Summary
Frågan om hur kromatin tillsynsmyndigheter och kromatin stater påverkar genomet in vivo är nyckeln till vår förståelse av hur tidigt cell öde beslut fattas i det växande embryot. Chip-Seq-mest populära tillvägagångssätt för att undersöka kromatin funktioner på global nivå-skisseras här för Xenopus embryon.
Protocol
OBS: Alla Xenopus arbete är helt förenligt med de brittiska Djur (vetenskapliga procedurer) Act 1986 som genomförts av MRC nationella institutet för medicinsk forskning.
1. Förberedelser
- Uppskatta antalet embryon som krävs för chip experimentet (se diskussion).
- Bered följande lösningar vilka lagras vid RT: 500 ml av 10x Marc Modified Ringers (MMR) utan EDTA, pH justerat till 7,5 och steriliserades genom autoklavering (1 M NaCl, 20 mM KCl, 20 mM CaCl2, 10 mM MgSO 4, 50 mM HEPES pH 7,5) 10, 1 ml av SDS-elueringsbuffert (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1% SDS) och 1 ml 5x DNA laddningsbuffert (0,2% Orange G, 30% glycerol, 60 mM EDTA pH 8,0).
- Bered följande lösningar som lagras vid 4 ° C: 50 ml HEG buffert (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0, 20% glycerol), 500 ml utvinning buffertar E1 (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. 10% glycerol, 0,5% Igepal CA-630, 0,25% Triton X-100), E2 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA) och E3 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Igepal CA-630, 0,25% Na-deoxicholat, 0,1% SDS), 500 ml av RIPA-buffert (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 500 mM LiCl, 1 mM EDTA , 1% Igepal CA-630, 0,7% Na-deoxicholat) och 50 ml TEN-buffert (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl).
- Betyg och klipp en 15 ml koniska polystyrenrör vid 7 ml markeringen. Använd detta rör sig innehålla kärnextrakt som genomgår ultraljudsbehandling.
- För post-sekvenseringsanalys, använd en flerkärnig Unix-stil drifts dator med minst 8 GB RAM och 500 GB ledigt diskutrymme. Installera följande programvara lokalt varav de flesta används på kommandoraden: FastQC, Illumina CASAVA-1,8 kvalitetsfilter, Bowtie 11, SAMtools 12, HOMER 13, MACS2 14, IGV 15,16, Cluster3 17, Java Treeview, BLAST + 18, och b2g4pipe
- Bygg en Bowtie index för att rikta kort NGS läser till Xenopus genomet. Ett exempel visas här för X. tropic genomet V7.1 (November 2011), som kan laddas ner som en FASTA fil (genome.fa) från Xenbase ftp-server (/ pub / Genomics / JGI). Flytta FASTA filen till indexkatalogen för Bowtie.
- Använd följande kommandorad (här efter prompten tecknet>) för att generera xenTro7 indexfiler:
> Bowtie-build /path/to/bowtie/index/genome.fa xenTro7
> Export BOWTIE_INDEXES = / sökväg / till / bowtie / index /
- Ladda genen annotation filen (GTF) från UCSC Genome Browser eller spegeln plats på NIMR servern efter senaste genom versioner (genomes.nimr.mrc.ac.uk) via Verktyg / Tabell Browser. Använd genomet FASTA filen och GTF-filen för att anpassa HOMER för Xenopus (t.ex. X. tropic genomet V7.1, - name xenTro7).
- Alternativt kan du använda färdiga HOMER paket för vissa äldre versioner av Xenopus genomet.
> LoadGenome.pl -name xenTro7 -OR null -fasta /path/to/genome.fa -gtf sökväg / till / genes.gtf
- Skapa ett genom spår (.genome fil) för genomet webbläsaren IGV genom att ladda upp en indexerad FASTA fil (genome.fa med genome.fa.fai fil i samma mapp) och anteckningsfilen (genes.gtf). Skapa ett genom byggnadsställning index (genome.fa.fai) för Xenopus-genomet enligt följande:
> Samtools faidx /path/to/genome.fa- Använd BLAST + passera Gene ontologi (GO) termer från flera modellarter (människa, mus, zebrafisk, bananfluga och jäst) på Xenopus gener enligt följande:
- Ladda ner alla kodande sekvenser (CDS) som en enda FASTA fil (cds.fa) från UCSC Genome Browser via Verktyg/ Tabell Browser och uppdatera BLAST + med pre-formaterade BLAST databas av icke-redundanta proteiner (nr):
> Update_blastdb.pl nr - Sök efter mänsklig (txid9606), mus (txid10090), zebrafisk (txid7955), fruktflugan (txid7227) och jäst (txid4932) proteiner från NCBI webbplats via sin avancerade sökfunktionen (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov / protein / avancerad) och skicka den resulterande GI (sekvens identifierare) lista (sequence.gi.txt) till datorn.
- Tilldela Xenopus gener till de mest liknande proteiner från GI listan genom att exekvera BLASTX med en viss förväntar (E) värdet cutoff (här 10 -20). Kontrollera utdataformatet är xml (-outfmt 5 utcheckning blastx_results.xml). Utnyttja tidsbesparande trådar (-num_threads) som korrelerar med antalet tillgängliga datorkärnor.
> BLASTX -db / sökväg / till / nr -gilist /path/to/sequence.gi.txt -query / sökväg / to / cds.fa -evalue 1e-20
-outfmt 5 utcheckning /path/to/blastx_results.xml -num_threads [# trådar] - Öppna b2gPipe.properties filen i b2g4pipe mapp med en textredigerare och uppdatera databasegenskaper till Dbacces.dbname = b2go_sep13 och Dbacces.dbhost = publicdb.blast2go.com. Kör b2g4pipe från installationsmappen.
> Java Xmx1000m -cp *: ext / *: es.blast2go.prog.B2GAnnotPipe -in /path/to/blastx_results.xml
-out resultat / xenTro7 -prop b2gPipe.properties -v -annot
OBS: Detta program extrakt GO termer för varje BLAST hit och tilldelar dem till motsvarande Xenopus gener (xenTro7.annot). De mest uppdaterade databasinställningar finns under Verktyg / Allmänna inställningar / Dataaccess Inställningar i Blast2GO Java Web Start (se 9.11.1).
- Bygg en Bowtie index för att rikta kort NGS läser till Xenopus genomet. Ett exempel visas här för X. tropic genomet V7.1 (November 2011), som kan laddas ner som en FASTA fil (genome.fa) från Xenbase ftp-server (/ pub / Genomics / JGI). Flytta FASTA filen till indexkatalogen för Bowtie.
