Summary
Болезнь Дюпюитрена (ДД) является фибропролиферативных заболевание ладони. Здесь мы приводим протокол к культуре резекции образцов из DD в трехмерном (3D) системе культуры. Такая краткосрочная система культуры позволяет сохранение структуры 3D и молекулярные свойства фиброзной ткани.
Introduction
Болезнь Дюпюитрена (DD), доброкачественная фибропролиферативных заболевание вызывает постоянное сгибание пальцев в связи с образованием узелков и шнуры в ладони. Хотя болезнь распространилась особенно высока среди кавказцев Северной Европы, основной генетический этиология этого заболевания остается неизвестной 1. Основной характеристикой ДД избыточное производство внеклеточного матрикса (ECM) белков (например, коллагена), которые образуют жесткую волокнистую ткань, занимающий пространство между жилами и кожи ладони и пальцев, постоянно нарушая тонких движений от руки 2, 3. рецидив болезни, говорит о внутренней генетические изменения в качестве причины фиброза 1, 4. эффективное лечение может быть ориентирована непосредственно на неконтролируемые фиброзные механизмы на клеточном и молекулярном уровне.
Наша последняя работа на фиброз привело нас к развитиюНовая система культуры 3D, что позволяет краткосрочный культуру человека фиброзной ткани с потенциалом тестирования на наркотики. Эта система помогла преодолеть предельный подход 2D фибробластов культур и определить роль частичного вниз регулирования, достигнутый пропуска экзона, в пути активации TGF-beta в посредничестве фиброз 5.
Мы разработали метод к культуре Экс Vivo человек резекция образцы от пациентов DD для изучения взаимодействия между миофибробластов и окружающей ECM 5, 6. Исследование Д. соединительной ткани фиброза, а также другие фиброзные заболевания зависит от гистопатологический анализ Иссеченную хирургическое Образцы, изоляция фибробластов из ткани и создания первичных культур или процедур сортировки клеток. Эти подходы довольно статического, так как они не позволяют экзогенный манипулирование свойствами заболеваний или терапевтического вмешательства со стороны экспериментатора. Кроме того, первичный CELL культуры, как правило, адаптироваться к условиям культивирования и их свойства выражения гена по существу от ситуации в естественных условиях отличаются от всех прохода, даже во время ранних пассажах (среди проход 3 и 6) 7, 8. Мы сумели сохранить отходов хирургического материала в Экс Vivo условия культивирования в течение периода времени, что позволяет изучение конкретного пациента характеристики и скрининга анти-фиброзных или противовоспалительных соединений наркотиков.
Система основана на нитроцеллюлозную мембрану, которая позволяет контакт ткани со средой, но не с пластика, таким образом, предотвращая изменение ткани при присоединении, как ранее наблюдали при культивировании DD фибробласты, а также другие типы клеток 9. Нет коллагеновый гель или другой белок, ЕСМ подложки не требуется, так как сама по себе ДД ткани производит большое количество этих белков. Это выгодно для поддержания родного ECM микросреды и оборота грехаCE матричных субстратов являются важным регулятором архитектуры и функции 10, 11 ткани. Например, ECM белки, такие как фибронектин, ламинин и коллаген, могут влиять на передних и задних полярность фибробластов, как аналогично представленным на апикально-базальной полярности в эпителиальных клетках 12, 13 . поляризованных клетки имеют асимметричное распределение молекул внеклеточного который определяет миграцию клеток и экспрессию генов, например, α1β1 интегрин доступность на мембране влияет клеточную адгезию к типу коллагена 14. С Основная цель этой 3D модели было сохранить родной микросреду, не использовался искусственный ECM подложке матрицы.
