Summary
Spørgsmålet om, hvordan kromatin tilsynsmyndigheder og kromatin stater påvirker genomet in vivo er nøglen til vores forståelse af, hvordan tidlig celle skæbne beslutninger træffes i det udviklende foster. Chip Seq-den mest populære metode til at undersøge kromatin funktioner på globalt plan-er skitseret her Xenopus embryoner.
Protocol
BEMÆRK: Alle Xenopus arbejde i fuld overensstemmelse med de britiske Dyr (Videnskabelige procedurer) Act 1986, som gennemføres af MRC National Institute for Medical Research.
1. Forberedelser
- Estimere antallet af embryoner, der er nødvendige for chippen eksperiment (se diskussion).
- Forbered følgende løsninger, der er lagret ved stuetemperatur: 500 ml 10x Marc Modified Ringers (MMR) uden EDTA, pH justeret til 7,5 og steriliseret ved autoklavering (1 M NaCl, 20 mM KCI, 20 mM CaCl2, 10 mM MgSO4, 50 mM HEPES, pH 7,5) 10, 1 ml SDS elueringsbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1% SDS) og 1 ml af 5x DNA loading buffer (0,2% Orange G, 30% glycerol, 60 mM EDTA, pH 8,0).
- Forbered følgende løsninger, der er opbevaret ved 4 ° C: 50 ml HEG-buffer (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 1 mM EDTA, pH 8,0, 20% glycerol), 500 ml ekstraktionsopløsning buffere E1 (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA. 10% glycerol, 0,5% Igepal CA-630, 0,25% Triton X-100), E2 (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA) og E3 (10 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Igepal CA-630, 0,25% Na-deoxycholat, 0,1% SDS), 500 ml RIPA-buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM LiCI, 1 mM EDTA 1% Igepal CA-630, 0,7% Na-deoxycholat) og 50 ml TEN-buffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCI).
- Score og klip en 15 ml konisk polystyrenrør ved 7 ml mærket. Brug dette rør til at indeholde kerneekstrakter undergår sonikering.
- For post-sekventering analyse anvendes en multicore Unix-stil drift computer med mindst 8 GB RAM og 500 GB ledig diskplads. Installer følgende software lokalt, hvoraf de fleste er brugt på kommandolinjen: FastQC, Illumina casava-1,8 kvalitet filter, Bowtie 11, SAMtools 12 HOMER 13, MACS2 14. IGV 15,16, Cluster3 17, Java TreeView, BLAST + 18, og b2g4pipe
- Byg en Bowtie indeks for tilpasning kort NGS læser til Xenopus genomet. Et eksempel er vist her for X. tropicalis genom V7.1 (november 2011), som kan downloades som en FASTA fil (genome.fa) fra Xenbase ftp server (/ pub / Genomics / JGI). Flyt FASTA fil til indekset undermappe af Bowtie.
- Brug følgende kommando (her efter prompten karakter>) til at generere xenTro7 index-filer:
> Bowtie-build /path/to/bowtie/index/genome.fa xenTro7
> Eksport BOWTIE_INDEXES = / sti / til / butterfly / index /
- Download gen annotation fil (GTF) fra UCSC Genome Browser eller spejlet site på Nimr server til nyeste genom versioner (genomes.nimr.mrc.ac.uk) via Værktøj / Tabel Browser. Brug genomet FASTA fil og GTF-fil til at tilpasse HOMER for Xenopus (f.eks X. tropicalis genom V7.1 - navn xenTro7).
- Alternativt kan du bruge præ-bygget HOMER pakker til nogle ældre versioner af Xenopus-genomet.
> LoadGenome.pl -name xenTro7 -org null -fasta /path/to/genome.fa -gtf sti / til / genes.gtf
- Opret en genom spor (.genome fil) for genomet browser IGV ved at uploade en indekseret FASTA fil (genome.fa med genome.fa.fai fil i samme mappe) og annotation fil (genes.gtf). Opret en genom stillads indeks (genome.fa.fai) til Xenopus genomet som følger:
> Samtools faidx /path/to/genome.fa- Brug BLAST + passere Gene ontologi (GO) vilkår fra flere model arter (menneske, mus, zebrafisk, bananfluen og gær) på Xenopus-gener som følger:
- Download alle kodende sekvenser (CDS) som en enkelt FASTA fil (cds.fa) fra UCSC Genome Browser via Tools/ Tabel Browser og opdatere BLAST + med præ-formateret BLAST database over ikke-redundante proteiner (NR):
> Update_blastdb.pl nr - Søgning efter human (txid9606), mus (txid10090), zebrafisk (txid7955), frugt flyve (txid7227) og gær (txid4932) proteiner fra NCBI websted via den avancerede søgefunktion (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov / protein / avanceret) , og sender listen resulterende GI (sekvensidentifikatoren) (sequence.gi.txt) til computeren.
- Tildel Xenopus-gener til de tilsvarende proteiner fra GI listen ved at udføre BLASTx med en vis forventer (E) værdi cutoff (her 10 -20). Sørg for, at output-format er XML (-outfmt 5 udtjekning blastx_results.xml). Gør brug af tidsbesparende tråde (-num_threads), som korrelerer med antallet af tilgængelige computer kerner.
> BLASTX -db / sti / til / NR -gilist /path/to/sequence.gi.txt -query / sti / to / cds.fa -evalue 1e-20
-outfmt 5 udtjekning /path/to/blastx_results.xml -num_threads [# tråde] - Åbn b2gPipe.properties fil i den b2g4pipe mappe med en teksteditor og opdatere databasen egenskaber til Dbacces.dbname = b2go_sep13 og Dbacces.dbhost = publicdb.blast2go.com. Kør b2g4pipe fra installationsmappen.
> Java Xmx1000m cp *: ext / *: es.blast2go.prog.B2GAnnotPipe -I /path/to/blastx_results.xml
udtjekning resultater / xenTro7 prop b2gPipe.properties -v -annot
BEMÆRK: Dette program ekstrakter GO vilkår for hver BLAST ramt og tildeler dem til tilsvarende Xenopus gener (xenTro7.annot). De mest opdateret database indstillinger kan findes under Værktøj / Generelle indstillinger / DataAccess indstillinger for Blast2GO Java Web Start program (se 9.11.1).
- Byg en Bowtie indeks for tilpasning kort NGS læser til Xenopus genomet. Et eksempel er vist her for X. tropicalis genom V7.1 (november 2011), som kan downloades som en FASTA fil (genome.fa) fra Xenbase ftp server (/ pub / Genomics / JGI). Flyt FASTA fil til indekset undermappe af Bowtie.
2. Chromatin Krydsbinding
- Gød Xenopus æg, de-gelé og kultur embryos ifølge standardprotokoller 20.