2. Chromatin Tvärbindning
- Gödsla Xenopus ägg, de-gelé och kultur embryos enligt standardprotokoll 20.
- Överför dejellied embryon (max 2.500 X. laevis eller 10.000 X. tropic) på utvecklingsstadiet av intresse för en 8 ml glas provrör med lock och tvätta dem en gång snabbt med 0.01x MMR.
- Fäst embryon med 1% formaldehyd i 0.01x MMR (t.ex., tillsätt 225 pl av 36,5-38% formaldehyd till 8 ml 0.01x MMR) under 15 till 40 min vid RT (se diskussion för fixeringen tiden och antalet embryon som krävs per chip experiment).
OBS: Formaldehyd är frätande och mycket giftig. Det är farligt i fall av ögon och hudkontakt, matsmältningsbesvär, och inandning. Använd dragskåp när du lägger formaldehyd till flaskan. - Stoppa fixeringen genom att kort tvätta embryona tre gånger med kallt 0.01x MMR. Låt inte Embry os ta kontakt med vätskeytan eftersom ytspänningen får dem att brista.
- Alikvotera embryona i 2 ml mikrorör på ismed högst 250 embryon per rör, som upptar en volym på cirka 250 ^ (X. tropic) eller 600 l (X. laevis) innan kläckning.
- Pipettera bort så mycket 0.01x MMR som möjligt. Hoppa följande steget om du fortsätter omedelbart med avsnitt 3.
- Jämvikta embryon i 250 l av kall HEG buffert. När embryona har sjunkit till botten av röret ta bort så mycket vätska som möjligt och snabbfrys i flytande kväve. Förvara vid -80 ° C.
3. kromatin Extraktion
OBS: Följande utvinning av tvärbunden kromatin från Xenopus embryon fungerar mest effektivt med fixeringstiderna i steg 2.3 och 50 till 80 X. tropic eller 25 till 40 X. laevis embryon per ml extraktionsbuffert E1, E2 och E3. Varje extraktionssteg upprepas, så att två gånger den beräknade volymen av buffert krävs. För uppskalning, använder flera 2 ml microcentriFuge rör eller 50 ml centrifugrör. Håll prover och buffertar på is under kromatin extraktionen.
- Komplettera tillräckliga volymer av buffertar E1, E2 och E3 med 1 mM DTT och tabletter proteashämmare. Om du utför chip med en fosfor-specifik antikropp, ytterligare komplettera buffertar med 5 mM NaF och 2 mM Na 3 VO 4.
- Homogenisera fasta embryon med E1 genom pipettering upp och ned. Centrifugera homogenisat i en kyld centrifug (4 ° C) vid 1000 xg under 2 minuter (eller 5 min i fallet med användning av 50 ml rör). Aspirera supernatanten och eventuella lipider fästa på väggen.
- Resuspendera pellets i E1. Håll prover på is under 10 min. Centrifugera och kastas överbord supernatanter som i steg 3.2.
- Resuspendera pellets i E2. Centrifugera och kastas överbord supernatanter som i steg 3.2.
- Upprepa steg 3.4, men håll prover på is i 10 min innan centrifugering.
- Resuspendera pellets i E3. Håll prover på is under åtminstone 10 min. Centrifugera och kassera supernatants som i steg 3.2.
OBS: I detta skede bör resuspensions blivit ganska genomskinligt. De anjoniska tvättmedel i E3 extrahera tvärbundna kärnor genom att göra de flesta av de återstående äggula plättar lösliga. - Resuspendera och pool pellets av tvärbunden kärnor (normalt färgad brun från de insolubiliserade pigmentkornen) i en total volym av 1 ml E3. Späd provet med E3 till 2 eller 3 ml om det verkar väldigt trögflytande och är svår att pipett. Håll på is eller vid 4 ° C för att gå vidare med steg 4 på samma eller följande dag. Snap-frysa i flytande kväve och förvara vid -80 ° C för senare användning.
4. Kromatin Fragmentering
OBS: Sonikering används både för att solubilisera och att skjuva tvärbundna kromatin. Här är parametrar att köra Misonix Sonicator 3000 utrustad med en 1/16 tums avsmalnande microtip och ljud kapsling. Om du använder andra sonicators följa tillverkarnas rekommendationer för att klippatvärbunden kromatin eller använd 6-12 W för 4 till 8 min totalt.
- Överför kärnprov från steg 3,7 i en specialbyggd slang för ultraljudsbehandling (steg 1,4). Håll provet kylt under ultraljudsbehandling genom att ha röret fäst en 800 ml plastbägare fylld med isvatten via en kort termometer klämma.
- Placera bägaren på en laboratorie jack. Justera domkraften så att sonicator microtip är nedsänkt i provet till ungefär två tredjedelar av volymen djup och centrerad utan att röra rörväggen.
- Sonikera provet för 7 min totalt, avbröt every 30 sec med 1 min pauser. Ställ kraft till 1,0. Starta ultraljudsbehandling och omedelbart öka effektinställning (normalt 2-4) för att nå en läsning av 9 till 12 W. Paus omedelbart om provet börjar skumma. Flytta röret och starta när skummet har försvunnit helt.
- Överför klippt kromatin i förväg kylda 1,5 ml mikrorör och snurra på full fart (> 15,000 xg) i 5 min vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till pre-kyld 1,5 ml mikrocentrifugrör. Samla 50 pl av supernatanten (helst innehåller kromatin på cirka 400 tusen eller fler kärnor) för att visualisera graden av kromatin fragmentering (avsnitt 5). Använd resten av supernatanten för ChIP (avsnitt 6).
- Förvara proverna vid 4 ° C i upp till ett dygn. Snap-freeze prover som portioner (en per chip experiment) i flytande kväve för långtidsförvaring vid -80 ° C.
5. Imaging Kromatin Fragmentering
- Lägg 50 | il SDS-elueringsbuffert, 4 pl av 5 M NaCl och 1 | il proteinas K (20 ug / ul) till 50 ul av supernatanten från steg 4.6.
- Inkubera under 6-15 h (O / N) i en hybridisering ugn inställd på 65 ° C.
- Rena DNA med användning av ett kommersiellt PCR-reningskit. Om det behövs, använd 3 M natriumacetat (pH 5,2) för att justera pH så rekommenderas av tillverkaren. ElueraDNA två gånger med 11 ul av elueringsbuffert (10 mM Tris-HCl pH 8,5).
- Lägg 0.4 pl RNas A (20 mikrogram / l) och 5 pl 5x DNA buffert innan du kör hela provet tillsammans med en 100 bp och en 1 kb DNA-stege på en 1,4% agarosgel genom elektrofores. För bästa resultat, bets gel med en säker nukleinsyra färgningslösning efter elektrofores.