Вкратце: резекции образцы равной степени сократить в стерильной среде и помещали на nitrocellular мембран. Если лечение управляются с помощью инъекции требуется ткани вводят после того как они были размещены на мембране. Если лечение не требует быть введены с помощью Injотражения, то соединение добавляют к культуральной среде (модифицированной Игла среде Дульбекко (DMEM), с 1% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% пенициллина-стрептомицина (P / S)). Культуры поддерживали в течение не более десяти суток, после чего ткань фиксировали в 4% параформальдегида (PFA), обработанного с помощью 30% раствора сахарозы, вложенной в октябре соединения и хранили при -80 ° С, как описано ранее 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует руководству LUMC и AMC Научно-технического комитета по этике человека.
1. Хирургические процедуры и тканей Коллекция
Примечание: Хотя различные методы хирургического иссечения контрактуры Дюпюитрена существует, ток золотой стандарт частичное fasciectomy 15. Большинство пациентов лечатся в день хирургической клиники.
- Выполните операцию под общей или местной анестезией в зависимости от предпочтений пациента и анестезиолог-х и сопутствующих заболеваний пациента. Эти соображения выходят за рамки данной статьи. До разрез, прикасаться к коже с помощью острого предмета, чтобы убедиться, что анестезия является удовлетворительным. Используйте жгут, чтобы облегчить хирургическую визуализацию в результате бескровного области.
- После стерильной готовит и драпировки, выделить ожидаемую разрез с ручкой. Надрезать кожу скальпелем под лупой увеличении либо продольно оR с помощью зигзаг разрезы, чтобы предотвратить дополнительные контрактуры, а также для обеспечения достаточного воздействия.
- Использование ножниц рассечение, освободить кожу и подкожный слой из основных договорных фасции Palmaris. Выявление и охрана сосудисто-нервный пучок пальца, потому что больной мозг может вытеснять его к средней линии. После фиброзной ткани (узелка и / или шнура) подчеркивается, вырезать его резко и региональном (субтотальная) с помощью скальпеля. Выполнение тщательного гемостаза под контролем жгута в конце процедуры, чтобы предотвратить образование гематомы.
- Чтобы закрыть оболочку, использовать дополнительные Z-plasties, чтобы получить частичное удлинение кожи.
- Для этих исследований используют только узелок часть фиброзного шнура, наиболее активной и клеточного звена заболевания. У хирурга выполнять макроскопические идентификации. Выделенные узлы в ладони часто предшественников или шнур, но вряд ли когда-либо резекции, так как они, как правило, не вызывают симптомов.Те, кого мы резекции были узелки, которые были частью мозга, указанного в контракте пальца. Определите эти узелки на жестком толстой части шнуров в handpalm (рис 1а).
- После того, как хирург удаляет ткань, немедленно передать его с помощью стерильного пинцета в 50 мл пробирку, содержащую DMEM среде, дополненной 10% FCS и 1% (P / S). Держите ткани в течение максимум 2 часов в этой среде на коробке льду (4 o C) (например, транспортировка ткани из операционной, на объект для культивирования клеток).
- Держите образцов на льду (4 ° С) при подготовке к следующему шагу. Подготовка материалов и в клеточной культуре камере требуется 10-20 мин.
2. Подготовка инструментов, культуральной среды и культуры вставками
Примечание: Все процедуры проводили при комнатной температуре, если специально не указано иное.
- Приготовления 500 мл DMEM с добавлением 10% FCS и 1% (P / S) и фильтра сterilize. Prewarm среды на 37 ° С.
- Автоклав щипцы, пара изогнутых лезвием ножниц Майо (150-170 мм в длину) и пара Metzenbaum ножницами и хранить в стерильный контейнер.
- Под ламинарного потока, открыть стерильную культуральную пластину 12-а. Поместите одной культуры вставку (0,45 мкм размер пор, диаметр 12 мм) в каждую лунку 12-луночного планшета (Фиг.1В, нижняя панель).
- Заполните 12-луночный планшет с 600 мкл предварительно нагретой (37 ° C) культуральной среды с помощью пипетки на лунку, а не непосредственно на мембрану вкладыша. Место пластины в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2) (Фигура 1В, верхняя панель).
