Abstract
Redusert ryggmarg blodstrøm (SCBF) (dvs. iskemi) spiller en nøkkelrolle i traumatisk ryggmargsskade (SCI) patofysiologi og er derfor et viktig satsingsområde for nervecellene terapi. Selv om flere teknikker har blitt beskrevet å vurdere SCBF, de alle har betydelige begrensninger. For å overvinne den sistnevnte, foreslår vi bruk av sanntidskontrastforsterket ultralyd imaging (CEU). Her beskriver vi anvendelse av denne teknikk i en rottemodell av contusion SCI. En hals kateter implanteres først for en gjentatt injeksjon av kontrastmiddel, en natriumklorid-oppløsning av svovelheksafluorid innkapslede mikrobobler. Ryggraden blir deretter stabilisert med en skreddersydd 3D-ramme og ryggmarg dura mater er utsatt av en laminektomi ved ThIX-ThXII. Ultralydsonden blir deretter plassert i den bakre del av dura mater (belagt med ultralyd gel). For å vurdere baseline SCBF, en enkelt intravenøs injeksjon (400 mikroliter) av contrast middel påføres for å registrere dens passering gjennom intakte ryggmargen mikrovaskulaturen. En vekt-slipp-enheten blir deretter brukt til å generere en reproduserbar modell for eksperimentell contusion SCI. Kontrastmiddel reinjiseres 15 min etter skaden å vurdere post-SCI SCBF endringer. CEU tillater sanntids og in-vivo-vurdering av SCBF endringer følgende SCI. I uskadet dyr, ultralydavbildning viste ujevn blodstrøm langs intakt ryggmargen. Videre 15 min post-SCI, var kritisk iskemi i nivå med skjelv mens SCBF forble bevart i de mer fjerntliggende områder intakt. I regionene ved siden av skjelv (både rostralt og caudal), ble SCBF betydelig redusert. Dette svarer til den tidligere beskrevne "ischemisk penumbra sone". Dette verktøyet er av stor interesse for å vurdere effekten av behandling for å begrense iskemi og den resulterende vevsnekrose etterkant SCI.
Introduction
Traumatisk ryggmargsskade (SCI) er en ødeleggende tilstand som fører til betydelig svekkelse i motor, sensoriske og autonome funksjoner. Til dags dato har ingen terapi demonstrert sin effektivitet hos pasienter. For en slik grunn er det viktig å identifisere nye teknikker som vil forbedre vurdering av potensielle behandlinger, og kan ytterligere belyse skade pathiophysiology 1.
SCI er delt i to faser i rekkefølge, referert til som primære og sekundære skader. Den primære skaden tilsvarer den initiale mekaniske fornærmelse. Mens de sekundære skade grupper en kaskade av ulike biologiske hendelser (for eksempel betennelse, oksidativt stress og hypoksi) som ytterligere bidrar til progressiv utvidelse av den opprinnelige lesjon, vevsskade og derfor nevrologisk underskudd 2,3.
I den akutte fase av SCI, er nevrobeskyttende terapier rettet mot å redusere den sekundære skaden patologi og shOuld følgelig bedre nevrologiske utfall. Blant de mange sekundære skadehendelser, spiller iskemi en avgjørende rolle 4,5. På nivået av SCI episenteret, de skadede parenkymceller microvessels hindre effektiv ryggmarg blodstrøm (SCBF). Videre er SCBF også betydelig redusert i den region som omgir skaden skjelv, et område som er spesielt kjent som "ischemiske penumbra sone". Hvis SCBF ikke kan raskt gjenopprettet innen disse områdene, kan iskemi føre til tilleggs parenchymal nekrose og videre nervøs vevsskade. Som selv den minste vev bevaring kan ha betydelige effekter av funksjon, er det av stor interesse å utvikle medisiner og behandlinger som kan redusere iskemi post-SCI. For å markere dette fenomenet, har tidligere arbeid vist at bevaring av bare 10% av myelinerte axoner var nok til at gang i katter post-SCI 6.
Selv om flere metoder er blitt beskrevet for å vurdere SCBF, deny alle har betydelige begrensninger. For eksempel, bruk av radioaktive sfærer 7,8 og C14-iodopyrine autoradiography 9 krever påfølgende dyreoffer og kan ikke gjentas ved senere tidspunkter. Hydrogen klaring teknikk 10 avhenger av innsettingen av intraspinal elektroder og kan videre skade på ryggmargen. Mens laser Doppler, photoplethysmography 14,15 og in-vivo lysmikroskopi 16 har en svært begrenset dybde / område måle 11-13.