6. Kromatin Immunoprecipitation
OBS: I det här avsnittet använder låg retention 1,5 ml mikrocentrifugrör och minst en ml av angivna buffert per rör för att tvätta magnetiska kulor för 5 min vid 4 ° C. Innan du tar bort bufferten från kulorna, lämnar rören i den magnetiska rack för 20 till 30 sekunder varje gång eller tills lösningen är klar.
- Överför 10-30 pl av supernatanten (klippt kromatin) från steg 4.6 till ett nytt rör som ska användas senare som insamplet, vilket motsvarar cirka 1% av den totala kromatin används för chip. Förvaras vid 4° C tills flisprover är redo för att vända tvärbindningar.
- Överför återstående kromatin till ett nytt rör. För Chip-qPCR experiment som kräver en kontrollantikropp, distribuera lika volymer av kromatin till två rör.
- Lägg till Chip-grade antikropp (eller motsvarande antikroppskontroll) till kromatin. Som en grov vägledning, använda ca 1 | ig antikropp per miljon celler som uttrycker epitopen av intresse.
- För att mer exakt uppskatta mängden antikroppar som krävs per chip experiment köra samma chip med olika mängder av antikroppar (t.ex. 0,25 mikrogram, 1 ug och 2,5 mikrogram) och jämföra avkastningen på negativ och positiv kontroll loci med Chip-qPCR (se avsnitt 10). Som en kontrollantikropp, använder normalt serum av samma isotyp och värddjurarter som antikroppen.
- Inkubera på en rotator (10 rpm) O / N vid 4 ° C.
- Tvätta en adekvat mängd av antikropps kompatibel magnetiska kulor gång med E3 för 5 minuter tillsattes ent 4 ° C. Check tillverkarens specifikation för antikroppsbindningskapaciteten av pärlorna (normalt 5-20 | il pärlor binder ett ig av IgG-antikropp).
- Lägg tvättade pärlorna till antikroppen förinkuberas kromatin. Ytterligare inkubera på en rotator (10 rpm) under 4 h.
- Tvätta pärlor fyra gånger (chip-qPCR) eller tio gånger (chip-Seq) med pre-kyld RIPA buffert, och sedan en gång med pre-kyld TEN buffert.
- Endast utföra det här steget om du utför en Chip-Seq experiment.
- Resuspendera tvättade pärlor i 50 fil TEN buffert per rör. Pool alla kulor från ett enda chip experiment genom att överföra dem till en ny slang. Använd magnetställning och kyld (4 ° C) centrifugering vid 1000 xg för att samla pärlorna på botten av röret. Kassera så mycket vätska som möjligt utan att störa pelleten av pärlor.
- Strip flismaterial utanför pärlorna genom återsuspendering av pärlorna i 50 till 100 ^ SDS elueringsbuffert och vortexing dem kontinuerligt med en Thermomixer (1000 rpm) under 15 min vid 65 ° C. Efter det centrifug i full fart (> 15.000 xg) i 30 sek. Överför supernatanten (chip eluat) till ett nytt rör.
- Upprepa det sista steget och kombinera chipet eluat.
7. Chromatin Omvänd Tvärbindning och DNA Rening
- Tillsätt tillräckligt SDS elueringsbuffert till ingångsprovet (steg 6,1) för att nå volymen på chipsprov, vilket är 100-200 | il (steg 6.10). Komplettera både chip och insampel med 1/20 volym 5 M NaCl. Inkubera proverna i 6 till 15 h (O / N) vid 65 ° C i en hybridiseringsugn.
- Lägg en volym av TE-buffert och RNas A vid 200 | ig / ml. Inkubera i en timme vid 37 ° C.
- Lägg proteinas K vid 200 mikrogram / ml. Inkubera under 2-4 timmar vid 55 ° C.
- Rena DNA genom fenol: kloroform: isoamylalkohol extraktion följt av etanolutfällning såsom tidigare skisse 9. För Chip-Seq, lägga 32il elueringsbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) för upplösning av DNA-pelleten. Lämna prover på is i 30 minuter för att se till att DNA är helt upplöst.
OBS: Kommersiell PCR renings kit har lägre DNA återhämtning men är mer praktiskt, och kan användas för spån-qPCR prover. - För Chip-Seq, bestämma koncentrationen av 1 pl chip och input DNA med fluorometri baserade metoder. Följ tillverkarens anvisningar och se till att koncentrationen av DNA faller inom tillförlitlig detektering intervallet fluorometern.
8. Chip-Seq Library Bygg och validering
OBS: Nuvarande metoder för DNA-bibliotek beredning tillåta byggandet av hög komplexitet bibliotek för NGS från 1 till 2 ng. På bekostnad av en viss komplexitet kan bibliotek göras från så lite som 50 pg av DNA (se tabell av specifika material / utrustning). Använd samma mängd DNA för både ChIP och ingångs bibliotek. I korthet, för att make indexe (parade slut) spån Seq bibliotek, Chip och input-DNA måste vara slutrepar, ligeras till specialadaptrar (se tabell av specifika material / utrustning), storlek valda och PCR förstärks.
- Följ tillverkarens anvisningar för att göra spån Seq bibliotek. Se diskussionen för ytterligare rekommendationer.
- Eluera varje bibliotek i 12 ^ il elueringsbuffert och bestämma koncentrationen av en fil av varje chip och ingångs bibliotek med användning av en fluorometer. Räkna koncentrationer av 5-25 ng / ul. Överväg att minska antalet PCR-cykler (färre än 18 cykler) om halterna är högre än 25 ng / ul.
OBS: Exakt kvantifiering är nyckeln till att uppnå optimala NGS resultat. Bibliotek med så låga koncentrationer som 1 ng / l efter 18 PCR-cykler kan sekvens, men ofta är av lägre komplexitet. - Använd 1 l av biblioteket för att bestämma fördelningen av fragmentstorlek och för att kontrollera om någon adapter dimer förorening (band runt 120 bp) från chöft baserade kapillärelektrofores. Upprepa den fasta fasen reversibel immobilisering rening med ett förhållande pärlor till prov av 1: 1 (i stället för 1,6: 1) om biblioteket innehåller adapter dimerer.
- Utför qPCR På godkänd positiva och negativa kontroll loci (se avsnitt 10) för att kontrollera om liknande trender DNA anrikning observeras före och efter biblioteks beredning. Skicka kvalitetskontroll godkända bibliotek för sekvensering.
