Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Humant Dupuytrens Published: April 18, 2015 doi: 10.3791/52534

Summary

Dupuytrens sjukdom (DD) är en fibroproliferativa sjukdom i handflatan. Här presenterar vi ett protokoll till kultur resektion exemplar från DD i en tredimensionell (3D) odlingssystem. En sådan kortsiktig kultur systemet tillåter bevarandet av 3D-strukturen och molekylära egenskaper hos fibrotiska vävnaden.

Introduction

Dupuytrens sjukdom (DD), orsakar en godartad fibroproliferativa sjukdom permanent böjning av fingrarna på grund av bildandet av knölar och sladdar i handflatan. Även spridningen sjukdomen är särskilt hög bland vita i norra Europa, den underliggande genetiska etiologin av sjukdomen är okänd 1. Det som främst kännetecknar DD är den överproduktion av extracellulärt matrix (ECM) proteiner (t.ex. kollagen), som utgör en tuff fibrös vävnad ockuperar utrymmet mellan senor och hud i handflatan och fingrarna, permanent störa de fina rörelser av handen 2, 3. Den återfall av sjukdomen tyder underliggande genetiska förändringar som orsak till fibros 1, 4. En effektiv behandling kan vara att rikta direkt de okontrollerbara fibrotiska mekanismer på cell- och molekylnivå.

Vår senaste arbete med fibros har lett oss till utvecklingen av ennytt 3D kultursystem som möjliggör kortsiktiga kultur av mänskligt fibrotisk vävnad med potential drogtester. Detta system har bidragit till att övervinna den begränsande synsätt av 2D fibroblastkulturer och att definiera en roll för den partiella nedreglering, uppnås genom exon hoppa, av TGF väg aktivering i medier fibros 5.

Vi har utvecklat en metod att odla ex vivo human resektion prover från DD patienter för att studera interaktionen mellan myofibroblaster och den omgivande ECM 5, 6. Studiet av DD bindvävsfibros samt andra fibrotiska sjukdomar bygger på histopatologisk analys av utskurna kirurgiska prover, isolering av fibroblaster från vävnaden och etablering av primära odlingar eller cellsorteringsprocedurer. Dessa tillvägagångssätt är ganska statiska eftersom de inte tillåter exogen manipulation av fastigheter sjukdomen eller terapeutiska ingrepp av försöks. Dessutom primära cell kulturer tenderar att anpassa sig till de odlingsbetingelser och deras genuttryck egenskaper skiljer sig väsentligt från situationen in vivo vid varje passage, även under tidiga passager (bland passagen 3 och 6) 7, 8. Vi har lyckats behålla avfallet kirurgiska materialet i ex vivo odlingsbetingelser under en tidsperiod som möjliggör studie av patientspecifika egenskaper och screening av anti-fibrotiska eller anti-inflammatoriska läkemedelsföreningar.

Systemet är baserat på ett nitrocellulosamembran som medger kontakt av vävnaden med mediet men inte med plasten således förhindra ändring av vävnaden vid infästning, såsom tidigare observerats vid odling DD fibroblaster samt andra celltyper 9. Ingen kollagengel eller andra ECM proteinsubstrat är nödvändigt, eftersom den DD vävnaden själv producerar stora mängder av dessa proteiner. Detta är fördelaktigt för upprätthållande av nativa ECM mikromiljö och omsättning syndce matris substrat är viktig reglerare av vävnad arkitektur och funktion 10, 11. Exempelvis ECM-proteiner såsom fibronektin, laminin och kollagen, kan påverka fram-bak polaritet fibroblaster som på liknande sätt visade för apikal-basal polaritet i epitelceller 12, 13 . Polarise celler har asymmetrisk fördelning av extracellulära molekyler som bestämmer cellmigration och genuttryck, t.ex. α1β1 grin tillgänglighet på membranet påverkar celladhesion till typ I kollagen 14. Eftersom ett primärt mål för denna 3D-modell var att bevara den naturliga mikroades ingen artificiell ECM matrissubstratet används.

