Abstract
Det er mange forskjellige dyremodeller er tilgjengelige for å studere patogenesen av human inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), hver med sine egne fordeler og ulemper. Vi beskriver her en eksperimentell kolitt modell som er initiert av adoptiv overføring av syngene milt CD4 + CD45RB høy T-celler til T og B-celle mangel resipientmus. CD4 + CD45RB høy T-celle-populasjon som i stor grad består av naive effektor-celler er i stand til å indusere kronisk intestinal inflammasjon, nærmere ligner viktige aspekter av human IBD. Denne metoden kan bli manipulert for å studere aspekter ved sykdomsdebut og progresjon. I tillegg kan den brukes til å studere funksjonen av medfødt, adaptiv, og regulatoriske immuncellepopulasjoner, og rollen til miljømessige eksponeringer, dvs. bakterieflora i tarmbetennelse. I denne artikkelen vil vi illustrere metoden for å indusere kolitt med en trinn-for-trinn-protokollen. Dette includes en video demonstrasjon av viktige tekniske aspekter som kreves for å lykkes med å utvikle denne murine modell av eksperimentell kolitt for forskningsformål.
Protocol
MERK: Kontroller at alle animalske protokoller er godkjent av og i samsvar med Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) forskrifter og National Research Council Veiledning for Care og bruk av forsøksdyr. Donor mus kan være enten mann eller kvinne, men resipientmus bør være mann. Hvis kvinnelige mottakere skal brukes, må giver mus være kvinnelig 5. Oppretthold kolonier ved hjelp av vanlig, ikke-sterile sengetøy og ikke-surgjort vann, da disse kan påvirke tarmfloraen, og således den kolitt fenotype av musene 5,6.
1. Experimental Forberedelse
- Bruk iskalde medier og buffere. Holde cellene på is i løpet av eksperimentet.
- Utføre eksperimentet i sterile biohazard hetten med steril teknikk.
2. Isolering av milt T-celler
- Avlive donor mus / mus i CO 2 kammer etterfulgt av livmorhals dislocation. Spray magen med 70% etanol.
- Lage en horisontal snitt i buken og skrelle bort huden til å eksponere peritoneum. Hold bukhinne vekk fra de indre organer med pinsett og gjøre et snitt i venstre mage bukhinnen å avsløre og avgiftsdirektoratet milten.
- Plasser milt i 10 ml av Komplett Media i en petriskål. Fjern og kast overflødig vev fra milten.
- Bruk to steriliserte glass lysbilder å knuse og erte hverandre milt inn encellede suspensjon. Filter cellesuspensjon gjennom en 70 mikrometer sil i en 50 ml konisk rør og skyll silen med 5 ml av Komplett Media. Plassere opptil fem spleens i en 50 ml konisk tube.
- Sentrifuger cellene ved 450 x g i 7 min. Kast supernatant ved å helle av, eller ved hjelp av vakuum sug i avfallsbeholder.
- Forsiktig resuspender cellene i 5 ml per milt av Lysis-buffer for å lysere røde blodceller i 10 minutter ved romtemperatur. Legg til et likt volum av fullstendig medium (5 ml per milt) til røret.
- Forsiktig resuspender cellene i 10 ml Merking buffer.
- Telle celler ved trypanblå eksklusjon.
- Fjern 20fil cellesuspensjon og legge til 180 mL trypanblått til en mikrofugerør og bland godt. Etter 5 min, tilsett 10 mL merkede celler til hemocytometer og teller ikke-blå celler under mikroskop. Bestemme totalt antall levedyktige celler. Kast celle / trypanblått mix.
- Sentrifuger cellene i 10 ml Merking buffer ved 450 x g i 7 min. Kast supernatant ved å helle av, eller ved hjelp av vakuum sug i avfallsbeholder.
3. Anrikning av CD4 + T-celler
MERK: Følg produsentens instruksjoner for spesifikke produkter som brukes i denne delen.