- В качестве альтернативы, использовать 24-луночного планшета и добавить 300 мкл среды на лунку. Объем среды на лунку является оптимальным, когда мениск слой образован между жидкостью и нижней части мембраны вставки.
Примечание: среда в нижней части скважины диффундирует через нитроцеллюлозный MembrЭНА формирования мениска слой, как показано на схемах фиг.1В (нижняя панель).
- В качестве альтернативы, использовать 24-луночного планшета и добавить 300 мкл среды на лунку. Объем среды на лунку является оптимальным, когда мениск слой образован между жидкостью и нижней части мембраны вставки.
3. Ткань Setup Подготовка и Ex Vivo культуры ткани
Примечание: Все процедуры проводили при комнатной температуре, если специально не указано иное.
- Трансфер узелок на кабеле от 50 мл трубку на блюдо 100 мм Петри и добавляют 10 мл предварительно нагретого (37 ° C) среды. Убедитесь, что ткань находится в контакте с жидкостью в течение всей процедуры.
- Снимите perinodular слой жира, используя ножницы Metzenbaum. Откажитесь от жировой ткани. При использовании щипцов и изогнутых лезвием ножниц, вырезать поперек ткани на более мелкие куски (максимальная толщина 200 мкм).
- Передача пластины 12-а из инкубатора в ламинарном шкафу. Убедитесь, что мембрана вставки получилось прозрачным (влажный) и, следовательно, находится в контакте со средой.
- Использование щипцовосторожно поднимите тканевой часть, коснувшись наружный слой (не применять напряжение на ткани). Поместите один ткани часть на мембрану из клеточной культуры вставки, так что ткань остается в воздушной среды интерфазы. Культура максимум из двух частей ткани на той же вставки / лунку.
- Убедитесь, что ткань не помещается ровно на мембране, в продольном контакте со средой таким образом, что ткани ни плавает от мембраны, ни полностью покрывается среды. Избегайте воздушных пузырьков.
Примечание: На этом этапе можно добавить факторы роста или ингибиторы, представляющие интерес для средств массовой информации; Например, тестируемые соединения (A, B, C, D, E) в повторах и / или в кривой концентрации. Включите по крайней мере 2 управления (необработанные) кусочков ткани при нормальных условиях роста, чтобы гарантировать, что эксперимент был настроен должным образом. Инкубируйте ткани в течение 3-7 дней в инкубаторе тканевых культур. - Инфекция ткани либо лентивирусным или аденовирусной конструкции, если гиперэкспрессией или сбить еxperiments гена интересов, должны быть выполнены (рисунок 2). Передача ткани часть от пластины 12-а в 35 мм блюдо с помощью щипцов.
- Использование максимального объема 10 мкл высокой титра вируса.
- Выполнение инъекции под микроскопом рассечение с инсулиновый шприц с грузом 50 мкл PBS, содержащий 10 мкл выбранного вируса. Поместите иглу перпендикулярно к центру ткани.
- Медленно вводить содержимое шприца. Не убрать иглу непосредственно. При прокалывания ткани, не позволить пройти через иглу с другой стороны, но поддерживать иглу внутри самой ткани (вокруг центра ткани).
- Передача ткани обратно в пластине 12-а, закрыть культуральный планшет и поместите его в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2).
4. Всего монтажа Иммунофлуоресценции Окрашивание и 3D реконструкции
Примечание: Все процедуры выполняются при комнатной температуре, если специально не указано иное. Протокол всей горе иммунным и визуализации, описанной ниже как адаптация от ранее описанного методов, используемых для других тканей 16-19. Буферы и материалы описаны в таблице 1 и список материалов.
- Передача ткани из культуральной пластины к 2 мл микроцентрифужных пробирках, содержащих PBS. Промыть 2x в течение 5 мин в PBS раствора на поворотной платформе. Исправить ткани в 4% буферный PFA (1,5 мл раствора на ткани в 2 мл микроцентрифужных пробирках), O / N при 4 ° С на вращающейся платформе.
