wie durch einen Pathologen zu den Versuchsgruppen geblendet und auf der Grundlage spezifischer in unserem Labor 12 entwickelten Kriterien bestimmt, im Vergleich zu Rag1 waren höher in RKO / δ KD Empfängermäuse - / - Empfängermäuse (3B). Zusätzlich spontane Zytokinproduktion von Kolon Explantatkulturen zeigten verringerte IL-10 und die IL-12p40-Produktion durch RKO / δ KD Empfängermäusen gegenüber Rag1 - / - Empfängermäuse (3C, D) 12. Wiederum erhöht IL-12p40 und verringerte IL-10-Produktion in der Pathogenese von menschlichen IBD 1 gebracht.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll Induzieren Kolonentzündung in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + CD45RB + T-Zellen in immundefizienten Mäusen. Wir verwendeten C57BL / 6 Spender Milz und syngenen Rag1 - / - Empfängermäuse, obwohl auch andere Stämme (zB BALB / c, 129S6 / SvEv, nicht-übergewichtigen diabetischen (NOD)) und genetische Modelle der Immunschwäche (zB SCID, Rag2 - / -), können ebenfalls verwendet werden 4,14-16. Es ist gut bekannt, dass Hintergrundstamm beeinflußt experimentellen Kolitis Schwere bei Mäusen 1. Darüber hinaus die magensaftresistente Mikroflora in einem murinen Bevölkerung erhebliche Unterschiede zwischen den Einrichtungen, auch zwischen denen, in der gleichen Institution 6,17. Während 2 und 3 haben die Entwicklung der Colitis in Rag1 nicht zeigen - / - Mäusen nach 4 Wochen nach der Übertragung, in unserer und den Erfahrungen anderer Rag1 - / - Empfänger zu entwickeln clische Erkrankung zwischen 6 und 9 Wochen nach dem Transfer von CD4 + CD45RB hoch -T-Zellen 18-23. Diese Variabilität im klinischen Verlauf und Krankheits Ausdruck und sollte bei der Festlegung dieses Modell experimenteller Colitis auf intra- und inter experimentellen Inkonsistenz möglichst gering zu halten.
Ein entscheidender Schritt für die Reproduzierbarkeit des Experiments ist FACS Isolierung reiner Populationen von CD4 + CD45RB hoch Zellen ohne Rest aktiviert / Speicher / regulatorischen T-Zellen. Dies beinhaltet eine kompetente Verständnis der Durchflusszytometrie. Es ist wichtig, zunächst negativ wählen nicht lebensfähigen und CD4-Zellen. Dann, mit einem einfachen Histogramm für CD45RB PE-Zellen, wählen Sie die höchste 40% der Zellen, um die CD45RB hoch -T-Zellen und die niedrigste 20% als niedrig CD45RB T-Zellen darstellen. Andere Marker, den Einsatz der für die Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen werden CD62L und CD25, obwohl in unserer Erfahrung CD45RB hoch geringen Trenn eine ausreichende und reproduzierbare 5. Zusätzlich ist es möglich, das Verhältnis von CD45RB hoch variieren niedrigen T-Zellen in Empfänger übertragen, um die Effekte von regulatorischen T-Zellpopulationen auf Krankheitsphänotyp studieren CD45RB. Arbeiten Sie mit jemandem, der mit der Durchflusszytometrie vertraut zunächst die Einrichtung des FACS-Protokoll und dann mit Hilfe dieses Protokolls in zukünftigen Experimenten ist. Darüber hinaus ist ein Schritt, in dem erhebliche Unterschiede können die Ergebnisse in diesem Protokoll beeinflussen die intraperitoneale Injektion von T-Zellen in Empfängermäuse. Hier kann die intra- und inter Experimentator Variabilität einen enormen Einfluss auf das Ergebnis des Experiments. Es wird vorgeschlagen, dass die Person, die diesen Schritt ist bequem mit Handhabungs Mäusen und mit der Injektionstechnik, um Schwankungen in der Qualität und Quantität der adoptiv übertragenen Zellen zu minimieren. Darüber hinaus ist es wichtig, Nadeln zwischen Mäusen ändern, da Nadel Abstumpfung kann die Wirksamkeit beeinflussendie intraperitoneale Injektion.
Schritte des Protokolls, die Optimierung erforderlich sind Abschnitt 3: Anreicherung von CD4 + T-Zellen und Abschnitt 4: Kennzeichnung und Sortieren von Zellen. Optimierung der CD4 + T-Zellanreicherung abhängig von der verwendeten Magnetsystem und sollten den Anweisungen des Herstellers folgen. Optionen für Magnetzellseparationssysteme sind in der Tabelle der spezifischen Reagenzien / Zubehör aufgelistet. Es ist ratsam, für CD4 + T-Zellen durch negative Selektion anzureichern, wie zum direkten Markieren dieser Population kann der Phänotyp der Zellen beeinflussen. Es gibt viele Antikörper-Klone für die Markierung von Zellen für FACS erhältlich. Die Antikörperkonzentration (Schritt 4.4) sollten optimiert werden, um spezifische Färbung zu gewährleisten und eine angemessene Trennung von CD4 + CD45RB T-Zellpopulationen während FACS erhalten.
Die Entwicklung dieses Protokolls kann verlangen, Fehlersuche. Zuerst wird der Erfolg eines jeden Experimentshängt von der Kompetenz der Forscher und werden mit verbesserten Fähigkeiten in diesen Verfahren zu erhöhen. Jedoch kann konsequent Erhalt geringen Anzahl von T-Zellen für die adoptive Übertragung von nicht halten Zellen auf Eis während der Isolierung, Resuspendieren abzentrifugierten Zellen zu aggressiv, oder die Verwendung von Splenozyten von jungen Mäusen mit kleinen Milz verursacht werden. Zusätzlich optimiert die Konzentration von anti-CD4 und anti-CD45RB Markierung von Antikörpern zum Anfärben um fehlerhafte oder nicht-spezifische Zell-Färbung zu vermeiden (siehe oben). Wenn die Empfänger zu entwickeln sehr unterschiedliche Grade der Darmentzündung ist die wahrscheinlichste Ursache ungenau intraperitoneale Injektionstechnik. Dies sollte mit der Praxis zu verbessern, und kann durch eine immunhistologische Anfärbung von CD3 + -Zellen in den Eingeweiden von Empfängermäusen beobachtet werden. Weitere Dinge zu beachten sind: das Geschlecht des Spenders und des Empfängers Mäusen und normalen Schwankungen der Penetration Krankheit. Wenn männliche Empfängermäuse verwendet werden, sind entweder männlich oder weiblich Spendermäusen einppropriate. Wenn jedoch weiblichen Empfängermäusen verwendet werden sollen, werden die Spendermäuse müssen female 5 sein. In unserer und anderer Erfahrungen, ist das Eindringen der Krankheit in diesem Modell 85-90% 5. Somit ist zu erwarten, dass einige Mäuse können nicht Darmentzündung entwickeln, gegeben haben andere Ursachen der ausgeprägten Variabilität der Schweregrad der Erkrankung ausgeschlossen worden. Denken Sie daran, es gibt deutliche Variabilität der Phänotypen zwischen Einrichtungen innerhalb eines Unternehmens als auch außerhalb in Bezug auf murinen gastrointestinalen Mikrobiota und Praktiken, die die Mikrobiota 6,17 beeinflussen. Somit ist die Robustheit der Phänotyp oder Kinetik der Krankheit in Rag1 - / - Empfängermäuse kann breit auf eigenen Standort variieren. Daher ist es wichtig, dass die besten Parameter für diese Experimente auf der Grundlage der Zeitachse und die Ergebnisse von jeder einzelnen Anlage gesammelt bestimmen.
Hier beschreiben wir die Methodik der gut charakterisierten adaptiven Übertragung murineModell der chronischen Dünndarm und Dickdarm-Entzündung, die menschliche IBD 5 ähnelt. Diese Schritt-für-Schritt-Protokoll stellt Key-Techniken für die erfolgreiche Entwicklung dieser Verfahren für Forschungszwecke. Dies ist ein besonders nützliches Tiermodell der menschlichen IBD, denn sie ermöglicht eine Synchronisation der Krankheit und die Manipulation von verschiedenen Zellpopulationen. Allerdings sind die immungeschwächten Empfängermäuse gentechnisch veränderten ohne reife adaptive Immunzellen zu entwickeln, die wahrscheinlich Auswirkungen auf nachgeschaltete Krankheitsverläufe. Trotzdem wird das hier beschriebene Verfahren als sehr nützlich bei zukünftigen Untersuchungen Bestimmung der Auswirkungen der enterischen Mikroflora, Zellen des angeborenen Immunsystems und adaptive Immunregulatorzellen in der Pathogenese von menschlichen IBD.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom amerikanischen Gesellschaft für Gastroenterologie (AGA) Forschung Wissenschaftler-Preis und Crohn und Colitis Foundation of America (CCFA) Career Development Award (den SZS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS) und Universität von North Carolina Center for Gastrointestinal Biology unterstützt und Disease Grants P30 DK34987 (Histologie Core). Der UNC-Durchflusszytometrie Core Facility ist teilweise durch eine NCI-Center Core-Unterstützung Grant (P30CA016086) an den UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center unterstützt. Wir danken Lukas B. Borst von North Carolina State University College of Veterinary Medicine für seine Hilfe bei histopathologischen Analyse und Immunhistochemie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10x PBS | Gibco | 14200075 | |
| 12 mm x 75 mm round-bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 15 ml conical | Corning | 430790 | |
| 26 G x 3/8 Needle | BD Biosciences | 305110 | |
| 50 ml conical | Corning | 430828 | |
| 70 μm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363548 | |
| BD IMagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 35602 | |
| CD4-FITC IgG2b | eBioscience | 11-0041 | |
| CD45RB-PE IgG2a | BD Pharminogen | 553101 | |
| Complete Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME | ||
| FACS tube + strainer | BD Falcon | 352235 | |
| Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Heat-inactivated FBS | Gemini | 100-106 | |
| Labeling Buffer | 1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | ||
| Lysis Buffer | 0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA | ||
| MoFlo XDP | Beckman Coulter | ||
| Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM | BD Biosciences | 558131 | |
| Mouse IgG2a-PE | BD Pharminogen | 553457 | |
| Mouse IgG2b-FITC | eBioscience | 11-4732 | |
| Pasteur pipet | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-CI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Fisherbrand | 875713 | |
| Pure Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705-HC | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11-875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| Wash Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME |
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