- Overfør dejellied embryoner (maksimum 2.500 X. laevis eller 10.000 X. tropicalis) på udviklingsstadiet af interesse for en 8 ml glas hætteglas med hætte og vaske dem kort en gang med 0.01x MMR.
- Fastgør embryoer med 1% formaldehyd i 0.01x MMR (f.eks tilsættes 225 pi 36,5-38% formaldehyd til 8 ml 0.01x MMR) for 15 til 40 minutter ved stuetemperatur (se Diskussion til fiksering og antallet af embryoner kræves per chip eksperiment).
BEMÆRK: Formaldehyd er ætsende og meget giftige. Det er farlig i tilfælde af øjnene og hudkontakt, fordøjelsesbesvær, og indånding. Brug stinkskabet, når tilsætning af formaldehyd til hætteglasset. - Stop optagelsen ved kort at vaske embryoner tre gange med kold 0.01x MMR. Lad ikke Embry os komme i kontakt med væskeoverfladen fordi overfladespændingen får dem til at briste.
- Alikvot embryoner i 2 ml mikrocentrifugerør på ismed et maksimum på 250 embryoner pr rør, der rykker et volumen på ca. 250 pi (X. tropicalis) eller 600 pi (X. laevis) før klækning.
- Pipette væk så meget 0.01x MMR som muligt. Spring følgende trin, hvis du fortsætter straks med afsnit 3.
- Ækvilibrer embryoner i 250 pi kold HEG buffer. Når embryonerne er fast til bunden af røret fjerne så meget væske som muligt og lynfrys i flydende nitrogen. Opbevares ved -80 ° C.
3. Chromatin Extraction
BEMÆRK: Følgende udvinding af tværbundet chromatin fra Xenopus embryoer fungerer mest effektivt med fikseringstidspunkter angivet i trin 2.3 og 50 til 80 X. tropicalis eller 25 til 40 X. laevis embryoner pr ml ekstraktionsbuffer E1, E2 og E3. Hver ekstraktion trin gentages, således at to gange den beregnede mængde af puffer er påkrævet. For opskalering, bruger flere 2 ml microcentriFuge rør eller 50 ml centrifugerør. Opbevare prøver og buffere på is under kromatin ekstraktion.
- Supplement tilstrækkelige mængder af buffere E1, E2 og E3 med 1 mM DTT og proteasehæmmere tabletter. Hvis der udføres chip med et phospho-specifikt antistof, yderligere supplement buffere med 5 mM NaF og 2 mM Na 3 VO 4.
- Homogeniseres faste embryoner med E1 ved pipettering op og ned. Centrifuger homogenater i en afkølet centrifuge (4 ° C) ved 1.000 xg i 2 min (eller 5 min i tilfælde af anvendelse af 50 ml rør). Aspirer supernatanten og eventuelle lipider fastgjort til væggen.
- Resuspendér pellets i E1. Opbevare prøver på is i 10 min. Centrifuge og udsmid supernatanter som i trin 3.2.
- Resuspendér pellets i E2. Centrifuge og udsmid supernatanter som i trin 3.2.
- Gentag trin 3.4, men holde prøverne på is i 10 minutter før centrifugering.
- Resuspendér pellets i E3. Opbevare prøver på is i mindst 10 min. Centrifuger og kassér supernatants som i trin 3.2.
BEMÆRK: På dette tidspunkt, bør resuspensions blive temmelig gennemsigtig. De anioniske detergenter i E3 ekstrakt tværbundne kerner ved at gøre de fleste af de resterende æggeblomme blodplader opløselige. - Resuspender og pool pellets af tværbundne kerner (normalt farvet brun fra uopløseliggjorte pigmentgranula) i et samlet volumen på 1 ml E3. Fortynd prøve med E3 til 2 eller 3 ml, hvis det forekommer meget viskos og vanskelig at pipette. Hold på is eller ved 4 ° C for at fortsætte med trin 4 på den samme eller følgende dag. Snap-freeze i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C til senere brug.
4. Chromatin Fragmentering
BEMÆRK: Sonikering anvendes både til at solubilisere og at forskyde tværbundet chromatin. Her er parametre at køre Misonix Sonicator 3000 er udstyret med en 1/16 tomme tilspidset mikrospids og lyd kabinet. Hvis du bruger andre sonikatorer Følg producentens anvisninger for at forskydetværbundet kromatin eller brug 6. til 12. W for 4 til 8 min i alt.
- Overfør nukleare prøve fra trin 3.7 i en specialbygget rør til lydbehandling (trin 1.4). Prøven kølet under lydbehandling Opbevares ved at røret er fastgjort til en 800 ml plast bæger fyldt med isvand via en kort termometer klemme.
- Bægerglasset anbringes på et laboratorium stik. Juster donkraften, således at sonikator mikrospids er nedsænket i prøven til ca. to tredjedele af mængden dybde og centreret uden at røre rørvæggen.
- Soniker prøven i 7 min i alt, afbrudt hver 30 sek med 1 min pause. Sæt strøm til 1,0. Start lydbehandling og straks øge varmetrin (normalt 2 til 4) for at nå frem til en læsning af 9.-12 W. Pause samme, hvis prøven begynder at skumme. Flyt rør og genstart når skummet er helt forsvundet.
- Overfør klippet kromatin i nedkølede 1,5 ml mikrocentrifugerør og spin ved fuld hastighed (> 15,000 xg) i 5 minutter ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten til præ-kølet 1,5 ml mikrocentrifugerør. Collect 50 pi af supernatanten (ideelt indeholdende chromatin på omkring 400.000 eller flere kerner) til at visualisere graden af kromatin fragmentering (afsnit 5). Brug resten af supernatanten for chip (afsnit 6).
- Opbevar prøver ved 4 ° C i op til én dag. Lynfrys prøver som portioner (en per chip eksperiment) i flydende nitrogen til langvarig opbevaring ved -80 ° C.
5. Imaging Chromatin Fragmentering
- Der tilsættes 50 pi SDS-elueringspuffer, 4 pi af 5 M NaCl og 1 pi proteinase K (20 pg / pl) til 50 pi af supernatanten fra trin 4.6.
- Inkuber i 6 til 15 timer (O / N) i en hybridiseringsovn indstillet til 65 ° C.
- Renses DNA ved anvendelse af et kommercielt PCR oprensningskit. Hvis det er nødvendigt, anvende 3 M natriumacetat (pH 5,2) for at justere pH som anbefalet af fabrikanten. ElueresDNA to gange med 11 pi elueringsbuffer (10 mM Tris-HCI pH 8,5).
