Summary
مرض دوبوترين (DD) هو مرض fibroproliferative من كف اليد. هنا، نقدم بروتوكول لعينات ثقافة الاستئصال الجزئي من DD في ثلاثي الأبعاد (3D) نظام الثقافة. مثل هذا النظام الثقافة على المدى القصير يسمح الحفاظ على هيكل 3D والخصائص الجزيئية للأنسجة متليفة.
Introduction
مرض دوبوترين (DD)، وهو مرض يسبب انثناء fibroproliferative حميدة دائمة العضوية في الأصابع بسبب تشكيل عقيدات والحبال في كف اليد. على الرغم من أن انتشار المرض مرتفع بشكل خاص بين القوقازيين من شمال أوروبا، والمسببات الوراثية الكامنة وراء هذا المرض ما زال مجهولا 1. السمة الرئيسية للDD هو إنتاج فائض من المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات (مثل الكولاجين)، والتي تشكل النسيج الليفي الصعبة التي تحتل مساحة بين الأوتار والجلد من كف اليد والأصابع، وتعطيل حركات غرامة بشكل دائم من جهة 2، 3، وتكرار المرض تشير التعديلات الوراثية الكامنة كسبب للتليف 1، 4. علاج فعال يمكن أن يكون لاستهداف مباشرة الآليات تليفي لا يمكن السيطرة عليها على المستوى الخلوي والجزيئي.
وقد أدى عملنا مؤخرا على التليف بنا إلى تطويررواية نظام الثقافة 3D التي تسمح الثقافة على المدى القصير من أنسجة متليفة الإنسان مع إمكانية اختبار المخدرات. وقد ساعد هذا النظام على التغلب على نهج الحد من الثقافات الليفية 2D و تحديد دور لتنظيم أسفل جزئي، من خلال اكسون تخطي يتحقق، تفعيل مسار TGFβ في التوسط التليف 5.
لقد قمنا بتطوير طريقة لثقافة فيفو السابقين العينات استئصال الإنسان من المرضى DD لدراسة التفاعل بين myofibroblasts وECM المحيطة 5 و 6. وتعتمد دراسة DD تليف الأنسجة الضامة وكذلك الأمراض تليفي أخرى على تحليل الأنسجة من رفعه الجراحية العينات وعزل الخلايا الليفية من الأنسجة وإنشاء الثقافات الأولية أو إجراءات خلية الفرز. هذه المناهج هي ثابتة تماما لأنها لا تسمح التلاعب خارجي من خصائص مرض أو التدخل العلاجي من قبل المجرب. وبالإضافة إلى ذلك، CE الأساسيالثقافات ليرة لبنانية تميل إلى التكيف مع الظروف الثقافة والجينات خصائص التعبير عنها تختلف أساسا عن الوضع في الجسم الحي على كل مرور، حتى خلال الممرات الأولى (من بين مرور 3 و 6) 7، 8. لقد نجحنا في الحفاظ على المواد الجراحية النفايات في السابق الظروف الثقافة الجسم الحي لفترة زمنية تسمح دراسة خصائص المريض محددة وفحص المركبات عقار مضاد للمتليفة أو المضادة للالتهابات.
ويستند هذا النظام على غشاء النيتروسليلوز الذي يسمح اتصال من النسيج مع المتوسط ولكن ليس مع البلاستيك، وبالتالي، ومنع تغيير النسيج على المرفق، كما لوحظ سابقا عند زراعة الخلايا الليفية DD وكذلك أنواع الخلايا الأخرى 9. لا يلزم جل الكولاجين أو غيرها من ECM البروتين الركيزة، منذ الأنسجة DD نفسها تنتج كميات كبيرة من هذه البروتينات. هذا هو مفيد لصيانة المكروية ECM الأم ودوران الخطيئةركائز م المصفوفة هي المنظم المهم العمارة الأنسجة وظيفة 10 و 11 على سبيل المثال، والبروتينات ECM مثل فبرونيكتين، laminin والكولاجين، قد تؤثر قطبية الأمامي الخلفي من الخلايا الليفية كما هو موضح بالمثل لقطبية قمية-القاعدية في الخلايا الظهارية 12، 13 . خلايا الاستقطاب لها توزيع غير متوازن من جزيئات الخلية والذي يحدد الهجرة الخلية والتعبير الجيني، على سبيل المثال، α1β1 الوصول إنتغرين على الغشاء يؤثر التصاق الخلية إلى النوع الأول من الكولاجين 14. منذ كان الهدف الأساسي من هذا النموذج 3D للحفاظ على المكروية الأم، تم استخدام أي مصطنعة ECM مصفوفة الركيزة.
