Abstract
Reduziert Rückenmark Blutfluss (SCBF) (dh Ischämie) spielt eine Schlüsselrolle bei der traumatischen Rückenmarksverletzungen (SCI) Pathophysiologie und ist daher ein wichtiges Ziel für neuroprotektive Therapien. Obwohl mehrere Techniken beschrieben worden, um SCBF bewerten, sie haben alle signifikante Einschränkungen. Um letzteres zu überwinden, schlagen wir die Verwendung von Echtzeit-kontrastverstärkten Ultraschall-Bildgebung (CEU). Hier beschreiben wir die Anwendung dieser Technik in einem Rattenmodell der Prellung SCI. A Jugularkatheter zunächst für die wiederholte Injektion von Kontrastmittel, einer Natriumchloridlösung von Schwefelhexafluorid eingekapselten Mikrobläschen implantiert. Der Dorn wird dann mit einem maßgeschneiderten 3D-Rahmen stabilisiert und das Rückenmark Dura mater durch eine Laminektomie bei THIX-ThXII belichtet. Die Ultraschallsonde wird dann an der Hinterseite der Dura mater (mit Ultraschall Gel beschichtet) positioniert ist. Zum Ausgangswert SCBF, eine einzelne intravenöse Injektion (400 ul) contra bewertenst Mittel angelegt wird, um seinen Durchgang durch die intakte Rückenmarks microvasculature aufzuzeichnen. Ein Gewichtsfangvorrichtung wird anschließend verwendet, um eine reproduzierbare experimentelle Quetschung Modell SCI generieren. Kontrastmittel wieder injiziert 15 Minuten nach der Verletzung, um post-SCI SCBF Veränderungen zu beurteilen. CEU ermöglicht die Echtzeit und in-vivo-Bewertung der SCBF Veränderungen nach SCI. In der unverletzten Tier zeigte Ultraschall-Bildgebung ungleichmäßige Blutfluss entlang der intakten Rückenmark. Außerdem, 15 min post-SCI, gab es kritische Ischämie auf der Ebene des Epizentrums während SCBF blieb in den abgelegeneren Gebieten intakt bewahrt. In den Bereichen neben dem Mittelpunkt (beide rostral und kaudalen) SCBF signifikant reduziert wurde. Dies entspricht dem vorher beschriebenen "ischämischen Penumbra zone". Dieses Tool ist von großem Interesse für die Beurteilung der Auswirkungen von Therapien zur Begrenzung Ischämie und die resultierende Gewebsnekrose im Anschluss an SCI ausgerichtet.
Introduction
Traumatische Rückenmarksverletzungen (SCI) ist eine verheerende Zustand führt zu erheblichen Beeinträchtigungen in motorischen, sensorischen und autonomen Funktionen. Bisher wurde noch keine Therapie seiner Effizienz bei Patienten nachgewiesen. Für solche Grund ist es wichtig, neue Techniken, die die Bewertung der potenziellen Behandlungen zu verbessern und kann weiter aufzuklären Verletzungen pathiophysiology 1 zu identifizieren.
SCI ist in zwei aufeinanderfolgenden Phasen unterteilt, die als primäre und sekundäre Verletzungen. Der primäre Verletzung entspricht der Ausgangs mechanische Beleidigung. Die sekundäre Verletzungen Gruppen eine Kaskade von verschiedenen biologischen Ereignisse (wie Entzündung, oxidativer Stress und Hypoxie), die auf die fortschreitende Expansion des ursprünglichen Läsion, Gewebeschäden und damit neurologisches Defizit 2,3 beizutragen.
Bei der akuten Phase der SCI werden neuroprotektive Therapien zur Verringerung der Sekundärverletzung Pathologie und sh gerichtetOuld entsprechend verbessern neurologischen Folgen. Unter den vielen sekundären Verletzungen Ereignisse, spielt eine entscheidende Rolle Ischämie 4,5. Auf der Ebene des SCI Epizentrum, die beschädigten parenchymal Mikrogefäßen behindern effektive Rückenmark Blutfluss (SCBF). Außerdem SCBF wird ebenfalls deutlich in der Region rund um das Epizentrum Verletzungen, einen Bereich speziell als "ischämischen Penumbra Zone" bekannt reduziert. Wenn SCBF nicht schnell in diesen Regionen wieder hergestellt werden kann, um Ischämie Zusatz parenchymal Nekrose und weitere Nervenschäden Gewebes führen. Als auch nur die geringste Gewebekonservierung kann erhebliche Auswirkungen Funktion haben, ist es von großem Interesse, um Medikamente und Therapien, die Ischämie post-SCI zu reduzieren entwickeln. Um dieses Phänomen zu markieren, hat früheren Arbeiten, dass die Erhaltung der nur 10% der markhaltigen Axonen gezeigt war genug, um zu Fuß in Katzen erlauben post-SCI 6.
Obwohl mehrere Techniken beschrieben worden, um SCBF, die beurteileny alle haben erhebliche Einschränkungen. Zum Beispiel kann die Verwendung von radioaktiven Mikrosphären 7,8 und C14- iodopyrine Autoradiographie 9 erfordert nachfolgende Tieropfer und kann nicht zu späteren Zeitpunkten wiederholt werden. Die Wasserstoff-Clearance-Technik 10 ist abhängig von der Einfügung intraspinal Elektroden, die weiter beschädigen können das Rückenmark. Während Laser-Doppler-Bildgebung, Photoplethysmographie 14,15 und in-vivo-Lichtmikroskopie 16 haben eine sehr begrenzte Tiefe / Bereich der Messung 11-13.