Vårt lag har tidligere vist at kontrastforsterket ultralyd (CEU) avbildning kan brukes til å vurdere sanntid og in-vivo SCBF endringer i rotteryggmarg parenchyma 17. Det er viktig å merke seg at en lignende teknikk ble anvendt av Huang et al. I et grisemodell SCI 18. CEU gjelder en bestemt modus av ultralydavbildning som gjør det mulig å knytte gråtoner morfologisk imaldre (oppnådd ved den konvensjonelle B-modus) med romlig fordeling av blodstrøm 19. Den SCBF avbildning og kvantifisering er avhengig av intravaskulær injeksjon av kontrastmiddel for ultralyd. Kontrastmiddelet består av svovelheksafluorid mikrobobler (gjennomsnittlig diameter på omtrent 2,5 um og 90% har en diameter mindre enn 6 um) stabilisert av fosfolipider. Mikroboblene reflekterer ultralydstrålen som sendes ut av sonden og dermed forsterke blod ekkogenisitet og øke kontrasten av vevet i henhold til deres blodstrøm. Det er derfor mulig å vurdere blodstrømmen i et gitt område av interesse i henhold til intensiteten av det reflekterte signal. Mikroboblene er også trygt og de har vært anvendt klinisk i mennesker. Den svovelheksafluorid er raskt ryddet (gjennomsnittlig terminal halveringstid er 12 min), og mer enn 80% av gitt svovelheksafluorid gjenvinnes i utåndingsluften innen 2 minutter etter injeksjon. Denne protokollen er en enkel måte å bruke CEU imaldring å vurdere SCBF endringer i rotte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: De metodene som er beskrevet i dette manuskriptet ble godkjent av bioetikk komité av Lariboisière School of Medicine, Paris, Frankrike (CEEALV / 2011-08-01).
1. Instrument Forberedelse
- Forberede og rense følgende instrumenter for kateterinnleggelse: Micro-tang, mikro-saks, mikro-vascular klemme, store sakser, kirurgisk tråd (Svart flettet silke 4-0) og en 14 G kateter. Heparinisere kateteret med en heparin-løsning (5000 U / ml).
- Forberede og rense følgende instrumenter for laminektomi: store saks, skalpell og et bein cutter. Utføre laminektomi med en skreddersydd ben kutter er utformet for å redusere risikoen for skade i ryggmargen i løpet av laminektomi (figur 1).
- Set-up 3D-ramme benyttes for posisjonering og stabilisering av dyret. Den skreddersydde rammen er bygget med elementer av en ekstern Fixator Hoffman tre i forbindelse med tang, hh er buet for å passe lumbalcolumna av dyret.
- Klargjør vekt-slipp-enhet (anslags) brukes for ryggmargs biomekanisk skade.
MERK: skreddersydde else enheten ble utformet med en 3D-programvare og skrives ut i 3D. - Slå på ultralyd maskin.
- Forbered kit for tilberedning av kontrastmiddel.
MERK: Settet inneholder 1 hetteglass med 25 mg frysetørket pulver, 1 ferdigfylt sprøyte som inneholder 5 ml natriumklorid og en mini-spike overføringssystem (figur 2). Trinnene for tilberedning av kontrastmiddel er beskrevet nedenfor (i kapittel 5).
2. jugularvenen Kateterisering (figur 3)
- Bedøve dyret med 4% isofluran. Plasser dyret i liggende stilling. Bekreft riktig anesthetization ved å sikre at dyret ikke svarer når potene er klemt med en tang. Påfør veterinær salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Barbere nakken og rense huden. Lag et snitt på midtlinjen av nakken. Trekke sternocleidomastoidian muskelen for å finne den indre halsvene. Stram en ligatur på rostralt del av venen.
- Påfør en microvascular klemme på vein, 1 cm under ligaturen. Passere en annen tråd rundt venen, rett under klemmen med knuten klar til å være stram når klemmen slippes.
- Åpne veggen av venen (venotomy) mellom klemmen og den rostrale ligatur. Innføre en 14 G kateter i lumen av venen og skyv den mot hjertet.
- Når den kommer opp mot klemmen, slipper sistnevnte og skyv kateteret videre. Fest kateteret i venen, ved å ta godt stramme knuten på venen med kateteret inne.
- Vurdere åpenhet av kateteret ved å trekke ut en liten mengde av venøst blod i kateteret og senere deretter spyle den med heparinisert saltløsning. Dette hindrer blokkering av C-atheter av en potensiell blodpropp.