9. Eftersekvense Analys och Data Visualization
OBS: Numera är NGS ofta utförs av internt eller kommersiella sekvenseanläggningar (se diskussion för några NGS riktlinjer). Den standard ut är en eller flera gzip-komprimerade FASTQ filer (* .fastq.gz) lagra miljontals sekvense läser. Normalt läser multiplex redan separerade enligt deras index och varje läsning innehåller en sekvens identifierare och en kvalitetskontroll poäng (Phred + 33 för Illumina 1.8+) för varje base samtal. Detta tillvägagångssätt här är bara ett av många sätt hur man analyserar NGS uppgifter. Läsaren uppmanas att kontrollera om någon av kommando följande rader kräva förändringar som detta fält är snabbt framryckande och uppdateringar inträffar regelbundet.
- Sammanfoga gzip-komprimerade FASTQ filer och kontrollera kvaliteten på de sekvensdata med användning av FastQC skriptet. Utför detta och de flesta av följande kommandon för både chip och input sekvenseuppgifter (Exempel visas för chip) från terminalen:
> Cat /path/to/*.fastq.gz> ChIP.fastq.gz
> Fastqc ChIP.fastq.gz
OBS: Rådata från den framgångsrika sekvensering av en hög komplexitet Chip-Seq bibliotek ska passera de flesta tester. Misslyckanden kommer främst från fattiga sekvense körningar och experimentella artefakter såsom partisk PCR-amplifiering eller förorening adapter. En viss grad av överlappning (redundans) förväntas som redundant läser kan representera bona fide DNA anrikning - Pre-processsekvensdata för att avlägsna föroreningar adapter (homerTools trim -3 <adaptersekvens>) tillåter en mismatch (-mis 1). Använd de första 20 baserna i (indexe) adapter (5 'till 3') proximalt till DNA-fragment av intresse vid ligering (visas för kort i listan i Tabell över specifika material / utrustning).
> Gzip -cd ChIP.fastq.gz | fastq_illumina_filter -vn> ChIP.fastq
> homerTools trim -3 GATCGGAAGAGCACACGTCT -mis en -min 36 ChIP.fastq
OBS: Avskaffandet av filtrerad lyder (N) krävs endast som standard i FASTQ filer som genereras av Illumina 1.8. Uteslut kommandot fastq_illumina_filter (dvs. "| Fastq_illumina_filter -vn ')Om en äldre version än 1.8 genererade sekvensidentifieraren. - Rikta förbearbetade läser till referens genomet (xenTro7) med användning Bowtie. Behåll endast unikt mappas lyder (-m 1) med standardinställningar, dvs maximal två felpassningar i de första 28 baser och ett totalt Phred + 33 kvalitetsresultat på alla felpassningar per läsning av maximal 70. Rapport anpassning i SAM-format (-S) . Öka antalet megabyte per tråd (--chunkmbs) om bit minne är utmattad:
> Bowtie -m 1 -S -p [# trådar] --chunkmbs [t.ex. 200] xenTro7 ChIP.fastq.trimmed> ChIP.sam
OBS: Bowtie förväntar Phred + 33 kvalitetsresultat som standard. Inkludera alternativet - phred64-kval om FASTQ filen genererades med Phred + 64 kvalitetsresultat från Illumina äldre än 1.8. - Använd två HOMER kommandon att omvandla inriktningen (SAM) fil till en höjdare fil (.bw):
> MakeTagDirectory ChIP / -Single -tbp en ChIP.sam
> MakeUCSCfile ChIP /-bigWig / sökväg / till / genome.fa.fai -fsize 1e20 -norm 1E7 -o ChIP.bw
OBS: Omvandlingen kräver ställningen index (genome.fa.fai) av referens genomet (steg 1,8). Här profilen är begränsad till en tagg per baspar (-tbp 1) och normaliserades till 10 miljoner läser (-norm 1E7). Bigwig är en av de önskat format för att dynamiskt visualisera kromatin profiler med ett genom webbläsare såsom IGV (steg 9,12). - Bestäm fördelningen av taggar (-d chip /) vid iska landmärken (t.ex. +/- 10 kb med 25 bp korgar, -Si ze 20000 -hist 25) såsom transkriptionsstarten (TSS, exempel visas här) och uppsägning ( tts) webbplatser. Kör HOMER perl script annotatePeaks.pl med Xenopus anteckningar xenTro7 (steg 1,7):
> AnnotatePeaks.pl tss xenTro7 -storlek 20000 -hist 25 -d ChIP /> ChIP_tagDensity.tss - Hitta signifikanta toppar av DNA anrikning mellan chip(-t ChIP.sam) och Input (-c Input.sam) i X. tropic genomet med användning MACS2 med en 1% FDR cutoff (-q 0,01) och DNA-fragment (efter sonikering) av 200 bp (--bw = 200) för modellbygge. Lägg flaggan --broad till denna kommandorad om väntar en bred fördelning av kromatin inslag i intresse, såsom histon märken eller RNA-polymeras.
> Macs2 callpeak -t ChIP.sam -c Input.sam -f SAM -n ChIP -g 1.4376e9 -q 0,01 --bw = 200
OBS: Den effektiva storleken på X. tropic genomet montering V7.1 är ca 1437600000 bp (-G 1.4376e9). MACS2 genererar en BED-fil (ChIP_peaks.bed) värv toppar med sina iska platser. - Jämför flera kromatin profiler i form av en klustrad heatmap:
- Skapa en tagg distributionsmatris från tagg densitet kataloger av intresse (-d chip / other_ChIP /) vid MACS2 toppar (t.ex. +/- 1 kb med 25 bp korgar, -storlek 2000 -hist 25 -ghist):
> AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -storlek 2000 -hist 25 -ghist -d ChIP / other_ChIP /> ChIP.matrix - Använd det grafiska användargränssnittet i Cluster3 att ladda upp ChIP.matrix fil och hierarkiskt kluster dessa tagg densiteter baserade på minimal euklidiska avståndet till närmaste tyngd. Öppna genererade CTD-filen i Java Treeview för att visualisera klustring.