Unser Team hat bereits gezeigt, dass kontrastverstärkten Ultraschall (CEU) Bildgebung verwendet werden, um in Echtzeit zu bewerten und in-vivo die SCBF Veränderungen in der Rattenrückenmark Parenchym 17. Es ist wichtig anzumerken, dass eine ähnliche Technik wurde von Huang et al aufgetragen. In einem Schweinemodell SCI 18. CEU legt eine spezifische Form der Ultraschall-Bildgebung, die in Graustufen morphologischen im verknüpfen erlaubtAlter (nach dem herkömmlichen B-Modus erhalten wird) mit der räumlichen Verteilung der Blutfluss 19. Die SCBF Bildgebung und Quantifizierung beruht auf intravaskuläre Injektion von Echokontrastmittel. Das Kontrastmittel besteht aus Schwefelhexafluorid Mikrobläschen gebildet (mittlerer Durchmesser von etwa 2,5 um und 90% mit einem Durchmesser von weniger als 6 & mgr; m), die durch Phospholipide stabilisierte. Die Mikrobläschen reflektieren die Ultraschallstrahl durch die Sonde somit eine Verbesserung Blut Echogenität und Kontrasterhöhung der Gewebe entsprechend ihrer Blutfluss emittiert. Es ist daher möglich, den Blutfluss in einem bestimmten interessierenden Bereich entsprechend der Intensität des reflektierten Signals zu beurteilen. Die Mikrobläschen sind auch sicher und sie sind klinisch beim Menschen angewendet. Die Schwefelhexafluorid wird schnell abgeräumt (mittlere terminale Halbwertszeit beträgt 12 min) und mehr als 80% der verabreichten Schwefelhexafluorid wird in der ausgeatmeten Luft innerhalb von 2 Minuten nach der Injektion gewonnen. Dieses Protokoll bietet eine einfache Möglichkeit, um im CEU verwendenAging auf SCBF Änderungen Ratte zu bewerten.
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Protocol
HINWEIS: Die in dieser Handschrift beschriebenen Verfahren wurden von der Bioethik-Kommission der Lariboisière School of Medicine, Paris, Frankreich (CEEALV / 2011-08-01) zugelassen.
1. Instrumentenaufbereitung
- Bereiten Sie und reinigen Sie die folgenden Instrumente zur Kathetereinführung: Mikro-Pinzetten, Mikroscheren, Mikrogefäßklemme, große Scheren, chirurgische Faden (Black geflochtenen Seide 4-0) und eine 14 G-Katheter. Heparinisierung den Katheter mit einer Heparinlösung (5000 U / ml).
- Bereiten Sie und reinigen Sie die folgenden Instrumente für die Laminektomie: große Schere, Skalpell und einer Knochenschneider. Führen Laminektomie mit einem maßgeschneiderten Knochenschneider entwickelt, um das Risiko der Schädigung des Rückenmarks während der Laminektomie (Abbildung 1) zu reduzieren.
- Aufbau des 3D-Rahmens für die Positionierung und Stabilisierung des Tieres verwendet. Maßgeschneiderte Rahmen ist mit den Elementen eines Fixateur externe Hoffman 3 in Verbindung mit einer Pinzette, gebaut which haben, um die Lendenwirbelsäule des Tieres passen gebogen worden.
- Bereiten Sie das Gewicht-Drop-Einrichtung (Impaktor) zum Rückenmark biomechanischen Verletzungen verwendet.
HINWEIS: Die maßgeschneiderte Schlagvorrichtung wurde mit einer 3D-Software entwickelt und in 3D gedruckt. - Schalten Sie das Ultraschallgerät.
- Bereiten Sie das Kit zur Rekonstitution des Kontrastmittels.
HINWEIS: Das Kit enthält 1 Durchstechflasche mit 25 mg gefriergetrocknetes Pulver, 1 Fertigspritze mit 5 ml Natriumchlorid und einem Mini-Spike-Transfersystem (Abbildung 2). Die Schritte zur Rekonstitution des Kontrastmittels sind nachstehend aufgeführt (siehe Abschnitt 5).
2. Vena jugularis Katheterisierung (Abbildung 3)
- Betäuben das Tier mit 4% Isofluran. Legen Sie das Tier in Rückenlage. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch die Gewährleistung, dass das Tier nicht reagiert, wenn die Pfoten sind mit einer Zange gequetscht. Bewerben vet Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit, während und verhinderner Anästhesie.
- Rasieren Sie den Hals und reinigen die Haut. Einen Einschnitt auf der Mittellinie des Halses. Fahren Sie den sternocleidomastoidian Muskel, um die internen Halsschlagader zu finden. Ziehen Sie eine Ligatur am rostralen Teil der Vene.
- Tragen Sie eine mikrovaskuläre Klemme an der Vene, 1 cm unterhalb der Ligatur. Übergeben Sie einen anderen Thread um die Vene, direkt unterhalb der Klemme mit dem Knoten bereit zu sein anziehen, wenn die Klemme gelöst wird.
- Öffnen Sie die Wand der Vene (Venotomie) zwischen der Klemme und dem rostralen Ligatur. Einführung einer 14 G-Katheter in das Lumen der Vene und schieben Sie es in Richtung des Herzens.
- Wenn es darum geht gegen die Klemme, lassen Sie die letztere und schieben Sie den Katheter weiter. Sichern Sie den Katheter in die Vene, durch festes Anziehen der Knoten auf der Vene mit dem Katheter im Inneren.