- Forsiktig resuspender cellene til en enkeltcelle-suspensjon av 20 x 10 6 celler / ml i kald etiketting Buffer.
- Tilsett 5 mL per 1 x 10 6 celler av biotinylerte CD4 T-celle berikelse antistoffer. Inkuber cellene på is i 15 min.
- Legg 10x volum Merking Buffer. Sentrifuger cellene ved 450 x g i 7 min. Aspirere nøye all supernatanten ved hjelp av vakuum sug i avfallsbeholder.
- Grundig vortex streptavidin-konjugert magnetiske partikler. Tilsett 5 ul av partikler per 1 x 10 6 celler.
- Bland grundig, men forsiktig. Hold blanding ved 6-12 ° C i 30 min.
- Legg Merking buffer til en konsentrasjon på 20-80 x 10 6 celler / ml. Overfør opp til 1,0 ml merkede celler per 12 x 75 mm rundbunnet reagensrør (referert til som "positive-fraksjon tube").
- Plasser hver positiv-fraksjon tube på magnet for 6-8 min.
- Med de positive-fraksjonen rør fortsatt på magnet, nøye overføre supernatanten fra positiv-fraksjonen tube med glass Pasteur pipette til en ny steril 50 ml konisk rør (referred til som "anrikede fraksjon"). Denne anrikede fraksjon inneholder CD4 + T-celler. Vær forsiktig så du ikke å forstyrre de merkede celler tiltrukket av magneten.
- Resuspender cellene igjen i positiv-fraksjonen rør i samme volum av buffer merking som i trinn 3.6 ved å pipettere opp og ned kraftig. Plassere positive-fraksjonen tube tilbake på magnet for 6-8 min.
- Med positiv-fraksjonen rør fortsatt på magnet, nøye overføre supernatanten (anriket brøkdel, CD4 +) fra positiv-fraksjonen tube med glass Pasteur pipette til sterilt 50 ml konisk tube fra trinn 3.8 uten å forstyrre celler festet til magnet.
- Gjenta trinn 03.09 til 03.10 for å øke utbyttet av CD4 + T celler hentet. Fortsett protokollen med beriket brøkdel (CD4 + celler).
4. Merking og sortering Cells 7
- Sentrifuger anriket cellene ved 450 x g i 7 min. Kast supernatant ved å helle av eller vakuum suction i avfallsbeholder.
- Resuspender celler i en ml Merking Buffer. Fjern aliquot av celler for å telle og for å vurdere levedyktigheten til cellen ved trypan blå eksklusjon som i trinn 2.9.
- Legg et volum på Merking Buffer til 10 x 10 6 celler / ml; hvis celler er allerede <10 x 10 6, sentrifuger ved 450 xg i 7 min, kast supernatant ved å helle av eller vakuumsug i avfallsbeholderen, og legge til volum av Merking buffer til 10 x 10 6 celler / ml.
- Sette opp egne prøver av ca 5-10 × 10 5 celler hver for ufargede, isotypen-farget, og enkelt-farget kontrollceller i mikrofugerør.
- Tilsett 5 ug / ml CD4-FITC og 1 ug / ml CD45RB-PE til celler. Legg isotypekontroll flekker og enkle flekker ved samme konsentrasjon til passende porsjoner i mikrofugerør. Bland godt, men forsiktig og inkuberes på is beskyttet mot lys i 30 min.
- Legg 10x volum Merking Buffer til celler og kontrolls. Sentrifuger 450 x g i 7 min. Kast supernatanten ved vakuum sug i avfallsbeholder.
- Suspender i Merking Buffer til volum i trinn 4.5. Sentrifuger 450 x g i 7 min. Kast supernatanten ved vakuum sug i avfallsbeholder.
- Suspender i Merking Buffer til 10 x 10 6 celler / ml. Passere cellene gjennom 70 mikrometer sil inn FACS tube. Hold på is beskyttet mot lys før du er klar for FACS.
- Sette opp og bestemme passende kompensasjon på cellen sorter med ufargede celler og enkelt-farget kontroller.