I korthet: resektion exemplar är jämnt skuren i en steril miljö och placeras på nitrocellular membran. Om behandling administreras via injektion krävs vävnaderna injiceras efter att de har släppts ut på membranet. Om behandlingen inte kräver att administreras via injektion sedan föreningen sättes till odlingsmediet (Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), med en% fetalt kalvserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin (P / S)). De kulturerna bibehålls under högst tio dagar, varefter vävnaden fixeras i 4% paraformaldehyd (PFA), bearbetas genom 30% sackaros lösning, inbäddade i OCT förening och förvaras vid -80 ° C, som tidigare beskrivits 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll följer LUMC och AMC riktlinjer för mänskliga forskningsetisk kommitté.

Tissue Collection 1. kirurgiska ingrepp och

Anmärkning: Även om olika tekniker för kirurgisk excision av Dupuytrens kontraktur existerar, är den aktuella guldstandard partiell fasciectomy 15. De flesta patienter behandlas under dagen-kirurgi klinik.

  1. Utför operation under allmän eller regional anestesi enligt patientens och anestesiolog preferenser och patientens komorbiditet. Dessa överväganden är utanför ramen för denna uppsats. Före snittet, röra vid huden med ett vasst föremål för att verifiera att anestesi är tillfredsställande. Använd en tryckförband för att underlätta kirurgisk visualisering i en oblodig fält.
  2. Efter steril hudrengöring och draperingar, markera den förväntade snittet med en penna. Incise huden med en skalpell enligt lupp förstoring antingen longitudinellt or att använda sicksack snitt för att förhindra ytterligare kontrakturer och även för att möjliggöra tillräcklig exponering.
  3. Använda sax dissektion, befria huden och subkutana lager från de underliggande kontrakte fascia palmaris. Identifiera och skydda neurovaskulärt bunt av fingret eftersom det sjuka sladden kan förskjuta den mot mittlinjen. När fibrotiska vävnaden (knöl och / eller sladden) skisseras, skära det skarpt och regionalt (delsumma) med hjälp av en skalpell. Utför noggrann hemostas i tryckförband kontroll i slutet av förfarandet för att förhindra hematombildning.
  4. För att stänga huden, använda ytterligare Z-plasties att erhålla partiell förlängning av huden.
  5. För dessa studier använder endast knutan del av den fibrotiska sladd, den mest aktiva och cellulära delen av sjukdomen. Har kirurgen utför makroskopisk identifiering. De isolerade knutor i handflatan är ofta föregångare eller en sladd, men nästan aldrig opererande, eftersom de vanligtvis inte orsaka symptom.De som vi resekterade var knölar som var en del av en sladd av den avtalade fingret. Identifiera dessa knölar av den hårda tjocka delen av sladdarna i handpalm (Figur 1A).
  6. När kirurgen avlägsnar vävnad, omedelbart överföra den med hjälp av steril pincett till en 50 ml rör innehållande DMEM-medium kompletterat med 10% FCS och 1% (P / S). Håll vävnaden för högst 2 h i detta medium på en låda med våt is (4 ° C) (t.ex. transport av vävnad från operationsrummet till cellodlingsfaciliteten).
  7. Håll proverna på våt is (4 ° C) samtidigt förbereda sig för nästa steg. Beredning av material och cellodlingskammare kräver 10-20 min.

2. Beredning av instrument, odlingsmedium och kultur Inlägg

Obs: Alla procedurer utförs vid RT inte annat angivits.

  1. Förbered 500 ml DMEM kompletterat med 10% FCS och 1% (P / S) och filter sterilize. Prewarm mediet vid 37 ° C.
  2. Autoklav pincett, ett par krökta blad Mayo sax (150-170 mm i längd) och ett par Metzenbaum saxar och förvara i en steril behållare.
  3. Under laminärt flöde, öppna en steril 12-brunnars odlingsplatta. Placera en odlingsinsatsen (0,45 ^ m porstorlek, 12 mm i diameter) i varje brunn på 12-brunnar (Figur 1B, nedre fältet).
  4. Fyll 12-brunnar med 600 | il förvärmd (37 ° C) odlingsmedium genom pipettering på väl och inte direkt på membranet av skäret. Placera plattan i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2) (Figur 1B, övre panel).
    1. Alternativt kan man använda en 24-brunnar och tillsätt 300 | il medium per brunn. Den volym medium per brunn är optimal när en menisk skikt bildas mellan vätskan och den nedre delen av membraninsatsen.
      Anm: mediet vid botten av brunnen diffunderar genom nitrocellulosa Membrane bildar menisken skiktet som visas i systemen enligt figur 1B (undre panelen).