- Skapa en tagg distributionsmatris från tagg densitet kataloger av intresse (-d chip / other_ChIP /) vid MACS2 toppar (t.ex. +/- 1 kb med 25 bp korgar, -storlek 2000 -hist 25 -ghist):
- Hitta nya och tidigare kända bindningsmotiv, som är berikad på topp toppmöten +/- 100 bp (-storlek 200). Använd annotatePeaks.pl att kartmotiv händelser och att rita motiv tätheter:
> FindMotifsGenome.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 ChIP_motifs / -storlek 200 -p [# trådar]
> AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif> ChIP_peaks.motif1
> AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif -storlek 800 -hist 25> motif1.density
OBS: findMotifsGenome.pl skriptet infers av anriknings från jämförelse med slumpmässigt utvalda gen-centrerad bakgrundssekvenser. Den mest berikade nya motiv sparas under motif1.motif i form av en position viktmatris. Läsaren uppmanas att underbygga dessa resultat med andra de novo motiv upptäckt metoder såsom cisFinder 22 och MEME 23. - Kommentera toppar genom att beräkna deras avstånd till närmaste genen och genom att bestämma deras normaliserade lästa räkna inom 400 bp fönster (-storlek 400):
> AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -storlek 400 -d CHIP / Input /> ChIP_peaks.genes - Sammanfatta utgång med följande awk kommando för att lista numret (N), plats och normaliserade läsning räkna av individuella (R) och alla (LR) toppar per närmaste (mål) gen.
> Awk 'begin {FS =' t '} $ 7> = -5000 && $ 7 <= 1000
{N [$ 8] + = 1; R [$ 8] + = $ 9; LR [$ 8] = LR [$ 8] ', &# 39, $ 7 '(' $ 9 ')'} end {för (i i N)
{Print i " t 'N [i]' t 'R [i]' t 'substr (LR [i], 2)}}' ChIP_peaks.genes> ChIP_peaks.summary
OBS: Siffran efter $ refererar till kolumnnumret, som kan behöva modifiera för att passa ChIP_peaks.genes filen skapades i föregående steg. Detta skript exemplar filtrerar bort toppar bortom 5 kb uppströms och 1 kb nedströms om TSS. $ 7, $ 8 och $ 9 avser avståndet till TSS, genen identifierare och normaliserade lästa talet per topp, respektive. - Utför analysen av berikade GO termer bland målgener enligt följande:
- Starta det grafiska användargränssnittet i Blast2GO från kommandoraden via Java Web Start (javaws) 19.
> Javaws http://blast2go.com/webstart/blast2go1000.jnlp - Följ utvecklarnas instruktioner för att ladda upp kommentarenfilen för Xenopus gener (xenTro7.annot) som genererats i 1.9.4 och en platt fil av identifierade mål gener. Se till att samma gen identifierare används i båda filerna.
- Starta det grafiska användargränssnittet i Blast2GO från kommandoraden via Java Web Start (javaws) 19.
- Visualisera kromatin profiler genom att lägga Bigwig (ChIP.bw, Input.bw) och BED filer (ChIP_peaks.bed) i IGV som spår. Komplettera data med RNA-Seq spår om tillgängligt för samma utvecklingsstadium. Spara resultat som en session.
- Använd programmering plattformar R (www.r-project.org) eller MATLAB för att ytterligare manipulera och visualisera data som genereras ovan. Alternativt, rita små datamängder med Excel.
10. Chip-qPCR för testning Chip och Bekräfta Chip-Seq
- Använd on-line plattform Primer3 att designa primers kring ca 100 bp DNA vid 60 ° C (Tm) för både positiva (topp-specifika) och negativa kontroll loci. Bekräfta primer specificitet med hjälp av in silico
- Skapa en 8-punkts standardkurva för tre-faldiga utspädningar med början från approximativt 1% ingång eller använd 2 - ΔΔC metoden (T) 8,24 för kvantifiering av DNA-anrikning.
- Utför realtids-PCR i tekniska triplicates för alla prover, dvs chip, kontroll och, vid behov, standardkurva prover.
- Plot DNA anrikning som andelen ingångs DNA eller som ett förhållande mellan chip kontra kontrollprov på både positiva och negativa kontroll loci.
Representative Results
Likvärdiga resultat som de som presenteras här väntas om protokollet är välgjord och antikroppen som används är av Chip-kvalitet (se diskussion). Detta protokoll möjliggör utvinning av kärnor från formaldehydfixerade Xenopus embryon och effektiv klippning av kromatin genom ultraljudsbehandling (Figur 1A-C). Klippt kromatin visar en asymmetrisk fördelning av DNA-fragment i huvudsak sträcker sig från 100 till 1000 bp och toppbelastning mellan 300 och 500 bp (Figur 1C). En minimal 50 pg av immunoutfällt DNA krävs för att framgångsrikt göra en indexerad parade slut Chip-Seq bibliotek med liknande storlek DNA-insättningar (Figur 2A). Biblioteket ska vara i stort sett saknar adapter dimerer, som kan ses på electropherogram vid ca 120 bp.
Vid sekvensering-genom-syntes, förbearbetat läser mappas till genomet (fig 2B, C). I ett lyckat experiment med
Spån Seq experiment tillåter utforska genomet hela egenskaper kromatin funktioner. Till exempel kan beräkna läs fördelning över iska element såsom transkriptionsstart och termineringsställen uppmärksamma eventuella rumsliga bindande preferenser kring gener (Figur 3C). På samma sätt är en heatmap lästa distributioner på topp platser som används för att jämföra olika kromatin funktioner till ett genomet hela skalan (Figur 3D). Vissa transkriptionsfaktorer binder DNA-sekvens-specifikt. De novo motiv analys av genomisk DNA underliggande toppar kan hämta den här typen av information, inklusive co-berikade motiv av potentiella co-faktorer (figur 3E). Den stora majoriteten av målgener visar DNA beläggning på en lägre snarare än högre nivå (Figur 3F). Detta skalfria funktionen verkar vara ganska vanligt bland transcription faktorer och föreslår att endast en liten del av målgener direkt regleras med biologisk relevans 27,28. Analysen av berikade GO termer eller andra attribut som differential uttrycket av målgener kan vidare avslöja insikter den biologiska funktionen av kromatin funktionen i Xenopus embryot (Figur 3G).