في سطور: يتم قطع العينات بتر قدم المساواة في بيئة معقمة ووضعها على الأغشية nitrocellular. إذا كان مطلوبا العلاج تدار عن طريق الحقن يتم حقن الأنسجة بعد أن يكونوا قد وضعت على الغشاء. إذا لا تتطلب العلاج إلى أن تدار عن طريق حقنةection ثم يضاف المركب إلى وسائل الإعلام الثقافة (Dulbecco لتعديل متوسطة النسر (DMEM)، مع 1٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ البنسلين، الستربتومايسين (P / S)). يتم الحفاظ على الثقافات لمدة أقصاها عشرة أيام وبعد ذلك يتم إصلاح الأنسجة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA)، معالجتها من خلال 30٪ من محلول السكروز، جزءا لا يتجزأ في أكتوبر مركب وتخزينها في -80 ° C، كما هو موضح سابقا 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البروتوكول يتبع LUMC وAMC المبادئ التوجيهية من الإنسان لجنة أخلاقيات البحث.
1. إجراء العمليات الجراحية والأنسجة مجموعة
ملاحظة: على الرغم من أن تقنيات مختلفة لالاستئصال الجراحي للانكماش دوبوترين موجودة، معيار الذهب الحالي هو استئصال اللفافة الجزئي 15. يتم التعامل مع معظم المرضى في عيادة جراحة اليوم الواحد.
- إجراء عمليات جراحية تحت التخدير العام أو الإقليمي وفقا لتفضيلات المريض والتخدير وإلى التعاون مرضية المريض. هذه الاعتبارات هي خارج نطاق هذه الورقة. قبل شق، لمس الجلد بآلة حادة للتحقق من التخدير هو مرض. استخدام عاصبة لتسهيل التصور الجراحي في حقل غير دموي.
- بعد الإستعداد معقمة واللف، علامة من أصل شق المتوقع بالقلم. شق الجلد مع مشرط تحت العدسة التكبير إما طوليا سص باستخدام شقوق متعرجة لمنع التقلصات إضافية وأيضا لإتاحة فرص كافية للظهور.
- باستخدام مقص تشريح، حرر الجلد وطبقة تحت الجلد من وراء الراحي فآسيا المتعاقد عليها. تحديد وحماية حزمة وعائية عصبية من الاصبع لأن الحبل المريضة يمكن أن تحل في اتجاه خط الوسط. وبمجرد أن الأنسجة تليفي (العقيدات و / أو الحبل) ويرد، استئصال عليه بحدة وإقليميا (المجموع الفرعي) باستخدام مشرط. أداء الإرقاء الدقيق تحت السيطرة وقف النزف في نهاية الإجراء لمنع تشكيل الورم الدموي.
- لإغلاق الجلد، واستخدام Z-plasties إضافية للحصول على إطالة جزئية من الجلد.
- لاستخدام هذه الدراسات إلا الجزء العقيدات من الحبل متليفة، والجزء الأكثر نشاطا والخلوية من المرض. هل لديك الجراح أداء تحديد العيانية. العقيدات المعزولة في كف اليد وغالبا ما تكون السلائف أو الحبل ولكنها مقطوعة بالكاد أي وقت مضى، لأنها عادة لا يسبب الأعراض.كانت تلك التي كنا مقطوعة العقيدات التي كانت جزءا من سلك من الاصبع المتعاقد عليها. تحديد هذه العقيدات من قبل جزء سميك من الصعب من الحبال في handpalm (الشكل 1A).
- مرة واحدة الجراح بإزالة الأنسجة، ونقل على الفور باستخدام ملقط معقم لأنبوب 50 مل تحتوي على DMEM المتوسطة تستكمل مع 10٪ FCS و1٪ (P / S). الحفاظ على الأنسجة لمدة أقصاها 2 ساعة في هذه الوسيلة على مربع من الجليد الرطب (4 ° C) (على سبيل المثال، نقل أنسجة من غرفة العمليات إلى مرفق ثقافة الخلية).
- الحفاظ على عينات على الجليد الرطب (4 ° C) في حين تستعد للخطوة التالية. إعداد المواد وزراعة الخلايا الغرفة يتطلب 10-20 دقيقة.
2. إعداد الآلات، ثقافة متوسطة والثقافة إدراجات
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الإجراءات في RT ما لم يذكر على وجه التحديد.
- إعداد 500 مل من DMEM تستكمل مع 10٪ FCS و1٪ (P / S) ومرشح الصورةterilize. Prewarm المتوسط عند 37 درجة مئوية.
- ملقط الأوتوكلاف، وزوج من مقص مايو المنحنية ريش (150-170 ملم في الطول) وزوج من مقص Metzenbaum وتخزينها في حاوية معقمة.
- تحت تدفق الصفحي، فتح المعقمة لوحة الثقافة 12 أيضا. مكان واحد إدراج الثقافة (0.45 ميكرون حجم المسام، 12 مم) في كل بئر من لوحة 12-جيدا (1B الشكل، اللوحة السفلى).
- ملء لوحة 12-جيدا مع 600 ميكرولتر من prewarmed (37 درجة مئوية) وسائل الإعلام الثقافة من قبل pipetting على البئر وليس مباشرة على غشاء إدراج. وضع لوحة في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2) (1B الشكل، لوحة العليا).