3. Vävnads Förberedelse och Ex Vivo Tissue Culture Setup

Obs: Alla procedurer utförs vid RT inte annat angivits.

  1. Överför knöl delen av sladden från 50 ml rör på en 100 mm petriskål och tillsätt 10 ml förvärmd (37 ° C) medium. Se till att vävnaden är i kontakt med vätskan under hela proceduren.
    1. Avlägsna perinodular fettlagret med hjälp av Metzenbaum sax. Kassera fettvävnad. Med användningen av pincett och de krökta blad sax, skär på tvären vävnaden i mindre bitar (maximal tjocklek på 200 ^ m).
  2. Överför 12-brunnar från inkubatorn till laminärt huven. Kontrollera att membranet hos insatsen har vänt transparent (våt) och därför är i kontakt med mediet.
  3. Använda pincettförsiktigt lyfta en vävnadsdelen genom att röra det yttre lagret (gäller inte spänningen på vävnaden). Placera en vävnadsdel på membranet av cellodlingsinsatsen så att vävnaden förblir i luft-mediet interfas. Kultur högst två vävnadsdelar på samma insats / brunn.
  4. Se till att vävnaden placeras plant på membranet, i längd kontakt med mediet så att vävnaden varken flyter bort membranet heller är helt täckt av medium. Undvik luftbubblor.
    OBS: I detta skede är det möjligt att lägga till tillväxtfaktorer eller hämmare av intresse för media; exempelvis testföreningar (A, B, C, D, E) i replikat och / eller i koncentrationskurva. Inkludera minst 2 kontroll (obehandlade) bitar av vävnad under normala tillväxtförhållanden för att säkerställa att experimentet har satts upp ordentligt. Inkubera vävnader för 3-7 dagar i en vävnadskultur inkubator.
  5. Infektera vävnaden med antingen lentiviral eller adenovirus konstruktion om överuttryck eller slå ner experiments av en gen-om-intresse måste utföras (Figur 2). Överför en vävnadsdelen från 12-brunnar i en 35 mm skål med pincett.
    1. Använd en maximal volym av 10 | il av hög titer virus.
    2. Utför injektion under en dissektion mikroskop med en insulinspruta laddad med 50 pl PBS innehållande 10 pl av den valda viruset. Placera nålen vinkelrätt mot centrum av vävnaden.
    3. Injicera långsamt innehållet i sprutan. Inte dra in nålen direkt. När punktering av vävnaden, låt inte nålen går genom den andra sidan, men bibehålla nålen i vävnaden själv (runt centrum av vävnaden).
    4. Överför vävnaden tillbaka in i 12-brunnar, stänger odlingsplattan och placera den i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2).

4. Hela montering immunofluorescensfärgning och 3D återuppbyggnad

Obs: Alla proförfaranden utförs vid RT inte annat angivits. Protokollet för hela berget immunfärgning och bildbehandling som beskrivs nedan är en anpassning från tidigare rapporterade metoder som används för andra vävnader 16-19. Buffertar och material är beskrivna i tabell 1 och lista över material.