Figur 1. Kromatin immunoprecipitation förfarande för Xenopus embryon. (A) Embryon är formaldehyd fixerade i utvecklingsstadiet av intresse för kovalent bindning (tvärbinda) eventuella proteiner associerade med genomiskt DNA. Vid kärnutvinning (B), är tvärbunden kromatin fragment att begränsa iskt DNA bindande eller kromatin modifierings webbplatser genom att minimera flankerar DNEn sekvens (C). Därefter är de kromatin fragment immunoprecipiterade med chip-grade antikropp för att berika de som innehåller epitopen av intresse (D). Sam-immunprecipiterade DNA klädde av proteinet och renas (E) innan du skapar chipet fragmentet bibliotek för NGS (Figur 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Chip-Seq bibliotek förberedelse, sekvensering genom syntes, kartläggning och topp kallelse. (A) Elektroferogrammet visar en god Chip-Seq bibliotek med DNA-mallar av 250-450 bp. Dessa mallar innebär DNA-insertet av intresse flankerad av det universella (58 bp) och den indexerade (63 bp) adapter. (B) (C) Endast läser att kartan unikt till Xenopus genomet hålls. Eftersom alla fragmenten sekvenserades från 5'-änden, kartläggning av ChIP läser resultat i strängspecifika toppar som flankerar kromatin kännetecknet av intresse. Därigenom topp ringer upptäcka anrikning som härstammar från immunoutfällning och utvidga läser för en genomsnittlig fragment längd för att exakt lokalisera kromatin funktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Ett exempel på post-sekvenseringsanalys och datavisualisering med hjälp av zygotiska T-box-transkriptionsfaktor Vegt (zVegT). Alla lästa räkningar som visas här är normaliserade till 10.000.000 unikt mappad och ickeredundant läser. (A) Utdrag av genomet hela profilen zVegT bindning i X. tropic gastrula embryon (stadium 11-12,5 efter Nieuwkoop och Faber 29). Varje topp, en pile-up av förlängd läser, representerar ett bindningsställe. Dessa toppar kallas av MACS2 med ett falskt upptäckt hastighet (FDR) av mindre än 1%. Varje MESP genen visar mycket proximala och uppströms zVegT bindande, men bara mespa och mespb uttrycks genom det skedet (RNA-Seq uppgifter 30). (B) DNA beläggning nivåer zVegT som bestäms av Chip-qPCR vid flera loci (inklusive en icke -bunden region 0,5 kb uppströms om β-aktin) konrm den specifika anrikning hittades av Chip-Seq. Jämför resultat mespa med topp kallas (röd stapel) i (A). DNA beläggning nivån visualiseras som en procentandel av ingång för båda, Chipet med Vegt antikropp (kanin-polyklonal av IgG-isotyp) och chip med kontrollantikroppen (normal kanin-IgG). Felstaplar speglar standardavvikelsen för två biologiska replikat. (C) Metagene analys visar förmåns zVegT bindning (taggar binned över 25 bp) till promotorn i förhållande till någon annan genomregion omkring och inuti gen organ. (D) Heatmap visar k-medelvärde klustrade (k = 5) DNA beläggningsfaktorer (taggar arkiveras över 25 bp) i zVegT och Smad2 / Smad3 (chip-Seq uppgifter 31) i förhållande till alla zVegT-bundna regioner i gastrulastadium. Den heatmap är log 2 bygger och centrerad på 5 taggar per bp. (E) De novo motiv analys upptäcker den kanoniska T-box transkriptionsfaktor bindande motiv i 38% av zVegT-bundna regioner om det underliggande motivet poängen är normaliserad till en 5% upptäckt takt i bakgrundssekvenser. Densiteten Kartan visar högsta anrikning för T-box-motiv i centrala zVegT bindningsställen, medan den kanoniska Smad2 / Smad3 bindande motiv är knappast berikas. (F) Histogram visar DNA beläggning nivåer zVegT, som beräknas för varje målgen från alla toppar (+/- 200 bp) mellan 5 kb uppströms [-]. och 1 kb nedströms [+] i motsvarande transkriptionsstartplatser (G) Topp 300 gener med högsta DNA beläggning nivåer inom -5 kb och en kb är berikad för biologiska processer av tidig embryonal utveckling. Dessa GO termer är i linje med den förmodade funktion zVegT. FDR är baserat på en två-tailed Fishers exakta test och korrigeras för multipel testning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vår protokoll beskriver hur man gör och analysera genomet hela kromatin profiler från Xenopus embryon. Den täcker varje steg från tvärbindande proteiner till endogena loci in vivo till bearbetning miljontals läser representerar anrikade iska platser i silico. Eftersom allt fler genom utkast finns tillgängliga bör detta protokoll tillämpas på andra modell och icke-modellorganismer. Den viktigaste experimentella avsnitt, som anger detta protokoll bortsett från tidigare arbeten 8,31,33,34, är den efter fixering procedur att extrahera tvärbundna kärnor. Det underlättar effektiv kromatin solubilisering och kapning och enkel uppskalning. Tillsammans med förbättrade effektiviteten av biblioteks förberedelser detta protokoll möjliggör byggandet av hög komplexitet spån Seq bibliotek från halv till två miljoner celler som uttrycker kromatin-associerade epitopen av intresse. För Chip-qPCR experiment, några tio tusen av dessa celler är normalt tillräckligtatt kontrollera om DNA anrikning vid kanske sex distinkta iska loci. Dessa siffror är konservativa uppskattningar, men kan variera beroende på proteinuttryck nivå, antikropps kvalitet, tvärbindningseffektivitet och epitop tillgänglighet. Som en guide, innehåller en enda Xenopus embryo ca 4000 celler vid mitten blastula skede (8,5 efter Nieuwkoop och Faber 29), 40.000 celler vid sena gastrulastadium (12) och 100.000 celler vid tidiga tailbud stadiet (20).
Den exakta fixering tiden för effektiv immunoutfällning måste fastställas empiriskt av Chip-qPCR (avsnitt 10). I allmänhet är längre fixeringstider krävs om försöket involverar X. laevis embryon, tidiga utvecklingsstadier, och svaga (eller indirekta) DNA bindningsegenskaper. Det är dock inte att rekommendera om fastställande Xenopus embryon längre än 40 minuter, eller bearbeta fler embryon än vad som anges (avsnitt 3), kromatin klippning blir mindre effektiv. Det är viktigt att inteatt använda glycin efter fixering som denna gemensamma steg för härdning formaldehyd kan göra kärn extraktion från gulerika embryon mycket svåra. För närvarande är orsaken till detta inte är känd. Det är tänkbart att formaldehyd-glycin addukt reagerar vidare med N-terminal amino-grupper eller argininresterna 35.
Antikroppen är nyckeln till alla chip experiment och tillräckliga kontroller måste genomföras för att visa sin specificitet för epitop av intresse (se riktlinjer genom et al. Landt 36). Om ingen Chip-grade antikropp är tillgänglig, kan införandet av motsvarande epitopmärkta fusionsproteiner vara ett legitimt alternativ eftersom dessa proteiner kan ockupera endogena bindningsställen 37. I det här fallet, oinjicerade embryon är bäst att använda som en negativ kontroll snarare än en chip med ospecifik serum. Denna strategi kan även appliceras om proteinet av intresse uttrycks vid låga nivåer resulterar i dålig utvinning av EnriCHED DNA.