- Beurteilen Durchgängigkeit des Katheters durch Entnahme einer kleinen Menge von venösem Blut in den Katheter und in der Folge dann Spülen mit heparinisierter Kochsalzlösung. Dies verhindert Verstopfung der catheter durch eine Potential Blutgerinnsel.
- Verbinden flexiblen Schlauch an den Katheter für eine weitere Injektion von Kontrastmittel (Mikroblasen). Halten Sie es geschlossen (abgedichtet) bis zur Verwendung.
3. Zugriff auf die Wirbelsäule, Laminektomie und Rat Positionierung (in der 3D-Rahmen)
- Legen Sie das Tier in einer flachen anfällig horizontale Position. Rasieren und reinigen Sie den Rücken (Brustbereich) des Tieres.
- Identifizieren Sie die letzten Rippe (XIII bei der Ratte) durch Palpation (Abbildung 4). Dies erlaubt es, die Position des XIII Brustwirbel (ThXIII) zu schätzen.
- Machen Sie eine 4 cm Hautschnitt auf der Mittellinie, auf ThXIII zentriert. Öffnen Sie den Hautschnitt sowie die zugrunde liegenden Schleimbeutels. Beachten Sie die Aponeurose der Rückenmuskulatur sowie die Spitzen der Wirbelsäule Prozesse.
- Die Wirbelsäule Prozess der ThXIII sorgfältig zu lokalisieren durch Palpation XIII Rippen.
HINWEIS: Der XIII Rippe zu ThXIII verbunden und stellt somit eine einfach zu locate anatomische Landmarke für die Identifikation von ThXIII. Dieser Schritt ermöglicht die Lokalisierung des ThXII auf Dornfortsatz sowie L1 und L2 (ersten und zweiten Lendenwirbel) THIX. - Schneiden Sie die Muskelsehnenplatte und nehmen Sie die Muskeln auf beiden Seiten, um die Dornfortsätze, die Lamellen und der Facettengelenke aus Thix zu L2 aus. Setzen die lateralen Seite von L1 und L2 durch Ablösen Muskeln von den Querfortsätzen.
- Haken Schneidezähne des Tieres auf der 3D-Rahmen, um die Position (Abbildung 5) zu sichern. Klemmen die L1- und L2-Wirbel mit den modifizierten Pinzette. Schließen Sie die modifizierte Zange zum 3D-Rahmen, um das Tier zu stabilisieren.
- Gently kaudal ziehen die Zange Halten der Lendenwirbelsäule, um die gesamte Wirbelsäule festziehen und den Brustkorb von der Bank zu erhöhen.
HINWEIS: Bei der beschriebenen Anordnung sollte das Tier in der Lage zu atmen ist. Außerdem besteht, auch Atembewegungen des Brustkorbs, der Wirbelsäule und des RückenKabel sollte auch unbeweglich bleiben. - Entfernen Sie die Dornfortsätze processess von Thix zu ThXII. Die untere Klinge des Knochenschneider Schieben Sie unter dem linken Lamina ThXII und schließen Sie die Knochenschneider, um die Lamina (Abbildung 6) zu schneiden.
- Wiederholen Sie das gleiche Manöver für den rechten Lamina und nacheinander entfernen Sie den hinteren Bogen. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte für die Wirbelkörper ThXI zu Thix um ein Vier-Stufen-Laminektomie zu erreichen. Entfernen Sie die beiden Facettengelenke für jeden Wirbel.
HINWEIS: Während des gesamten Verfahrens, reinigen Sie das Operationsfeld von lokalen Blutungen. Dafür verwenden Wattestäbchen und Spülung mit lauwarmem Salzlösung. Hämostase systematisch erfolgt innerhalb weniger Minuten.
4. CEU Probe Positioning
- Decken Sie die Dura mater mit Ultraschall-Gel. Dies erlaubt eine wirksame Übertragung der Ultraschallwellen zwischen der Sonde und des Rückenmarks (Abbildung 7).
- Stabilisierung der Ultraschallsonde witha Klemme, die nachfolgend zu dem 3D-Rahmen durch eine Gelenkarm verbunden werden kann. Manuell positionieren Sie die Sonde. Sicherzustellen, dass die Sonde so ausgerichtet ist, um einen schrägen Längs Sagittalscheibe erhalten. In einer korrekten Position befindet, ist das Rückenmark streng horizontal auf dem Bild und der Zentralkanal im Rückenmark entlang der vollen Segment des Rückenmarks ist sichtbar.
HINWEIS: Positionierung sollte von der Echtzeit-B-Modus-Bild auf dem Bildschirm des Ultraschall-Maschine angezeigt leiten. Die Brennweite der Ultraschallsonde sollte mit der Zentralkanal im Rückenmark ausgerichtet werden. Zu diesem Zeitpunkt ist die hintere Seite des Rückenmarks zugänglich ist, die letztlich für die Positionierung des Stoß ermöglichen. - Bei optimalen, sperren Sie die Gelenkarm, um die Position zu stabilisieren.
5. Herstellung von Kontrastmittel - Mikroblasen Rekonstitution
- Verwenden Sie den Inhalt einer kommerziellen Rekonstitution Kit und schließen Sie die Kolbenstange durch Befestigung tightly in die Spritze (im Uhrzeigersinn). Öffnen Sie das Transfersystem Blister und entfernen Sie die Spritze Spitzenkappe. Öffnen Sie das Transfersystem Kappe und schließen Sie die Spritze mit dem Transfersystem (Befestigung fest).
- Entfernen Sie die Schutzscheibe aus dem Fläschchen. Schieben Sie die Schale in die transparente Schutzhülle aus der
- Transfersystem und drücken Sie sie fest, um die Ampulle zu sichern.
- Leeren Sie den Inhalt der Spritze in die Durchstechflasche, indem Sie an der Kolbenstange. Kräftig schütteln für 20 Sekunden, um alle Inhalte in der Ampulle zu mischen, um eine milchig weiße homogene Flüssigkeit zu erhalten.
- Das gesamte System und vorsichtig in die Spritze zurückziehen das Kontrastmittel. Schrauben Sie die Spritze aus dem Transfersystem. Nach der Zubereitung (wie vorgeschrieben), 1 ml der erhaltenen Dispersion enthält 8 ul Schwefelhexafluorid in den Mikrobläschen. Zeichnen Sie die Suspension von Mikrobläschen in einen 100-ml-Spritze. Legen Sie die 100-ml-Spritze in die Elektropumpe. Schließen Sie den Deckel.
- Starten konstanter Bewegung der Wiederkonstituierten Mikrobläschen. Erhalten konstantem Rühren durch langsames Drehen der Spritze, die die Mikrobläschensuspension beibehält. Schließen Sie die Pumpe an die Jugularkatheter durch den Schlauch. Stellen Sie das Ultraschallgerät auf "Harmonic Mode".
HINWEIS: Die Letzterer entspricht dem Modus, in dem die Mikrobläschen spezifisch nachgewiesen und visualisiert werden. Dieser Modus hat eine geringe mechanische Index, der die Mikrobläschen nicht zerstört, im Gegensatz zu dem B-Modus. - Spülen Sie den Katheter durch Infusion eine erste Dosis (400 ul) des Kontrastmittels. Während dieser ersten Infusion, überprüfen Sie, dass die Mikrobläschen haben auf dem Ultraschallbildschirm. Dies bestätigt, dass die gesamte Schaltung (aus der Spritze in den Blutkreislauf der Ratte) intakt und offen ist.
- Stellen Sie das Ultraschallgerät auf "B-Modus", um das Rückenmark Parenchym und die Zerstörung der wenigen Mikrobläschen in den Blutkreislauf verbleibende zu visualisieren. Die hohe Frequenz der "B-Mode" tranSmits hohe Energie, um den Mikrobläschen, die es ihnen ermöglicht Zusammenbruch.
- Lassen Sie das Tier lag noch für ca. 30 min. Diese Frist ermöglicht die Stabilisierung der hämodynamischen Parameter.
6. Bewertung der SCBF im Intact Spinal Cord
- Stellen Sie das Ultraschallgerät auf die "Harmonic Mode". Starten Sie gleichzeitig (1) Infusion von Kontrastmittel (400 & mgr; l) und (2) des Chronometers.
HINWEIS: Während der Infusion sollte die Konzentration der Mikrobläschen in den Blutkreislauf zu erhöhen, so dass der Kontrast Vorstellung des Rückenmarks (Abbildung 8). Da die Mikrobläschen schnell zerstört, die Blutkonzentration von Mikrobläschen abzunehmen beginnt, sobald das Einspritzen beendet, die eine fortschreitende Abnahme in Kontrastdarstellung des Rückenmarks erzeugt. - Nach 1 min, wählen Sie (drücken) der "Clip-Store" auf der Ultraschall-Maschine. Dies wird eine Lage zu versetzen, 1 min von r sparenaw Ultraschalldaten und die Bildvideoaufzeichnung (der zuvor auf dem Ultraschallbild angezeigt wird).
- Stellen Sie das Ultraschallgerät auf "B-Mode". Dadurch werden die verbleibenden Mikroblasen zu beseitigen.
7. Experimentelle SCI
- Verwendung des Mikromanipulators in die 3D-Rahmen verbunden ist, zu positionieren, das Gewicht Drop Schlagvorrichtung so, dass die Spitze des Prüfkörpers in Kontakt mit der Dura mater (auf der Mittellinie des Rückenmarks), an der Verbindung zwischen THX und ThXI (Figur 9) .
ANMERKUNG: Diese Ebene sollte bis zur Mitte des Segments der Wirbelsäule mit dem Ultraschallgerät beobachteten entsprechen. Der Stürmer und der Körper des Schlagkörpers sind 8 mm Durchmesser. Die Spitze des Stoßkörpers, der die Verletzung generieren wird, ist 3 mm Durchmesser. - Legen Sie die Stürmer der Schlagvorrichtung auf einen 10 cm hohen Position. Induzieren die experimentellen SCI durch Lösen der Stürmer der Schlagvorrichtung. Der Stürmer fällt und gibt the Impaktor, Verletzungen des Rückenmarks. Das Maß impaction liefert ein schlag entspricht einem 10 g Gewicht fiel aus einer Höhe von 10 cm.
8. Beurteilung der SCBF 5 min Post-SCI
- Wiederholen Sie die in Abschnitt 6 (Bewertung der SCBF) beschriebenen Schritte. Die Mikrobläschen nicht in der Lage, durch die beschädigte Mikrogefäßsystems und der Schädigung Epizentrum passieren wird dunkel bleiben (Abbildung 10).
9. Tieropfer
- Euthanize das Tier mit intraperitonealen tödliche Injektion von Pentobarbital (100 mg).
10. Die Quantifizierung der SCBF von Offline-Analyse
- Starten Sie den Ultra Extend Software für die Quantifizierung (auf Ultraschallgerät) eingesetzt. Wählen Sie "Datei" und wählen Sie dann zuvor gespeicherte Rohdaten, und öffnen Sie die zugehörigen Dateien. Aktivieren Sie die "Quantifizierung Modus" durch Drücken (Auswahl) die Taste "Chi Q". Select "Set ROI" (Taste) und wählen Sie die Kreisform.
- Wählen Sie "ROI zeichnen" (Schaltfläche) und zeichnen sieben benachbarten kreisförmigen Regionen von Interesse (ROI) auf das Rückenmark (Abbildung 11). Öffnen Sie das Menü "Fitting" und wählen Sie die Funktion "Kurvenwert". Beachten Sie die Software Darstellung mehrerer Kurven, die jeweils auf die Veränderungen der Mikrobläschen-Konzentration innerhalb einer ROI entspricht.
HINWEIS: Jede Kurve einen "Perfusions-deperfusion" Profil hat. Die erste Phase der Kurve ist flach und entspricht dem Zeitraum vor der Ankunft der Mikrobläschen. In der zweiten Phase die Konzentration von Mikroblasen schneller ansteigt als Ergebnis der Infusion. In der dritten Phase, die, wenn die Infusion beendet ist beginnt die Konzentration von Mikrobläschen fortschreitend abnimmt, wenn sie in den Blutkreislauf disintegratse. - Legen Sie die erste vertikale Linie zu Beginn der zweiten Phase der cUrve und wählen Sie "SET". Dies informiert die Software, wo die Analyse zu beginnen.
- Legen Sie die zweite senkrechte Linie an das Ende der Aufnahme und nochmals wählen Sie "SET". Dies informiert die Software, wo die Analyse zu stoppen.
- Schauen Sie sich im Menü "CV" und notieren Sie die "AUC" Wert, der an die "Fläche unter der Kurve" analysiert entspricht. Dieser Wert ist proportional zur SCBF innerhalb der entsprechenden ROI.
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Representative Results
Mit der vorstehend beschriebenen Protokoll ist es möglich, die SCBF entlang einer longitudinalen Rückenmarks sagittalen Segment zuzuordnen.
Im intakten Rückenmark scheint es SCBF Unregelmäßigkeiten im Parenchym (Figur 12) sein. Dies kann durch die variable Verteilung der radiculo-medullären Arterien (RMA) von einem Tier zum anderen erläutert. RMA bezieht sich auf Arterien, die vorderen Rückenmarkarterie (ASA) zu erreichen und bieten somit die Blutversorgung des Rückenmarks Parenchym segmentale. Im Gegensatz dazu entsprechen die radikulären Arterien Arterien, die das ASA nicht erreichen und daher nicht bieten Rückenmark Blutversorgung segmentale. Daher wird in Rückenmarksegmente wo die RMA anastomosiert mit dem ASA, gibt es mehr Blutfluss (wie in unseren Ergebnissen gezeigt).
Nach SCI, zeigt Echtzeit-Bildgebung CEU einen Mangel in Umlauf zu Verletzungen Epizentrum. Das Epizentrum bleibt dunkel (kein Kontrastmittel-Signal),da es keine aktiven Blutung. Eine genauere Analyse des Blutflusses mit mehreren ROIs zeigt drei einzigartige Blutung Territorien. Zuerst wird in der Ebene der Mittelpunkt ist der Blutstrom die niedrigste mit einer mittleren Abnahme von etwa 90%. Zweitens, in den Gebieten neben dem Epizentrum (beide rostral und kaudal), SCBF wurde ebenfalls deutlich zurückgegangen (im Bereich von -50% bis -80%). Drittens, in den entlegensten Gebieten entsprechend intaktem Gewebe, SCBF erhalten bleibt. Der zweite Bereich entspricht dem "ischämischen Penumbra-Zone", die das Ziel der potentielle neuroprotektive Therapien sollten. In der Lage, leicht zu visualisieren und zu quantifizieren SCBF ändert post-SCI ist nützlich für die Beurteilung der Effizienz von Therapien zur Verringerung Gewebeischämie richtet und damit unterstreicht die Bedeutung dieser Technik (Abbildung 13).