- Удалить PFA и мыть 3 раза в PBS в течение 5 минут каждый.
- Высушить ткани путем погружения в 25% -ном растворе метанола в течение 2 ч при комнатной температуре на поворотной платформе. Увеличение процентного метанола постепенно (в 50%, 75%, 100%) с тканей, погруженных в каждый раствор в течение 2 ч при комнатной температуре на поворотной платформе.
- Передача ткани в ДМСО / метанол Раствор (пермеабилизации этапе) в течение 3 недель при 4 ° С,как описано выше 18.
Примечание: На этом этапе, ткани могут быть сохранены на долгий срок в 100% метаноле при -20 ° С. - Продолжайте Процедура окраски 16, 17; постепенно увлажняет ткани (75% -50% -25% -0% серии метанол). Выполнение каждой стадии регидратации в течение 2 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С при постоянном перемешивании.
- Инкубируйте образцы с первичными антителами в PBS, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 20% ДМСО O / N при 4 ° С. Использование антител в следующих соотношениях с использованием коммерческих запасов в PBS: анти-α актин гладких мышц (1: 500, мышь), анти-коллагена типа I (1: 500, козы), анти-коллаген типа III (1: 500, коза).
- Промыть широко в PBS в течение 48 ч при температуре 4 ° С (изменение раствора PBS, от 3 до 4 раз).
- Развести соответствующие вторичные антитела (Alexa 555 анти-мыши, Alexa 488 анти-козел) в соотношении 1: 250 разбавление в PBS, содержащем 1% (BSA) и 20% ДМСО. Инкубируйте O / N при 4 ° С.
- Промыть широко в PBS в течение 48 ч при 476; С и инкубировали с ядерным контрастирующая, К-PRO-3 разводили 1: 500 в PBS на конечной стадии промывки.
Примечание: TO-PRO-3 дальней красной излучающих краситель ДНК (с He-Ne 633 нм лазерной линии) и в сочетании для одновременного изображений с других каналов; в этом случае коллагена типа I / коллагена типа III (488 нм), α актин гладких мышц (555 нм), к-PRO-3 (647 нм). - Передача ткани в серии метанол (25% -50% -75%) медленно обезвоживают ткани; выполнять каждый шаг дегидратации в течение 2 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С при постоянном перемешивании.
- Передача ткани в полипропиленовых трубах. Очистить ткани в метилсалицилат (ручка при химическом капотом) 18 или в качестве альтернативы использованию раствора Бабб 19. Выдержите при комнатной температуре при постоянном перемешивании до тех пор, ткани не станут прозрачными. Устанавливается между горкой и покровного герметичного с жестким монтажный комплект среде (рис 1С, верхняя панель).
- Образцы изображение на перевернутой конфокальной микроСфера оснащен высокой Н.А. 63x и / или 100x целей масло погружения (Рисунок 1С).
- Очистите объектив с чистящим раствором, предоставленной производителем микроскопа.
- Нанесите один каплю масла на линзу объектива. Поместите слайд с образца на столике микроскопа и сосредоточиться на образце.
- Установите конфигураций на микроскопе для одновременного визуализации флуоресценции трехканальной с лазерных линий 488 нм, 514 нм и 633 нм.
- Приобретать отдельные изображения XY или несколько фокальной плоскости изображения (Z стека) (рис 3а). Используйте повышенную ширину Z стека для выполнения 3D-реконструкция. Для получения изображения с высоким разрешением использовать низкую скорость сканирования, количество средних сканирования (≥ 3), и получать 16-битные изображения разрешения 1024 х 1024 пикселей.
- Проанализируйте Z стек полученные изображения: сначала переименовать и сохранить файл изображения (XYZ). Использование программного обеспечения в конфокальной микроскопии, настроить максимальное PROJE интенсивностиие образов Z стека в 3D восстановленного изображения.