- Ekskluder ikke-levedyktige celler med fremtids og side-scatter gating (figur 1A). Sett opp gating for CD4 + og CD45RB + celler med isotype-farget kontroller. Gate celler på CD4 + befolkningen.
- Sorter CD4 + celler i CD45RB høy og CD45RB lave bestander ved hjelp av en enkel histogram for PE-farget celler inn rør med 2 ml Komplett Media. Den CD45RB høy + CD45RB + celler (CD45RB høy), og CD45RB lav befolkning er den laveste 20% av CD4 + CD45RB + -celler (CD45RB lav, figur 1B).
Figur 1: Representant flowcytometri plott av CD4 + CD45RB T celle populasjoner under FACS analyse (A - C) FITC CD4 og PE CD45RB-farget splenocytes fra donor C57BL / 6 mus ble sortert etter FACS til CD4 + CD45RB høy og CD4 +. CD45RB lav T-celle populasjoner. (A) Doublet hendelser ble ekskludert på fremover spredningsdiagram. (B) lymfocytter ble inngjerdet i forover og sidespredningsdiagram. (C) CD4 + (D) CD4 + CD45RB + T-celler ble plottet på et PE versus Arrangement histogram. CD4 + CD45RB lave celler ble ansett å være den laveste 20% av CD45RB + -celler. CD4 + CD45RB høye celler ble definert som den høyeste 40% av CD45RB + -celler.
- Kjøre en alikvot av hver cellepopulasjon på FACS maskin for å vurdere renheten av populasjoner.
- Sentrifuger sortert cellene ved 450 x g i 7 min. Resuspender i 1 ml PBS. Fjern aliquot av celler for å telle og for å vurdere levedyktigheten til cellen ved trypan blå eksklusjon som i trinn 2.9.
5. Injeksjon av celler inn Mottakere
- Suspender sortert celler til 4 x 10 6 celler / ml (CD45RB høy) eller 2 x 10 6 celler / ml (CD45RB lav) i PBS.
- Overføre 100 mL av CD45RB høye celler per mottaker til ny sterilt rør. Tilsett 100 ul PBS permottaker i dette rør. Således totalt injeksjonsvolum per dyr er 200 ul, og den totale mengden av celler pr mottakeren er 4 x 10 5 CD4 + CD45RB høye naive T-celler.
- Hvis eksperimentelle gruppen som fikk T regulatoriske celler er ønsket, overføre 100 mL av CD45RB høye celler per mottaker til ny sterilt rør. Tilsett 100 mL av CD45RB lave celler per mottaker i samme rør. Totalt injeksjonsvolum per dyr er 200 ul; forholdet av CD45RB høy: CD45RB lave celler er 2: 1.
- Injisere 100 ul av CD45RB høy eller CD45RB høy / lav CD45RB CD4 + celler intraperitonealt inn i høyre og venstre side av abdomen (totalt 200 pl) av hver mottaker.
6. Overvåking av sykdomsprogresjon i mottaker Dyr
- For å vurdere den kliniske status mottaker dyr, tildele samlede kliniske score for følgende parameteretrs 8 på dagen for injeksjon, deretter ukentlig, og ved tidspunktet for avlivelse:
- Bestem sløse ved å måle vekttap: 0 - ingen vekttap; 1 - 0,1-10% tap av opprinnelig kroppsvekt; 2 - mer enn 10% tap av opprinnelig kroppsvekt (figur 2A).
Figur 2: Kliniske og grove patologiske tegn på inflammasjon oppstå etter overføring av villtype CD4 + CD45RB høy T-celler til Rag1 - / - og NRDKO resipientmus 11 (A) NRDKO mottakere mistet gjennomsnittlig 10% av sin opprinnelige kroppsvekt etter 5. uker etter overføring, mens Rag1- / - Mottakere ikke vise kliniske tegn på sykdom på denne tiden. Hvert punkt representerer den midlere prosent av initial kroppsvekt for kullet ± SEM. **, P <0,005. (B) Noen mus utviklet alvorlig tarmbetennelse, som demonstrert ved tilstedeværelsen av rektal prolaps. Dette er et representativt bilde av rektal prolaps i en NRDKO mottaker mus. (C) Grovt, kolon fra både Rag1 - / - og NRDKO resipientmus er tykkere og forkortet i forhold til kolon fra Rag1 - / - og NRDKO mus uten T-celle adoptiv overføring. Kolon fra NRDKO resipientmus viser alvorlig betennelse og økt kolon vekter (data ikke vist). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bestemme kvaliteten på krakk ved å plassere dyret i ren beholder før det har gåttkrakk: 0 - none; 1 - myk avføring; 2 - vassen og / eller blodig avføring.
- Bestem generelle helsen til dyret ved nærvær av følgende tegn på sykdom: 0 - ingen krum holdning, stritter pels eller hud lesjoner; 1 - ett av følgende til stede: krum holdning, stritter pels, eller hudlesjoner.
- Fastslå tilstedeværelse av rektal prolaps: 0 - fraværende; 1 - tilstede (figur 2B).
- Ofre dyr av CO 2 innånding fulgt av halsdislokasjon når de har mistet 20% av sin startkroppsvekt eller på ønsket tidspunkt, avhengig av hva som kommer først. Klinisk sykdom er vanligvis tydelig starter i uke 5 etter repletion.
- Vurdere for sykdommens alvorlighetsgrad som tidligere beskrevet 5,7.
- Tildele kliniske score som i trinn 6.1 8.
- Mål kolon lengde og vekt (figur 2C).
- Utføre histologisk analyse av betennelse5.
- Bestem spontan cytokin ekspresjon i tarm vevseksplantatet kulturer 9, mesenteriske lymfeknuter 10 og / eller 11 serum.
- Kort, for eksplantering kulturer 9, fjerne kolon etter offer, åpen lengderetningen, og ren med PBS. Inkuber kolon på en orbital ryste innstilt på 250 rpm i fullstendig medium i 30 minutter ved romtemperatur.
- Hakk vev i små biter og inkuberes ved 37 ° C i Komplett Media i 24 timer. Samle supernatanten og bruk for kvantifisering av cytokiner pr 100 mg vev ved hjelp av ELISA.
- Utføre ex vivo karakteriseringen av T-celle-fenotyper og / eller funksjon 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ca 10 x 10 6 CD4 + CD45RB høy T-celler fra 10 spleens fra voksen C57BL / 6 giver mus er pålitelig isolert. Dette antallet vil variere avhengig av alder og belastning av donor mus og ferdighet av forskeren. Når 4 x 10 5 C57BL / 6 CD4 + CD45RB høy T-celler er overført til C57BL / 6 Rag1 - / - resipientmus, kliniske tegn på sykdom dukke opp rundt uke 5 etter repletion eller tidligere hvis mus er genetisk utsatt for mer alvorlig sykdom ( Figur 2, 3) 11,12. CD3 + T-celler er sett akkumuleres i kolon av Rag1 - / - mottakere så tidlig som 3 uker (Figur 3A) 12.
Figur 3: Overføring av villtype CD4 + CD45RB høy T-celler til Rag1 - / - og RKO / δ KD mottakere induserer kronisk intestinal inflammasjon 12 (A) (Opprinnelig forstørrelse 10X, H & E- og CD3 immunhistokjemi).. H & E flekker (topplater) illustrerer epitelial hyperplasi, inflammatoriske celleinfiltrater, og krypten abscesser (pil) til stede i RKO / δ KD mottakere, men ikke Rag1 - / - mottakere. Kolon fra RKO / δ KD resipientmus viste markant opphopning av CD3 + T-celler ved CD3 IHC (bunnplater) sammenlignet med kolon fra Rag1 - / - mottakere. (B) Kolon fra RKO / δ KD resipientmus demonstrerte mer alvorlig betennelse i forhold til kolon from Rag1 - / - resipientmus som bestemmes av histologi scoring. (C, D) Tykktarms eksplantering kulturer fra RKO / δ KD resipientmus utskilles mindre IL-10 (C) og mer IL-12p40 (D) enn gjorde colonic eksplantering kulturer fra Rag1 - / -. Resipientmus Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Vi har tidligere publisert at adoptiv T-celle overføring til Nfil3 - / - / Rag1 - / - dobbel knockout mottakere (NRDKO) utvikle mer alvorlig kolitt i forhold til Rag1 - / - resipientmus (figur 2) 11. NFIL3 negativt regulerer IL-12p40 i murine colonic makrofager uavhengig av sine IL-10-induserende effekter 13. Feilregulering av IL-12p40 og IL-10 er innblandet i banenogenesis av menneskelig IBD en. Således merket IL-12p40 produksjon i adoptiv overføring NDRKO resipientmus resulterer i hurtigere sykdomsprogresjon, som vist ved vekttap (figur 2A). Noen NRDKO resipientmus utviklet alvorlig sykdom med rektal prolaps (figur 2B). Grovt, er kolon fra NRDKO resipientmus fortykket og forkortet, som representerer en stor tilstrømning av betennelsesceller i tykktarmen, sammenlignet med Rag1 - / - resipientmus (Figur 2C).
Relativt, i Rag1 - / - mus med en ikke-fungerende PI3K katalytisk subenhet p110δ i ikke-lymfocyttpopulasjoner (RKO / δ KD), induserer CD4 + CD45RB høy T-celle repletion en tilsvarende rask og alvorlig klinisk sykdomsforløp sammenlignet med NRDKO mus (Figur 3) 12. Histologisk analyse på tre uker demonstrerer kolonvev hypertrofi, inflammaTory celleinfiltrater og krypten abscesser (pil) i RKO / δ KD mottakere i forhold til Rag1 - / - mottakere (figur 3A). Resipientmus i dette eksperimentet ble avlivet ved 3 uker på grunn av et betydelig antall som hadde mistet 20% av sin opprinnelige kroppsvekt. Histologiske score, som bestemmes av en patolog blindet for forsøksgrupper og basert på bestemte kriterier utviklet i vår lab 12, var høyere i RKO / δ KD resipientmus forhold til Rag1 - / - resipientmus (Figur 3B). I tillegg spontan cytokinproduksjon fra colonic eksplantering kulturer viste redusert IL-10 og IL-12p40 forbedret produksjon av RKO / δ KD resipientmus forhold til Rag1 - / - mottaker-mus (figur 3C, D) 12. Igjen økte IL-12p40 og redusert IL-10-produksjon er implisert i patogenesen av human IBD 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en trinn-for-trinn-protokollen induserende tykktarmsbetennelse hos mus ved adoptiv overføring av CD4 + CD45RB + T-celler i immundefekte mus. Vi brukte C57BL / 6 donor spleens og syngen Rag1 - / - resipientmus, selv om andre stammer (f.eks BALB / c, 129S6 / SvEv, ikke-overvektige diabetikere (NOD)) og genetiske modeller av immunsvikt (f.eks SCID, Rag2 - / -) kan også anvendes 4,14-16. Det er godt etablert at bakgrunnen belastning påvirker eksperimentell kolitt alvorlighetsgrad hos mus 1. Videre enteriske floraen i en murine befolkningen varierer mye mellom anlegg, selv mellom de innenfor samme institusjon 6,17. Mens figur 2 og 3 ikke viser utviklingen av kolitt i Rag1 - / - mus på fire uker etter overføring, i vår og andres erfaringer Rag1 - / - mottakere utvikle cliniske sykdom mellom seks og ni uker etter overføring av CD4 + CD45RB høy T-celler 18-23. Denne variasjonen i klinisk forløp og sykdom uttrykk og bør tas hensyn til ved etablering av denne modellen av eksperimentell kolitt for å minimere intra- og inter-eksperimentell inkonsekvens.
Et kritisk trinn for reproduserbarheten av dette eksperimentet er FACS isolering av rene populasjoner av CD4 + CD45RB høye celler uten rest aktiverte / minne / regulatoriske T-celler. Dette innebærer en dyktig forståelse av strømningscytometri. Det er viktig først å velge en negativ ikke-levedyktige og CD4 celler. Deretter bruker en enkel histogram for CD45RB-PE celler, markerer det høyeste 40% av cellene til å representere CD45RB høy T-celler og den laveste 20% som CD45RB lave T-celler. Andre markører for å vurdere å bruke for isolering av naive CD4 + T celler er CD62L og CD25, selv i vår erfaring CD45RB høy lav separasjon er tilstrekkelig og reproduserbar 5. I tillegg er det mulig å variere forholdet av CD45RB høy til CD45RB lave T-celler overføres til mottakerne for å studere effektene av regulatoriske T-cellepopulasjoner på sykdoms fenotype. Jobbe med noen som er kjent med flowcytometri i første omgang å sette opp FACS protokollen og deretter bruker den protokollen i fremtidige eksperimenter. I tillegg et trinn hvor betydelig variasjon kan påvirke resultatene i denne protokollen er intraperitoneal injeksjon av T-celler til resipientmus. Her kan intra- og inter-experimenter variabilitet i stor grad påvirke utfallet av eksperimentet. Det er foreslått at den som utfører dette trinnet er komfortabel med håndterings mus og med injeksjonsteknikk for derved å minimalisere variasjoner i kvalitet og kvantitet av celler adoptivt overført. I tillegg er det viktig å endre nåler mellom mus, som nålen sløver kan påvirke effekten avintraperitoneal injeksjon.
Trinnene i protokollen som krever optimalisering inkluderer Seksjon 3: Berikelse av CD4 + T-celler og avsnitt 4: Merking og sortering Cells. Optimalisering av CD4 + T-celle berikelse avhenger av magnetsystemet brukt og bør følge produsentens instruksjoner. Alternativer for magnetisk celleseparasjonssystemer er oppført i tabellen over spesifikke reagenser / utstyr. Det er tilrådelig å anrike for CD4 + T-celler ved negativ seleksjon, som direkte merking av denne populasjonen kan påvirke fenotypen av cellene. Det er mange antistoff kloner tilgjengelige for merking av celler for FACS. Den antistoffkonsentrasjon (trinn 4.4) bør optimaliseres for å sikre spesifikk farging og for å oppnå en tilfredsstillende separering av CD4 + T-cellepopulasjoner CD45RB under FACS.
Utviklingen av denne protokollen kan kreve feilsøking. For det første lykkes i hvert eksperimentavhenger av ferdighet av forsker og vil øke med økt ferdighet i disse metodene. Imidlertid kan konsekvent oppnå lave antall av T-celler for adoptiv overføring være forårsaket av ikke å holde cellene på is under isolering, resuspendering sentrifugerte celler for aggressivt, eller anvendelse av splenocytter fra unge mus med små milter. I tillegg optimalisere konsentrasjonen av anti-CD4 og anti-CD45RB merking antistoffer for farging for å unngå mangelfull eller ikke-spesifikk celle-farging (se ovenfor). Hvis mottakerne utvikle svært varierende grader av tarmbetennelse, er den mest sannsynlige årsaken upresis intraperitoneal injeksjonsteknikk. Dette skal forbedre med praksis og kan overvåkes ved immunohistologic farging av CD3 + celler i tarmen hos resipientmus. Andre ting å vurdere omfatter kjønn av giver- og mottaker mus og normale variasjoner i sykdoms penetrasjon. Når mannlige resipientmus brukes, enten mannlige eller kvinnelige donor mus er enppropriate. Men hvis hunn resipientmus skal kunne benyttes, må donor mus være kvinnelig 5. I våre og andres erfaringer, er inntrengning av sykdom i denne modellen 85-90% 5. Således er det forventet at en mus ikke kan utvikle intestinal inflammasjon, har gitt andre årsaker til markert variasjon i sykdommens alvorlighetsgrad blitt utelukket. Husk det er markert variasjon i fenotyper mellom anlegg innenfor en organisasjon og utenfor det med hensyn til murine gastrointestinal bakterieflora og praksiser som påvirker bakterieflora 6,17. Dermed robustheten fenotype eller kinetikk av sykdom i Rag1 - / - resipientmus kan variere mye basert på ens plassering. Derfor er det viktig å bestemme de beste parametre for disse eksperimenter basert på tidslinjen og resultatene oppnådd fra hver enkelt innretning.
Her beskriver vi metodikken i godt karakterisert adaptive overføring murinemodell av kronisk tynntarmen og tykk betennelse som ligner menneskelig IBD 5. Denne trinn-for-trinn-protokollen illustrerer viktige teknikker for en vellykket utvikling av denne metoden for forskningsformål. Dette er en spesielt nyttig dyremodell for human IBD, som gjør det mulig for synkronisering av sykdom og manipulering av forskjellige cellepopulasjoner. Imidlertid er de immunodeficient resipientmus genetisk modifisert til å utvikle modne uten adaptive immunceller, som sannsynligvis påvirke nedstrømssykdoms utfall. Til tross for dette, vil metoden beskrevet her være svært nyttig i fremtidige studier som bestemmer virkningen av tarmfloraen, medfødte immunceller, og adaptive immun regulatoriske celler i patogenesen av menneskelig IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av amerikanske Gastroenterologisk Association (AGA) Forskning Scholars Award og Crohns og kolitt Foundation of America (CCFA) Career Development Award (til SZS), NIH NIDDK F30 DK089692 (til ECS), og University of North Carolina Center for Gastrointestinal Biology og sykdom Grant P30 DK34987 (Histologi Core). UNC flowcytometrisystemer Kjerne Facility støttes delvis av en NCI senter Kjerne Support Grant (P30CA016086) til UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Vi takker Luke B. Borst fra North Carolina State University College of Veterinary Medicine for hans hjelp med histopatologisk analyse og immunhistokjemi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10x PBS | Gibco | 14200075 | |
| 12 mm x 75 mm round-bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 15 ml conical | Corning | 430790 | |
| 26 G x 3/8 Needle | BD Biosciences | 305110 | |
| 50 ml conical | Corning | 430828 | |
| 70 μm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363548 | |
| BD IMagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 35602 | |
| CD4-FITC IgG2b | eBioscience | 11-0041 | |
| CD45RB-PE IgG2a | BD Pharminogen | 553101 | |
| Complete Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME | ||
| FACS tube + strainer | BD Falcon | 352235 | |
| Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Heat-inactivated FBS | Gemini | 100-106 | |
| Labeling Buffer | 1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | ||
| Lysis Buffer | 0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA | ||
| MoFlo XDP | Beckman Coulter | ||
| Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM | BD Biosciences | 558131 | |
| Mouse IgG2a-PE | BD Pharminogen | 553457 | |
| Mouse IgG2b-FITC | eBioscience | 11-4732 | |
| Pasteur pipet | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-CI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Fisherbrand | 875713 | |
| Pure Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705-HC | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11-875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| Wash Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME |
References
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
- Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).
- Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
- Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).
- Ma, B. W., et al. Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice. PLoS One. 7 (10), e47416 (2012).
- Read, S., Powrie, F. Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).
- Maillard, M. H., et al. The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells. J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).
- Hegazi, R. A., et al. Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway. J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).
- Kole, A., et al. Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis. J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).
- Kobayashi, T., et al. NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis. J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).
- Steinbach, E. C., et al. Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis. J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).
- Kobayashi, T., et al. NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity. J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).
- Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells. Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).
- Powrie, F., et al. Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4. T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).
- Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).
- Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
- Fukata, M., et al. The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease. J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).
- Kurtz, C. C., et al. Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).
- Naganuma, M., et al. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Ranatunga, D. C., et al. A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis. J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).
- Srikrishna, G., et al. Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa. B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).