- Tilføj 0,4 pi RNase A (20 pg / pl) og 5 pi 5x DNA loading buffer inden kører hele prøven sammen med en 100 bp og en 1 kb DNA-stige på en 1,4% agarosegel ved elektroforese. For at opnå optimale resultater, bejdse gel med en sikker nukleinsyre farvning løsning efter elektroforese.
6. Chromatin Immunopræcipitation
BEMÆRK: I dette afsnit anvender lav tilbageholdelse 1,5 ml mikrocentrifugerør og mindst 1 ml angivne buffer pr rør at vaske magnetiske perler i 5 minutter ved 4 ° C. Før fjernelse af buffer fra perlerne, lad rørene i det magnetiske stativ til 20 til 30 sekunder hver gang, eller indtil opløsningen er klar.
- Transfer 10 til 30 pi af supernatanten (klippet kromatin) fra trin 4.6 til et nyt rør, der skal anvendes senere som input prøve, hvilket svarer til ca. 1% af den samlede chromatin anvendes til chip. Opbevares ved 4° C, indtil chip prøver er klar til at vende tværbindinger.
- Overfør resterende kromatin til et nyt rør. For chip qPCR forsøg, der kræver et antistof kontrol, distribuere lige store volumener af kromatin til to rør.
- Tilføj Chippen-grade antistof (eller det tilsvarende antistof kontrol) til kromatin. Som en grov vejledning, bruger omkring 1 ug antistof per én million celler, der udtrykker epitopen af interesse.
- For mere præcist at estimere mængden af antistof kræves per chip eksperiment køre den samme chip med forskellige mængder af antistof (fx 0,25 ug, 1 ug og 2,5 ug) og sammenligne udbyttet på negativ og positiv kontrol loci af Chip-qPCR (se afsnit 10). Som et antistof kontrollen, anvender normalt serum af de samme isotype og vært dyrearter antistoffet.
- Inkuber på en rotator (10 rpm) O / N ved 4 ° C.
- Vask en passende mængde af antistof-kompatible magnetiske perler gang med E3 for 5 min at 4 ° C. Check fabrikantens specifikation for antistoffet bindingskapacitet af perlerne (normalt 5 til 20 pi perler binder 1 ug IgG-antistof).
- Tilføj vaskede perler til antistoffet præinkuberet kromatin. Yderligere inkuber på en rotator (10 rpm) i 4 timer.
- Vask perler fire gange (chip-qPCR) eller ti gange (chip-Seq) med allerede kølet RIPA buffer, og derefter en gang med præ-afkølet TEN buffer.
- Udfør kun dette trin, hvis udførelse af en chip-Seq eksperiment.
- Resuspender vaskede perler i 50 pi TEN buffer pr rør. Pool alle perler fra en enkelt chip eksperiment ved at overføre dem til en ny slange. Brug magnetiske rack og nedkølet (4 ° C) centrifugering ved 1.000 xg til at indsamle perler på bunden af røret. Kassér så meget væske som muligt uden at forstyrre pelleten af perler.
- Strip spånmateriale fra perlerne ved at resuspendere perlerne i 50 til 100 pi SDS-elueringspuffer og Vortexing dem kontinuerligt med en termomikser (1.000 rpm) i 15 minutter ved 65 ° C. Efter at centrifugen ved fuld hastighed (> 15.000 xg) i 30 sek. Overfør supernatanten (chip eluat) til et nyt rør.
- Gentag det sidste trin og kombinere chippen eluaterne.
7. Chromatin Reverse Tværbinding og DNA Purification
- Tilføj nok SDS elueringspuffer til input prøve (trin 6.1) at nå volumen af chip prøve, som er 100 til 200 pi (trin 6.10). Supplere både chip og input prøver med 1/20 volumen på 5 M NaCl. Inkuber prøverne 6 til 15 timer (O / N) ved 65 ° C i en hybridiseringsovn.
- Tilsæt 1 volumen TE-buffer og RNase A ved 200 ug / ml. Der inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
- Tilføj proteinase K ved 200 ug / ml. Inkuber i 2 til 4 timer ved 55 ° C.
- Renses DNA ved phenol: chloroform: isoamylalkohol-ekstraktion efterfulgt af ethanoludfældning som tidligere skitseret 9. For chip Seq, tilsættes 32pi elueringsbuffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,5) for at opløse DNA-pelleten. Lad prøverne på is i 30 minutter for at sikre, at DNA'et er fuldstændigt opløst.
BEMÆRK: Kommerciel PCR oprensningskit har lavere DNA nyttiggørelse, men er mere praktisk, og kan anvendes til chip qPCR prøver. - For chip Seq, bestemme koncentrationen af 1 pi chip og input-DNA ved hjælp fluorometriaflæsninger-baserede metoder. Følg producentens anvisninger, og sørg for, at koncentrationen af DNA falder inden for pålidelig detektering området fluorometeret.
8. chip Seq Bibliotek Byggeri og validering
BEMÆRK: De nuværende metoder til DNA-bibliotek forberedelse tillade opførelsen af høj kompleksitet biblioteker for NGS fra 1 til 2 ng. På bekostning af en vis kompleksitet, kan bibliotekerne være fremstillet fra så lidt som 50 pg af DNA (se tabel for specifikke materialer / udstyr). Brug den samme mængde DNA for både chip og input-bibliotek. Kort fortalt, at make indekseret (parret udgang) chip-Seq biblioteker, chip og input DNA skal være ende-repareret, ligeret til særlige adaptere (se tabel for specifikke materialer / udstyr) størrelsesselekteret og PCR-amplificeret.
- Følg producentens retningslinjer for at gøre chip-Seq biblioteker. Se diskussionen for yderligere anbefalinger.
- Elueres hvert bibliotek i 12 pi elueringspuffer og bestemme koncentrationen af 1 pi af hver chip og input bibliotek under anvendelse af et fluorometer. Forvent koncentrationer på 5 til 25 ng / pl. Overvej at reducere antallet af PCR-cyklusser (færre end 18 cykler), hvis koncentrationer højere end 25 ng / pl.
BEMÆRK: nøjagtig kvantificering er nøglen til at opnå optimale NGS resultater. Biblioteker med koncentrationer så lave som 1 ng / pl efter 18 PCR-cykler kan sekventeret, men ofte er af lavere kompleksitet. - Brug 1 pi biblioteket til at bestemme fragment størrelsesfordeling og at kontrollere for eventuelle adapter dimer kontaminering (bånd omkring 120 bp) ved Chip-baserede kapillarelektroforese. Gentag fastfase reversibel immobilisering rensning med en perler-til-prøve-forhold på 1: 1 (i stedet for 1,6: 1) Hvis biblioteket indeholder adaptordimerer.
- Udfør qPCR på bekræftede positive og negative kontrol loci (se afsnit 10) for at kontrollere, om lignende tendenser DNA berigelse overholdes før og efter bibliotek forberedelse. Indsend kvalitetskontrol godkendte biblioteker til sekventering.