  1. Överför vävnader från odlingsplattan till 2 ml mikrorör innehållande PBS. Tvätta 2x för 5 minuter i PBS-lösning på en roterande plattform. Fix vävnader i 4% buffrad PFA (1,5 ml lösning per vävnad i 2 ml mikrocentrifugrör), O / N vid 4 ° C på en roterande plattform.
  2. Ta bort PFA och tvätta 3x i PBS i 5 min vardera.
  3. Dehydrera vävnader genom nedsänkning i en 25% metanollösning under 2 h vid RT på en roterande plattform. Öka metanolprocent gradvis (50%, 75%, 100%) med vävnaderna nedsänkta vid varje lösning under 2 h vid RT på en roterande plattform.
  4. Överförings vävnader i DMSO / metanol-lösning (permeabilization steg) för 3 veckor vid 4 ° C,som beskrivits tidigare 18.
    OBS: I detta skede kan vävnaderna förvaras långsiktigt i 100% metanol vid -20 ° C.
  5. Fortsätt med färgning förfarande 16, 17; gradvis rehydrera vävnader (75% -50% -25% -0% metanol-serien). Utför varje rehydrering steg för 2 h vid RT eller O / N vid 4 ° C, under konstant omrörning.
  6. Inkubera proverna med primära antikroppar i PBS innehållande 1% bovint serumalbumin (BSA) och 20% DMSO O / N vid 4 ° C. Använd antikroppar vid följande förhållanden med hjälp av kommersiella bestånd i PBS: anti-α glattmuskelaktin (1: 500, mus), anti-kollagen typ I (1: 500, get), anti-kollagen typ III (1: 500, get).
  7. Tvätta i stor omfattning i PBS under 48 h vid 4 ° C (byt PBS-lösning 3-4 gånger).
  8. Späd lämpliga sekundära antikroppar (Alexa 555 anti-mus, Alexa 488 anti-get) vid 1: 250 utspädning i PBS innehållande 1% (BSA) och 20% DMSO. Inkubera O / N vid 4 ° C.
  9. Tvätta i stor omfattning i PBS under 48 h vid 476; C och inkubera med nukleär motfärg, TO-PRO-3 utspädd 1: 500 i PBS vid det slutliga tvättsteg.
    Obs: TO-PRO-3 är ett långt rött avger DNA färgämne (med en He-Ne 633 nm laserlinjen) och kombineras för samtidig avbildning med andra kanaler; i det här fallet kollagen typ I / kollagen typ III (488 nm), α glattmuskelaktin (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm).
  10. Överför vävnaderna till en metanol serier (25% -50% -75%) för att sakta dehydratisera vävnaden; utför varje dehydratiseringssteg under 2 h vid RT eller O / N vid 4 ° C under konstant omröring.
    1. Överför vävnader i polypropenrör. Tydliga vävnader i metylsalicylat (handtaget under kemisk huva) 18 eller som ett alternativ användning BABB lösning 19. Inkubera vid rumstemperatur under konstant omrörning till dess att vävnaderna blir transparenta. Mount mellan en bild och en täck förseglad med hårda set monteringsmedium (Figur 1C, övre panelen).
  11. Bild prover på en inverterad konfokala mikroomfattning utrustad med hög NA 63X och / eller 100X oljeimmersions mål (Figur 1C).
    1. Rengör linsen med rengöringslösning som tillhandahålls av mikroskopet tillverkaren.
    2. Applicera en droppe olja på objektivet. Placera bilden med provet på mikroskop scenen och fokusera på provet.
  12. Ställ konfiguration på mikroskopet för samtidig avbildning av tre-kanals fluorescens med laserlinjer 488 nm, 514 nm och 633 nm.
  13. Förvärva enstaka XY bilder eller flera Focal Plane bilder (Z stack) (Figur 3A). Använd ökad bredd av Z stacken för att utföra 3D-rekonstruktion. För att få en högupplöst bild använda låg scanningshastighet, antal genomsnittliga skanningar (≥ 3) och förvärva 16-bitarsbilder av 1,024 x 1,024 pixlar.
  14. Analysera Z stacken förvärvade bilder: först byta namn och spara bildfilen (xyz). Använda programvaran för konfokalmikroskop, konfigurera en maximal intensitet projeInsatser av Z stack bilder i en 3D-rekonstruerade bilden.
    1. Välj xyz filen i "Process Verktyg", klicka i "Visualisering" och "3D projicering". Skriv "Maximum" i metoden enligt utsprånget (eller "Medel" om den fluorescerande signalen är mättad). För en enda projektion inte ändrar X-, Y- och Z-planen, och tillämpa projektionsverktyget (figur 3B, r1).
  15. Använd Z stack bilder för att skapa en 3D-projektion med animation (konfokal programvara) för visningssyfte. Välj xyz filen, i processen Verktyg, klicka under "Visualisering" och "3D projicering".
    1. Klicka på "Skapa film". Ange Start Rotation vinkel i grader (t.ex. 0 ° som utgångspunkt av filmen, Y-axeln) och klicka på "Set Start". Ange End Rotation vinkel i grader (Y-axeln) som slutpunkt filmen (t.ex. 180 ° eller 3606; för en komplett rotation) och klicka på "Ställ End".
    2. Välj "max" som en metod för utsprång (eller "Medel" om den fluorescerande signalen är mättad). Ange "Antal Frames" för rotation av 3D-rekonstruktion (t.ex. 20 rotationer eller högre för att minska rotationshastigheten). Klicka på "Apply". Exportera filmen som visuell fil (t.ex. "avi") (Kompletterande Movie 1) eller export som "tiff" fil som skapar en bildfil för varje rotationsvinkel (Figur 3B, rotations r4, r10, r18).