- بدلا من ذلك، استخدم 24 لوحة جيدا وإضافة 300 ميكرولتر من المتوسطة لكل بئر. حجم المتوسطة لكل بئر هو الأمثل عندما يتم تشكيل طبقة الغضروف المفصلي بين السائل والجزء السفلي من إدراج الغشاء.
ملاحظة: المتوسط في أسفل البئر ينشر من خلال membr النيتروسليلوزانو تشكيل طبقة الغضروف المفصلي كما هو مبين في مخططات الشكل 1B (اللوحة السفلى).
- بدلا من ذلك، استخدم 24 لوحة جيدا وإضافة 300 ميكرولتر من المتوسطة لكل بئر. حجم المتوسطة لكل بئر هو الأمثل عندما يتم تشكيل طبقة الغضروف المفصلي بين السائل والجزء السفلي من إدراج الغشاء.
3. الأنسجة الإعداد إعداد وفيفو السابقين نسيج الثقافة
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الإجراءات في RT ما لم يذكر على وجه التحديد.
- نقل جزء العقيدات من الحبل من أنبوب 50 مل على طبق بيتري 100 ملم وإضافة 10 مل من prewarmed (37 درجة مئوية) متوسطة. تأكد من أن الأنسجة على اتصال مع السائل خلال الإجراء بأكمله.
- إزالة طبقة الدهون perinodular باستخدام مقص Metzenbaum. تجاهل الأنسجة الدهنية. مع استخدام ملقط ومقص منحني ريش، وقطع الأنسجة عرضيا إلى قطع أصغر (سمك الحد الأقصى من 200 ميكرون).
- نقل لوحة 12-جيدا من الحاضنة في غطاء محرك السيارة الصفحي. تأكد من أن غشاء من إدراج تحولت شفافة (الرطب)، وبالتالي هو في اتصال مع وسيط.
- باستخدام ملقطرفع بعناية جزء الأنسجة عن طريق لمس الطبقة الخارجية (لا تنطبق التوتر على الأنسجة). وضع جزء الأنسجة واحد على الغشاء من إدراج الثقافة الخلية بحيث تبقى الأنسجة في الطور البيني الهواء المتوسط. ثقافة بحد أقصى من جزئين الأنسجة على نفس إدراج / جيد.
- تأكد من أن الأنسجة يتم وضع مسطح على الغشاء، في اتصال مع الطولي المتوسط مثل أن الأنسجة لا يطفو قبالة غشاء ولا يتم تغطيتها بالكامل من قبل متوسطة. تجنب فقاعات الهواء.
ملاحظة: في هذه المرحلة، فمن الممكن إضافة عوامل النمو أو مثبطات التي تهم وسائل الإعلام. على سبيل المثال، والمركبات اختبار (A، B، C، D، E) في مكررات و / أو في منحنى التركيز. وتشمل 2 على الأقل التحكم (غير المعالجة) قطعة من الأنسجة تحت ظروف النمو الطبيعي للتأكد من أن تم تعيين التجربة بشكل صحيح. احتضان الأنسجة لمدة 3-7 أيام في حاضنة زراعة الأنسجة. - تصيب الأنسجة مع إما بناء lentiviral أو الفيروسة الغدانية إذا overexpression أو هدم البريدxperiments من حاجة الجينات في المصالح التي يتعين القيام بها (الشكل 2). نقل جزء من نسيج لوحة 12-جيدا في طبق 35 مم باستخدام ملقط.
- استخدام الحد الأقصى لحجم 10 ميكرولتر من فيروس عيار عالية.
- إجراء الحقن تحت المجهر تشريح مع حقنة الأنسولين محملة 50 ميكرولتر PBS تحتوي على 10 ميكرولتر من الفيروس المحدد. وضع الإبرة عمودية على مركز للأنسجة.
- حقن ببطء محتوى الحقنة. لا تتراجع الإبرة مباشرة. عندما ثقب الأنسجة، لا تدع الإبرة تذهب من خلال الجانب الآخر ولكن الحفاظ على إبرة داخل الأنسجة نفسها (حول مركز الأنسجة).
- نقل الأنسجة مرة أخرى في لوحة 12-جيدا، وإغلاق لوحة الثقافة ووضعه في الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2).
4. جبل لالجامع المناعي تلطيخ والإعمار 3D
ملاحظة: جميع المواليةيتم تنفيذ cedures في RT ما لم يذكر على وجه التحديد. بروتوكول لكامل المناعية جبل والتصوير هو موضح أدناه هو التكيف من أساليب ذكرت سابقا تستخدم لأنسجة أخرى 16-19. وصفت مخازن والمواد في الجدول 1 وقائمة المواد.
- الأنسجة نقل من لوحة الثقافة إلى 2 مل أنابيب microcentrifuge تحتوي على برنامج تلفزيوني. غسل 2X لمدة 5 دقائق في محلول PBS على منصة دوارة. إصلاح الأنسجة في 4٪ مخزنة PFA (1.5 مل من محلول في الأنسجة في 2 مل أنابيب microcentrifuge)، O / N عند 4 درجات مئوية على منصة دوارة.