- Koble det fleksible røret til kateteret for videre injeksjon av kontrastmiddel (mikrobobler). Holde det stengt (forseglet) til alt er klart til bruk.
3. Tilgang til Spine, laminectomy og Rat Lokalisering (i 3D-ramme)
- Plasser dyret i et flatt liggende horisontal stilling. Barbere og rengjør tilbake (thorax-regionen) av dyret.
- Identifisere den siste ribbe (XIIIth i rotte) ved palpering (figur 4). Dette gjør det mulig å beregne beliggenheten av XIIIth thorax vertebra (ThXIII).
- Lag en 4 cm hud snitt på midtlinjen, sentrert på ThXIII. Åpne innsnitt, så vel som de underliggende bursa. Observer aponeurosis av ryggmusklene samt tips av ryggvirvel ryggraden prosesser.
- Lokalisere ryggraden prosessen med ThXIII nøye av palpating XIIIth ribbeina.
MERK: XIIIth rib er koblet til ThXIII og representerer derfor en enkel å locate anatomiske landemerke for identifisering av ThXIII. Dette trinnet gjør at lokalisering av ThXII å ThIX spinous prosessen samt L1 og L2 (første og andre lumbale ryggvirvler). - Skjær den muskuløse aponeurosis og løsne musklene på hver side for å avsløre spinous prosesser, lamellene og fasett leddene fra ThIX til L2. Expose side aspekter av L1 og L2 ved å koble musklene fra de tverrgående prosesser.
- Hekte dyrets fortennene på 3D-rammen for å feste posisjonen (figur 5). Klemme L1 og L2 vertebras med de endrede tang. Koble de modifiserte tang til 3D-rammen for å stabilisere dyret.
- Dra forsiktig caudally pinsett holder korsryggen for å stramme hele ryggraden og å heve brystkassen fra benken.
MERK: Med det beskrevne arrangement dyret skal være i stand til å puste. Videre, til tross for respiratoriske bevegelser av brystkassen, ryggraden og ryggledningen bør også forbli immobile. - Fjern spinous processess fra ThIX til ThXII. Skyv forsiktig dårligere blad av benet cutter under venstre lamina av ThXII og lukk bein cutter for å kutte lamina (figur 6).
- Gjenta det samme manøver for retten lamina og suksessivt fjerne bakre bue. Gjenta de forrige trinnene for vertebras ThXI å ThIX for å oppnå en fire-nivå laminectomy. Fjern begge fasett leddene for hver vertebra.
MERK: Gjennom hele prosedyren, rengjør operative feltet fra lokale blødning. For det, bruke bomullspinner og vanning med lunkent saltvann. Hemostase systematisk oppstår i løpet av minutter.
4. CEU Probe Positioning
- Dekk dura mater med ultralyd gel. Dette tillater effektiv overføring av ultralydbølger mellom proben og ryggmargen (figur 7).
- Stabil ultralydproben viddha klemme som kan deretter bli koblet til 3D-bilde av en leddet arm. Manuelt posisjonere sonden. Sørg for at sonden er orientert for å oppnå en skrå lengde sagittal skive. I riktig stilling, er ryggmargen strengt vannrett på bildet, og den sentrale kanal i ryggmargen er synlig langs hele delen av ryggmargen.
MERK: Posisjonering bør styres av sanntids B-mode bildet som vises på skjermen på ultralyd maskinen. Brennvidden i ultralydproben bør være på linje med den sentrale kanalen i ryggmargen. På dette tidspunkt, er den bakre del av ryggmargen rullestol som til slutt vil gi rom for posisjonering av anslags. - Når optimal låse leddet arm for å stabilisere posisjonen.
5. Utarbeidelse av kontrastmiddel - mikrobobleutskillere Rekonstituering
- Bruke innholdet i en kommersiell tilberedning kit og koble stempelet ved å feste det tightly inn i sprøyten (med urviseren). Åpne overføringssystemet blemme og fjerne spissen sprøytehetten. Åpne overføringssystemet hetten og koble sprøyten til overføringssystemet (fest godt).
- Fjern beskyttelses disk fra hetteglasset. Skyv flasken inn i gjennomsiktig ermet av
- overføringssystemet og trykk fast injeksjonsflasken på plass.
- Tøm innholdet i sprøyten inn i hetteglasset ved å trykke på stempelstangen. Rist kraftig i 20 sekunder for å blande alt innholdet i hetteglasset for å få en hvit melkeaktig homogen væske.
