Summary
Malattia di Dupuytren (DD) è una malattia fibroproliferativa del palmo della mano. Qui vi presentiamo un protocollo per i campioni della cultura di resezione di DD in un tridimensionale (3D) sistema di coltura. Tale sistema di coltura a breve termine permette conservazione della struttura 3D e proprietà molecolari del tessuto fibrotico.
Introduction
Malattia di Dupuytren (DD), una malattia benigna fibroproliferativa provoca la flessione permanente delle dita a causa della formazione di noduli e corde nel palmo della mano. Anche se la diffusione della malattia è particolarmente alta tra i caucasici del Nord Europa, l'eziologia genetica alla base della malattia resta sconosciuta 1. La caratteristica principale del DD è l'eccesso di produzione di matrice extracellulare (ECM) proteine (per esempio, collagene), che costituiscono un tessuto fibroso duro che occupa lo spazio tra i tendini e la pelle del palmo della mano e delle dita, interrompendo definitivamente i movimenti fini della mano 2, 3. La ricorrenza della malattia suggerisce alterazioni genetiche sottostanti come causa di fibrosi 1, 4. Un trattamento efficace potrebbe essere quella di indirizzare direttamente le incontrollabili meccanismi fibrotiche a livello cellulare e molecolare.
Il nostro recente lavoro sulla fibrosi ci ha portato allo sviluppo di unnuovo sistema cultura in 3D che permette di cultura a breve termine di tessuto fibrotico umano con il potenziale di test anti-droga. Questo sistema ha contribuito a superare l'approccio limitazione di colture di fibroblasti 2D e definire un ruolo per la regolazione giù parziali, raggiunti da exon skipping, di TGFβ attivazione della via nella mediazione fibrosi 5.
Abbiamo sviluppato un metodo di coltura ex vivo campioni di resezione umano da pazienti DD di studiare l'interazione tra miofibroblasti e ECM circostante 5, 6. Lo studio della fibrosi tessuto connettivo DD nonché altre malattie fibrotiche basa sull'analisi istopatologica del escisso chirurgica esemplari, l'isolamento dei fibroblasti del tessuto e la creazione di colture primarie o procedure di separazione delle cellule. Questi approcci sono alquanto statico in quanto non consentono la manipolazione delle proprietà esogena malattia o intervento terapeutico dallo sperimentatore. Inoltre, ce primariall culture tendono ad adattarsi alle condizioni di coltura e le loro proprietà di espressione genica differiscono sostanzialmente dalla situazione in vivo su ogni passaggio, anche durante i primi passaggi (tra il passaggio 3 e 6) 7, 8. Siamo riusciti a mantenere il materiale chirurgico rifiuti ex vivo condizioni di coltura per un periodo di tempo che permette lo studio delle caratteristiche specifiche del paziente e lo screening di composti farmacologici anti-fibrotiche o anti-infiammatori.
Il sistema si basa su una membrana di nitrocellulosa che permette il contatto del tessuto con il mezzo, ma non con la plastica, quindi, impedendo l'alterazione del tessuto su di attaccamento, come precedentemente osservato quando la coltura fibroblasti DD così come altri tipi di cellule 9. Non è richiesta alcuna gel di collagene o altro substrato proteine ECM, poiché la stessa tessuto DD produce grandi quantità di queste proteine. Questo è vantaggioso per il mantenimento dei nativi microambiente ECM e il fatturato del peccatosubstrati matrice ce sono importante regolatore dell'architettura del tessuto e della funzione 10, 11. Ad esempio, le proteine ECM, come fibronectina, laminina e collagene, possono influenzare la polarità anteriore-posteriore fibroblasti come simile mostrati per polarità apicale-basale in cellule epiteliali 12, 13 . cellule polarizzate hanno una distribuzione asimmetrica di molecole extracellulari che determina la migrazione delle cellule e l'espressione genica, ad esempio, l'accessibilità α1β1 integrina sulla membrana colpisce adesione delle cellule al collagene di tipo I 14. Dal momento che l'obiettivo primario di questo modello 3D è stato quello di preservare il microambiente nativo, è stato utilizzato alcun substrato matrice ECM artificiale.