- إزالة PFA وتغسل 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- يذوى الأنسجة عن طريق الغمر في محلول الميثانول بنسبة 25٪ لمدة 2 ساعة على RT على منصة دوارة. زيادة نسبة الميثانول تدريجيا (50٪، 75٪، 100٪) مع الأنسجة مغمورة في كل حل لمدة 2 ساعة في RT على منصة دوارة.
- الأنسجة نقل في DMSO / حل الميثانول (الخطوة permeabilization) لمدة 3 أسابيع في 4 درجات مئوية،كما هو موضح سابقا (18).
ملاحظة: في هذه المرحلة، والأنسجة ويمكن تخزين على المدى الطويل في الميثانول بنسبة 100٪ في -20 ° C. - المضي قدما في تلطيخ الإجراء 16، 17؛ ترطيب أنسجة تدريجيا (75٪ -50٪ -25٪ -0٪ سلسلة الميثانول). تنفيذ كل خطوة الإماهة لمدة 2 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية، في إطار التحريض المستمر.
- احتضان العينات مع الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 20٪ DMSO O / N عند 4 درجات مئوية. استخدام الأجسام المضادة في النسب التالية باستخدام المخزونات التجارية في برنامج تلفزيوني: مكافحة α الأكتين العضلات الملساء (1: 500، والماوس)، ونوع المضادة للالكولاجين الأول (1: 500، الماعز)، ومكافحة الكولاجين النوع الثالث (1: 500، الماعز).
- غسل نطاق واسع في برنامج تلفزيوني لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية (تغيير PBS حل 3 إلى 4 مرات).
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (اليكسا 555 المضادة للماوس، اليكسا 488 المضادة للماعز) في 1: 250 التخفيف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ (BSA) و 20٪ DMSO. احتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
- غسل نطاق واسع في برنامج تلفزيوني لمدة 48 ساعة على 476، C واحتضان مع مباين النووي، TO-PRO-3 المخفف 1: 500 في برنامج تلفزيوني في خطوة الغسيل النهائية.
ملاحظة: TO-PRO-3 هو بعيدة الحمراء التي تنبعث منها صبغة DNA (مع وني 633 نانومتر خط ليزر) ويتم الجمع بين التصوير في وقت واحد مع القنوات الأخرى؛ في هذا النوع نوع القضية الكولاجين I / الكولاجين الثالث (488 نانومتر)، α الأكتين العضلات الملساء (555 نانومتر)، TO-PRO-3 (647 نانومتر). - نقل الأنسجة إلى سلسلة الميثانول (25٪ -50٪ -75٪) ليذوى ببطء الأنسجة. تنفيذ كل خطوة الجفاف لمدة 2 ساعة على RT أو O / N عند 4 ° C في إطار التحريض المستمر.
- الأنسجة نقل في أنابيب البولي بروبلين. الأنسجة واضحة في methylsalicylate (مقبض تحت غطاء الكيميائية) 18 أو بوصفه استخدام بديل BABB حل 19. في احتضان RT في إطار التحريض المستمر حتى تصبح الأنسجة شفافة. جبل بين شريحة وساترة مختومة مع مجموعة من الصعب متوسطة تركيب (الشكل 1C، لوحة العليا).
- عينات الصورة على الصغير متحد البؤر مقلوبنطاق مجهزة عالية NA 63X و / أو 100X أهداف الغمر النفط (الشكل 1C).
- تنظيف العدسة بمحلول التنظيف المقدمة من قبل الشركة المصنعة المجهر.
- تطبيق قطرة واحدة من الزيت على عدسة موضوعية. ضع الشريحة مع العينة على المسرح المجهر والتركيز على العينة.
- تعيين تكوينات على المجهر للتصوير في وقت واحد من ثلاث قنوات مضان مع خطوط الليزر 488 نانومتر، 514 نانومتر و 633 نانومتر.
- الحصول على صور XY واحد أو عدة صور تنسيق الطائرة (Z كومة) (الشكل 3A). استخدام زيادة العرض من Z المكدس للحصول على أداء 3D إعادة الإعمار. للحصول على صورة عالية الدقة تستخدم انخفاض سرعة المسح الضوئي، وعدد من متوسط بالاشعة (≥ 3) والحصول على صور 16 بت القرار 1،024 س 1،024 بكسل.
- تحليل الصور Z كومة المكتسبة: إعادة تسمية أولا وحفظ ملف الصورة (XYZ). باستخدام برنامج حاسوبي من المجهر متحد البؤر، تكوين الحد الأقصى لكثافة PROJEction من الصور Z كومة إلى 3D بناؤها الصورة.