- Выберите файл XYZ, в «процесс Сервис", нажать на кнопку под "Визуализация" и "3D-проекции". Ввод "Максимум" в способе проекции (или "Средний", если флуоресцентный сигнал насыщенный). Для всего одна проекция не меняют X, Y и Z. самолетов, а также применять проекцию инструмент (рис 3B, r1).
- Используйте изображений Z стека для создания 3D-проекцию с анимацией (конфокальной программного обеспечения) для целей обзора. Выберите файл XYZ в процессе Tools, нажмите в разделе "Визуализация" и "3D-проекции".
- Нажмите на кнопку "Создать фильм". Введите начальный угол поворота в градусах (например, 0 °, как отправной точки фильма, Y оси) и нажмите на кнопку "Set Start". Введите конечный угол поворота в градусах (по оси Y) как конечной точки фильма (например, 180 ° или 3606; для полного вращения) и нажмите на кнопку "Установить End".
- Выбрать "Максимум" в качестве способа проекции (или "Средний", если флуоресцентный сигнал насыщенный). Введите "количество кадров" для вращения реконструкции 3D (например, 20 оборотов или выше, чтобы снизить скорость вращения). Нажмите на кнопку "Применить". Экспорт фильма в визуальном файла (например, "AVI") (Дополнительный Фильм 1) или экспортировать в "TIFF", то файл, который создает файл изображения для каждого угла поворота (рис 3B; вращение R4, R10, R18).
5. Комбинированный Генерация второй гармоники (коллаген) и Двухфотонное Возбужденные флуоресценции (эластин) изображений на Ex Vivo ткани во время культуры
Примечание: Все процедуры проводили при комнатной температуре, если специально не указано иное.
- Удалить Transwell пластины из инкубатора и место одного (незакрепленный) TiСГУП часть в 35 мм культуры клеток пластину, содержащую 500 мкл среды.
- Расположите ткань так, чтобы длинная ось является квартира на тарелку. Держите ткани во влажном состоянии Однако, не плывет.
- Поместите воды, погружают цели многофотонной микроскопа в непосредственном контакте с тканью (рис 1С).
- Получение изображений с длиной волны возбуждения 800 нм и собирают свет, излучаемый от 371-425 нм (ГСП, коллаген) и 474-532 нм (автофлуоресцентной, эластин) (рис 3C). Выполнение двухфотонного микроскопии в вертикальном конфокальной микроскопии, оснащенной фемтосекундного лазера с использованием 20X / NA 1,0 водно-иммерсионный объектив. Процесс конфокальной стеки с программным обеспечением производителя.
Примечание: Возбуждение с ближней инфракрасной лазерной молекул коллагена создает высокую контрастность изображений родных коллагеновых структур в различных глубинах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод экс естественных условиях, 3D культура соединительной ткани простое и надежное система, устанавливаемая понять отношение между ECM и других клеточных компонентов, составляющих DD ткани и потенциально других типов фиброза, а также. Кроме того эта система позволяет надежный способ проверить эффекты соединений на различных типах клеток и их воздействия на фиброзной нагрузки 20.
В нескольких шагах от сбора хирургического отходов материала, полученного из фиброза Дюпюитрена, сборка камеры культуры и примеры инструментов анализа представлены на рисунке 1. Как показано на рисунке 1, этот метод обеспечивает экспериментальный инструмент для больших экранов экранов наркотиков, например, антифиброзных лекарственные соединения, а также изучение ECM моделирования в режиме реального времени и воспроизводимым образом. Узловые части фиброзного шнура одинаково нарезанный и помещается в Transwell пластин; каждая ткань часть (100-200 мкм) культивируют в верхней части оболочки культуральной пластины (0,45 мкм размер пор, диаметр 12 мм). Культуральную среду добавляют в нижней камере, что позволяет контакт с тканью через мембрану. В среднем 30-40 тканей детали могут быть получены из одного образца резекции, что позволяет широкомасштабный скрининг лекарственных средств; Соединения, небольшие молекулы или факторы роста. Эксперименты адресации концентрации и / или времени в зависимости от эффекта препаратов возможно.