In breve: campioni di resezione sono ugualmente tagliati in un ambiente sterile e posti su membrane nitrocellular. Se è richiesto un trattamento somministrato tramite iniezione i tessuti vengono iniettati dopo che sono state collocate sulla membrana. Se il trattamento non ha bisogno di essere amministrato via injezione poi il composto viene aggiunto al mezzo di coltura (Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM), con siero fetale di vitello 1% (FCS), 1% di penicillina-streptomicina (P / S)). Le colture vengono mantenute per un massimo di dieci giorni dopo che il tessuto è fissato in 4% paraformaldeide (PFA), elaborati attraverso soluzione di saccarosio al 30%, incorporato in OCT e conservati a -80 ° C, come descritto in precedenza 5.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida LUMC e AMC di umana comitato etico della ricerca.
1. Procedura chirurgica e Tissue Collection
Nota: Anche se esistono varie tecniche per l'asportazione chirurgica della contrattura di Dupuytren, il gold standard attuale è il fasciectomy parziali 15. La maggior parte dei pazienti sono trattati nella clinica day-surgery.
- Eseguire l'intervento chirurgico in anestesia generale o regionale in base alle preferenze del paziente e anestesista di e comorbidità del paziente. Queste considerazioni sono oltre la portata di questo documento. Prima di Incisione, toccare la pelle con un oggetto appuntito per verificare che l'anestesia sia soddisfacente. Utilizzare un laccio emostatico per facilitare la visualizzazione chirurgica in un campo esangue.
- Dopo Prepping sterile e drappeggi, segnare l'incisione previsto con una penna. Incidere la pelle con un bisturi sotto lente di ingrandimento sia longitudinalmente or utilizzando incisioni zigzag per prevenire contratture addizionali e anche per consentire l'esposizione sufficiente.
- Utilizzando forbici dissezione, liberare la pelle e lo strato sottocutaneo dalle sottostanti palmare fascia contratto. Identificare e proteggere il fascio neurovascolare del dito perché il cavo di malati può spostare verso la linea mediana. Una volta che il tessuto fibrotico (noduli e / o spinale) è delineato, accise bruscamente e regionale (subtotale) con un bisturi. Eseguire emostasi meticolosa sotto controllo del laccio al termine della procedura per impedire la formazione di ematomi.
- Per chiudere la pelle, utilizzare ulteriori Z-plasties avere allungamento parziale della pelle.
- Per questi studi utilizzano solo la parte del cavo nodulo fibrotico, la parte più attiva e cellulare della malattia. Avere il chirurgo esegue l'identificazione macroscopica. I noduli isolati nel palmo della mano sono spesso precursori o un cavo, ma sono quasi mai resecati, come di solito non causano sintomi.Quelli che sono stati sottoposti a resezione i noduli che facevano parte di un cavo del dito contratto. Identificare questi noduli dalla parte spessa duro delle cordicelle nel handpalm (Figura 1A).
- Una volta che il chirurgo rimuove il tessuto, trasferire immediatamente usando pinze sterili in una provetta da 50 ml contenente DMEM supplementato con 10% FCS e 1% (P / S). Mantenere il tessuto per un massimo di 2 ore in questo mezzo su una scatola di ghiaccio acquoso (4 ° C) (per esempio, il trasporto del tessuto dalla sala operatoria alla struttura coltura cellulare).
- Mantenere i campioni in ghiaccio (4 ° C), mentre si prepara per il prossimo passo. Preparazione dei materiali e di coltura cellulare camera richiede 10-20 min.
2. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e Cultura Inserti
Nota: Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversa indicazione.
- Preparare 500 ml di DMEM supplementato con 10% FCS e 1% (P / S) e filtro sterilize. Preriscaldare il mezzo a 37 ° C.
- Forcipe Autoclave, un paio di forbici Mayo curve lama (150-170 mm di lunghezza) e un paio di forbici Metzenbaum e conservare in un contenitore sterile.
- Sotto flusso laminare, aprire un 12-pozzetti cultura sterile. Inserire un inserto cultura (0,45 micron dimensioni dei pori, diametro 12 mm) in ciascun pozzetto della piastra 12 pozzetti (Figura 1B, pannello inferiore).