- حدد الملف XYZ، في "أدوات عملية"، انقر فوق تحت عنوان "التخيل" و "الإسقاط 3D". دخول "الأقصى" في طريقة العرض (أو "متوسط" إذا تم المشبعة إشارة الفلورسنت). الإسقاط واحد لا يتغير X، Y، Z والطائرات، وتطبيق أداة الإسقاط (الشكل 3B، R1).
- استخدام الصور Z كومة لإنشاء الإسقاط 3D مع الرسوم المتحركة (برنامج متحد البؤر) لأغراض العرض. حدد الملف XYZ، في أدوات عملية، انقر فوق تحت عنوان "التخيل" و "الإسقاط 3D".
- انقر على "إنشاء الفيلم". أدخل زاوية بدء دوران في درجة (على سبيل المثال، 0 ° كنقطة انطلاق للفيلم، محور Y) وانقر على "بدء تعيين". أدخل زاوية دوران النهاية في درجة (المحور Y) كنقطة نهاية الفيلم (على سبيل المثال، 180 درجة أو 3606؛ لدوران الكامل) وانقر على "نهاية تعيين".
- حدد "الحد الأقصى" كوسيلة من وسائل الإسقاط (أو "متوسط" إذا تم المشبعة إشارة الفلورسنت). دخول "عدد الإطارات" للدوران إعادة الإعمار 3D (على سبيل المثال، 20 التناوب أو أعلى للحد من سرعة دوران). انقر على "تطبيق". تصدير الفيلم كملف البصرية (على سبيل المثال، "وافي") (فيلم التكميلي 1) أو تصدير بأنها "شجار" ملف الذي يخلق ملف صورة لكل زاوية دوران (الشكل 3B، تناوب R4، R10، R18).
5. المشتركة الجيل الثاني متناسق (الكولاجين) وثنائي الفوتون مضان متحمس (الإيلاستين) التصوير في فيفو السابقين الأنسجة أثناء الثقافة
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الإجراءات في RT ما لم يذكر على وجه التحديد.
- إزالة لوحات transwell من الحاضنة ومكان واحد (غير المثبتة) منظمة الشفافية الدوليةجزء ssue في 35 ملم لوحة ثقافة الخلية تحتوي على 500 ميكرولتر من المتوسط.
- ضع الأنسجة بحيث محور طويل مسطح على لوحة. إبقاء الأنسجة الرطب في جميع الأوقات ولكن، لا العائمة.
- وضع الهدف، مغمورة بالمياه المجهر multiphoton على اتصال مباشر مع الأنسجة (الشكل 1C).
- الحصول على صور ذات الطول الموجي الإثارة من 800 نانومتر، وجمع الضوء المنبعث بين 371-425 نانومتر (SHG، والكولاجين) و474-532 نانومتر (تألق ذاتي، الإيلاستين) (الشكل 3C). أداء ثنائي الفوتون المجهري في مجهر متحد البؤر تستقيم مجهزة ليزر الفيمتو ثانية باستخدام الهدف الماء الغمر 20X / 1.0 NA. متحد البؤر عملية مداخن مع برنامج الشركة المصنعة.
ملاحظة: الإثارة مع ليزر الأشعة تحت الحمراء القريب من جزيئات الكولاجين يخلق التصوير التباين العالي هياكل الكولاجين الأم في أعماق مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
طريقة فيفو السابقين، والثقافة 3D من النسيج الضام هو انشاء نظام سهل وقوي لفهم العلاقة بين ECM ومكونات الخلايا الأخرى المكونة للنسيج DD وأنواع أخرى من المحتمل أن التليف كذلك. وعلاوة على ذلك يسمح هذا النظام طريقة موثوقة لاختبار آثار المركبات على أنواع مختلفة من الخلايا وآثارها على الحمل متليفة 20.
، وتعرض الخطوات من جمع النفايات الجراحية المستمدة من التليف دوبوترين الجمعية من غرفة الثقافة وأمثلة من أدوات التحليل في الشكل 1. وكما هو موضح في الشكل رقم 1، وهذه الطريقة توفر أداة تجريبية لشاشات المخدرات شاشات كبيرة، على سبيل المثال، المركبات الدوائية antifibrotic فضلا عن دراسة ECM النمذجة في الوقت الحقيقي وبطريقة استنساخه. أجزاء عقيدية من الحبل متليفة وشرائح متساوية ووضعها في لوحات transwell. كل جزء الأنسجة (100-200 ميكرون) هو مثقف على رأس الغشاء من إدراج الثقافة (0.45 ميكرون حجم المسام، 12 مم). يضاف مستنبت في الغرفة السفلى، مما يسمح للاتصال مع الأنسجة من خلال الغشاء. في المتوسط 30-40 أجزاء الأنسجة يمكن أن تستمد من عينة استئصال واحدة، والذي يسمح على نطاق واسع فحص المخدرات. مركبات، جزيئات صغيرة أو عوامل النمو. تجارب التصدي للتركيز و / أو تعتمد على الوقت تأثير المخدرات هي مجدية.