När det gäller att göra ChIP-Seq bibliotek, på grund av den låga mängden DNA i bruk, är det rekommenderat att välja förfaranden som minskar antalet rengöringssteg och att kombinera reaktioner för att hålla någon förlust av DNA vid ett minimum. De adaptrar och primers måste vara kompatibla med multiplex sekvense och NGS plattformen (se tabell på specifika material / utrustning). Vid användning av Y-adaptrar (innehållande långa enkelsträngade armar), är det kritiskt att pre-amplifiera biblioteket med 3-5 omgångar av PCR före storleksvälj DNA-inlägg (t.ex.., 100 till 300 bp) genom gelelektrofores. Enkelsträngade ändarna orsaka DNA-fragment att migrera heterogent. Provkörningar med olika mängder av ingångs DNA (t.ex., 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 och 20 ng) rekommenderas för att fastställa det totala antalet PCR-cykler (mindre än eller lika med 18 cykler) som krävs för att göra en storlek -utvalda bibliotek med 100 till 200 ng. Att minska antalet PCR-cykler gör sekvenseringen av redundant läser mindre troligt. Fast fas reversibla immobilisering pärlor är bra att städa upp reagenser för att effektivt återvinna DNA av intresse och tillförlitligt avlägsna eventuella fria adaptrar och dimerer från ligering och PCR-reaktioner.
Sett till antal, typ och längd läser, cirka 20 till 30.000.000 enda änden läser av 36 bp är tillräckligt för de flesta spån Seq experiment för att täcka hela Xenopus genomet med tillräckligt djup. De vanligaste NGS maskiner rutinmässigt kan uppfylla dessa kriterier. Det kan dock vara fördelaktigt att öka antalet läser om en bred fördelningar av läser förväntas, som kan ses med histon modifikationer, snarare än skarpa toppar. För många spån Seq experiment, kan 4-5 olika indexe bibliotek slås samman och sekvens i en flödescell körfält med hjälp av en högpresterande NGS maskin. Ibland är också lämpligt att förlänga den lästa längd och sekvens båda ändarna av DNA-mallen (parade slut) för att öka mappability whöna analysera kromatin inom repetitiva iska regioner.
Detta protokoll har tillämpats med framgång på en bred variation av kromatin funktioner såsom transkriptionsfaktorer, signal medlare och posttranslation histon modifieringar. Men embryon förvärva en ökande grad av cellulär heterogenitet som de utvecklas och kromatin profiler blir svårare att tolka. Lovande steg har tagits i Arabidopsis och Drosophila till vävnadsspecifikt profil kromatin landskap genom att extrahera cell typspecifika kärnor 38,39. Vår protokoll innehåller en nukleär extraktionssteg, vilket skulle kunna bana väg för vävnadsspecifika Chip-Seq i andra embryon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/16 inch tapered microtip | Qsonica | 4417 | This microtip is compatible with Sonicator 3000 from Misonix and Q500/700 from Qsonica. |
| 8 ml glass sample vial with cap | Wheaton | 224884 | 8 ml clear glass sample vials for aqueous samples with 15-425 size phenolic rubber-lined screw caps. |
| Adaptor | e.g., IDT or Sigma | NA | TruSeq universal adaptor,
AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq indexed adaptor, P-GATCGGAAGAGCACACGTC TGAACTCCAGTCAC ‐NNNNNN‐ ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, phosphorothioate bondphosphate group at 5' end. NNNNNN, index (see TruSeq ChIP Sample Preparation Guide for DNA sequence). Order adaptors HPLC purified. Adaptors can be prepared by combining equimolar amounts (each 100 µM) of the universal and the indexed adaptor and cooling them down slowly from 95 °C to room temperature. Use 1.5 pmol per ng of input DNA. Store at -20 °C. |
| b2g4pipe (software) | Blast2GO | non-commercial | http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip |
| BLAST+ (software) | Camacho et al. | non-commercial | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs& DOC_TYPE=Download |
| Bowtie (software) | Langmead et al. | non-commercial | http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml |
| cisFinder (software) | Sharov et al. | non-commercial | http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/ |
| Chip for capillary electrophoresis | Agilent Technologies | 5067-1504 | Load this chip with 1 µl DNA for library quality control. Store at 4 °C. |
| Chip-based capillary electrophoresis system | Agilent Technologies | G2940CA | The Agilent 2100 BioAnalyzer is used to check the quality of ChIP-Seq libraries. Keep reagents at 4 °C. |
| ChIP-Seq library preparation kit (KAPA Hyper Prep Kit) | Kapa Biosystems | KK8504 | Kit contains KAPA end repair and A-tailing enzyme mix, end Repair and A-tailing buffer, DNA ligase, ligation buffer, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X), and KAPA library amplification primer mix (10X) (see also PCR primers). Adaptors are not included. Store at -20 °C. |
| ChIP-Seq library preparation kit (alternative, ThruPLEX-FD Prep Kit) | Rubicon Genomics | R40048 | Kit uses their own stem-loop adaptors and primers. This kit eliminates intermediate purification steps and is as sensitive as the KAPA Hyper Prep Kit. Store at -20 °C. |
| Cluster3 (software) | de Hoon et al. | non-commercial | http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster |
| FastQC (software) | Simon Andrews | non-commercial | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc |
| Fluorometer | life technologies | Q32866 | Qubit 2.0 Fluorometer |
| Fluorometer reagents | life technologies | Q32851 | The kit provides concentrated assay reagent, dilution buffer, and pre-diluted DNA standards for the Qubit fluorometer. Store DNA standards at 4 °C, buffer and dye at room temperature. |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5-38% in H2O, stabilised with 10-15% methanol. Store at room temperature. CAUTION: Formaldehyde is corrosive and highly toxic. |
| Gel (E-Gel EX agarose , 2%) | life technologies | G4010 | Pre-cast gel with 11 wells, openable format. Leave one lane between ladder and library empty to avoid cross-contamination. Store gels at room temperature. |
| Gel electrophoresis system | life technologies | G6465 | E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager combo kit for size-selecting ChIP-Seq libraries. |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | Store all reagents at room temperature. Use 500 µl of QG buffer per 100 mg of 2% agarose gel slice to extract DNA. Use MinElute columns (from MinElute PCR purification kit) to elute DNA twice. |
| HOMER (software) | Chris Benner | non-commercial | http://homer.salk.edu/homer/index.html |
| Hybridization oven | Techne | FHB1D | Hybridizer HB-1D |
| IGV (software) | Robinson et al. | non-commercial | http://www.broadinstitute.org/igv/home |
| Illumina CASAVA-1.8 quality filter (software) | Assaf Gordon | non-commercial | http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter |
| Java TreeView (software) | Alok Saldanha | non-commercial | http://jtreeview.sourceforge.net |
| Laboratory jack | Edu-Lab | CH0642 | This jack is used to elevate sample in sound enclosure for sonication. |
| Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N3231 | Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C. |
| Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N3232 | Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C. |
| Low-retention 1.5-ml microcentrifuge tubes | life technologies | AM12450 | nonstick, RNase-free microfuge tubes, 1.5 ml |
| MACS2 (software) | Tao Liu | non-commercial | https://github.com/taoliu/MACS |
| Magnetic beads | life technologies | 11201D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-mouse IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
| Magnetic beads | life technologies | 11203D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-rabbit IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
| Magnetic beads | life technologies | 10001D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein A covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
| Magnetic beads | life technologies | 10003D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein G covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
| Magnetic rack | life technologies | 12321D | DynaMag-2 magnet |
| MEME | Bailey et al. | non-commercial | http://meme.nbcr.net/meme/ |
| Na3VO4 | New England BioLabs | P0758 | Sodium orthovanadate (100 mM) is a commonly used general inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. Store at -20 °C. |
| NaF | New England BioLabs | P0759 | Sodium fluoride (500 mM) is commonly used as general inhibitor of phosphoseryl and phosphothreonyl phosphatases. Store at -20 °C. |
| NGS machine | Illumina | SY-301-1301 | Genome Analyzer IIx |
| NGS machine (high performance) | Illumina | SY-401-2501 | HiSeq |
| Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2028 | Use as control for goat polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
| Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | Use as control for mouse polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
| Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | Use as control for rabbit polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
| Nucleic acid staining solution | iNtRON | 21141 | Use RedSafe nucleic acid staining solution at 1:50,000. Store at room temperature. |
| Orange G | Sigma | O3756-25G | 1-Phenylazo-2-naphthol-6,8-disulfonic acid disodium salt. Store at 4 °C. |
| PCR primers | e.g., IDT or Sigma | Primers to enrich adaptor-ligated DNA fragments by PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G and CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, phosphorothioate bond. Primers designed by Ethan Ford. Combine primers at 5 µM each. Use 5 µl in a 50 µl PCR reaction. Store at -20 °C. | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28006 | for purification of ChIP-qPCR and shearing test samples. Store MinElute spin columns at 4 °C, all other buffers and collection tubes at room temperature. |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1, pH 7.9) | life technologies | AM9730 | Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) is premixed and supplied at pH 6.6. Use provided Tris alkaline buffer to raise pH to 7.9. Store at 4 °C. CAUTION: phenol:chloroform:isoamyl alcohol is corrosive, highly toxic and combustible. |
| Primer3 (software) | Steve Rozen & Helen Skaletsky | non-commercial | http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | cOmplete, Mini, EDTA-free. Use 1 tablet per 10 ml. Store at 4 °C. |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free. Use 1 tablet per 50 ml. Store at 4 °C. |
| Proteinase K | life technologies | AM2548 | proteinase K solution (20 µg/µl). Store at -20 °C. |
| RNase A | life technologies | 12091-039 | RNase A (20 µg/µl). Store at room temperature. |
| Rotator | Stuart | SB3 | Rotator SB3 |
| SAMtools (software) | Li et al. | non-commercial | http://samtools.sourceforge.neta |
| Solid phase reversible immobilisation beads | Beckman Coulter | A63882 | The Agencourt AMPure XP beads are used to minimise adaptor dimer contamination in ChIP-Seq libraries. Store at 4 °C. |
| Sonicator 3000 | Misonix/Qsonica | Newer models are now available. Q125, Q500 or Q700 are all suitable for shearing crosslinked chromatin. | |
| Sound enclosure | Misonix/Qsonica | optional: follow the manufacturer's recommendation to obtain the correct sound enclosure. | |
| Thermomixer | eppendorf | 22670000 | Thermomixer for 24 x 1.5 mL tubes. Precise temperature control from 4 °C above room temperature to 99 °C. |
References
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
- Blythe, S. A., Reid, C. D., Kessler, D. S., Klein, P. S. Chromatin immunoprecipitation in early Xenopus laevis embryos. Dev Dyn. 238 (6), 1422-1432 (2009).
- Gentsch, G. E., Smith, J. C. Investigating physical chromatin associations across the Xenopus genome by chromatin immunoprecipitation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J Embryol Exp Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 14 (2), 178-192 (2013).
- Imoto, S., Nolan, J., Bioinformatics Miyano, S. 20 (9), 1453-1454 (2004).
- Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10, 421 (2009).
- Conesa, A., et al. Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).
- Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2000).
- Chen, Y., et al. Systematic evaluation of factors influencing ChIP-seq fidelity. Nat Methods. 9 (6), 609-614 (2012).
- Sharov, A. A., Ko, M. S. H. Exhaustive search for over-represented DNA sequence motifs with CisFinder. DNA Res. 16 (5), 261-273 (2009).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucl Acids Res. 37 (2), W202-W208 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Gentsch, G. E., et al. In vivo T-box transcription factor profiling reveals joint regulation of embryonic neuromesodermal bipotency. Cell Rep. 4 (6), 1185-1196 (2013).
- Barabasi, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nat Rev Genet. 5 (2), 101-113 (2004).
- Biggin, M. D. Animal transcription networks as highly connected, quantitative continua. Dev Cell. 21 (4), 611-626 (2011).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland. New York & London. (1994).
- Akkers, R. C., et al. A hierarchy of H3K4me3 and H3K27me3 acquisition in spatial gene regulation in Xenopus embryos. Dev Cell. 17 (3), 425-434 (2009).
- Yoon, S. J., Wills, A. E., Chuong, E., Gupta, R., Baker, J. C. HEB and E2A function as SMAD/FOXH1 cofactors. Genes Dev. 25 (15), 1654-1661 (2011).
- Jallow, Z., Jacobi, U. G., Weeks, D. L., Dawid, I. B., Veenstra, G. J. Specialized and redundant roles of TBP and a vertebrate-specific TBP paralog in embryonic gene regulation in Xenopus. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (37), 13525 (2004).
- Buchholz, D. R., Paul, B. D., Shi, Y. -B. Gene-specific changes in promoter occupancy by thyroid hormone receptor during frog metamorphosis. Implications for developmental gene regulation. J Biol Chem. 280 (50), 41222-41228 (2005).
- Wills, A. E., Guptaa, R., Chuonga, E., Baker, J. C. Chromatin immunoprecipitation and deep sequencing in Xenopus tropicalis and Xenopus laevis. Methods. 66 (3), 410-421 (2014).
- Metz, B., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactions with model peptides. J Biol Chem. 279 (8), 6235-6243 (2004).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18 (6), 1030-1040 (2010).
- Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44 (2), 148-156 (2012).