- Riempire la piastra 12 pozzetti con 600 ml di preriscaldata (37 ° C) Mezzi di coltura pipettando su e così non direttamente sulla membrana dell'inserto. Posizionare la piastra nel incubatore (37 ° C, 5% CO 2) (Figura 1B, pannello superiore).
- In alternativa, utilizzare un 24-pozzetti e aggiungere 300 ml di media per pozzetto. Il volume di terreno per pozzetto è ottimale quando uno strato del menisco viene formato tra il liquido e la parte inferiore dell'inserto membrana.
Nota: il supporto al fondo del pozzo diffonde attraverso la membr nitrocellulosaane formare lo strato menisco come illustrato negli schemi di figura 1B (pannello inferiore).
- In alternativa, utilizzare un 24-pozzetti e aggiungere 300 ml di media per pozzetto. Il volume di terreno per pozzetto è ottimale quando uno strato del menisco viene formato tra il liquido e la parte inferiore dell'inserto membrana.
3. Tissue Preparazione Impostazione ed Ex Vivo Tissue Culture
Nota: Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversa indicazione.
- Trasferire la parte del nodulo del cavo dal tubo 50 ml su un piatto da 100 millimetri Petri e aggiungere 10 ml di preriscaldata (37 ° C) di media. Assicurarsi che il tessuto è a contatto con il liquido durante l'intera procedura.
- Rimuovere lo strato di grasso perinodulare usando le forbici Metzenbaum. Eliminare il tessuto adiposo. Con l'uso di pinze e forbici curve pale, tagliare trasversalmente il tessuto in pezzi più piccoli (spessore massimo di 200 micron).
- Trasferire la piastra 12 pozzetti dal termostato nella cappa laminare. Verificare che la membrana dell'inserto ha trasformato trasparente (umido) e quindi è in contatto con il fluido.
- Utilizzando pinzeSollevare con attenzione una parte di tessuto toccando lo strato esterno (non applicare la tensione sul tessuto). Inserire una parte del tessuto sulla membrana dell'inserto coltura cellulare in modo che il tessuto rimanga in interfase aria medio. Culture un massimo di due parti di tessuto sullo stesso inserto / pozzetto.
- Assicurarsi che il tessuto è posto sulla membrana piatta, a contatto con il mezzo longitudinale tale che il tessuto non galleggia la membrana non sia completamente coperta dal mezzo. Evitare bolle d'aria.
Nota: A questo punto, è possibile aggiungere fattori di crescita o inibitori di interesse ai media; per esempio, composti di prova (A, B, C, D, E) in replicati e / o in curva concentrazione. Includere almeno 2 di controllo (non trattati) pezzi di tessuto in condizioni di crescita normali, per assicurare che l'esperimento è stato impostato correttamente. Incubare tessuti per 3-7 giorni in un tessuto culturale incubatore. - Infettare il tessuto sia con costrutto lentivirale o adenoviral se sovraespressione o abbattere experiments di un bisogno gene di interesse da eseguire (Figura 2). Trasferire una parte di tessuto da 12-pozzetti in un piatto 35 millimetri con pinze.
- Utilizzare un volume massimo di 10 ml di elevata virus titolo.
- Eseguire l'iniezione sotto un microscopio di dissezione con una siringa da insulina caricata con 50 microlitri di PBS contenente 10 ml di virus selezionato. Inserire l'ago perpendicolare al centro del tessuto.
- Lentamente iniettare il contenuto della siringa. Non ritrarre direttamente l'ago. Quando pungere il tessuto, non lasciare passare l'ago attraverso l'altro lato, ma mantenere l'ago all'interno del tessuto stesso (intorno al centro del tessuto).
- Trasferire il tessuto di nuovo nel 12-pozzetti, chiudere la piastra di coltura e metterlo in incubatrice (37 ° C, 5% CO 2).
4. Whole-mount immunofluorescenza colorazione e la ricostruzione 3D
Nota: Tutti i proprocedure vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversa indicazione. Il protocollo per l'intero immunostaining montaggio e l'imaging di seguito descritto è un adattamento da metodi precedentemente riportati utilizzati per altri tessuti 16-19. Buffer e materiali sono descritti nella tabella 1 e List materiali.