كما هو مبين في الشكل 2، يمكن التلاعب التعبير الجيني (overexpression / نهدم) عن طريق استخدام الغدة / lentiviruses حقنه مباشرة في الأنسجة. Fluorescently يتم تنفيذ تنبيغ الفيروسية في عينات الأنسجة الموسومة سميكة جديدة عن طريق الحقن. تبقى الأنسجة في الثقافة لمدة 24-48 ساعة بعد الحقن وثابتة في وقت لاحق، جزءا لا يتجزأ من ومقطوع في 0.7 ميكرون cryosections. وعلاوة على ذلك، لتحليل تأثير مركبات مختلفة أو شروط الثقافة الجزء الأنسجةيتم إصلاح الصورة وتعرض لجبل بأكمله المناعي كما هو مبين في الشكل (3). التصوير 3D من الأنسجة السميكة يتم ذلك عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 3A-B). طريقة أخرى هي التصوير 3D مباشرة على الأنسجة الاحتفاظ بها في الثقافة. يتم دراسة الذاتية الكولاجين إعادة عرض الوقت الحقيقي في تشريح الطازجة وقطع الأنسجة غير ثابتة من قبل الجيل الثاني التوافقي (SHG) (الشكل 3C). ويتبع تأثير العقاقير المضادة للتليفي المحتملة أيضا في أجزاء من نفس الأنسجة عند نقاط زمنية مختلفة. يتم تصوير هياكل الكولاجين من الأنسجة السميكة باستخدام SHG في مجهر multiphoton تستقيم. خلال التصوير، ويتم وضعها عينات الأنسجة في المتوسط ويتم تصوير مع الهدف الماء الغمر. بعد التصوير، والأنسجة يمكن نقلها مرة أخرى إلى نظام الثقافة. ويمكن دراسة الآثار على مستوى البيئة الخلوية وخارج الخلية توفير ميزة على المقايسات خلية مقرها في المختبر. هناك احتمالات متعددة لآناتحلل من الآثار البيولوجية مثل الأنسجة من أقسام الأنسجة الثابتة، وجبل بأكمله المناعي وإعادة الإعمار 3D التصوير بواسطة المجهر متحد البؤر، SHG واثنين من الفوتون التصوير مضان متحمس من الكولاجين والإيلاستين الذاتية. بعض من مزايا التصوير SHG هي استخدام أنسجة جديدة وغير ثابتة، أنه لا يوجد إعداد تلوين الأجسام المضادة هو مطلوب وأن الأنسجة نفسها ولا يمكن تصوير عدة مرات (دوام خلال ظروف الثقافة). وقد وصفت SHG واثنين من الفوتون التصوير مضان متحمس من قبل لالعضلات والنسيج الضام 21-23 والشرايين غير ملوثين هيكل جدار 24، ومع ذلك، ونحن هنا الإبلاغ عن تطبيق بديل لدراسة التليف دوبوترين.
الشكل 1. مخطط خارج الحي 3D نظام زراعة الأنسجة. (A) DD انكماش انثناء دائم في يد المريض قبل الاستئصال الجراحي. لقد تم تعديل هذا الرقم من دراسة سابقة 5. (ب) مثال من خارج الحي انشاء الثقافة. (C) أمثلة على النهج التجريبية التي يمكن استخدامها لتحليل ECM الترسيب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
وتصور الشكل 2. إثبات صحة المبدأ خارج الحي الجينات تعديل التعبير الفيروسية التي تتوسط في أنسجة جبل بأكمله. (A) النوى مع TO-PRO-3 صبغ (الأزرق). الحانات 75 ميكرون. (B) التصور المباشر من الفلورسنتصبغ DsRed (الحمراء)، بعد الحقن مع اتش معربا-DsRed. الحانات 75 ميكرون. (C) مدموجة صورة (تلطيخ النووي باللون الأزرق، DsRed باللون الأحمر). توطين حشوية من DsRed يدل تسليم الفيروسة الغدانية في الخلايا خلال 24 ساعة. الحانات 75 ميكرون. (DF) Lentiviral تنبيغ. وتصور (D) النوى مع TO-PRO-3 صبغ (الأزرق). الحانات 25 ميكرون. (E) التصور المباشر للGFP في أقسام الأنسجة (الأخضر)، وبعد الحقن مع جزيئات lenti-GFP. الحانات 25 ميكرون. (F) صورة مدموجة من D و E يشير إلى توطين الخلايا من lenti-GFP. الحانات 25 ميكرون (GH) مثال لضربة قاضية بوساطة الفيروسة البطيئة ضد الجينات في المصالح (وصفت بأنها "A")؛ (G) الفيروسة البطيئة التي تحمل تسلسل shRNA سارعتتم حقن فيفو السابقين في الأنسجة. تلطيخ المناعي للبروتين من الفائدة (تسمى "A") أظهرت باللون الأحمر. الحانات 75 ميكرون. تم حقن (H) الفيروسة البطيئة تحمل الجين تسلسل A-shRNA فيفو السابقين في الأنسجة. تلطيخ المناعي للبروتين "A". هي ملطخة النوى مع TO-PRO-3 الصبغة. الحانات 75 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. 