5. Kombinerad Second Harmonic Generation (Collagen) och Två-foton Upphetsad fluorescens (Elastin) Imaging på Ex Vivo Tissue under Kultur

Obs: Alla procedurer utförs vid RT inte annat angivits.

  1. Ta Transwell plattor från inkubatorn och placera en enda (ofixerade) tissue del i en 35 mm cell odlingsplatta innehållande 500 | il medium.
  2. Placera i vävnaden så att den långa axeln är platt på plattan. Håll vävnad våt hela tiden dock, inte flytande.
  3. Placera vatten-nedsänkt målet med multifotonmikroskop direkt i kontakt med vävnaden (figur 1C).
  4. Erhålla bilder med en excitationsvåglängd av 800 nm och samla utsänt ljus mellan 371-425 nm (SHG, kollagen) och 474-532 nm (autofluorescens, elastin) (figur 3C). Utför två-foton mikroskopi i upprätt konfokalmikroskop utrustad med en femtosecond laser med hjälp av en 20X / 1.0 NA vattenimmersionsobjektiv. Process konfokala travar med tillverkarens programvara.
    Obs: Excitation med nära infraröd laser av kollagenmolekyler skapar hög kontrast avbildning av infödda kollagenstrukturerna i olika djup.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoden för ex vivo, är 3D kultur av bindväv ett enkelt och robust uppsättning upp system för att förstå sambandet mellan ECM och andra cellkomponenter som utgör DD vävnad och eventuellt andra typer av fibros också. Dessutom detta system möjliggör en tillförlitlig metod för att testa effekterna av föreningar på olika celltyper och deras effekter på fibrotiska lasten 20.

Stegen från insamling av kirurgiska avfallsmaterial härrörande från Dupuytrens fibros, är monteringen av odlingskammare och exempel på analysverktyg presenteras i figur 1. Såsom illustreras i figur 1, ger denna metod en experimentell verktyg för stora skärmar drogskärmar, t.ex. antifibrotisk läkemedelssubstanser samt studier av ECM-modellering i en realtid och reproducerbart sätt. Nodulär delar av fibrotiska sladden är jämnt skivas och placeras i Transwell plattor; varje vävnad delen (100-200 | im) odlas ovanpå membranet i en odlingsinsatsen (0,45 ^ m porstorlek, 12 mm diameter). Odlingsmedium tillsätts vid den nedre kammaren, vilket gör kontakt med vävnaden genom membranet. I genomsnitt 30-40 vävnadsdelar kan härledas från en enda resektion exemplar, som möjliggör storskalig screening av läkemedel; föreningar, små molekyler eller tillväxtfaktorer. Experiment itu koncentrationen och / eller tidsberoende effekten av droger är genomförbara.

Såsom visas i fig 2, kan genuttryck manipuleras (expression / slå ner) med användning av adeno / lentivirus injiceras direkt in i vävnaden. Fluorescerande taggade viral transduktion utförs i fräscha tjocka vävnadsprover genom injektion. Tissue förblir i kultur för 24-48 timmar efter injektion och därefter fast, bäddades och snitt i 0.7 um kryosnitt. Dessutom, för att analysera effekten av olika föreningar eller odlingsbetingelser den vävnadsdelar är fasta och utsattes för hela montera immunofluorescens såsom visas i fig 3. 3D-avbildning av tjocka vävnader görs genom konfokal mikroskopi (Figur 3A-B). En annan metod är den levande 3D-röntgen på vävnader upprätthålls i kultur; endogena kollagen ombyggnad studeras i realtid i färsk dissekerade, icke fixerat delar andra harmoniska generationen (SHG) (Figur 3C). Effekten av potentiella antifibrotiska läkemedel följs också i delar av samma vävnad vid olika tidpunkter. Kollagen strukturer tjock vävnad avbildas med SHG i upprätt multifotonmikroskop. Under avbildning, är vävnadsprover placerades i medium och avbildas med en vattenimmersionsobjektiv. Efter avbildning, kan vävnaderna återföras till odlingssystemet. Effekter kan studeras på nivån för cellulära och extracellulära miljön ger en fördel över in vitro cellbaserade analyser. Det finns flera möjligheter för analys av biologiska effekter såsom histologi sektioner fasta vävnads, hela berget immunofluorescens och 3D-rekonstruktion avbildning av konfokalmikroskopi, SHG och två-foton glada fluorescens avbildning av endogen kollagen och elastin. Några av fördelarna med SHG avbildning är användning av färsk, icke fixerat, att ingen antikroppsfärgning beredning krävs, och att samma vävnad kan avbildas flera gånger (tidsförloppet under odlingsbetingelser). SHG och två-foton glada fluorescens avbildning har beskrivits tidigare för muskler och bindväv 21-23 och ofärgade artärväggstruktur 24, dock här rapporterar vi ett alternativt program för studier av Dupuytrens fibros.

Figur 1
Figur 1. Schema för ex vivo 3D vävnadskultursystem. (A) DD permanent flexionskontraktur i handen av en patient före kirurgiskt avlägsnande. Denna siffra har ändrats från tidigare studier 5. (B) Exempel på ex vivo kultur inrättas. (C) Exempel på experimentella metoder som kan användas för analys av ECM nedfall. Klicka här för att se en större version av bilden.

Figur 2
Figur 2. Proof-of-principen ex vivo viral-medierad genuttryck modulering i hela berget vävnad. (A) Kärnor visualiseras med TO-PRO-3 färgämne (blå). Bars 75 um. (B) Direkt visualisering av fluorescerandefärgämne DsRed (röd), efter injektion med adenovirus uttryckande-DsRed. Bars 75 um. (C) sammanslagna bilden (nukleär färgning i blått, dsRed i rött). Cytoplasmisk lokalisering av DsRed indikerar adenoviral leverans i cellerna inom 24 timmar. Bars 75 | im. (DF) Lentiviral transduktion. (D) Kärnor visualiseras med TO-PRO-3-färgämne (blå). Bars 25 um. (E) direkt visualisering av GFP i vävnadssektioner (grön), efter injektion med Lenti-GFP partiklar. Bars 25 um. (F) Sammanslagen bild av D och E anger intracellulär lokalisering av Lenti-GFP. Bars 25 pm (GH) Exempel på lentivirus-medierad knockdown mot gen av intresse (som "A");. (G) Lentivirus bär kodad shRNA sekvensinjicerades ex vivo in i vävnaden. Immunofluorescensfärgning för proteinet av intresse (som "A") som visas i rött. Bars 75 | im. (H) Lentivirus som bär gen A-shRNA sekvens injicerades ex vivo in i vävnaden. Immunofluorescensfärgning för protein "A". Kärnor färgas med TO-PRO-3 färgämne. Bars 75 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. 3D-rekonstruktion avbildning, andra harmoniska generationen och två-photon glada fluorescens avbildning. (A) 3D avbildning av konfokalmikroskopi. Enstaka (xy) bilder i fokalplan längs olika vävnadsdjup (z = 50-200 mikrometer). Sammanlagt mount IMMUnofluorescence färgning; myofibroblast markör α-glattmuskelaktin (αSMA, röd), nukleär färgning (TO-PRO-3, blå). Bars:. 500 pm (B) 3D rekonstruerade bilden (Z stacken 389 nm) av råbilder som visas i panelen A vid olika 3D rotationer markerade som "r1", "r4", "r10", "r18". Bars 500 nm. (C) Endogen kollagenhalt modellering av andra harmoniska generationen (SHG) avbildning i fräscha, tjocka vävnadsdelar (vänstra panelen, grön). Två-foton glada fluorescens (TPF) av elastin strukturer ECM fångades av multifotonmikroskop (mittpanelen, röd). Sammanslagna bilden av kollagen (grön) och elastin (röd) (höger panel). Bars:. 100 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande Movie 1. repredare 3D rekonstruktion filmen Dupuytrens hela montera vävnad Confocal avbildning av DD vävnad utfördes efter sju dagar ex vivo kultur och behandling för hela berget immunofluorescensfärgning.; myofibroblast markör α-glattmuskelaktin (αSMA, röd), nukleär färgning (TO-PRO-3, blå). Skalstreck = 500 | im. Ramar = 20. Z = 389 nm. Klicka här för att se filmen.

4% ​​paraformaldehyd / PBS
PBS (fosfatbuffrad saltlösning) 8,00 g NaCl (0,137 M)
0,20 g KCl (2,7 mM)
0,20 g KH 2 PO 4 (1,1 mM)
0,10 g MgCl2 · 6H 2 O (0,5 mM)
2,16 g Na 2 HPO 4 · 7 H2O (8,1 mM)
0,10 g vattenfri CaCl2 (0,9 mM)
H2O till 1 L
Lös 4 g paraformaldehyd i en kolv innehållande 100 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i dragskåp, täcker kolven. Placera kolven på en värme / omrörnings blocket och försiktigt röra om lösningen. Övervaka temperaturen så det är når en maximal 65 ° C. Undvik överhettning. När paraformaldehyden har upplösts och lösningen verkar klar, stäng av värmen men låt röra. Hantera inte av säkerhetsskäl. Tillåt kylning. När svalnat, alikvot lösningen och förvara långsiktigt i -20 ° C frys eller i en 4 ° C kylskåp för maximal veckan.
BSA (bovint serumalbumin), 10% (vikt / volym) Lös 10 g BSA i 100 ml H2O Filtersterilisera med användning av ett lågproteinbindande 0,22 ^ m filter. Förvaras vid 4 ° C.
DMSO / metanol (20%) permeabilization lösning Blanda Dimethyl Sulfoxide medMetanol (1: 4 analogier, total volym 100 ml).

Tabell 1. Buffertlösningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mest kritiska stegen i odling ex vivo human bindväv är omedelbar användning av vävnaden efter kirurgiskt avlägsnande för att säkerställa lönsamhet; vävnaden bör förbli i medium eller saltlösning vid alla tillfällen; upprätthålla en steril kultur; tvärsektioner av vävnad borde ha maximalt 200 um tjocklek; inrättats av ex vivo odlingssystemet är optimal när vävnaden är i kontakt med mediet men inte helt nedsänkt. Medium bör läggas enbart på utsidan kammaren i transwell i en liten volym (t.ex. 500-600 il per 12-brunnar yta).

Bindväv härrör från Dupuytrens är intrasslad i en tuff struktur med högt innehåll av ECM-proteiner såsom kollagen, proteoglykaner och elastin; på grund av dessa egenskaper och dessutom på grund av myofibroblast kontraktur det kan vara svårt att skära genom vävnaden. Det är viktigt att använda lämpliga kirurgiska verktyg; krökt BLAded Mayo sax för att skära större delar i samma tjocklek och mindre kirurgiska saxar för kapning mindre vävnadsdelar (t.ex. om fler vävnadsdelar används 24-hålsplattor krävs).

Metoder för studiet av DD är histopatologiska analyser av den utskurna fibrotiska provet, eller härledning av primära fibroblaster. Cell härledning från patientmaterial är gjort är två sätt; i någon av metoderna, vävnadsdelar odlas i plastkulturplattor för ett antal veckor tills det finns utväxt av fibroblaster. Den andra metoden är enzymatisk behandling av vävnad med kollagenas och trypsin. Den första metoden är tidskrävande, är fibroblast egenskaper förändras på grund av odlingsbetingelser och det finns passage beroende variation bland passager av samma cellinje. Den enzymatiska metoden är snabbare och det kan användas för cellsortering analyser emellertid betyder in vitro upprätthållande av dessa celler ut från det medfödda ECM reflektera inte in vivo 25 (dvs. mechanoregulation och mechanotransduction). Förlust av spänning leder demontering av αSMA fibrer i MFBs i kort tid 26. Överflödet av αSMA i ex vivo 27, 28. När det gäller teknisk och biologisk variabilitet, är vår metod reproducerbar (viabilitet, ECM-nätverk) och mindre benägna att vävnads förändringar till följd av kort tid av kultur. Exempelvis, metoden för fibroblast utväxt kräver flera veckor som kan orsaka biokemiska förändringar (t.ex. ackumulering av genetiska mutationer, replikativ hudåldrande). Men patientspecifika genetiska egenskaper och biologisk variabilitet är per se utmaningarna inom forskningsområdet DD och kan inte tacklas med någon av de nuvarande metoderna.

Som framgår av detta protokoll, fibrotiska DD prover efter kirurgiskt avlägsnande är direkt odlas i ex vivo 3D-system och / eller snabbfrystes. Beroende på den vetenskapliga fråga, är möjlig modifiering av vävnaden genom tillsats av tillväxtfaktorer, kemiska föreningar, virus-medierad gentillförsel, antisensoligonukleotider och miRNA. Föreningar kan levereras i media eller med lokala microinjections av vävnaden i 3D kulturkammaren. Efter tre och upp till 7 dagars odling vävnaden kan antingen homogeniserats för cellisolering och FACS-analys eller isolering av totalt RNA och proteiner för uttrycksprofilanalys, såväl som bearbetas för histologisk analys. Uttrycket status fibrösa proteiner (αSMA, kollagen typ I och II, fibronektin), vävnadsarkitektur av knuta delen av sladden och konsistensen av fibrösa nätverket bedöms före och efter behandlingarna. För att övervaka ECM omflyttningar under kulturen kombinerade vi SHG (kollagen) och två-photon glada fluorescens (elastin) avbildning.

De extracellulära omdisponeringar kan sedan kvantifieras eller modelleras med hjälp bild kvantifiering programvara. Dessa parametrar ger en indikation av effekterna läkemedels på fibros eller MolecUlar förändringar som har inducerats under odlingen. Dessutom ECM arrayer kan också utföras på enstaka skivor för att skapa en bättre överblick över effekterna. Sammantaget har vi etablerat ett robust system som tillåter studier av fibros ex vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har lämnat in en patentansökan för Dupuytrens sjukdom: 3D organkultur. # GB1307200. Kommersiella licenser och serviceavtal finns tillgängliga.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Invitrogen 11965-084
fetal calf serum (FCS) Gibco high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin Invitrogen 15070-063
Cell culture inserts Millicell PIHA01250 0.45 μm pore size, 12 mm diameter
anti-collagen type I Southern Biotech 1310-08
anti-α smooth muscle actin Sigma A2547
anti-collagen type III Southern Biotech 1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Invitrogen A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody Invitrogen A-11055
TOPRO-3 Invitrogen T3605
methylsalicylate Sigma M6752
paraformaldehyde Sigma P6148
Tissue Tek OCT Sakura 25608-930
Microsccope glass coverslips Menzel-Glaser BB024060A1 24 x 60 mm
Microscope SuperFrost slides Menzel-Glaser AA00000102E 76 x 26 mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium Vector laboratories H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope Leica Microsystems Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope Jena, Germany Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
  2. Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren's disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
  3. Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren's disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
  4. Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren's disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
  5. Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren's disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
  6. Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
  7. Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren's disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
  8. Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren's Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
  9. Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
  10. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
  11. Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
  12. Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
  13. Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
  14. Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
  15. Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
  16. Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
  17. Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
  18. Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
  19. Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
  20. Karkampouna, S., de Julio, M. K. ruithof- Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
  21. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
  22. Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
  23. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  24. Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
  25. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
  26. Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
  27. Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
  28. Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).

Tags

Medicin fibros Dupuytrens sjukdom TGF 3D odlingssystem förening skärm extracellulära matrix
Humant Dupuytrens<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur för studien av Myofibroblaster och extracellulära matrixinteraktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karkampouna, S., Kloen, P., Obdeijn, More

Karkampouna, S., Kloen, P., Obdeijn, M. C., Riester, S. M., van Wijnen, A. J., Kruithof-de Julio, M. Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions. J. Vis. Exp. (98), e52534, doi:10.3791/52534 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter