Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導 Published: April 21, 2015 doi: 10.3791/52533

Abstract

ヒト炎症性腸疾患(IBD)、それぞれに長所と短所の病因を研究するために利用可能な多くの異なる動物モデルがある。ここではTおよびB細胞欠損レシピエントマウスに同系の脾臓CD4 + CD45RB high T細胞の養子移入によって開始される実験的大腸炎モデルを記述する。主にナイーブ、エフェクター細胞からなるCD4 + CD45RB T細胞集団は、密接に、ヒトIBDの重要な側面に似た、慢性的腸炎を誘導することができる。この方法は、疾患の発症および進行の側面を研究するために操作することができる。さらに、それは腸の炎症、すなわち 、先天性、適応性の機能、及び調節免疫細胞集団、および環境曝露の役割は微生物を研究するために使用することができる。この記事では、ステップバイステップのプロトコルで大腸炎を誘発するための方法論を示している。このINCludes成功裏に研究目的のために実験的大腸炎のこのマウスモデルを開発するために必要なキー技術的な側面のデモビデオ。

Protocol

注:すべての動物のプロトコルはによっておよび施設内動物管理使用委員会(IACUC)規制や実験動物の管理と使用に関する米国学術研究会議·ガイドに準拠して承認されていることを確認します。ドナーマウスは、男性または女性のいずれでもよいが、レシピエントマウスは、雄であるべきである。女性の受信者が使用する場合、ドナーマウスは、雌5でなければならない。 、したがって、マウス5,6の大腸炎の表現型を、これらが腸内細菌叢に影響を与える可能性があるように、定期的に、非滅菌寝具と非酸性化した水を使用してコロニーを維持し、。

1。実験の準備

  1. 氷のように冷たいメディアとバッファを使用。実験を通して氷上で細胞を保管してください。
  2. 無菌技術を用いた無菌のバイオハザードフード中で実験を行います。

脾臓T細胞の2の分離

  1. 子宮頸dislocatio続くCO 2チャンバー内でドナーマウス/マウスを安楽死させるN。 70%エタノールで腹部スプレー。
  2. 腹部の横切開を行い、腹膜を露出するために皮膚をはがし。腹膜離れて鉗子で内臓からのホールドと脾臓を露出し、切除する左腹部腹膜の切開を作る。
  3. ペトリ皿の中で完全なメディアの10ミリリットルで脾臓を置きます。脾臓から余分な組織を除去し、廃棄する。
  4. つぶすと単一細胞懸濁液に脾臓を離れていじめる2滅菌ガラススライドを使用してください。 50ミリリットルに70μmのストレーナーを通してフィルタ細胞懸濁液円錐管に完全メディア5mlでストレーナーをすすぐ。 1 50ミリリットルコニカルチューブに5脾臓まで置きます。
  5. 7分間450×gで遠心分離した細胞。オフ注ぐことによって、または廃棄物容器に真空吸引により上清を捨てる。
  6. 穏やかに室温で10分間、赤血球を溶解するために溶解緩衝液の脾臓当たり5mlの細胞を再懸濁。チューブへの完全なメディアの等量の(脾臓あたり5ミリリットル)を追加します。
  7. 静かにラベル緩衝液10mlで細胞を懸濁します。
  8. トリパンブルー排除により、細胞を数える。
    1. 細胞懸濁液の20μlのを削除し、マイクロチューブに180μlのトリパンブルーに加え、十分に混合する。 5分後、顕微鏡下で非青色細胞を血球計数器とカウントする10μlの標識細胞を追加します。生存細胞の総数を決定します。セル/パンブルーミックスを破棄します。
  9. 7分間450×gで標識化緩衝液10mlで遠心細胞。オフ注ぐことによって、または廃棄物容器に真空吸引により上清を捨てる。