3D التصوير إعادة الإعمار، وتوليد التوافقي الثاني واثنين من الفوتون التصوير مضان متحمس. (A) التصوير 3D بواسطة المجهر متحد البؤر. واحدة (س ص) وصور في طائرات التنسيق على طول أعماق الأنسجة المختلفة (ض = 50-200 ميكرون). كله جبل immuتلطيخ nofluorescence. علامة α على نحو سلس الأرومة الليفية العضلية الأكتين العضلات (αSMA والأحمر)، وتلطيخ النووي (TO-PRO-3، الزرقاء). القضبان: 500 ميكرون (B) 3D بناؤها صورة (Z كومة 389 ميكرون) من الصور الخام كما هو مبين في لوحة وعلى مختلف دورات 3D أشارت بأنها "R1"، "R4"، "R10"، "R18". الحانات 500 ميكرون. (C) المحتوى الكولاجين الذاتية النمذجة التي كتبها الجيل الثاني التوافقي (SHG) التصوير في طازجة وقطع الأنسجة السميكة (اللوحة اليسرى، الأخضر). تم القبض على اثنين من الفوتون مضان متحمس (TPF) هياكل الإيلاستين من ECM بواسطة المجهر multiphoton (لوحة المتوسطة، الحمراء). صورة المدمجة من الكولاجين (الخضراء) والإيلاستين (أحمر) (اللوحة اليمنى). القضبان: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم التكميلي 1. تمثيلاtative فيلم 3D إعادة بناء الأنسجة جبل بأكمله دوبوترين التصوير متحد البؤر من DD الأنسجة أجريت بعد سبعة أيام فيفو السابقين الثقافة وتجهيز لجبل بأكمله المناعي تلطيخ؛ علامة α على نحو سلس الأرومة الليفية العضلية الأكتين العضلات (αSMA والأحمر)، وتلطيخ النووي (TO-PRO-3، الزرقاء). مقياس شريط = 500 ميكرون. إطارات = 20. Z = 389 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.
| PBS (الفوسفات مخزنة المالحة) | 8.00 غرام كلوريد الصوديوم (0.137 M) 0.20 ز بوكل (2.7 ملم) 0.20 ز KH 2 PO 4 (1.1 ملم) 0.10 ز MgCl 2 · 6H 2 O (0.5 ملم) 2.16 ز نا 2 هبو 4 · 7H 2 O (8.1 ملم) 0.10 ز اللامائية CaCl 2 (0.9 ملم) H 2 O إلى 1 L |
| حل 4 غرام من امتصاص العرق في قارورة تحتوي على 100 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في غطاء الدخان، وتغطي القارورة. ضع قارورة على التدفئة / كتلة اثارة ويحرك بلطف الحل. رصد درجات الحرارة بحيث تصل إلى الحد الأقصى هو 65 ° C. تجنب الإفراط في التدفئة. مرة واحدة وقد حلت امتصاص العرق والحل يبدو واضحا، وإيقاف الحرارة ولكن ترك لاثارة. لا معالجة لأسباب تتعلق بالسلامة. السماح التبريد. عندما تبرد، قسامة الحل وتخزين على المدى الطويل في الثلاجة -20 درجة مئوية أو في 4 ° C الثلاجة لأقصى مدة أسبوع. | |
| BSA (ألبومين المصل البقري)، 10٪ (ث / ت) | حل 10 ز BSA في 100 مل H 2 O. فلتر تعقيم باستخدام بروتين منخفض ملزم مرشح 0.22 ميكرون. تخزينها في 4 ° C. |
| DMSO / الميثانول (20٪) حل permeabilization | مزيج ثنائي ميثيل سلفوكسيد معالميثانول (1: 4 القياس، السعة الإجمالية 100 مل). |
الجدول 1. حلول العازلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية من زراعة الأنسجة الضامة الإنسان خارج الحي هي استخدام الفوري من الأنسجة بعد الاستئصال الجراحي لضمان جدوى. ينبغي أن يظل النسيج في محلول ملحي أو متوسطة في جميع الأوقات؛ الحفاظ على الثقافة العقيمة. يجب المقاطع العرضية من الأنسجة يكون الحد الأقصى سماكة 200 ميكرون. اقامة النظام الثقافة فيفو السابقين هو الأمثل عند الأنسجة على اتصال مع المتوسط ولكن ليس غمرت بالكامل. وينبغي أن يضاف المتوسطة فقط على غرفة خارجية للtranswell في حجم صغير (على سبيل المثال، 500-600 ميكرولتر في 12-جيدا لوحة المساحة السطحية).