- Trasferimento tessuti dalla piastra di coltura a 2 ml microprovette contenenti PBS. Lavare 2x per 5 min in soluzione di PBS su una piattaforma rotante. Fissare tessuti in 4% PFA tamponata (1,5 ml di soluzione per tessuti in 2 ml provette da microcentrifuga), O / N a 4 ° C su una piattaforma rotante.
- Rimuovere PFA e lavare 3x in PBS per 5 minuti ciascuno.
- Disidratare tessuti mediante immersione in una soluzione di metanolo al 25% per 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma rotante. Aumentare la percentuale metanolo gradualmente (50%, 75%, 100%) con i tessuti immersi in ciascuna soluzione per 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma rotante.
- Tessuti di trasferimento in DMSO / soluzione di metanolo (permeabilizzazione step) per 3 settimane a 4 ° C,come descritto in precedenza 18.
Nota: In questa fase, i tessuti possono essere conservati a lungo termine in metanolo 100% a -20 ° C. - Procedere con la procedura di colorazione 16, 17; gradualmente reidratare tessuti (75% -50% -25% -0% serie metanolo). Eseguire ogni fase di reidratazione per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C, sotto costante agitazione.
- Incubare campioni con anticorpi primari in PBS contenente 1% di albumina sierica bovina (BSA) e 20% DMSO O / N a 4 ° C. Usare gli anticorpi ai seguenti rapporti con le scorte commerciali di PBS: anti-α actina muscolo liscio (1: 500, mouse), di tipo anti-collagene I (1: 500, di capra), anti-collagene di tipo III (1: 500, capra).
- Lavare estesamente in PBS per 48 ore a 4 ° C (soluzione PBS cambiamento 3 a 4 volte).
- Diluire appropriati anticorpi secondari (Alexa 555 anti-topo, Alexa 488 anti-capra) a 1: 250 di diluizione in PBS contenente 1% (BSA) e il 20% DMSO. Incubare O / N a 4 ° C.
- Lavare estesamente in PBS per 48 ore a 476; C e incubare con contrasto nucleare, TO-PRO-3 diluito 1: 500 in PBS alla fase di lavaggio finale.
Nota: TO-PRO-3 è un colorante DNA emettono lontano-rosso (con una linea laser 633 nm He-Ne) ed è abbinato per l'imaging simultaneo con altri canali; in questo tipo di tipo caso collagene I / collagene III (488 nm), α actina muscolo liscio (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). - Trasferire i tessuti ad una serie di metanolo (25% -50% -75%) a disidratare lentamente il tessuto; effettuare ogni passo di disidratazione per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C sotto costante agitazione.
- Tessuti di trasferimento in tubi di polipropilene. Tessuti chiari in metilsalicilato (maniglia sotto cappa chimica) 18 o come uso alternativo soluzione BABB 19. Incubare a RT sotto costante agitazione fino a quando i tessuti diventano trasparenti. Mount tra una diapositiva e un copri sigillato con set dura mezzo di montaggio (Figura 1C, pannello superiore).
- Campioni un'immagine su un micro confocale invertitaambito dotato di alta NA 63X e / o gli obiettivi immersione olio 100X (Figura 1C).
- Pulire l'obiettivo con la soluzione di pulizia fornito dal produttore del microscopio.
- Applicare una goccia di olio sulla lente dell'obiettivo. Posizionare il vetrino con il campione sul palco microscopio e concentrarsi sul campione.
- Impostare le configurazioni del microscopio per l'imaging simultaneo di fluorescenza a tre canali con linee laser 488 nm, 514 nm e 633 nm.
- Acquisire le immagini XY singoli o più immagini sul piano focale (Z pila) (Figura 3a). Utilizzare maggiore larghezza di Z stack per eseguire la ricostruzione in 3D. Per ottenere un'immagine ad alta risoluzione utilizzare bassa velocità di scansione, numero di scansioni medi (≥ 3) e di acquisire immagini a 16 bit di risoluzione 1.024 x 1.024 pixel.
- Analizzare le immagini Z pila acquisite: prima rinominare e salvare il file immagine (xyz). Utilizzando il programma software del microscopio confocale, configurare un proge intensità massimaction delle immagini Z pila in un 3D ricostruito un'immagine.
- Selezionare il file xyz, in "Strumenti di processo", fare clic su sotto "Visualizzazione" e "Proiezione 3D". Inserire "Maximum" nel metodo di proiezione (o "media" se il segnale fluorescente è saturo). Per una singola proiezione non cambiano X, Y, Z e aerei, e applicare lo strumento di proiezione (Figura 3B, r1).
- Utilizzare le immagini Z pila per creare una proiezione 3D con l'animazione (software confocale) per scopi di visualizzazione. Selezionare il file xyz, negli strumenti di processo, fare clic su sotto "Visualizzazione" e "Proiezione 3D".
- Clicca su "Crea Movie". Inserire l'angolo iniziale di rotazione in gradi (ad esempio, 0 ° come punto di partenza del film, l'asse Y) e clicca su "Set Start". Inserire l'angolo di rotazione in gradi End (asse Y) come punto finale del film (ad esempio, 180 ° o 3606; per una rotazione completa) e clicca su "Set End".
- Selezionare "Maximum" come metodo di proiezione (o "media" se il segnale fluorescente è saturo). Inserire il "numero di fotogrammi" per la rotazione della ricostruzione 3D (ad esempio, 20 rotazioni o superiore per ridurre la velocità di rotazione). Fare clic su "Applica". Esportare il filmato come file visivo (ad esempio, "avi") (Film supplementare 1) o l'esportazione in formato "tiff", che crea un file di immagine per ogni angolo di rotazione (Figura 3B, rotazione r4, r10, r18).
5. combinata seconda armonica Generation (collagene) e due fotoni fluorescenza Excited (elastina) Imaging su Ex Vivo Tissue durante Cultura
Nota: Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversa indicazione.
- Rimuovere le piastre transwell da incubatore e posizionare un singolo (non fissata) tiparte SSUE in una piastra di coltura cellulare 35 mm avente 500 ml di mezzo.
- Posizionare il tessuto in modo che l'asse lungo è piatto sulla piastra. Mantenere tessuto bagnato in ogni momento, tuttavia, non galleggiante.
- Inserire obiettivo a immerso acqua del microscopio multifotone direttamente a contatto con il tessuto (Figura 1C).
- Ottenere immagini con una lunghezza d'onda di eccitazione di 800 nm e raccogliere la luce emessa tra 371-425 nm (SHG, collagene) e 474-532 nm (autofluorescenza, elastina) (Figura 3C). Eseguire microscopia a due fotoni in un microscopio confocale verticale dotato di un laser a femtosecondi utilizzando un obiettivo ad immersione 20X acqua / 1.0 NA. Confocale Process stack con il software del produttore.
Nota: eccitazione con un laser vicino infrarosso di molecole di collagene crea imaging ad alta contrasto delle strutture di collagene nativo a diverse profondità.
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Representative Results
Il metodo di ex vivo, 3D coltura del tessuto connettivo è un sistema di set up semplice e robusto per comprendere la relazione tra ECM e altri componenti cellulari che costituiscono il tessuto DD e potenzialmente altri tipi di fibrosi pure. Inoltre questo sistema permette un metodo affidabile per testare gli effetti dei composti sulla differenti tipi cellulari ei loro effetti sul carico fibrotica 20.
I passi da raccolta di materiale chirurgico rifiuti derivati da fibrosi di Dupuytren, il montaggio della camera di coltura ed esempi di strumenti di analisi sono presentati in Figura 1. Come illustrato nella Figura 1, questo metodo fornisce uno strumento sperimentale per grandi schermi droga schermi, ad esempio, composti farmacologici antifibrotiche nonché lo studio della ECM modellazione in tempo reale e modo riproducibile. Parti nodulari del cavo fibrotica sono ugualmente tagliati e messi in lastre transwell; ogni parte del tessuto (100-200 micron) è coltivato in cima alla membrana di un inserto cultura (0,45 micron dimensioni dei pori, diametro 12 mm). Il terreno di coltura è aggiunto alla camera inferiore, permettendo il contatto con il tessuto attraverso la membrana. In media 30-40 parti di tessuto può essere derivato da un singolo esemplare di resezione, che permette lo screening su larga scala di farmaci; composti, piccole molecole o fattori di crescita. Esperimenti indirizzamento della concentrazione e / o l'effetto dipendente dal tempo di farmaci sono fattibili.