CD4 + T細胞の3濃縮

注:このセクションで使用される特定の製品については、製造元の指示に従ってください。

  1. 穏やかに冷たいラベル20×10 6細胞/ mLの単一細胞懸濁液に細胞を再懸濁INGバッファー。
  2. ビオチン化CD4 T細胞濃縮抗体の1×10 6細胞あたり5μlを添加する。 15分間氷上で細胞をインキュベート。
  3. ラベルバッファーの10倍のボリュームを追加します。 7分間450×gで遠心した細胞。慎重に廃棄物容器内に真空吸引を使用してすべての上清を吸引する。
  4. 徹底的にストレプトアビジン結合磁性粒子をボルテックス。 1×10 6細胞当たりの粒子の5μlを添加する。
  5. 徹底的になく穏やかに混合。 30分間6-12℃でミックスしてください。
  6. 20-80×10 6細胞/ mlの濃度に標識バッファーを加える。 12×75ミリメートルの丸底試験管当たりの標識細胞を1.0mlにまで転送する(「ポジティブフラクションチューブ」と称する)。
  7. 6-8分間磁石上の各ポジティブフラクションチューブを置きます。
  8. まだ磁石に正のフラクションチューブを、慎重に新しい無菌の50mlの円錐チューブにガラスパスツールピペットでポジティブフラクションチューブから上清を移す(referre「濃縮画分」などからd)。この濃縮画分は、CD4 + T細胞が含まれています。磁石に引きつけ標識細胞を破壊しないように注意してください。
  9. 精力的に上下にピペッティングすることによって、ステップ3.6のようにラベル表示のバッファの同じ体積でポジティブフラクションチューブに残って細胞を再懸濁し。 6-8分間背面磁石に正のフラクションチューブを置きます。
  10. まだ磁石に正のフラクションチューブを、慎重に磁石に付着した細胞を破壊することなく、ステップ3.8から50ミリリットルのコニカルチューブを無菌ガラスパスツールピペットでポジティブフラクションチューブから上清(濃縮画分、CD4 +)を転送。
  11. 繰り返して得られたCD4 + T細胞の収量を増加させるために3.9から3.10までを繰り返す。濃縮画分(CD4 +細胞)を使用してプロトコルを継続します。

4.ラベル付けとソートセル7

  1. 遠心7分間450×gで細胞を濃縮。または真空suctをオフに傾けて上清を除去廃棄物容器にイオンを打ち込む。
  2. ラベル緩衝液1mlに細胞を再懸濁。カウントするとステップ2.9のようにトリパンブルー排除により、細胞生存率のために評価するために、細胞のアリコートを削除します。
  3. 10×10 6細胞/ mlに標識バッファーの容量を追加する。細胞が既にある場合は<10×10 6、7分間450×gで遠心分離は、廃棄物容器に捨てるか、真空吸引により上清を捨て、そして10×10 6細胞/ mlに標識バッファーの容量を追加する。
    1. マイクロチューブ内アイソタイプ染色し、染色されていない、および単一染色対照細胞のために約5〜10×10 5個の細胞それぞれの個別の分量を設定します。
  4. 細胞に5μg/ mlのCD4-FITCおよび1μg/ mlのCD45RB-PEを追加します。マイクロチューブ中でアリコートを適切な同じ濃度で、アイソタイプ対照汚れやシングルの汚れを追加します。うまくしかし穏やかに混合し、30分間、光から保護氷上でインキュベートする。
  5. 細胞とコントロールにラベルバッファーの10倍のボリュームを追加します。S。 7分間遠心450 XG。廃棄物容器に真空吸引により上清を捨てる。
  6. ステップ4.5でボリュームにラベルバッファーに懸濁します。 7分間遠心450 XG。廃棄物容器に真空吸引により上清を捨てる。
  7. 10×10 6細胞/ mlに標識化緩衝液に再懸濁する。 FACSチューブに70μmのストレーナーを通して細胞を渡します。 FACSの準備が整うまで、光から保護氷上に保管してください。
  8. 設定し、非染色細胞と単染色コントロールとセルソーター上の適切な補償を決定する。
  9. 順方向及び側方散乱ゲーティング( 図1A)と生育不能細胞を除外します。アイソタイプ染色コントロールとCD4 +およびCD45RB +細胞のためのゲーティングを設定します。 CD4 +集団上のゲート細胞。
  10. 完全なメディアの2ミリリットルにチューブにPE染色細胞のための単純なヒストグラムを用いた CD45RBとCD45RB 集団にソートCD4 +細胞。 CD45RB + CD45RB +細胞( CD45RB)の最高40%を表し、CD45RB 集団はCD4 + CD45RB +細胞の最低20%である( CD45RB; 図1B)。

図1
図1:FACS分析中CD4 + CD45RB T細胞集団のプロット代表的なフローサイトメトリー(A - C)FITC CD4-、ドナーからPE CD45RB染色した脾細胞C57BL / 6マウスを、CD4 +高 CD45RBおよびCD4 +にFACSによって選別した CD45RB 低い T細胞集団。 (A)ダブレットイベントが前方散乱プロット上除外された。 (B)、リンパ球を前方および側方散乱プロットにゲートした。 (C)CD4 + (D)CD4 + CD45RB + T細胞を、PEに対するイベントヒストグラムにプロットした。 CD4 + CD45RB low細胞をCD45RB +細胞の最低20%であると考えられた。 CD4 + CD45RB high細胞をCD45RB +細胞の最大40%と定義した。

  1. 集団の純度を評価するためにFACSマシン上の各細胞集団のアリコートを実行する。
  2. 遠心7分間450×gで細胞を選別した。 1mlのPBSで再懸濁します。カウントするとステップ2.9のようにトリパンブルー排除により、細胞生存率のために評価するために、細胞のアリコートを削除します。

受信者への細胞の5インジェクション

  1. 再懸 ​​濁し、4×10 6細胞/ ml(CD45RB )またはPBS中の2×10 6細胞/ ml( CD45RB)に細胞を選別した。
  2. 新しい滅菌チューブに受信者ごとCD45RB high細胞の100μlのを転送します。 PBSあたり100μlのを追加します。このチューブに受信者。したがって、動物あたりの総注射容量は200μlであり、受信者ごとの細胞の総量は、4×10 5個のCD4 + CD45RB ナイーブT細胞である。
  3. 制御性T細胞を受けた実験群が必要な場合は、新しい滅菌チューブに受信者ごとCD45RB 高い細胞100μlを移す。同じチューブに受信者ごとCD45RB 細胞100μlを追加。動物あたりの総注射容量は200μlである。 CD45RB の比率:CD45RB low細胞は2:1である。
  4. ハイ / CD45RB CD4 +細胞の腹腔内各受信者の腹部(200μLの合計)の右側と左側にCD45RB またはCD45RB100μlのを注入。

レシピエント動物における疾患進行の6モニタリング

  1. レシピエント動物の臨床状態を評価するために、以下のparameteの集計臨床スコアを割り当てる注射の日のRS 8、その後毎週、および屠殺時:
    1. 重量損失を測定することによって無駄に判断します。0 - なし減量を。 1 - 初期体重の0.1〜10%の損失。 2 -最初の体重( 図2A)の10%以上の損失。