- Snu systemet og trekke kontrastmiddelet forsiktig inn i sprøyten. Skru løs sprøyten fra overføringssystemet. Etter oppløsning (som angitt), 1 ml av den resulterende dispersjon inneholder 8 ul svovelheksafluorid i mikroboblene. Tegn suspensjon av mikrobobler i en 100 ml sprøyte. Sett 100 ml sprøyte inn den elektriske pumpen. Lukk lokket.
- Begynn konstant omrøring av reinnsatte mikrobobler. Oppnådd konstant omrøring ved langsom rotasjon av sprøyten, som opprettholder mikroboblesuspensjonen. Koble pumpen til vena kateteret gjennom den fleksible slangen. Sett ultralyd maskin til "Harmonic Mode".
MERK: De sistnevnte tilsvarer hvilken modus mikrobobler kan være spesielt oppdages og visualisert. Denne modus har en lav mekanisk indeks, som ikke ødelegger mikroboblene i motsetning til B-mode. - Renske kateteret ved infusjonen en første dose (400 mikroliter) av kontrastmiddel. I løpet av denne første infusjonen, sjekk at mikrobobler vises på ultralydskjermen. Dette bekrefter at hele kretsen (fra sprøyten til rotteblodbanen) er intakt og åpen.
- Sett ultralyd maskin til "B-modus" for å visualisere ryggmargen parenchyma og ødeleggelsen av de få gjenværende mikrobobler i blodstrømmen. Den høye frekvensen til "B-Mode" tranSmits høy energi til mikroboblene, som gjør dem i stand til sammenbrudd.
- La dyret lå fortsatt i ca. 30 min. Denne perioden kan for stabilisering av de hemodynamiske parametre.
6. Vurdering av SCBF i Intakt Spinal Cord
- Sett ultralyd maskinen til "Harmonic Mode". Starte samtidig (1) infusjon av kontrastmiddel (400 ul) og (2) kronometeret.
NB: I løpet av infusjonen, bør konsentrasjonen av mikrobobler i blodet øke, slik at kontrasten skaping av ryggmargen (figur 8). Siden mikroboblene blir fort ødelagt, konsentrasjonen av mikrobobler blodet begynner å reduseres når injeksjonen er ferdig som frembringer en progressiv reduksjon i kontrast visualisering av ryggmargen. - Etter 1 min, velger du (trykk) "Clip Store" -knappen på ultralyd maskin. Dette vil aktivere en å spare 1 min av raw ultralyd data og bildebehandling videoopptak (som tidligere ble vist på ultralyd skjermen).
- Sett ultralyd maskin til "B-modus". Dette vil fjerne de resterende mikroboblene.
7. Experimental SCI
- Bruke mikromanipluatoren koblet til 3D-rammen, plasserer vekt-slipp else enheten slik at tuppen av anslags kommer i kontakt med dura mater (på ryggmargen midtlinjen), i krysset mellom THX og ThXI (figur 9) .
MERK: Dette nivået skal tilsvare midten av segmentet av ryggmargen observert med ultralydanordningen. Spissen og kroppen av anslags er 8 mm i diameter. Tuppen av støters, som vil generere skaden, er 3 mm i diameter. - Plasser spissen av toppelse enhet om 10 cm høy stilling. Indusere eksperimentelt SCI ved å slippe spissen av toppelse enheten. Spissen faller og utgivelser the nedslaget og skadet ryggmargen. Den skreddersydde else leverer en effekt tilsvarende 10 g vekt falt fra en høyde på 10 cm.
8. Vurdering av SCBF 5 min Post-SCI
- Gjenta fremgangsmåten som er beskrevet i kapittel 6 (Vurdering av SCBF). Mikrobobler vil være ute av stand til å passere gjennom den skadede microvasculature og skaden episenteret vil forbli mørk (Figur 10).
9. Animal Sacrifice
- Avlive dyret med intra-peritoneal dødelig injeksjon av pentobarbital (100 mg).
10. Kvantifisering av SCBF av Offline Analysis
- Start Ultra-Extend Programvare brukt for kvantifisering (på ultralyd maskin). Velg "File" og velg deretter tidligere lagrede rådata og åpne de tilhørende filene. Aktivere "kvantifisering mode" ved å trykke (merke) det "Chi Q" -knappen. Select "Set ROI" (knappen) og velg sirkulær form.
- Velg "Tegn ROI" (knappen) og trekke sju tilstøtende sirkulære områder av interesse (ROI) på ryggmargen (Figur 11). Åpne menyen "Fitting" og velg funksjonen "Curve verdi". Observere programvaren vise flere kurver, som svarer til endringene av mikrobobler konsentrasjon inne i en ROI.