9. Post-sekventering analyse og Data Visualization
BEMÆRK: I dag, NGS ofte udføres af in-house eller kommercielle sekventering faciliteter (se diskussion for nogle NGS retningslinjer). Standard output er enkelt eller flere gzip-komprimeret FASTQ filer (* .fastq.gz) oplagring millioner af sekventering læser. Normalt multiplex læser allerede adskilles efter deres indeks, og hver læsning indeholder en sekvens id og en kvalitetskontrol score (Phred + 33 for Illumina 1.8+) for hver base opkald. Denne fremgangsmåde her er kun en ud af mange måder, hvordan man analyserer NGS data. Læseren opfordres til at kontrollere, om nogen af de følgende kommandolinjer kræver ændringer, da dette område hurtigt fremrykkende og opdateringer forekommer regelmæssigt.
- Sammenkæde gzip-komprimeret FASTQ filer og kontrollere kvaliteten af sekventering data ved hjælp af FastQC script. Udføre denne og de fleste af de følgende kommandoer for både chip og input sekventering data (Eksempler vist for chip) fra terminalen:
> Cat /path/to/*.fastq.gz> ChIP.fastq.gz
> Fastqc ChIP.fastq.gz
BEMÆRK: Rådata fra den vellykkede sekventering af en høj kompleksitet chip-Seq bibliotek skal passere de fleste tests. Fejl stammer hovedsageligt fra fattige sekventering løber og eksperimentelle artefakter såsom forudindtaget PCR-amplifikation eller adapter forurening. Der forventes en vis grad af overlapning (redundans) som overflødig læser kan repræsentere bona fide DNA berigelse - Pre-proces sekventeringsdata at fjerne adapter forurening (homerTools trim -3 <adapter sekvens>) tillader en mismatch (-mis 1). Brug de første 20 baser af (indekseret) adapter (5 'til 3') proksimalt til DNA-fragmentet af interesse ved ligering (vist for adapter i Tabel over specifikke materialer / udstyr).
> Gzip -cd ChIP.fastq.gz | fastq_illumina_filter -vN> ChIP.fastq
> homerTools trim -3 GATCGGAAGAGCACACGTCT -mis 1 -min 36 ChIP.fastq
BEMÆRK: Fjernelse af filtreret læser (N) er kun nødvendig som standard i FASTQ filer genereret af Illumina 1.8. Udelad fastq_illumina_filter kommando (dvs.. «| Fastq_illumina_filter -vN)hvis en ældre version end 1,8 genereret sekvens id. - Juster forbehandles læser til referencen genom (xenTro7) ved hjælp Bowtie. Kun holde entydigt kortlagt læser (-m 1) ved hjælp af standardindstillinger, dvs. maksimale to uoverensstemmelser i de første 28 baser og en total Phred + 33 kvalitet score på alle uoverensstemmelser pr læse af maksimal 70. Rapport tilpasning i SAM-format (-S) . Øge antallet af megabytes per tråd (--chunkmbs), hvis luns hukommelse er opbrugt:
> Bowtie -m 1 -S -p [# tråde] --chunkmbs [f.eks 200] xenTro7 ChIP.fastq.trimmed> ChIP.sam
BEMÆRK: Bowtie forventer Phred + 33 kvalitetsresultater som standard. Medtag mulighed - phred64-quals hvis FASTQ filen blev genereret med Phred + 64 kvalitetsresultater fra Illumina ældre end 1.8. - Brug to HOMER kommandoer at omdanne justeringen (SAM) fil i en kanon fil (.bw):
> MakeTagDirectory chip / -single -tbp 1 ChIP.sam
> MakeUCSCfile chip /-bigWig / sti / til / genome.fa.fai -fsize 1e20 -norm 1e7 -o ChIP.bw
BEMÆRK: Transformationen kræver stillads indeks (genome.fa.fai) af referencen genomet (trin 1.8). Her profilen er begrænset til en tag per basepar (-tbp 1) og normaliseret til 10 millioner læser (-norm 1e7). bigwig er en af de foretrukne format til dynamisk visualisere chromatin profiler med et genom browser såsom IGV (trin 9.12). - Bestem fordelingen af tags (-d chip /) ved genomiske vartegn (f.eks +/- 10 kb med 25 bp siloer, Si ze 20000 -hist 25), såsom transkriptionsstarten (TSS, eksempel vist her) og afslutning ( TTS) sites. Kør HOMER perl script annotatePeaks.pl med Xenopus anmærkninger xenTro7 (trin 1.7):
> AnnotatePeaks.pl TSS xenTro7 size 20000 -hist 25 -d chip /> ChIP_tagDensity.tss - Find betydende toppe af DNA berigelse mellem chip(-t ChIP.sam) og Input (-c Input.sam) i X. tropicalis genomet ved hjælp MACS2 med en 1% FDR cutoff (-Q 0,01) og DNA-fragmenter (efter sonikering) af 200 bp (--bw = 200) til model bygning. Tilføj flaget --broad til denne kommando linje, hvis forventer en bred fordeling af kromatin træk af interesse, såsom histon mærker eller RNA-polymerase.
> Macs2 callpeak -t ChIP.sam -c Input.sam -f SAM-N chip -g 1.4376e9 Q 0.01 --bw = 200
BEMÆRK: Den effektive størrelse X. tropicalis genom samling V7.1 er omkring 1437600000 bp (-G 1.4376e9). MACS2 genererer en BED fil (ChIP_peaks.bed) mobilisere toppe med deres genomiske placeringer. - Sammenlign flere kromatin profiler i form af en klynge Heatmap:
- Opret en tag fordeling matrix fra tag massefylde mapper af interesse (-d chip / other_ChIP /) ved MACS2 toppe (fx +/- 1 kb med 25 bp siloer, size 2000 -hist 25 -ghist):
> AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 size 2000 -hist 25 -ghist -D chip / other_ChIP /> ChIP.matrix - Brug den grafiske brugergrænseflade i Cluster3 at uploade ChIP.matrix fil og hierarkisk klynge disse tag tætheder baseret på den minimale euklidiske afstand til nærmeste tyngdepunkt. Åbn den genererede CTD-filen i Java TreeView at visualisere klyngedannelse.
- Opret en tag fordeling matrix fra tag massefylde mapper af interesse (-d chip / other_ChIP /) ved MACS2 toppe (fx +/- 1 kb med 25 bp siloer, size 2000 -hist 25 -ghist):
- Find nye og tidligere kendte bindende motiver, som er beriget på højeste topmøder +/- 100 bp (-størrelse 200). Brug annotatePeaks.pl til kort motiv hændelser og at plotte motiv tætheder:
> FindMotifsGenome.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 ChIP_motifs / size 200 -p [# tråde]
> AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif> ChIP_peaks.motif1
> AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif size 800 -hist 25> motif1.density
BEMÆRK: findMotifsGenome.pl script infers berigelsen fra sammenligningen til tilfældigt udvalgte gen-centreret baggrund sekvenser. Den mest berigede roman motiv gemmes under motif1.motif i form af en position vægt matrix. Læseren opfordres til at underbygge disse resultater med andre de novo motiv opdagelse metoder såsom cisFinder 22 og MEME 23. - Anmærke toppe ved at beregne deres afstand til nærmeste genet og ved at bestemme deres normaliseret læse tæller inden for 400 bp vinduer (-størrelse 400):
> AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -størrelse 400 -D chip / input /> ChIP_peaks.genes - Opsummer output ved hjælp af følgende awk kommando til liste nummeret (N), placering og normaliseret læse optælling af individuelle (R) og alle (LR) toppe pr nærmeste (mål) genet.
> Awk 'BEGIN {FS =' t '} $ 7> = -5000 && $ 7 <= 1000
{N [$ 8] + = 1; R [$ 8] + = $ 9 LR [$ 8] = LR [$ 8] «, og# 39, $ 7 '(»9 $') '} end {for (i i N)
{Print i « t 'N [i]' t 'R [i]' t 'substr (LR [i], 2)}}' ChIP_peaks.genes> ChIP_peaks.summary
BEMÆRK: Tallet efter $ refererer til kolonnenummeret, som har behov for at ændre det passer til ChIP_peaks.genes fil oprettet i forrige trin. Dette script exemplar filtrerer toppe ud over 5 kb opstrøms og 1 kb nedstrøms for TSS. $ 7, $ 8 og $ 9 refererer til afstanden til TSS, genet id og den normaliserede læse tæller pr peak hhv. - Udfør analysen af beriget GO vilkår blandt målgener som følger:
- Start den grafiske brugergrænseflade i Blast2GO fra kommandolinjen via Java Web Start (javaws) 19.
> Javaws http://blast2go.com/webstart/blast2go1000.jnlp - Følg udviklernes instruktioner for at uploade annotationfilen for Xenopus gener (xenTro7.annot) som genereres i 1.9.4 og en flad fil identificerede target gener. Sørg for, at det samme gen identifikatorer anvendes i begge filer.
- Start den grafiske brugergrænseflade i Blast2GO fra kommandolinjen via Java Web Start (javaws) 19.
- Visualiser kromatin profiler ved at tilføje bigwig (ChIP.bw, Input.bw) og seng-filer (ChIP_peaks.bed) ind IGV som spor. Supplere data med RNA-Seq spor hvis de er tilgængelige for den samme fase af udviklingen. Gem resultaterne som en session.
- Brug programmering platforme R (www.r-project.org) eller Matlab til yderligere manipulere og visualisere data som genereres ovenfor. Alternativt plotte små datasæt med Excel.
10. chip qPCR for prøvetagning chip og bekræftelse chip Seq
- Brug online-platform Primer3 at designe primere omkring ca. 100 bp DNA ved 60 ° C (T m) for både positive (peak-specifikke) og negativ kontrol loci. Bekræft primer specificitet under anvendelse af in silico
- Opret en 8-punkts standardkurve af tre gange fortyndinger startende fra ca. 1% input eller bruge 2 - ΔΔC (T) metode 8,24 til kvantificering af DNA berigelse.
- Udfør real-time PCR i tekniske tre eksemplarer til samtlige prøver, dvs, chip, kontrol og, om nødvendigt, standardkurve prøver.
- Plot DNA berigelse som procentdelen af input DNA eller i forhold til chip versus kontrolprøve på både positive og negative kontrol loci.
Representative Results
Tilsvarende resultater til dem, der præsenteres her, er forventes, hvis protokollen er velgennemført og antistoffet i anvendelse er chip-grade kvalitet (se diskussion). Denne protokol tillader udvinding af kerner fra formaldehyd-fikseret Xenopus embryoner og effektiv klipning af chromatin ved lydbehandling (figur 1A-C). Skåret kromatin viser en asymmetrisk fordeling af DNA-fragmenter hovedsagelig i området fra 100 til 1.000 bp og topper mellem 300 og 500 bp (figur 1C). En minimal 50 pg immunopræcipiteret DNA kræves for en vellykket foretage en indekseret parret ende chip Seq bibliotek med samme størrelse DNA-inserter (figur 2A). Biblioteket bør være stort set blottet for adaptordimerer, som kan ses på elektroferogram på ca. 120 bp.
Ved sekventering-by-syntese, forbehandlet læser mappes på genomet (figur 2B, C). I et vellykket eksperiment med
CHIP-Seq eksperimenter tillader udforske genom-dækkende karakteristika kromatin funktioner. For eksempel kan beregningen af læse- fordeling over genomiske elementer som transkriptionsstart og termineringssteder fremhæve eventuelle rumlige bindende præferencer omkring gener (figur 3C). Tilsvarende er en Heatmap af læste distributioner på højeste steder bruges til at sammenligne forskellige kromatin funktioner til en genom-plan (figur 3D). Visse transkriptionsfaktorer binder DNA-sekvens-specifikt. De novo motiv analyse af genomisk DNA underliggende toppe kan hente den slags oplysninger, herunder co-berigede motiver af potentielle co-faktorer (Figur 3E). Det store flertal af målgener viser DNA belægning på et lavere snarere end højere niveau (figur 3F). Denne skala-fri funktion synes at være ganske udbredt blandt transcription faktorer og foreslår, at kun en lille brøkdel af target gener er direkte reguleret med biologisk relevans 27,28. Analysen af berigede GO vilkår eller andre egenskaber, såsom den differentielle ekspression af målgener kan endvidere give indsigt i den biologiske funktion af kromatin funktion i Xenopus embryo (figur 3G).
Figur 1. Chromatin immunfældning procedure for Xenopus embryoer. (A) embryoner formaldehyd-fikseret på udviklingsstadiet af interesse for kovalent binder (cross-link) eventuelle proteiner associeret med genomisk DNA. Ved nuklear ekstraktion (B), er tværbundet kromatin fragmenteret at indsnævre genomisk DNA binding eller kromatin modifikationssteder ved at minimere flankerende DNEn sekvens (C). Efterfølgende kromatinet fragmenter immunfældet med en chip-grade antistof at berige dem, der indeholder epitopen af interesse (D). Den co-immunpræcipiteret DNA krængede proteinet og oprenses (E), inden du opretter chippen fragment bibliotek for NGS (figur 2). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. chip Seq bibliotek forberedelse, sekventering-by-syntese, kortlægning og peak kald. (A) elektroferogram viser en god Chip-Seq bibliotek med DNA-skabeloner af på 250 til 450 bp. Disse skabeloner medfører DNA-insert af interesse flankeret af Universal (58 bp) og indekseret (63 bp) adapter. (B) (C) Kun læser dette kort unikt til Xenopus genomet holdes. Da alle fragmenter sekventeret fra 5'-enden, kortlægning af chip læser resulterer i streng-specifikke toppe, der flankerer kromatin funktionen af interesse. Derved peak opkaldere registrere berigelse, der stammer fra immunpræcipitering og udvide læser til en gennemsnitlig længde fragment til præcist lokalisere kromatin funktioner. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Et eksempel på post-sekventeringsanalyse og data visualisering ved hjælp af zygotisk T-box transkriptionsfaktor Vegt (zVegT). Alle læste tæller vist her er normaliseret til 10 millioner entydigt kortlagt og ikke-redundant læser. (A) Uddrag af hele genomet profil zVegT bindende i X. tropicalis gastrula embryoner (stadie 11-12,5 efter Nieuwkoop og Faber 29). Hver top, en bunke-up af udvidet læser, udgør en bindingssted. Disse toppe bliver kaldt af MACS2 med en falsk opdagelse sats (FDR) på mindre end 1%. Hver MESP gen viser meget proksimale og opstrøms zVegT bindende, men kun mespa og mespb udtrykkes af denne fase (RNA-Seq data 30). (B) DNA belægningsniveauer af zVegT som bestemt af Chip-qPCR på flere loci (herunder en ikke -bundet region 0,5 kb opstrøms for β-actin) fortroligRM specifik berigelse fundet af chip Seq. Sammenlign resultater for mespa med peak kaldet (rød bjælke) i (A). DNA belægning niveau visualiseres som en procentdel af input til både chippen med Vegt antistof (polyklonalt kanin-IgG-isotype) og chippen med antistoffet kontrol (normal kanin IgG). Fejlbjælker afspejler standardafvigelsen af to biologiske replikater. (C) Metagene analyse viser præferentiel zVegT binding (tags sammenflettede over 25 bp) til promotoren i forhold til enhver anden genomisk region rundt om og inden gen organer. (D) Heatmap viser K-middelværdi klynger (k = 5) DNA belægningsniveauer (tags arkiveret lodret over 25 bp), i zVegT og Smad2 / Smad3 (chip-Seq data 31) i forhold til alle zVegT-bundne regioner på gastrula stadium. Den Heatmap logge 2 baseret og centreret ved 5 mærker pr bp. (E) De novo motiv analyse opdager den kanoniske T-box transskriptionsfaktorbindende motiv i 38% af zVegT-bundne regioner, hvis den underliggende motiv score er normaliseret til en opdagelse sats i baggrunden sekvenser 5%. Tætheden kort viser højeste berigelse for T-box-motiv i centrum af zVegT bindingssteder, mens den kanoniske Smad2 / Smad3 bindingsmotiv næppe er beriget. (F) Histogram viser DNA belægningsniveauer af zVegT, som er beregnet for hver målgen fra alle toppe (+/- 200 bp) mellem 5 kb opstrøms [-]. og 1 kb nedstrøms [+] af tilsvarende transcription start sites (G) Top 300 gener med højeste DNA belægningsniveauer inden -5 kb og +1 kb er beriget for biologiske processer i den tidlige fosterudvikling. Disse går vilkår er i overensstemmelse med den formodede funktion zVegT. Den FDR er baseret på en to-tailed Fishers eksakte test og korrigeret for multipel testning. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Vores protokol skitserer, hvordan man laver og analysere genom-dækkende kromatin profiler fra Xenopus embryoner. Den dækker alle trin fra tværbindende proteiner til endogene loci in vivo til behandling af millioner af læser repræsenterer berigede genomiske steder i silico. Da et stigende antal genom udkast er tilgængelige, bør denne protokol anvendelse på andre modeller og ikke-modelorganismer. Det vigtigste eksperimentelle afsnit, der sætter denne protokol, bortset fra tidligere arbejde 8,31,33,34, er den post-fiksering procedure at udvinde tværbundne kerner. Det letter effektiv kromatin solubilisering og udskæring og let opskalering. Sammen med forbedrede virkningsgrader på biblioteket forberedelse denne protokol giver mulighed for opførelse af høj kompleksitet chip-Seq biblioteker fra en halv til to millioner celler, der udtrykker kromatin-epitop af interesse. For chip qPCR forsøg, et par ti tusinde af disse celler er normalt nokat kontrollere, om DNA berigelse på måske seks distinkte genomiske loci. Disse tal er forsigtige skøn, men kan variere afhængigt af proteinekspression niveau antistof kvalitet, tværbindende effektivitet og epitop tilgængelighed. Som en guide, en enkelt Xenopus embryo indeholder omkring 4.000 celler i midten blastula etape (8.5 efter Nieuwkoop og Faber 29), 40.000 celler på det sene gastrula etape (12) og 100.000 celler på det tidlige tailbud etape (20).
Den nøjagtige fiksering tid til effektiv immunpræcipitation skal bestemmes empirisk af Chip-qPCR (afsnit 10). I almindelighed er længere fikseringstidspunkter påkrævet, hvis forsøget involverer X. laevis embryoner, tidlige udviklingsstadier, og svage (eller indirekte) DNA-bindende egenskaber. Men er det ikke anbefales fastsættelse Xenopus embryoner længere end 40 min, eller behandling af flere fostre end angivet (afsnit 3), kromatin klipning bliver mindre effektiv. Det er vigtigt ikkeat bruge nogen glycin efter fiksering, da dette fælles skridt for quenching formaldehyd kan gøre nukleare ekstraktion fra æggeblomme-rige embryoner meget vanskelige. I øjeblikket er årsagen til dette ikke er kendt. Det er tænkeligt, at formaldehyd-glycin addukt yderligere reagerer med N-terminal amino-grupper eller argininrester 35.
Antistoffet er nøglen til enhver chip eksperiment og tilstrækkelig kontrol skal udføres for at vise sin specificitet for epitop af interesse (se retningslinjer Landt et al. 36). Hvis der ikke chip-grade antistof er tilgængelig, kan indførelsen af tilsvarende epitop-mærkede fusionsproteiner være en legitim alternativ, da disse proteiner kan indtage endogen bindingssteder 37. I dette tilfælde injicerede embryoner er bedst at bruge som en negativ kontrol snarere end en chip med non-specifik serum. Denne strategi kan også anvendes, hvis proteinet af interesse udtrykkes ved lave niveauer, hvilket resulterer i dårlig genvinding af EnriChed DNA.
Som for at gøre chip Seq biblioteker, på grund af den lille mængde DNA i brug, anbefales det at vælge procedurer, som reducerer antallet af rensningstrin og at kombinere reaktioner at holde tab af DNA på et minimum. De adaptere og primere skal være forenelige med multiplex-sekventering og NGS platform (se tabel for specifikke materialer / udstyr). Hvis anvendelse af Y-adaptere (indeholdende lange enkeltstrengede arme), er det afgørende at pre-amplificere biblioteket med 3-5 runder af PCR før størrelsesmæssige vælge DNA-inserter (f.eks. 100 til 300 bp) ved gelelektroforese. Enkeltstrengede ender forårsager DNA-fragmenter til at migrere heterogent. Trial kører med forskellige mængder af input DNA (fx 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 og 20 ng) anbefales for at bestemme det samlede antal PCR-cyklusser (mindre end eller lig med 18 cyklusser), der kræves til at foretage en størrelse -selected bibliotek på 100 til 200 ng. Reduktion af antallet af PCR-cyklusser gør sekventering af Redundant læser mindre sandsynligt. Solid fase reversible immobiliseringstrin perler er gode oprydning reagenser til effektivt genvinde DNA'et af interesse og pålideligt fjerne frie adaptere og dimerer fra ligering og PCR-reaktioner.
Med hensyn til antal, type og længde læser, omkring 20 til 30.000.000 enkelt ende læser på 36 bp er nok for de fleste chip-Seq eksperimenter at dække hele Xenopus genomet med tilstrækkelig dybde. De mest anvendte NGS maskiner er rutinemæssigt stand til at opfylde disse kriterier. Dog kan det være fordelagtigt at øge antallet af læser hvis der forventes en bred fordeling af læser, som observeret med histon modifikationer, snarere end skarpe toppe. For mange chip Seq eksperimenter, kan 4-5 forskelligt indekserede biblioteker samles og sekventeret i en strømningscelle bane ved hjælp af en højtydende NGS maskine. Nogle gange er også tilrådeligt at udvide den læste længde og sekvens begge ender af DNA-skabelonen (parret ende) for at øge mappability whøne analysere chromatin inden gentagne genomiske regioner.
Denne protokol er blevet anvendt med succes til en bred vifte af kromatin funktioner såsom transkriptionsfaktorer, signalering mediatorer og posttranslationelle histon modifikationer. Men embryoner erhverve en stigende grad af cellulær heterogenitet som de udvikler og kromatin profiler bliver sværere at fortolke. Lovende skridt er allerede taget i Arabidopsis og Drosophila til tissue-specifikt profil kromatin landskaber ved at udvinde celletype-specifikke kerner 38,39. Vores Protokollen indeholder et skridt nuklear ekstraktion, som kunne bane vejen for vævsspecifikke chip-Seq i andre embryoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/16 inch tapered microtip | Qsonica | 4417 | This microtip is compatible with Sonicator 3000 from Misonix and Q500/700 from Qsonica. |
| 8 ml glass sample vial with cap | Wheaton | 224884 | 8 ml clear glass sample vials for aqueous samples with 15-425 size phenolic rubber-lined screw caps. |
| Adaptor | e.g., IDT or Sigma | NA | TruSeq universal adaptor,
AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq indexed adaptor, P-GATCGGAAGAGCACACGTC TGAACTCCAGTCAC ‐NNNNNN‐ ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, phosphorothioate bondphosphate group at 5' end. NNNNNN, index (see TruSeq ChIP Sample Preparation Guide for DNA sequence). Order adaptors HPLC purified. Adaptors can be prepared by combining equimolar amounts (each 100 µM) of the universal and the indexed adaptor and cooling them down slowly from 95 °C to room temperature. Use 1.5 pmol per ng of input DNA. Store at -20 °C. |
| b2g4pipe (software) | Blast2GO | non-commercial | http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip |
| BLAST+ (software) | Camacho et al. | non-commercial | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs& DOC_TYPE=Download |
| Bowtie (software) | Langmead et al. | non-commercial | http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml |
| cisFinder (software) | Sharov et al. | non-commercial | http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/ |
| Chip for capillary electrophoresis | Agilent Technologies | 5067-1504 | Load this chip with 1 µl DNA for library quality control. Store at 4 °C. |
| Chip-based capillary electrophoresis system | Agilent Technologies | G2940CA | The Agilent 2100 BioAnalyzer is used to check the quality of ChIP-Seq libraries. Keep reagents at 4 °C. |
| ChIP-Seq library preparation kit (KAPA Hyper Prep Kit) | Kapa Biosystems | KK8504 | Kit contains KAPA end repair and A-tailing enzyme mix, end Repair and A-tailing buffer, DNA ligase, ligation buffer, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X), and KAPA library amplification primer mix (10X) (see also PCR primers). Adaptors are not included. Store at -20 °C. |
| ChIP-Seq library preparation kit (alternative, ThruPLEX-FD Prep Kit) | Rubicon Genomics | R40048 | Kit uses their own stem-loop adaptors and primers. This kit eliminates intermediate purification steps and is as sensitive as the KAPA Hyper Prep Kit. Store at -20 °C. |
| Cluster3 (software) | de Hoon et al. | non-commercial | http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster |
| FastQC (software) | Simon Andrews | non-commercial | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc |
| Fluorometer | life technologies | Q32866 | Qubit 2.0 Fluorometer |
| Fluorometer reagents | life technologies | Q32851 | The kit provides concentrated assay reagent, dilution buffer, and pre-diluted DNA standards for the Qubit fluorometer. Store DNA standards at 4 °C, buffer and dye at room temperature. |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5-38% in H2O, stabilised with 10-15% methanol. Store at room temperature. CAUTION: Formaldehyde is corrosive and highly toxic. |
| Gel (E-Gel EX agarose , 2%) | life technologies | G4010 | Pre-cast gel with 11 wells, openable format. Leave one lane between ladder and library empty to avoid cross-contamination. Store gels at room temperature. |
| Gel electrophoresis system | life technologies | G6465 | E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager combo kit for size-selecting ChIP-Seq libraries. |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | Store all reagents at room temperature. Use 500 µl of QG buffer per 100 mg of 2% agarose gel slice to extract DNA. Use MinElute columns (from MinElute PCR purification kit) to elute DNA twice. |
| HOMER (software) | Chris Benner | non-commercial | http://homer.salk.edu/homer/index.html |
| Hybridization oven | Techne | FHB1D | Hybridizer HB-1D |
| IGV (software) | Robinson et al. | non-commercial | http://www.broadinstitute.org/igv/home |
| Illumina CASAVA-1.8 quality filter (software) | Assaf Gordon | non-commercial | http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter |
| Java TreeView (software) | Alok Saldanha | non-commercial | http://jtreeview.sourceforge.net |
| Laboratory jack | Edu-Lab | CH0642 | This jack is used to elevate sample in sound enclosure for sonication. |
| Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N3231 | Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C. |
| Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N3232 | Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C. |
| Low-retention 1.5-ml microcentrifuge tubes | life technologies | AM12450 | nonstick, RNase-free microfuge tubes, 1.5 ml |
| MACS2 (software) | Tao Liu | non-commercial | https://github.com/taoliu/MACS |
| Magnetic beads | life technologies | 11201D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-mouse IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
| Magnetic beads | life technologies | 11203D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-rabbit IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
| Magnetic beads | life technologies | 10001D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein A covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
| Magnetic beads | life technologies | 10003D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein G covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
| Magnetic rack | life technologies | 12321D | DynaMag-2 magnet |
| MEME | Bailey et al. | non-commercial | http://meme.nbcr.net/meme/ |
| Na3VO4 | New England BioLabs | P0758 | Sodium orthovanadate (100 mM) is a commonly used general inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. Store at -20 °C. |
| NaF | New England BioLabs | P0759 | Sodium fluoride (500 mM) is commonly used as general inhibitor of phosphoseryl and phosphothreonyl phosphatases. Store at -20 °C. |
| NGS machine | Illumina | SY-301-1301 | Genome Analyzer IIx |
| NGS machine (high performance) | Illumina | SY-401-2501 | HiSeq |
| Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2028 | Use as control for goat polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
| Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | Use as control for mouse polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
| Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | Use as control for rabbit polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
| Nucleic acid staining solution | iNtRON | 21141 | Use RedSafe nucleic acid staining solution at 1:50,000. Store at room temperature. |
| Orange G | Sigma | O3756-25G | 1-Phenylazo-2-naphthol-6,8-disulfonic acid disodium salt. Store at 4 °C. |
| PCR primers | e.g., IDT or Sigma | Primers to enrich adaptor-ligated DNA fragments by PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G and CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, phosphorothioate bond. Primers designed by Ethan Ford. Combine primers at 5 µM each. Use 5 µl in a 50 µl PCR reaction. Store at -20 °C. | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28006 | for purification of ChIP-qPCR and shearing test samples. Store MinElute spin columns at 4 °C, all other buffers and collection tubes at room temperature. |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1, pH 7.9) | life technologies | AM9730 | Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) is premixed and supplied at pH 6.6. Use provided Tris alkaline buffer to raise pH to 7.9. Store at 4 °C. CAUTION: phenol:chloroform:isoamyl alcohol is corrosive, highly toxic and combustible. |
| Primer3 (software) | Steve Rozen & Helen Skaletsky | non-commercial | http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | cOmplete, Mini, EDTA-free. Use 1 tablet per 10 ml. Store at 4 °C. |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free. Use 1 tablet per 50 ml. Store at 4 °C. |
| Proteinase K | life technologies | AM2548 | proteinase K solution (20 µg/µl). Store at -20 °C. |
| RNase A | life technologies | 12091-039 | RNase A (20 µg/µl). Store at room temperature. |
| Rotator | Stuart | SB3 | Rotator SB3 |
| SAMtools (software) | Li et al. | non-commercial | http://samtools.sourceforge.neta |
| Solid phase reversible immobilisation beads | Beckman Coulter | A63882 | The Agencourt AMPure XP beads are used to minimise adaptor dimer contamination in ChIP-Seq libraries. Store at 4 °C. |
| Sonicator 3000 | Misonix/Qsonica | Newer models are now available. Q125, Q500 or Q700 are all suitable for shearing crosslinked chromatin. | |
| Sound enclosure | Misonix/Qsonica | optional: follow the manufacturer's recommendation to obtain the correct sound enclosure. | |
| Thermomixer | eppendorf | 22670000 | Thermomixer for 24 x 1.5 mL tubes. Precise temperature control from 4 °C above room temperature to 99 °C. |
References
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
- Blythe, S. A., Reid, C. D., Kessler, D. S., Klein, P. S. Chromatin immunoprecipitation in early Xenopus laevis embryos. Dev Dyn. 238 (6), 1422-1432 (2009).
- Gentsch, G. E., Smith, J. C. Investigating physical chromatin associations across the Xenopus genome by chromatin immunoprecipitation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J Embryol Exp Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 14 (2), 178-192 (2013).
- Imoto, S., Nolan, J., Bioinformatics Miyano, S. 20 (9), 1453-1454 (2004).
- Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10, 421 (2009).
- Conesa, A., et al. Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).
- Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2000).
- Chen, Y., et al. Systematic evaluation of factors influencing ChIP-seq fidelity. Nat Methods. 9 (6), 609-614 (2012).
- Sharov, A. A., Ko, M. S. H. Exhaustive search for over-represented DNA sequence motifs with CisFinder. DNA Res. 16 (5), 261-273 (2009).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucl Acids Res. 37 (2), W202-W208 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Gentsch, G. E., et al. In vivo T-box transcription factor profiling reveals joint regulation of embryonic neuromesodermal bipotency. Cell Rep. 4 (6), 1185-1196 (2013).
- Barabasi, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nat Rev Genet. 5 (2), 101-113 (2004).
- Biggin, M. D. Animal transcription networks as highly connected, quantitative continua. Dev Cell. 21 (4), 611-626 (2011).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland. New York & London. (1994).
- Akkers, R. C., et al. A hierarchy of H3K4me3 and H3K27me3 acquisition in spatial gene regulation in Xenopus embryos. Dev Cell. 17 (3), 425-434 (2009).
- Yoon, S. J., Wills, A. E., Chuong, E., Gupta, R., Baker, J. C. HEB and E2A function as SMAD/FOXH1 cofactors. Genes Dev. 25 (15), 1654-1661 (2011).
- Jallow, Z., Jacobi, U. G., Weeks, D. L., Dawid, I. B., Veenstra, G. J. Specialized and redundant roles of TBP and a vertebrate-specific TBP paralog in embryonic gene regulation in Xenopus. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (37), 13525 (2004).
- Buchholz, D. R., Paul, B. D., Shi, Y. -B. Gene-specific changes in promoter occupancy by thyroid hormone receptor during frog metamorphosis. Implications for developmental gene regulation. J Biol Chem. 280 (50), 41222-41228 (2005).
- Wills, A. E., Guptaa, R., Chuonga, E., Baker, J. C. Chromatin immunoprecipitation and deep sequencing in Xenopus tropicalis and Xenopus laevis. Methods. 66 (3), 410-421 (2014).
- Metz, B., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactions with model peptides. J Biol Chem. 279 (8), 6235-6243 (2004).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18 (6), 1030-1040 (2010).
- Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44 (2), 148-156 (2012).