Как показано на фиг.2, экспрессия гена можно манипулировать (сверхэкспрессия / сбить) с использованием адено / лентивирусов непосредственно вводят в ткани. Флуоресцентно меченого вирусной трансдукции выполняется в свежих образцах толщиной ткани путем инъекции. Ткань остается в культуре в течение 24-48 ч после инъекции и последующей фиксации, встроенные и секционные в 0,7 мкм криосрезов. Кроме того, для анализа влияния различных соединений или условий культивирования тканей деталейс фиксируются и подвергали всей горе иммунофлуоресценции, как показано на фиг.3. 3D визуализации толстых тканей осуществляется конфокальной микроскопии (3А-В). Другой способ заключается в прямом эфире 3D визуализации на ткани поддерживали в культуре; эндогенный коллаген ремоделирования изучены в режиме реального времени в недавно рассеченные, частями нефиксированными ткани генерации второй гармоники (ГВГ) (3С). Эффект потенциальных анти-фиброзных препаратов также им на части одной и той же ткани в различные моменты времени. Коллагеновые структуры толщиной ткани визуализируют с помощью ГВГ в вертикальном МФ микроскопом. Во изображений, тканевые образцы помещают в среду и полученную с использованием водно-иммерсионный объектив. После обработки изображений, ткани могут быть переданы обратно в систему культуры. Эффекты могут быть изучены на уровне клеточной и внеклеточной среде, обеспечивающей преимущество над в пробирке клеточных анализов. Есть множество возможностей для анализис биологических эффектов, таких как гистология разделов фиксированной ткани, вся гора иммунофлюоресценции и 3D визуализации Реконструкция конфокальной микроскопии, ГВГ и два фотона рады флуоресценции изображений эндогенного коллагена и эластина. Некоторые из преимуществ визуализации ГСП являются использование свежей, нефиксированного ткани, что ни одно учебное окрашивание антитела не требуется, и что же ткань может быть отображена несколько раз (время курс в течение условий культивирования). ГСП и двухфотонная рады флуоресценции изображений была описана ранее для мышц и соединительной ткани 21-23 и структуры незапятнанным артериальной стенки 24, однако, здесь мы приводим альтернативный приложение для изучения фиброза Дюпюитрена.
Рисунок 1. Схема Экс Vivo 3D системы культуры ткани. () DD постоянного сгибания контрактура в руке пациента до хирургического удаления. Эта цифра была изменена с предыдущего исследования 5. (B) Пример Экс Vivo культуры создана. (С) примеры экспериментальных подходов, которые могут быть использованы для анализа осаждения ECM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
Рисунок 2. Доказательство-из-принципе экс естественных условиях гена модуляции вирусно-опосредованного выражения в целом горе ткани. () Ядра визуализировали с помощью К-PRO-3 красителя (синий). Бары 75 мкм. (B) Прямая визуализация флуоресцентногокраситель DsRed (красный), после инъекции с аденовируса, выражающей-DsRed. Бары 75 мкм. (C) объединенного изображения (окрашивание ядер в синий, DsRed красным цветом). Цитоплазма локализация DsRed указанием аденовирусной доставку в клетках в течение 24 ч. Бары 75 мкм. (DF) Lentiviral трансдукции. (D) Ядра визуализировали с помощью TO-PRO-3 красителя (синий). Бары 25 мкм. (E) прямой визуализации GFP в срезах тканей (зеленый), после инъекции с Ленти-GFP частиц. Бары 25 мкм. (F) Объединенный образ D и E, указывающие внутриклеточная локализация Ленти-GFP. Бары 25 мкм (GH) Пример лентивирусов-опосредованной нокдауна от интересующего гена (обозначенного как "А");. (G) Лентивирус проведении омлет последовательности shRNAвводили экс виво в ткани. Иммунофлуоресценции окрашивание интерес белка (обозначенные как "A") показан красным. Бары 75 мкм. (Н) Лентивирус проведении гена-shRNA последовательность вводили экс виво в ткани. Иммунофлуоресценции окрашивание белков "А". Ядра окрашиваются TO-PRO-3 красителя. Бары 75 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. 3D визуализации реконструкция, генерация второй гармоники и двухфотонная рады флуоресценции изображений. () 3D визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Холост (XY) изображения в фокальных плоскостях вдоль разных глубинах тканей (Z = 50-200 мкм). Всего горе иммуnofluorescence окрашивание; миофибробластного габаритные α-гладкие мышцы актина (αSMA, красный), Окрашивание (TO-PRO-3, синий). Бары:. 500 мкм (B) 3D реконструкция образа (Z стек 389 мкм) необработанных изображений, как указано в панели А в различных 3D поворотов, указанных в "r1", "r4", "r10", "r18". Бары 500 мкм. (C) моделирование эндогенного содержание коллагена в генерации второй гармоники (ГВГ) изображений в свежем, толстых деталей, ткани (левой панели, зеленый). Двухфотонное рады флуоресценции (ТПФ) эластиновых структур ECM был захвачен МФ микроскопии (средней панели, красный). На объединенном изображении коллагена (зеленый) и эластина (красный) (правая панель). Бары:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Дополнительная Фильм 1. представивитель 3D-реконструкция фильм всей горе ткани Дюпюитрена конфокальной визуализации DD ткани была выполнена после семидневного Экс Vivo культуры и обработки данных для всей иммунофлуоресцентного горе.; миофибробластного габаритные α-гладкие мышцы актина (αSMA, красный), Окрашивание (TO-PRO-3, синий). Шкала бар = 500 мкм. Рамки = 20. Z = 389 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео.
| PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) | 8,00 г NaCl (0,137 М) 0,20 г KCl (2,7 мм) 0,20 г KH 2 PO 4 (1,1 мм) 0,10 г MgCl 2 · 6H 2 O (0,5 мм) 2,16 г Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (8,1 мм) 0,10 г безводного CaCl 2 (0,9 мМ) H 2 O до 1 л |
| Растворите 4 г параформальдегида в колбу, содержащую 100 мл фосфатно-буферным раствором (PBS) в вытяжном шкафу, покрывают колбу. Поместить колбу на отопление / перемешивания блока и аккуратно перемешайте раствор. Монитор температуры таким образом, что это достигает максимального 65 ° C. Избегайте перегрева. После того, как параформальдегид растворяется и раствор становится ясно, выключите тепла, но оставить шевелиться. Не прикасайтесь по соображениям безопасности. Разрешить охлаждения. При охлаждении, Алиготе решение и сохранить на долгий срок в -20 ° C морозильнике или в 4 ° C холодильник для максимальной неделю. | |
| БСА (бычий сывороточный альбумин), 10% (вес / объем) | Растворите 10 г BSA в 100 мл H 2 O. Фильтр стерилизовать с использованием низкого связывания с белками фильтр 0,22 мкм. Хранить при 4 ° С. |
| ДМСО / метанол (20%) раствор пермеабилизации | Смешайте диметилсульфоксид сМетанол (1: 4 аналогии, общий объем 100 мл). |
Таблица 1. буферные растворы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важные шаги культивирования Экс Vivo человеческой соединительной ткани немедленное использование ткани после хирургического удаления обеспечения жизнеспособности; Ткань должна оставаться в среднесрочной или физиологического раствора во все времена; поддерживать стерильную культуру; поперечные срезы ткани должны иметь максимальную толщину 200 мкм; настроить экс виво системе культуры является оптимальным, когда ткань находится в контакте со средой, но не полностью погружен в воду. Средний должны быть добавлены только на внешней камере Transwell в небольшом объеме (например, 500-600 мкл на 12-луночные области поверхности пластины).
Соединительная ткань получена из Дюпюитрена запутался в жесткой структуре с высоким содержанием белков ВКМ, таких как коллаген, протеогликаны и эластина; Благодаря этим свойствам и, кроме того из-за миофибробластного контрактуры он может быть сложным, чтобы прорваться через ткань. Важно использовать соответствующие хирургические инструменты; изогнутые BLaded Майо ножницы для резки больших частей в равной толщины и небольших хирургических ножниц для резки более мелкие части тканей (например, если несколько частей ткани требуется использование 24-луночных планшетах).
Методы изучения DD являются гистологические анализы отделенных фиброзных образца, или вывод первичных фибробластов. Сотовый вывод из пациентов материала делается два способа; В одном из методов, тканевые части культивируют в пластиковых культуральных планшетах для нескольких недель, пока не будет следствием фибробластов. Второй способ ферментативную обработку ткани с коллагеназы и трипсина. Первый способ является трудоемким, фибробластов свойства изменен из-за условий культивирования и есть вариабельность проход зависит среди проходов одной и той же клеточной линии. Способ ферментативного быстрее, и он может быть использован для сортировки клеток анализы, однако, содержание этих клеток из врожденной ЕСМ в пробирке не отражает в естественных 25 (а именно mechanoregulation и механотрансдукции). Потеря результатов напряженности в разборки αSMA волокон в МФБ в короткий период времени 26. Обилие αSMA в экс естественных условиях 27, 28. Что касается технической и биологической изменчивости, наш метод является воспроизводимым (жизнеспособность, ECM сети) и менее склонны к ткани изменения из-за короткого времени культуры. Например, метод фибробластов выроста требуется несколько недель, которые могут вызвать биохимические изменения (например, накопление генетических мутаций, репликативное старение). Тем не менее, конкретного пациента генетические характеристики и биологическая изменчивость сами по себе являются проблемы в области исследований DD и не могут быть решены с любым из существующих методов.
Как показано в этом протоколе, фиброзные DD образцов после хирургического удаления непосредственно культивировали в экс виво 3D системы и / или быстро замораживали. В зависимости от научных вопрос, модификация ткани можно с добавлением факторов роста, химических соединений, Vирус-опосредованной доставки генов, антисмысловые олигонуклеотиды и микроРНК. Соединения могут быть доставлены в средствах массовой информации или с местными микроинъекции ткани в культуральной камере 3D. После 3 и до 7 дней культивирования тканей может быть либо гомогенизируют в течение выделения клеток и анализа FACS или выделения общей РНК и белков для анализа профиля экспрессии, а также обработаны для гистологического анализа. Статус выражение волокнистых белков (αSMA, коллаген типа I и II, фибронектина), ткани архитектуры узелка части мозга и консистенции волокнистой сети оценивается до и после лечения. В целях контроля за ECM перестановки в процессе культивирования мы объединили ГВГ (коллаген) и двухфотонную рады флуоресценции (эластина) изображений.
Внеклеточные перестановки могут быть количественно или моделируется с помощью изображений количественного программного обеспечения. Эти параметры дают представление о последствиях наркотиков на фиброз или MolecУлар изменения, которые были вызваны во время культивирования. Более того массивов ECM также может быть выполнена на отдельных кусочков, чтобы генерировать более полное представление о воздействии. В целом, мы создали надежную систему, которая позволяет изучать фиброза экс VIVO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы подали заявку на патент для болезни Дюпюитрена: 3D органной культуре. # GB1307200. Коммерческая лицензия и сервисные контракты доступны.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45 μm pore size, 12 mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective. |
References
- Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
- Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren's disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
- Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren's disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
- Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren's disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
- Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren's disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
- Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
- Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren's disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
- Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren's Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
- Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
- Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
- Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
- Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
- Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
- Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Karkampouna, S., de Julio, M. K. ruithof- Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
- Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
- Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
- Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
- Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
- Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
- Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).