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Kit zur Rekonstitution und die Mikrobläschen Vueject ° Pumpe für Mikroblasen Infusion verwendet. Das Transfersystem ermöglicht die Lieferung von Mikroblasen und Kochsalzlösung zwischen der Phiole und Spritze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Jugularkatheter. Der Katheter wird in die Halsschlagader eingeführt werden kann, dann schob in Richtung des Herzens und schließlich befestigen mit einem Knoten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Verfahren für die korrekte Identifizierung der Wirbel Ebenen. Bei der Ratte wird der letzten Rippe dem XIII Wirbel befestigt. Letzteres kann durch die Haut als ein Wahrzeichen für die letzten Brustwirbel, XIII getastet werden. Muskeln sind auf beiden Seiten der Dornfortsätze freistehend. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Stabilisierung des Tieres in der 3D-Rahmen. (1) Die Schneidezähne sind an dem Rahmen eingehängt, während die ersten und zweiten Lendenwirbel (L1 & L2) mit maßgeschneiderten Zange geklemmt. (2) Die Lendenwirbelsäule wird leicht angezogen, die das Tier stabilisiert und erhöht den Brustkorb von der Bank aus, wodurch freie Atembewegungen ohne Wirbelsäulenbewegungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Technische Details des Laminektomie. Zuerst wird die dünne Klinge des maßgeschneiderten Knochenschneider unter der Lamina übergeben, ohne die Rückenmark. Dann wird die Knochenschneider geschlossen ist, die cUTS und entfernt einen Teil der Lamina. Das Verfahren ist auf beiden Seiten und von den ThXII TxIX um ein vierstufiges Laminektomie erreichen wiederholt. Schließlich werden die Facettengelenke werden ebenfalls entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 7. Die Positionierung der Ultraschallsonde und der Schlagvorrichtung. Die Sonde ist parallel zu dem Rückenmark und leicht schräg gestellt (20-30 °), so dass das Gewicht-drop Impaktor gegen die hintere Seite der Dura platziert werden. Das Rückenmark sollte in der gesamten Mittelsegment auf der Ultraschall-Bildgebung "B-Mode" der zentralen vorliegenden Kanal sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um zu seheneine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8. Kontrastbildgebung des intakten Rückenmark. Die aufeinanderfolgenden Zahlen in Kontrastmodus (orangefarbene Bilder) zeigen, wie die Kontrastmittel (Mikroblasen) progressiv erscheint nach der Infusion, wodurch der Kontrast des Rückenmarks verbessern. Bolusinfusion dauert ca. 10 sec und die Kontrastdaten wurde für 1 min aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 9. Veränderungen der B-Modus folgenden experimentellen SCI. Ein echoreiche Läsion erscheint innerhalb des Parenchyms, entsprechend der ursprünglichen parenchymal h emorrhage post-SCI. Histologie (H & E-Färbung): Die Blutung resultiert aus massiven traumatischen Störung der kleinen Blutgefäße, die zu Blut Extravasation im Parenchym (gelbe Balken = 2,000 & mgr; m). Die Schlagvorrichtung ist auf der rechten Seite gezeigt. Der Stürmer von einer 10 cm Höhe freigegeben und kollidiert mit dem Impaktor, die anschließend erzeugt die Verletzung des Rückenmarks. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 10. Contrast Imaging 15 min post-SCI. Ähnlich zu 8, sind die Mikrobläschen sichtbar, wie sie durch das Rückenmark Mikrogefäßsystem übergeben. Im Epizentrum (Sternchen), wird der Blutfluss durch die mikrovaskuläre Störung behindert.10large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 11. Protokoll zur SCBF Quantifizierung. Mit Ultra Extend Software werden sieben kreisförmigen und der angrenzenden Regionen von Interesse (ROI) auf der Längs Bild Rückenmark gezogen. Die erste ROI basiert auf der Verletzung Epizentrum platziert. In jedem ROI generiert die Software eine Perfusions-deperfusion Kurve und berechnet die Fläche unter dieser Kurve. Dieser Wert mit dem Blutfluss in diesem Bereich korreliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 12. Heterogenität der Blutfluss entlangdas Rückenmark. Diese Diagramme zeigen die Heterogenität der Rückenmarksdurchblutung sowie die Variabilität zwischen den Tieren. Dies ist weitgehend auf die Gefäßanatomie des Rückenmarks erläutert. Jedoch aufgrund der Heterogenität und variable Gefßanatomie, muß die Blutflussmessungen (von jeder ROI) vor Verletzungen als Basislinie verwendet werden. Die Messungen an folgenden Zeitpunkten (post-SCI) gemacht werden als die Prozentänderung der Grundlinie ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 13. Änderungen in Rückenmarksdurchblutung (SCBF) durch die experimentellen Verletzung des Rückenmarks induziert (SCI) 15 Min. Nach der SCI es kritische Ischämie auf der Ebene der Epizentrum während SCBF blieb pin den abgelegeneren Gebieten intakt vorbehalten. In den Bereichen neben dem Mittelpunkt (beide rostral und kaudalen) wird SCBF deutlich reduziert. Dies entspricht dem zuvor beschriebenen "ischämischen Penumbra zone". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Zwar haben wir beschrieben, wie man CEU in einem Ratten-SCI Prellung Modell verwenden, kann dieses Protokoll geändert, um andere experimentelle Ziele oder SCI-Modellen passen. Wir haben uns entschieden, SCBF nur an zwei Zeitpunkten zu messen (vor Verletzungen und 15 Minuten nach der SCI), jedoch ist die Anzahl der Zeitpunkte und die Verzögerung zwischen SCBF Messungen angepasst werden, um die Bedürfnisse der anderen Studien erfüllen. Beispielsweise in unserer früheren Arbeit 17, haben wir SCBF an fünf aufeinanderfolgenden Zeitpunkten in der ersten Stunde nach der SCI gemessen. Es ist wichtig zu beachten, dass in der Sham-Gruppe (kein SCI), waren wir überrascht, um eine fortschreitende Abnahme SCBF beobachten. Während wir zunächst befürchtet, dass wiederholte Mikroblaseninfusion könnte das Rückenmark Gefäßsystem, weitere Experimente (unveröffentlichte Daten) Schaden bestätigt, dass diese Veränderungen wurden durch progressive Veränderungen in lokalen Gewebe physiologischen Bedingungen (Temperatur, Feuchtigkeit) durch die Laminektomie induziert, sowie die verlängerten verursacht Ausstellung von ter Dura und umgebendem Gewebe zu der Umgebungsluft und dem Ultraschall-Gel. Diese Probleme sind in allen Versuchen, die sich mit der Mikrozirkulation gemeinsam, da die Zirkulation ist äußerst empfindlich gegenüber vielen Parametern und daher anfällig für vascoconstriction oder Vasodilatation. Daher empfehlen wir, dass der Zeitraum, in dem die Operationswunde offen bleibt so kurz wie möglich ist. Wenn mehrere SCBF Messungen über einen längeren Zeitraum erforderlich ist, wäre es vorzuziehen, um das Tier Einschnitt zwischen den Akquisitionen, um physiologischen Bedingungen der Umgebung wiederherzustellen und innerhalb des Rückenmarks zu schließen.
Es ist auch möglich, die Form, die Größe, die Lage und die Anzahl der ROIs für SCBF Analyse zu modifizieren. Einer der Hauptvorteile der CEU ist, dass die Messungen können jederzeit folgende experimentelle Fertigstellung durch Verarbeitung der aufgezeichneten Daten offline erfolgen. Es ist auch möglich, um die Messungen zu wiederholen oder, wenn notwendig, die Messeinstellungen / Standards zu ändern.
Räumliche Auflösung der Ultraschallbildgebung ist proportional zur Frequenz der Ultraschallwellen. Je höher die Ultraschallfrequenz, desto besser ist die räumliche Auflösung. Wir haben ein hohes verwendet-Frequenz (12-14 MHz) Sonde, die ein Bild mit einer Pixelauflösung von etwa 100 um liefert. Mit sehr hochauflösenden Systemen, erhöht die Frequenz bis zu 55 MHz und jedes Pixel ist ungefähr 20 um 20. Solche Vorrichtungen können auch für CEU, die viel genauer die Verteilung SCBF im Parenchym zeigen eingesetzt werden. Allerdings sind die sehr hochauflösende Systeme viel teurer.
Einige andere Techniken wurden vorgeschlagen, um SCBF in SCI zu messen, aber sie alle einzigartig Einschränkungen haben. Einige, wie radioaktiven Mikrosphären 7,8 oder der C14-Iod-Antipyrin Autoradiographie 9, erfordern Tieropfer. In diesen Fällen muss das Rückenmark zur Analyse geerntet werden. Auf der anderen Seite, der Wasserstoff-Clearance-Technik 10, erfordert intraspinal Elektrode, die das Einsetzen SCBF tatsächlich ändern kann. Darüber hinaus kann die Messung nur in einem sehr begrenzten Bereich des Rückenmarks Parenchym vorgenommen werden. Lichtmikroskopiedurch ein Rückenfenster bietet auch einen Weg, um die Mikrozirkulation zu bewerten, aber dieser Ansatz hat einen sehr eingeschränkten Tiefe der Beobachtung. Sie erlaubt nur, um die Zirkulation in den oberflächlichen pia Materie und nicht innerhalb des Parenchyms 16 beobachten.
In der Literatur werden in Echtzeit in-vivo-Beurteilungen der SCBF Regel durch Laser-Doppler-Imaging-11-13 durchgeführt. Jedoch hat auch diese Technik mehrere Einschränkungen. Erstens, da der Laser ist kleiner als 1 mm im Durchmesser, SCBF kann nur in einem sehr eingeschränkten Bereich entspricht, eine Halbkugel von etwa 1 mm Durchmesser bewertet. Da das Rückenmark der Ratte etwa 3 mm im Durchmesser, ist der begrenzte Bereich der Analyse eine große Einschränkung. Außerdem ist, wie wir gezeigt haben, dass SCBF im intakten Rückenmark nicht homogen ist, ist es wichtig, SCBF in einem größeren Bereich für eine richtige Darstellung der Mikrozirkulation im Gewebe zu messen. Zweitens hat der Laser eine begrenzte Eindringtiefe und daher detects oberflächliche SCBF. Infolgedessen misst nicht nur parenchymalen SCBF sondern auch, dass der Pia mater (dh das Parenchym umgibt). Da der Pia mater eine eindeutige Gefäßsystem und ist nicht auf die gleiche Autoregulierungsmechanismen als parenchymale Gefäßen unterzogen wurde, kann dies irreführend sein. Schließlich hat der Laser-Doppler keinerlei morphologische Informationen. CEU windet diese Einschränkungen durch Anzeigen morphologischen Bilder der Schnur (B-Modus), während eindeutig Darstellung des Kontrastmittels, die eindeutig innerhalb des Parenchyms identifiziert werden können.
Trotz ihrer vielen Vorteile zu anderen Ansätzen hat CEU auch einige deutliche Einschränkungen. Da die Messungen auf einer zweidimensionalen Sagittalscheibe hergestellt (in der Regel parallel zu dem zentralen Kanal) SCBF aus anderen Regionen des Parenchyms nicht zugänglich sind. Weiterhin kann die von einem einzigen Segment zweidimensionalen sagittalen Rückenmark erzeugten Informationen nicht repräsentativ für die gesamte Schnur sein. Nevertheless, kann dies durch verschiedene Vorkehrungen gesteuert werden. Zunächst die Messungen wiederholt an der gleichen Stelle hat die erste Messung (intakte Rückenmark) als Ausgangswert verwendet werden. Zweitens durch Verletzen an der Mittellinie des Rückenmarks (bilaterale Verletzung), die SCBF Änderungen sollten symmetrisch zwischen den linken und rechten (unveröffentlichte Daten) sein. Diese Vorsichtsmaßnahmen helfen sicherzustellen, dass die Analyse von Einzel Sagittalscheibe ist genug, um die globale Verteilung der Längs SCBF reflektieren.
Die hohen Kosten der Ultraschallgeräten ist eine weitere Einschränkung. Jedoch existieren mehrere Lösungen für dieses Problem zu zielen. Erstens können einige Labors eine temporäre Darlehen verhandeln der Hersteller für ihre Experimente. Wie Ultraschallgeräte sind transportabel, sind vorübergehend Kredite möglich. Dies war der Ansatz von unserem Labor verwendet. Alternativ kann auch eine Gruppe von Labors Ressourcen, um die Maschine zu kaufen bündeln und teilen Sie die Kosten. Ansonsten viele Hochschuleinrichtungen haben bildgebende Einrichtungen und Ultraschallgeräts kann als wesentliche Instrumente empfohlen werden. So können Tiere die Abbildungseinrichtung für CEU Beurteilung transportiert werden und dann für andere Experimente brachte.
Zu Gefäßveränderungen, Kontrastmittel (Mikrobläschen) beurteilen muss intravenös injiziert werden. Obwohl Katheterisierung der Vena femoralis oder invasiv und riskant, die Venen sind leicht zugänglich und eindeutig identifizierbar. Im Gegensatz dazu ist eine Schwanzveneninjektion weniger invasiv, aber der Behälter schwer unterschieden / für die richtige Katheter sichtbar. Daher besteht die Gefahr, dass die Nadelspitze nicht richtig in der Vene angeordnet werden oder daß sie während der Injektion zu verschieben, dabei die gesamte Experiment. Für solche Grund bevorzugen wir, die Halsschlagader nutzen und präsentieren einen Katheter zur konsistenten Mikroblasen-Infusion.
Wirbel Knochen umgeben das Rückenmark. Als Ultraschallwellen werden durch Knochen reflektiert und können nicht durch das Rückenmark Lamellen passieren, Bildgebung erfordertKnochenentfernung (Laminektomie) eine akustische Fenster zu öffnen. Der einfachste Weg, um den Wirbelkanal geöffnet ist, um den hinteren Bogen des Wirbels durch eine Laminektomie entfernen. In diesem Protokoll, benötigen wir eine Vier-Stufen-Laminektomie, um eine lange Segment des Rückenmarks, einschließlich des Epizentrums, den Halbschatten Zone und abgelegenen Gebieten von intaktem Rückenmark zu visualisieren. Obwohl ein Großteil der experimentellen SCI Modelle erfordern eine Laminektomie (für Clip-Anwendung oder Impaktor Prellung), werden diese in der Regel aus der Entfernung von 1-2 Lamina. Die umfangreichen 4-Level-Laminektomie ist eine weitere Einschränkung unserer Studie. Wenn man jedoch nur noch den Mittelpunkt und Penumbra Zone zu untersuchen, kann eine weniger umfangreiche Laminektomie gemacht werden und wird empfohlen.
Abschließend trotz der oben beschriebenen mehr Grenzen ist CEU ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung SCBF Veränderungen und die Wirkung verschiedener Therapien (Forschungszwecken). Diese zuverlässige Echtzeit, In-vivo-Ansatz ist ideal für das Betrachten Behandlungen zu reduzierenIschämie und anschließende Gewebsnekrose post-SCI.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- MacDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Martirosyan, N. L., et al. Blood supply and vascular reactivity of the spinal cord under normal and pathological conditions. J Neurosurg Spine. 15 (3), 238-251 (2011).
- Blight, A. R. Cellular morphology of chronic spinal cord injury in the cat: analysis of myelinated axons by line-sampling. Neuroscience. 10 (2), 521-543 (1983).
- Bassingthwaighte, J. B., et al. Validity of microsphere depositions for regional myocardial flows. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H184-H193 (1987).
- Drescher, W. R., Weigert, K. P., Bunger, M. H., Hansen, E. S., Bunger, C. E. Spinal blood flow in 24-hour megadose glucocorticoid treatment in awake pigs. J Neurosurg. 99 (3 Suppl), 286-290 (2003).
- Golanov, E. V., Reis, D. J. Contribution of oxygen-sensitive neurons of the rostral ventrolateral medulla to hypoxic cerebral vasodilatation in the rat. J Physiol. 495 (Pt 1), 201-216 (1996).
- Ueda, Y., et al. Influence on spinal cord blood flow and function by interruption of bilateral segmental arteries at up to three levels: experimental study in dogs). Spine (Phila Pa 1976). 30 (20), 2239-2243 (2005).
- Carlson, G. D., et al. Sustained spinal cord compression: part II: effect of methylprednisolone on regional blood flow and recovery of somatosensory evoked potentials). J Bone Joint Surg Am. 85-A (1), 95-101 (2003).
- Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 32 (18), 1955-1962 (2007).
- Horn, E. M., et al. The effects of intrathecal hypotension on tissue perfusion and pathophysiological outcome after acute spinal cord injury). Neurosurg Focus. 25 (5), E12 (2008).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Ishikawa, M., et al. Platelet adhesion and arteriolar dilation in the photothrombosis: observation with the rat closed cranial and spinal windows. J Neurol Sci. 194 (1), 59-69 (2002).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (1976).
- Huang, L., et al. Quantitative assessment of spinal cord perfusion by using contrast-enhanced ultrasound in a porcine model with acute spinal cord contusion). Spinal Cord. 51 (3), 196-201 (2012).
- Postema, M., Gilja, O. H. Contrast-enhanced and targeted ultrasound. World J Gastroenterol. 17 (1), 28-41 (2011).
- Soubeyrand, M., Badner, A., Vawda, R., Chung, Y. S., Fehlings, M. Very High Resolution Ultrasound Imaging for Real-Time Quantitative Visualisation of Vascular Disruption After Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. , (2014).
- Akhtar, A. Z., Pippin, J. J., Sandusky, C. B. Animal models in spinal cord injury: a review. Rev Neurosci. 19 (1), 47-60 (2008).