MERK: Hver kurven har en "perfusjons-deperfusion" profil. Den første fasen av kurven er flat og tilsvarer perioden før ankomsten av mikrobobler. I den andre fase, konsentrasjonen av mikrobobler øker raskt som et resultat av infusjonen. I den tredje fase, som begynner når infusjon konsentrasjonen av mikrobobler gradvis reduseres etter hvert som de disintegratse i blodet. - Plasser den første vertikale linje ved begynnelsen av den andre fasen av den C-urve og velg "SET". Dette informerer programvaren hvor du skal begynne analysen.
- Plasser den andre vertikale linjen på slutten av innspillingen og nok en gang velg "SET". Dette informerer programvaren hvor du skal stoppe analyse.
- Se på "Cv" meny, og registrere "AUC" verdi, som tilsvarer den "arealet under kurven" analysert. Denne verdien er proporsjonal med SCBF inne i tilsvarende avkastning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med den protokoll som er beskrevet ovenfor, er det mulig å kartlegge SCBF langs en langsgående ryggmarg sagittal segment.
I det intakte ryggmargen, synes det å være SCBF uregelmessigheter innenfor parenchyma (figur 12). Dette kan forklares ved den variable fordelingen av radiculo-medullær arterier (RMA) fra ett dyr til et annet. RMA refererer til segmental arterier som når fremre spinal arterie (ASA) og derfor gi blodtilførselen til ryggmargen parenkym. I motsetning til dette radicular arteriene tilsvarer segmental arterier, som ikke kommer til ASA, og derfor ikke gir ryggmarg blodtilførsel. Derfor, i ryggmargssegmenter hvor RMA-anastomoser med ASA, er det mer blodstrøm (som vist i våre resultater).
Etter SCI, viser sanntids CEU bildebehandling en mangel i omløp på skaden episenteret. Episenteret forblir mørkt (ingen kontrastmiddel signal),så det er ingen aktive blodstrømmen. Mer detaljert analyse av blodstrøm ved hjelp av flere ROIs viser tre unike blodstrøm territorier. Først, på nivå med skjelv, er blodstrømmen lavest med en gjennomsnittlig reduksjon på omtrent 90%. For det andre, i områdene som grenser til episenteret (både rostral og caudal), SCBF ble også redusert betraktelig (varierer fra -50% til -80%). For det tredje, i de mest fjerntliggende områder som tilsvarer intakt vev, er SCBF bevart. Det andre område tilsvarer den "ischemisk penumbra zone", som bør være målet for potensielle nevro terapier. Å være i stand til lett å visualisere og kvantifisere SCBF endringer post SCI er nyttig for å vurdere effektiviteten av terapi for å redusere vev-ischemi, og derfor fremhever viktigheten av denne teknikken (figur 13).
Figur 2. Skjematisk fremstilling av kit for mikrobobler rekonstituering og Vueject ° pumpe som brukes for mikrobobler infusjon. Overføringssystemet gir mulighet for levering av mikrobobler og saltvann mellom hetteglasset og sprøyten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. vena kateteret. Kateteret skal settes inn i halsvenen, så presset mot hjertet og til slutt feste med en knute. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Metode for korrekt identifisering av ryggvirvel nivåer. Hos rotter er det siste ribbeinet festet til XIIIth vertebra. Sistnevnte kan palperes gjennom huden som et landemerke for siste thorax vertebra, XIIIth. Muskler er frittliggende på hver side av spinous prosesser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Stabilisering av dyret i 3D-rammen. (1) fortennene er hektet på rammen, mens den første og andre lumbale ryggvirvler (L1-L2) er fastklemt med skreddersydde tang. (2) Den korsryggen er litt strammet som stabiliserer dyret og løfter thorax fra benken, og dermed lar frie luftbevegelser uten ryggrad bevegelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Tekniske detaljer om laminektomi. Først blir den tynne blad av skreddersydde bein kutter gått under lamina uten å skade ryggmargen. Da benet kutteren er lukket, noe som cUTS og fjerner en del av arket. Prosedyren gjentas på begge sider og fra ThXII til TxIX for å oppnå en fire-nivå laminektomi. Til slutt, fasett leddene er også fjernet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Plassering av ultralydsonde og else enheten. Sonden er parallell med ryggmargen og lett skråstilte (20-30 °), slik at vekten slipp anslags kan plasseres mot den bakre del av dura. Ryggmargen skal være synlig med den sentrale kanalen til stede i hele midt-segmentet på ultralydavbildning "B-modus". Klikk her for å seen større versjon av dette tallet.