ومتشابكا النسيج الضام المستمدة من ودوبوترين في بنية صعبة مع نسبة عالية من البروتينات ECM مثل الكولاجين، البروتيوغليكان، والإيلاستين. بسبب هذه الخصائص وبالإضافة إلى ذلك بسبب انكماش الأرومة الليفية العضلية يمكن أن يكون تحديا لقطع طريق الأنسجة. من المهم أن استخدام أدوات الجراحية المناسبة؛ المنحني BLaded مقص مايو لقطع أجزاء كبيرة في سمك المساواة ومقص جراحي أصغر لقطع أجزاء أصغر الأنسجة (على سبيل المثال، إذا هناك حاجة إلى مزيد أجزاء الأنسجة لوحات استخدام 24 أيضا).
طرق لدراسة DD هي التحليلات النسيجية المرضية للعينة تليفي استئصاله، أو اشتقاق الخلايا الليفية الأولية. اشتقاق الخلية من المواد المرضى يتم هو بطريقتين. في واحدة من الطرق وقطع الأنسجة يتم تربيتها في لوحات ثقافة البلاستيكية لعدد من الأسابيع حتى يكون هناك ثمرة من الخلايا الليفية. الأسلوب الثاني هو العلاج الأنزيمية من الأنسجة مع كولاجيناز والتربسين. الطريقة الأولى هي مضيعة للوقت، وتغيير خصائص الخلايا الليفية بسبب الظروف والثقافة، وهناك تقلب تعتمد على مرور بين مقاطع من خط الخلية نفسها. طريقة الأنزيمية هو أسرع ويمكن استخدامه لخلية الفرز المقايسات، ومع ذلك، والصيانة في المختبر من هذه الخلايا من ECM الفطري لا يعكس في الجسم الحي 25 (أي mechanoregulation وmechanotransduction). ويؤدي فقدان التوتر في التفكيك من الألياف αSMA في MFBs في فترة قصيرة من الزمن 26. وفرة αSMA في خارج الحي 27 و 28. وفيما يتعلق تقلب الفني والبيولوجي، أسلوبنا هو استنساخه (الجدوى، شبكة ECM) وأقل عرضة للتغيير الأنسجة نتيجة لوقت قصير للثقافة. على سبيل المثال، يتطلب طريقة الليفية ثمرة عدة أسابيع والتي قد تسبب تغيرات كيميائية حيوية (على سبيل المثال، وتراكم الطفرات الجينية، والشيخوخة تنسخي). ومع ذلك، الخصائص الجينية المريض محددة وتقلبه البيولوجي هي في حد ذاتها تحديات في مجال البحوث وDD لا يمكن معالجتها مع أي من الطرق الحالية.
كما هو مبين في هذا البروتوكول، والعينات DD تليفي بعد الاستئصال الجراحي يتم استزراع مباشرة في فيفو السابقين نظام 3D و / أو المفاجئة المجمدة. اعتمادا على مسألة علمية، وتعديل الأنسجة ممكن عن طريق إضافة عوامل النمو، والمركبات الكيميائية، والخامسirus بوساطة توصيل الجينات، أليغنوكليوتيد] العقاقير وmiRNAs. يمكن أن يتم تسليم المركبات في وسائل الإعلام أو بواسطة إبر دقيقة جدا المحلية من الأنسجة في الثقافة غرفة 3D. بعد 3 ويصل إلى 7 أيام من الثقافة يمكن أن تكون إما المتجانس الأنسجة لعزل الخلايا وتحليل FACS أو عزل الحمض النووي الريبي مجموع والبروتينات لتحليل الشخصية التعبير، فضلا عن تجهيزها للتحليل النسيجي. ويتم تقييم الوضع التعبير عن البروتينات الليفية (αSMA، نوع الكولاجين الأول والثاني، فبرونيكتين)، والهندسة المعمارية الأنسجة للجزء العقيدات من الحبل واتساق شبكة ليفية قبل وبعد العلاج. من أجل مراقبة إعادة ترتيب ECM خلال الثقافة التي تجمع بين SHG (الكولاجين) واثنين من الفوتون مضان متحمس (الإيلاستين) التصوير.
ويمكن بعد ذلك إعادة ترتيب الخلية يكون كميا أو على غرار باستخدام برنامج صورة الكمي. هذه المعايير تعطي مؤشرا للآثار المخدرات على التليف أو molecالتعديلات الجزيئية التي تم يسببها خلال الثقافة. ويمكن أيضا بالإضافة إلى ذلك حوى صفائف ECM أن يؤديها على شرائح واحدة لتوليد نظرة أفضل للآثار. عموما قمنا بتأسيس نظام قوي الذي يسمح للدراسة تليف خارج الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد رفعت المؤلفين طلب البراءة لمرض دوبوترين: الثقافة الجهاز 3D. # GB1307200. تتوفر عقود الترخيص والخدمات التجارية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45 μm pore size, 12 mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective. |
References
- Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
- Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren's disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
- Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren's disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
- Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren's disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
- Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren's disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
- Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
- Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren's disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
- Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren's Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
- Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
- Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
- Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
- Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
- Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
- Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Karkampouna, S., de Julio, M. K. ruithof- Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
- Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
- Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
- Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
- Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
- Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
- Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).