Come mostrato in Figura 2, l'espressione genica può essere manipolato (sovraespressione / abbattere) mediante l'uso di adeno / lentivirus direttamente iniettati nel tessuto. Fluorescenza trasduzione virale con tag viene eseguita in campioni di tessuto spesse freschi per iniezione. Tissue rimane in coltura per 24-48 ore dopo l'iniezione ed è fissato successivamente, incorporato e sezionato in 0,7 micron criosezioni. Inoltre, per analizzare l'effetto di composti differenti condizioni di coltura o la parte di tessutos sono fissi e sottoposti a tutta immunofluorescenza di montaggio come mostrato nella figura 3. imaging 3D di tessuti spessi avviene mediante microscopia confocale (Figura 3A-B). Un altro metodo è l'imaging 3D diretta su tessuti mantenute in coltura; endogena rimodellamento del collagene è studiata in tempo reale in appena sezionato, parti di tessuto non-fissi di generazione di seconda armonica (SHG) (Figura 3C). L'effetto di potenziali farmaci anti-fibrotiche è seguito anche in parti dello stesso tessuto in diversi punti temporali. Strutture di collagene di tessuto spesso vengono esposte con SHG in un microscopio multiphoton verticale. Durante l'imaging, campioni di tessuto sono collocati in media e vengono esposte con un obiettivo ad immersione acqua. Dopo l'imaging, i tessuti possono essere trasferiti al sistema cultura. Gli effetti possono essere studiati a livello cellulare e dell'ambiente extracellulare fornendo un vantaggio rispetto saggi cellulari in vitro. Ci sono diverse possibilità di analisi degli effetti biologici come istologia di sezioni di tessuto fissate, tutto immunofluorescenza montaggio e 3D ricostruzione di immagini al microscopio confocale, SHG e due fotoni di fluorescenza eccitata immagini di collagene endogeno ed elastina. Alcuni dei vantaggi del dell'imaging SHG sono l'uso di tessuto fresco, non fissa, che nessuna preparazione colorazione anticorpale è richiesto e che lo stesso tessuto può essere ripreso più volte (naturalmente durante condizioni di coltura). SHG e due fotoni imaging di fluorescenza emozionato è stato descritto in precedenza per il muscolo e del tessuto connettivo 21-23 e la struttura della parete arteriosa senza macchia 24, tuttavia, qui segnaliamo un'applicazione alternativa per lo studio della fibrosi di Dupuytren.
Figura 1. Schema di ex vivo 3D sistema di coltura tissutale. (A) DD permanente contrattura di flessione nella mano di un paziente prima della rimozione chirurgica. Questa cifra è stata modificata dal precedente studio 5. (B) Esempio di ex vivo cultura impostare. (C) Esempi di approcci sperimentali che possono essere utilizzati per l'analisi di ECM deposizione. Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.