図2
図2:炎症の臨床的および肉眼的病理学的徴候は、RAG1に野生型CD4 + CD45RB high T細胞の転写後に起こる- / -およびNRDKOレシピエントマウス11(A)NRDKO受信者5によってその初期体重の平均は10%で失わ週間後転送、RAG1のに対し、- / -レシピエントは、この時点で疾患の臨床徴候を示さなかった。各点は、平均±SEMコホートの初期体重の平均パーセンテージを表す。 **、P <0.005。直腸脱の存在によって示されるように(B)いくつかのマウスは、重篤な腸炎を発症した。これはNRDKOレシピエントマウスにおける直腸脱の代表画像です。 (C)肉眼、からコロン両方RAG1 - / -とNRDKOレシピエントマウスは、RAG1からコロンに比べて厚くなったと短縮されている- / -およびT細胞の養子移入せずにNRDKOマウス。 NRDKOレシピエントマウスからのコロンが重度の炎症と増加したコロンの重み(データは示していない)を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    1. それが経過するまで、清潔な容器内に動物を置くことによって、糞便の質を決定するスツール:0 - なし。 1 - ソフトスツール。 2 - 水っぽい及び/または血便。
    2. 病気の以下の徴候の存在によって動物の全般的な健康状態を決定します。0 - なし猫背の姿勢、毛皮、または皮膚病変を毛。 1 - 次の本のいずれか:猫背の姿勢は、毛皮、皮膚病変を剛毛。
    3. 直腸脱の存在の決定:0 - 不在を。 1 -現在( 図2B)。
  1. 彼らは彼らの開始体重の20%を失ったか、いずれか早い方所望の時点、でてきたとき頸椎脱臼に続いてCO 2吸入により動物を生け贄に捧げる。臨床疾患は週5ポスト充満から始まる通常は明らかである。
  2. 以前に5,7を説明するように、疾患の重症度について評価します。
    1. ステップ6.1 8のように、臨床スコアを割り当てます。
    2. 結腸の長さと重さ( 図2C)を測定します。
    3. 炎症の組織学的分析を実行します5。
    4. 腸組織外培養における自発的なサイトカイン発現9、腸間膜リンパ節10、および/ ​​または血清11を決定します。
      1. 簡単に言えば、外植片培養9のために、縦方向に開いて、屠殺後のコロンを削除して、PBSで洗浄してください。室温で30分間完全培地中で、250rpmでオービタルシェーカーセットにコロンをインキュベートします。
      2. 組織を小片にチョップし、24時間完全培地中で37℃でインキュベートした。上清を収集し、ELISAにより100 mgの組織あたりのサイトカインの定量のために使用します。
    5. T細胞の表現型および/ ​​または機能10ex vivoでの特性評価を行います。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

約成体C57BL / 6ドナーマウスから脾臓を10から10×10 6個のCD4 + CD45RB high T細胞を確実に分離されている。この数は、年齢や歪みドナーマウスの研究者の習熟度に応じて変化するであろう。 - / - 4×10 5 C57BL / 6 CD4 + CD45RB high T細胞をC57BL / 6 RAG1に転送されたとき、レシピエントマウスマウスは、より重篤な疾患に遺伝的に感受性である場合、疾患の臨床徴候は、(5週後の補充または早く周囲に現れる2、3)11,12。 - / -早くも3週間後( 3A)12のような受信者のCD3 + T細胞を、RAG1の結腸内蓄積が見られる。

図3
図3:野生型CD4 +の譲渡 RAG1にCD45RB high T細胞- / -及びRKO /δのKDの受信者は、慢性腸炎12を誘導する(A)(オリジナル倍率10倍、H&EおよびCD3の免疫組織化学)。。 - / -レシピエントH&E染色(上パネル)はRKO /δのKDの受信者ではなく、RAG1に存在する上皮過形成、炎症性細胞浸潤、および陰窩膿瘍(矢印)を示す。 - / -レシピエントRKO /δKDレシピエントマウスからの結腸はRAG1の大腸に比べCD3 IHC(下のパネル)でCD3 + T細胞の著しい蓄積を示した。 (B)コロンfr ​​のと比較して、RKO /δKDレシピエントマウスからの結腸は、より重篤な炎症を示したOM RAG1 - / -レシピエントマウス組織学スコアによって決定される。 (C、D)から結腸外植文化をしたより少ないIL-10(C)に分泌RKO /δKDレシピエントマウスとのIL-12p40の(D)からの結腸外植文化RAG1 - / - 。エントマウス表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。