Figur 8. Contrast avbildning av intakt ryggmargen. De påfølgende tall i kontrastmodus (oransje fargede bilder) viser hvordan kontrastmiddel (mikrobobler) progressivt vises etter infusjonen, og dermed styrke kontrasten i ryggmargen. Bolusinfusjon varer i ca 10 sek og kontrasten data ble registrert i 1 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9. Endring i B-modus følgende forsøks SCI. En hyperechoic lesjon vises inne i parenchyma, svarende til den innledende parenchymal h emorrhage post-SCI. Histologi (H & E flekker): blødningen Resultatene fra massive traumatisk forstyrrelse av små blodårene som fører blod bloduttredelse i parenkym (gul skala bar = 2000 mm). Den impaction enheten er vist til høyre. Spissen er gitt ut fra en 10 cm høyde og kolliderer med anslags som senere genererer ryggmargsskade. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10. Kontrast avbildning 15 min post-SCI. I likhet med figur 8, mikrobobler er synlige når de passerer gjennom ryggmargen mikrovaskulaturen. Ved episenteret (stjerne), er blodstrømmen hindres av mikrovaskulær avbrudd.10large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11. Protokoll for SCBF kvantifisering. Med Ultra-Extend Software, er sju sirkulære og tilstøtende regioner av interesse (ROI) tegnet på den langsgående ryggmargen bilde. Den første ROI er plassert på skadeskjelv. I hvert ROI, genererer programmet en perfusjons-deperfusion kurve og beregner arealet under denne kurven. Denne verdien korrelerer med blodtilførselen til dette området. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12. Heterogenitet av blodstrømmen langsryggmarg. Disse grafene viser heterogenitet av ryggmargen blodstrøm samt variasjonen mellom dyrene. Dette kan i stor grad forklares med vaskulær anatomi av ryggmargen. Men på grunn av heterogeniteten og variable vaskulære anatomi, må man bruke de blodstrømsmåling (fra hvert ROI) før skade som grunnlinjen. Målingene er gjort på følgende tidspunkter (post-SCI) er uttrykt som prosent endring av grunnlinjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 13. Endringer i ryggmarg blodstrøm (SCBF) indusert ved den eksperimentelle ryggmargsskade (SCI). 15 minutter etter SCI det er kritisk iskemi i nivå med skjelv mens SCBF forble preservert i de mer avsidesliggende intakte områder. I regionene ved siden av skjelv (både rostralt og caudal), blir SCBF betydelig redusert. Dette tilsvarer den tidligere omtalte "iskemisk penumbra sone". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om vi har beskrevet hvordan du skal bruke CEU i en rotte SCI kontusjon modellen, kan denne protokollen bli endret for å passe andre eksperimentelle mål eller SCI-modeller. Vi har valgt å måle SCBF bare to tidspunkter (før skade, og 15 min post-SCI), men antallet tidspunkter og forsinkelsen mellom SCBF målinger kan tilpasses for å oppfylle behovene til andre studier. For eksempel, i vårt tidligere arbeid 17, har vi målt SCBF på fem suksessive tidspunkter i løpet av den første timen etter SCI. Det er viktig å merke seg at i humbug gruppen (ingen SCI), var vi overrasket over å observere en progressiv nedgang i SCBF. Mens vi først fryktet at gjentatt tilførsel av mikrobobler kan skade på ryggmargen blodkar, videre eksperimentering (upubliserte data) bekreftet at disse forandringene var forårsaket av progressive endringer i lokale vev fysiologiske betingelser (temperatur, fuktighet) indusert ved laminektomi, samt langvarig utstilling av tHan dura og omkringliggende vev til den omgivende luft og ultralyd gel. Disse problemer er vanlig i alle forsøk som arbeider med mikrosirkulasjonen, som sirkulasjonen er ekstremt følsomme for mange parametere, og derfor utsatt for vascoconstriction eller vasodilatasjon. Derfor anbefaler vi at den perioden hvor operasjonssåret forblir åpen er så kort som mulig. Hvis flere SCBF målinger er nødvendig over en lengre periode, vil det være foretrukket å lukke dyret innsnitt mellom anskaffelser for å gjenopprette fysiologiske betingelser rundt og inne i ryggmargen.
Det er også mulig å modifisere den form, størrelse, plassering og antall ROIs for SCBF analyse. En av de store fordelene med CEU er at målingene kan gjøres når som helst etter eksperimentell fullført ved å behandle de registrerte data frakoblet. Det er også mulig å gjenta målingene eller å endre måleinnstillinger / standarder, hvis det er nødvendig.
Romlig oppløsning av ultralydavbildning er proporsjonal med frekvensen av ultralydbølgene. Jo høyere ultralydfrekvensen er, desto bedre romlig oppløsning. Vi har brukt en høy-frequency (12-14 MHz) probe, som gir et bilde med en piksel oppløsning på ca 100 mikrometer. Med svært høy oppløsning systemer, øker hyppigheten opp til 55 MHz, og hver piksel er omtrent 20 mikrometer 20. Slike anordninger kan også anvendes for CEU, som viser mye mer nøyaktig fordeling av SCBF i parenkym. Imidlertid er meget-høy oppløsning systemer er mye dyrere.
Flere andre teknikker er blitt foreslått for å måle SCBF i SCI, men de har alle spesielle begrensninger. Noen, som for eksempel radioaktive sfærer 7,8 eller C14-jod-antipyrine autoradiography 9, krever dyreoffer. I slike tilfeller må ryggmargen bli høstet for analyse. På den annen side, hydrogen klaring teknikk 10 krever intraspinal elektrode innførings som faktisk kan modifisere SCBF. Videre kan målingen kun gjøres i en meget begrenset område av ryggmargen parenchyma. Lysmikroskopigjennom en rygg vindu gir også en måte å vurdere mikrosirkulasjonen, men denne tilnærmingen har en svært begrenset dybde på observasjon. Det gjør det mulig bare å observere sirkulasjon i den overfladiske pia materie og ikke inne i parenkym 16.
I litteraturen er sanntid in-vivo vurderinger av SCBF vanligvis utføres av laser Doppler 11-13. Imidlertid har også denne teknikken flere begrensninger. For det første, siden laseren er mindre enn 1 mm i diameter, SCBF bare kan vurderes i et meget begrenset område som svarer til en halvsfære ca. 1 mm i diameter. Siden rotte ryggmargen er ca. 3 mm i diameter, den begrensede område for analyse er en stor begrensning. Videre, ettersom vi har vist at SCBF i intakt ryggmargen ikke er homogen, er det viktig å måle SCBF i et større område for en riktig fremstilling av vev mikrosirkulasjonen. For det andre har laseren en begrenset inntrengningsdybde og derfor DeteCTS overfladisk SCBF. Som et resultat, er det ikke bare måler parenchymal SCBF men også at av de pia mater (som omgir parenchyma). Siden pia mater har en unik karsystemet og er ikke underlagt de samme auto-reguleringsmekanismer som parenkymceller fartøy, kan denne informasjonen være misvisende. Endelig gjør laser-Doppler gir ingen morfologisk informasjon. CEU vinner slike begrensninger ved å vise morfologiske bilder av ledningen (B-mode), mens unikt presentere kontrastmiddel som kan være tydelig identifisert innen parenkym.
Til tross for sine mange fordeler til andre tilnærminger, har CEU også noen klare begrensninger. Siden målinger blir foretatt på en bi-dimensjonal sagittal skive (vanligvis parallelt med den sentrale kanalen), SCBF fra andre regioner av parenchyma er utilgjengelige. Videre kan informasjonen generert av en enkelt bi-dimensjonale sagittal ryggmargssegmentet ikke være representativ for hele ledningen. Nevertheless, kan denne styres ved hjelp av en rekke forholdsregler. For det første ved å gjenta målinger på samme sted, har den første målingen (intakt ryggmarg) kan brukes som en grunnlinjeverdi. For det andre, ved skader på ryggmargen midtlinjen (bilateral skade), bør SCBF endringene være symmetrisk mellom venstre og høyre (upublisert data). Disse forholdsreglene bidra til at analyser av enkelt sagittal skive er nok til å reflektere det globale lengdefordelingen SCBF.
Den høye kostnaden for ultralyd maskiner er en annen begrensning. Men flere løsninger finnes for å målrette dette problemet. For det første kan noen laboratorier forhandle frem en midlertidig lån av produsenten for sine eksperimenter. Som ultralyd maskiner er transportable, midlertidige lån er mulig. Dette har vært den tilnærmingen som brukes ved vår lab. Alternativt kan en gruppe av laboratorier ressurser for å kjøpe maskinen og dele kostnadene. Ellers mange vitenskapelige høgskolene har bildebehandlings fasiliteter og ultralyd maskins kan anbefales som viktige verktøy. Dermed kan dyrene transporteres bildeanlegg for CEU vurdering og deretter brakt tilbake for andre eksperimenter.
For å vurdere vaskulære endringer, kontrastmiddel (mikrobobler) må injiseres intravenøst. Selv kateterisering av vena eller femoralvenepunksjon er invasiv og risikabelt, venene er lett tilgjengelig og tydelig identifiserbare. I motsetning til dette, er haleveneinjeksjon mye mindre invasiv, men fartøyet er dårlig utmerker / synlig for riktig kateterisering. Derfor er det en risiko for at nålespissen ikke vil være riktig plassert inne i venen, eller at det kan bevege seg i løpet av injeksjonen, noe som påvirker hele eksperimentet. Av den grunn foretrekker vi å bruke vena jugularis, og innføre et kateter for konsekvent mikroboble infusjon.
Ryggvirvel bein omgir ryggmargen. Som ultralydbølgene reflekteres av bein og kan ikke passere gjennom ryggmargen plater, krever bildebehandlingbein fjerning (laminektomi) for å åpne en akustisk vindu. Den enkleste måten å åpne ryggmargskanalen er å fjerne den bakre bue av vertebra gjennom en laminektomi. I denne protokollen, krever vi en fire-nivå laminectomy å visualisere en lang segment av ryggmargen, inkludert episenteret, penumbra sonen og avsidesliggende områder av intakt ryggmargen. Selv om et flertall av eksperimentelle SCI-modeller krever en laminektomi (for klipp program eller anslags kontusjon), disse består vanligvis av å fjerne 1-2 lamina. Den omfattende 4-nivå laminectomy er en annen begrensning av vår studie. Men hvis man bare trenger å studere episenteret og penumbra sone, en mindre omfattende laminectomy kan gjøres og anbefales.
I konklusjonen, til tross for flere begrensninger som er beskrevet ovenfor, er CEU et nyttig verktøy for å vurdere SCBF endringer og effekten av ulike behandlingsformer (forskningsformål). Denne pålitelige, real-time, in-vivo tilnærming er ideelt for å se på behandlinger for å redusereiskemi og påfølgende vevsnekrose post-SCI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- MacDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Martirosyan, N. L., et al. Blood supply and vascular reactivity of the spinal cord under normal and pathological conditions. J Neurosurg Spine. 15 (3), 238-251 (2011).
- Blight, A. R. Cellular morphology of chronic spinal cord injury in the cat: analysis of myelinated axons by line-sampling. Neuroscience. 10 (2), 521-543 (1983).
- Bassingthwaighte, J. B., et al. Validity of microsphere depositions for regional myocardial flows. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H184-H193 (1987).
- Drescher, W. R., Weigert, K. P., Bunger, M. H., Hansen, E. S., Bunger, C. E. Spinal blood flow in 24-hour megadose glucocorticoid treatment in awake pigs. J Neurosurg. 99 (3 Suppl), 286-290 (2003).
- Golanov, E. V., Reis, D. J. Contribution of oxygen-sensitive neurons of the rostral ventrolateral medulla to hypoxic cerebral vasodilatation in the rat. J Physiol. 495 (Pt 1), 201-216 (1996).
- Ueda, Y., et al. Influence on spinal cord blood flow and function by interruption of bilateral segmental arteries at up to three levels: experimental study in dogs). Spine (Phila Pa 1976). 30 (20), 2239-2243 (2005).
- Carlson, G. D., et al. Sustained spinal cord compression: part II: effect of methylprednisolone on regional blood flow and recovery of somatosensory evoked potentials). J Bone Joint Surg Am. 85-A (1), 95-101 (2003).
- Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 32 (18), 1955-1962 (2007).
- Horn, E. M., et al. The effects of intrathecal hypotension on tissue perfusion and pathophysiological outcome after acute spinal cord injury). Neurosurg Focus. 25 (5), E12 (2008).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Ishikawa, M., et al. Platelet adhesion and arteriolar dilation in the photothrombosis: observation with the rat closed cranial and spinal windows. J Neurol Sci. 194 (1), 59-69 (2002).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (1976).
- Huang, L., et al. Quantitative assessment of spinal cord perfusion by using contrast-enhanced ultrasound in a porcine model with acute spinal cord contusion). Spinal Cord. 51 (3), 196-201 (2012).
- Postema, M., Gilja, O. H. Contrast-enhanced and targeted ultrasound. World J Gastroenterol. 17 (1), 28-41 (2011).
- Soubeyrand, M., Badner, A., Vawda, R., Chung, Y. S., Fehlings, M. Very High Resolution Ultrasound Imaging for Real-Time Quantitative Visualisation of Vascular Disruption After Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. , (2014).
- Akhtar, A. Z., Pippin, J. J., Sandusky, C. B. Animal models in spinal cord injury: a review. Rev Neurosci. 19 (1), 47-60 (2008).