Figura 2. ex vivo gene modulazione prova di principio virale-mediata espressione in tutto il tessuto monte. (A) I nuclei sono visualizzati con TO-PRO-3 dye (blu). Bar 75 micron. (B) la visualizzazione diretta del fluorescentidye DsRed (rosso), post-iniezione con Adenovirus esprimono-DsRed. Bar 75 micron. (C) immagine unita (colorazione nucleare in blu, DsRed in rosso). Localizzazione citoplasmatica di DsRed indicando consegna adenoviral nelle cellule entro 24 ore. Bars 75 micron. (DF) lentivirali trasduzione. (D) nuclei sono visualizzati con TO-PRO-3 colorante (blu). Bar 25 micron. (E) la visualizzazione diretta di GFP in sezioni di tessuto (verde), post-iniezione con particelle lenti-GFP. Bar 25 micron. (F) immagine unita di D ed E che indicano la localizzazione intracellulare di lenti-GFP. Bar 25 micron (GH) Esempio di knockdown lentivirus-mediata contro gene di interesse (designato come "A");. (G) Lentivirus portando sequenza shRNA strapazzateè stato iniettato ex vivo nel tessuto. Immunofluorescenza per proteina di interesse (designato come "A") mostrato in rosso. Bars 75 micron. (H) Lentivirus trasportano gene sequenza A-shRNA stato iniettato ex vivo nel tessuto. Immunofluorescenza per la proteina "A". I nuclei sono colorati con TO-PRO-3 dye. Bar 75 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. imaging 3D ricostruzione, generazione di seconda armonica e due fotoni di imaging di fluorescenza eccitata. (A) imaging 3D mediante microscopia confocale. (Xy) singole immagini in piani focali lungo diverse profondità dei tessuti (z = 50-200 micron). Whole montare Immucolorazione nofluorescence; α-lisce miofibroblasti marcatori actina muscolare (αSMA, rosso), colorazione nucleare (TO-PRO-3, blu). Bar:. 500 micron (B) 3D ricostruito immagine (Z pila 389 micron) di immagini RAW, come indicato nel pannello A a diverse rotazioni 3D indicati come "r1", "r4", "r10", "R18". Bar 500 micron. (C) modellazione contenuto di collagene endogeno per generazione di seconda armonica (SHG) imaging freschi parti di tessuto di spessore, (pannello di sinistra, verde). Due fotoni di fluorescenza eccitata (TPF) di strutture elastina della ECM è stato catturato al microscopio multiphoton (pannello centrale, rosso). Immagine unita di collagene (verde) ed elastina (rosso) (pannello di destra). Bar:. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Movie supplementare 1. rapprerap- 3D movie ricostruzione di tutto il tessuto monte di Dupuytren confocale di DD tessuto è stato eseguito dopo sette giorni ex vivo della cultura e di trasformazione per tutto il monte immunofluorescenza.; α-lisce miofibroblasti marcatori actina muscolare (αSMA, rosso), colorazione nucleare (TO-PRO-3, blu). Bar Scala = 500 micron. Frames = 20. Z = 389 micron. Cliccate qui per vedere il video.
| PBS (PBS) | 8.00 g NaCl (0.137 M) 0.20 g KCl (2.7 mM) 0.20 g KH 2 PO 4 (1.1 mM) 0,10 g MgCl 2 · 6H 2 O (0,5 mM) 2,16 g di Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (8.1 mM) 0,10 g anidra CaCl 2 (0.9 mM) H 2 O a 1 L |
| Sciogliere 4 g di paraformaldeide in un pallone contenente 100 ml tampone fosfato (PBS) nella cappa, coprire il pallone. Porre il pallone su un / blocco agitazione riscaldamento e mescolare delicatamente la soluzione. Monitorare la temperatura in modo che è raggiunge un massimo a 65 ° C. Evitare il surriscaldamento. Una volta che la paraformaldeide è sciolto e la soluzione appare limpida, spegnere il calore ma lasciare a muoversi. Non maneggiare per ragioni di sicurezza. Lasciare raffreddare. Una volta raffreddato, un'aliquota della soluzione e conservare a lungo termine in -20 ° C in un congelatore o frigorifero 4 ° C per una settimana massimo. | |
| BSA (albumina sierica bovina), 10% (w / v) | Sciogliere 10 g BSA in 100 ml di H 2 O. Filtro sterilizzare con un legame filtro da 0,22 micron a basso contenuto proteico. Conservare a 4 ° C. |
| DMSO / metanolo (20%) soluzione permeabilizzazione | Mescolare Dimetilsolfossido conMetanolo (1: 4 analogie, volume totale 100 ml). |
Tabella 1. Soluzioni tampone.
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Discussion
Le fasi più critiche di coltura ex vivo tessuto connettivo umano sono l'uso immediato del tessuto dopo la rimozione chirurgica per garantire la redditività; il tessuto dovrebbe rimanere in soluzione salina media o in ogni momento; mantenere una cultura sterile; sezioni trasversali di tessuto devono avere spessore massimo di 200 micron; set up del sistema di coltura ex vivo è ottimale quando il tessuto è in contatto con il mezzo ma non completamente sommerso. Piano dovrebbe essere aggiunto solo sulla camera esterna del transwell in un piccolo volume (per esempio, 500-600 microlitri per 12 pozzetti superficie piastra).
Il tessuto connettivo derivato dal Dupuytren di è impigliata in una struttura resistente con alto contenuto di proteine ECM come il collagene, proteoglicani, ed elastina; a causa di queste proprietà e inoltre grazie alla miofibroblasti contrattura può essere difficile per tagliare il tessuto. E 'importante utilizzare adeguati strumenti chirurgici; curva blADED forbici Mayo per il taglio di componenti di grandi dimensioni in uguale spessore e piccole forbici chirurgiche per tagliare pezzi di tessuto più piccoli (ad esempio, se più parti di tessuto sono necessari piastre uso da 24 pozzetti).
Metodi per lo studio di DD sono analisi istopatologiche del campione fibrotici escisse o derivazione di fibroblasti primari. Derivazione di cellule dal materiale paziente è fatto è di due modi; in uno dei metodi, parti di tessuto sono coltivate in piastre di coltura in plastica per un certo numero di settimane fino a quando c'è conseguenza di fibroblasti. Il secondo metodo è trattamento enzimatico del tessuto con collagenasi e tripsina. Il primo metodo è molto tempo, proprietà fibroblasti sono alterati a causa di condizioni di coltura e c'è la variabilità passaggio-dipendente tra passaggi della stessa linea cellulare. Il metodo enzimatico è più veloce e può essere utilizzato per cell sorting saggi, tuttavia, manutenzione in vitro di queste cellule fuori della ECM innata non riflette in vivo 25 (vale a dire mechanoregulation e meccanotrasduzione). Perdita di risultati di tensione in smontaggio delle fibre αSMA in MFB nel breve periodo di tempo 26. L'abbondanza di αSMA nella ex vivo 27, 28. Per quanto riguarda la variabilità tecnica e biologica, il nostro metodo è riproducibile (viabilità, reti ECM) e meno soggetto ad alterazioni dei tessuti a causa del tempo breve della cultura. Per esempio, il metodo di fibroblasti conseguenza richiede diverse settimane che possono causare variazioni biochimiche (ad esempio, l'accumulo di mutazioni genetiche, senescenza replicativa). Tuttavia, le caratteristiche genetiche specifiche del paziente e la variabilità biologica sono sé sfide per nel campo della ricerca DD e non possono essere affrontati con uno dei metodi attuali.
Come mostrato in questo protocollo, i campioni DD fibrotiche dopo la rimozione chirurgica sono direttamente coltivate nel sistema 3D ex vivo e / o scatto congelati. A seconda della domanda scientifica, la modifica del tessuto è possibile mediante aggiunta di fattori di crescita, composti chimici, vIRU-mediata consegna del gene, oligonucleotidi antisenso e miRNA. I composti possono essere consegnati nei media o con microiniezioni locali del tessuto nella camera di coltura 3D. Dopo 3 e fino a 7 giorni di coltura del tessuto può essere sia omogeneizzato per l'isolamento delle cellule e l'analisi FACS o l'isolamento di RNA totale e proteine per l'analisi del profilo di espressione, così come preparate per l'analisi istologica. Lo stato espressione di proteine fibrose (αSMA, collagene di tipo I e II, fibronectina), l'architettura del tessuto della parte nodulo di cavo e la consistenza della rete fibrosa viene valutata prima e dopo i trattamenti. Al fine di monitorare i riarrangiamenti ECM durante la cultura abbiamo combinato l'SHG (collagene) e due fotoni di fluorescenza eccitata (elastina) imaging.
I riarrangiamenti extracellulari possono essere quantificati o modellati utilizzando il software immagine quantificazione. Questi parametri forniscono un'indicazione degli effetti dei farmaci sulla fibrosi o la Molecalterazioni Ular che sono stati indotti durante la cultura. Array ECM Inoltre possono essere eseguite anche su singole fette di generare una migliore visione degli effetti. Nel complesso abbiamo stabilito un sistema robusto che permette lo studio della fibrosi ex vivo.
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Disclosures
Gli autori hanno presentato una domanda di brevetto per la malattia di Dupuytren: cultura d'organo 3D. # GB1307200. Contratti di licenza e di servizi commerciali sono a disposizione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45 μm pore size, 12 mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective. |
References
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