- / - / RAG1 - / - / - -レシピエントマウス( 2)11ダブルノックアウト受信者(NRDKO)RAG1に比べてより深刻な大腸炎を発症する我々は以前NFIL3に養子T細胞移入があることを発表した。 NFIL3は否定的に独立して、そのIL-10誘導効果13のマウス結腸マクロファージにおけるIL-12p40のを調節する。 IL-12p40の、およびIL-10の調節不全は、経路に関与している人間のogenesis IBD 1。したがって、体重減少( 図2A)によって示されるように、より急速な疾患の進行における養子移入NDRKOレシピエントマウスの結果、未チェックのIL-12p40の産生。一部のNRDKOレシピエントマウスは、直腸脱( 図2B)、結果重症疾患を発症した。 - / -レシピエントマウス( 図2C)肉眼、NRDKOレシピエントマウスからのコロンはRAG1に比べ、結腸に炎症細胞の大流入を表す、肥厚と短縮されている。

比較的、RAG1- / -非リンパ球集団における非機能的なPI3K触媒サブユニットのp110δの(RKO /δのKD)、CD4 + CD45RB T細胞補充がNRDKOマウスと比較して疾患の同様に急速かつ深刻な臨床経過を誘導によるマウス( 3)12。 3週目の組織学的分析は、結腸組織の肥大、inflammaを実証- / -レシピエント( 3A)RAG1に比べRKO /δのKDレシピエントにおける保守党細胞浸潤、および陰窩膿瘍(矢印)。この実験では、レシピエントマウスは、それらの初期体重の20%を失っていたかなりの数の3週目に安楽死させた。実験群を知らされていないと私たちの研究室12で開発された特定の基準に基づいて病理学者によって決定されるように組織学的スコアは、RAG1に比べRKO /δKDレシピエントマウスに高かった- / -レシピエントマウス( 図3B)。さらに、結腸の外植片培養物からの自発的なサイトカイン産生を実証したRAG1に比べRKO /δKDレシピエントマウスによるIL-10および強化されたIL-12p40の産生の減少- / -レシピエントマウス( 3C、D)12。再度、IL-12p40の増加し、IL-10産生が、ヒトIBD 1の病因に関与して減少した。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ここでは、免疫不全マウスにCD4 + CD45RB + T細胞の養子移入によってマウスでの大腸の炎症を誘導するステップバイステップのプロトコルを記述します。 - / -レシピエントマウス、他の系統であるが( 例えば 、BALB / C、129S6 / SvEv、非肥満糖尿病(NOD))及び免疫不全の遺伝的モデル( 例えば 、SCID、 が、Rag2我々はC57BL / 6ドナー脾臓と同系RAG1を使用- / - )4,14-16をも使用することができる。これはよくバックグラウンド系統マウス1における実験的大腸炎の重症度に影響を与えることが確立されている。さらに、マウスの集団内の腸内細菌叢は、同じ機関6,17内のものとの間で、施設間で大きく異なる。 - / -マウス4週目の転写後、私たちのと他人の経験RAG1- / - 図2および図3 RAG1における大腸炎の開発を示していませんが、受信者は、CLIを開発CD4 + CD45RB high T細胞18-23の転送後6,9週間の間nical疾患。内および実験間の矛盾を最小限にするために実験的大腸炎のこのモデルを確立するときに、臨床経過および疾患の発現におけるこの変動性は考慮されるべきである。

この実験の再現性のための重要なステップは、残存有効化/メモリ/制御性T細胞のないCD4 + CD45RB high細胞の純粋な集団のFACS単離である。これは、フローサイトメトリーの熟練した理解を含む。それは最初にマイナス非生存とCD4 - 細胞を選択することが重要である。その後、CD45RB-PE細胞のための単純なヒストグラムを用いて、CD45RB 低い T細胞としてCD45RB high T細胞を表すために、細胞の最高40%、最低20%を選択する。我々の経験のCD45RBの高いものの、ナイーブCD4 + T細胞の単離のために使用することを検討するための他のマーカーは、CD62LおよびCD25である低い分離が十分で5再現可能である。加えて、疾患の表現型上の調節性T細胞集団の効果を研究するためにレシピエントに移し低い T細胞をCD45RB CD45RBの比率を変化させることができる。 FACSプロトコルを設定した後、今後の実験で、そのプロトコルを使用して最初にフローサイトメトリーに精通している人と一緒に作業します。さらに、有意な変化がこのプロトコルでの結果に影響を与える可能性があるステップは、レシピエントマウスへのT細胞の腹腔内注射である。ここで、内および間の実験者の変動が大幅に実験の結果に影響を与えることができます。これは、養子移入細胞の質と量の変動を最小にするように、このステップを実行する人はマウスを扱うとともに、注入技術で快適であることが示唆される。加えて、針はつや消しの有効性に影響を与えることができるように、マウスの間に針を変化させることが重要である腹腔内注射。

CD4 + T細胞および第4節の濃縮:細胞を標識し、ソート最適化を必要とするプロトコルのステップは第3節があります。 CD4 + T細胞濃縮の最適化は、使用される磁気システムに依存し、製造業者の指示に従ってください。磁気細胞分離システムのオプションは、 特定の試薬​​/機器の表に記載されています。これは、直接、細胞の表現型に影響を与えることができるこの集団を標識し、陰性選択によって、CD4 + T細胞を濃縮することをお勧めします。 FACS用の細胞を標識するための利用可能な多くの抗体クローンがあります。抗体濃度(ステップ4.4)に特異的な染色性を確保し、FACS中のCD4 + CD45RB T細胞集団の十分な分離が得られるように最適化されるべきである。

このプロトコルの開発は、トラブルシューティングが必要な場合があります。まず、各実験の成功研究者の熟練度に依存し、これらの方法で改善されたスキルを増加します。しかし、一貫して養子移入のためのT細胞の低い数値を得ることはあまりにも積極的に遠心分離した細胞を再懸濁し、単離の間、氷上で細胞を維持しないことによって引き起こされる、または小さな脾臓を持つ若いマウスからの脾細胞を使用することができる。さらに、(上記参照)を欠損又は非特異的細胞染色を避けるために染色するための、抗CD4および抗CD45RB標識抗体の濃度を最適化する。受信者が腸の炎症の広範囲に変化する度合いを開発する場合は、最も可能性が高い原因は、不正確な腹腔内注射技法である。これは、実際に改善する必要があり、レシピエントマウスの腸内のCD3 +細胞の免疫組織学的染色によってモニターすることができる。ドナーとレシピエントマウスと病気の浸透の通常の変動の性別を含んで考慮すべき追加の事。雄のレシピエントマウスを使用する場合には、男性または女性のドナーマウスのいずれかであるppropriate。雌のレシピエントマウスが使用される場合は、ドナーマウスは、雌5でなければならない。我々の等の経験では、このモデルにおける疾患の浸透が85〜90%5。したがって、一部のマウスは、腸の炎症を発症しないことが期待される、疾患の重症度の顕著な変動の所定の他の原因が除外されている。ネズミ胃腸の微生物叢と微生物6,17に影響与える慣行に関してそこに、組織内の施設間の表現型の著しい変動があり、それの外に注意してください。したがって、表現型またはRAG1疾患の動態の堅牢性- / -レシピエントマウスは、自分の位置に基づいて、広範囲に変化し得る。したがって、それぞれの個々の施設から得られたタイムラインとその結果に基づいて、これらの実験のための最良のパラメータを決定することが重要である。

ここでは、よく特徴付けられた適応転送ネズミの方法論を記述人間IBD 5に似ている慢性小腸と大腸の炎症のモデル。このステップバイステップのプロトコルは、研究目的のために、この方法の開発の成功のための重要な手法を例示する。それは様々な細胞集団の疾患の同期および操作を可能にするので、これは、ヒトIBDの特に有用な動物モデルである。しかし、免疫不全レシピエントマウスは、遺伝的に可能性が高い下流の疾患の結果に影響を与えている、成熟した適応免疫細胞なしで開発するように変更されます。それにもかかわらず、ここで説明する方法は、腸微生物叢、自然免疫細胞、およびヒトIBDの病因における適応免疫調節細胞の影響を決定する将来の研究において非常に有用であろう。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

この作品はアメリカの消化器協会(AGA)研究学者賞とクローン病とアメリカの大腸炎財団(SZSへ)(CCFA)キャリア開発賞、(ECS)は、NIH NIDDK F30 DK089692、胃腸生物学ノースカロライナ大学のセンターによってサポートされていましたと疾病グラントのP30のDK34987(組織学コア)。 UNCフローサイトメトリーコアファシリティは、UNCラインバーガー総合がんセンターのNCIセンターコアサポートグラント(P30CA016086)によって部分的にサポートされています。私たちは、病理組織学的分析および免疫組織化学との彼の助けを獣医のノースカロライナ州立大学からルークB.ボーストに感謝。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
10x PBS Gibco 14200075
12 mm x 75 mm round-bottom tube Falcon 352052
15 ml conical Corning 430790
26 G x 3/8 Needle BD Biosciences 305110
50 ml conical Corning 430828
70 μm Cell Strainer Fisherbrand 22363548
BD IMagnet BD Biosciences 552311
β-mercaptoethanol Thermo Scientific 35602
CD4-FITC IgG2b eBioscience 11-0041
CD45RB-PE IgG2a BD Pharminogen 553101
Complete Media RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME
FACS tube + strainer BD Falcon 352235
Glass Microscope Slides Fisherbrand 12550A3
Heat-inactivated FBS Gemini 100-106
Labeling Buffer 1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Lysis Buffer 0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA
MoFlo XDP Beckman Coulter
Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM BD Biosciences 558131
Mouse IgG2a-PE BD Pharminogen 553457
Mouse IgG2b-FITC eBioscience 11-4732
Pasteur pipet Fisherbrand 13-678-20D
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X Corning Cellgro 30-002-CI
Name Company Catalog Number Comments
Petri Dish Fisherbrand 875713
Pure Ethanol 200 Proof Decon Labs 2705-HC
RPMI-1640 Gibco 11-875-093
Syringe BD Biosciences 309597
Trypan blue Corning Cellgro 25-900-CI
Wash Media RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  2. Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).
  3. Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
  4. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Ma, B. W., et al. Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice. PLoS One. 7 (10), e47416 (2012).
  7. Read, S., Powrie, F. Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).
  8. Maillard, M. H., et al. The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells. J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).
  9. Hegazi, R. A., et al. Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway. J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).
  10. Kole, A., et al. Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis. J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).
  11. Kobayashi, T., et al. NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis. J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).
  12. Steinbach, E. C., et al. Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis. J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).
  13. Kobayashi, T., et al. NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity. J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).
  14. Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells. Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).
  15. Powrie, F., et al. Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4. T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).
  16. Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).
  17. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  18. Fukata, M., et al. The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease. J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).
  19. Kurtz, C. C., et al. Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).
  20. Naganuma, M., et al. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).
  21. Ranatunga, D. C., et al. A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis. J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).
  22. Srikrishna, G., et al. Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa. B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).
  23. Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).

Tags

免疫学、問題98、IBD、大腸炎、実験モデル、適応免疫、T細胞、粘膜免疫、炎症
エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steinbach, E. C., Gipson, G. R.,More

Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (98), e52533, doi:10.3791/52533 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter