Contraste melhorado Ecografia de Avaliação da Medula Espinhal fluxo de sangue em Experimental lesão medular

Abstract

Redução do fluxo de sangue da medula espinal (FSME) (isto é, isquemia) desempenha um papel-chave na lesão traumática da medula espinal (SCI) patofisiologia e é, portanto, um importante alvo para terapias neuroprotectores. Embora vários técnicas tenham sido descritas para avaliar FSME, todos eles têm limitações significativas. Para superar este último, propomos o uso de tempo real de imagens de contraste melhorado ultra-som (CEU). Aqui nós descrevemos a aplicação desta técnica em um modelo de rato de contusão SCI. Um cateter jugular é implantada em primeiro lugar para a injecção repetida do agente de contraste, uma solução de cloreto de sódio de hexafluoreto de enxofre microbolhas encapsuladas. A coluna é então estabilizada com um 3D-frame feito por encomenda e da medula espinhal dura mater é exposto por uma laminectomia em ThIX-ThXII. A sonda de ultra-sons é, então, posicionado no aspecto posterior da dura-máter (revestidas com gel de ultra-som). Para avaliar FSME linha de base, uma única injecção intravenosa (400 ul) de contrapartidaagente é aplicado r para gravar a sua passagem intacta através da microvasculatura da medula espinal. Um dispositivo de peso-gota é subsequentemente utilizado para gerar um modelo experimental reproduzível contusão da SCI. Agente de contraste é reinjetado 15 min após a lesão para avaliar as mudanças pós-SCI SCBF. CEU permite em tempo real e in vivo avaliação de alterações SCBF após uma lesão medular. No animal ileso, ultra-sonografia mostrou fluxo sanguíneo irregular ao longo da medula espinhal intacta. Além disso, 15 minutos após a SCI, houve isquemia crítica no nível do epicentro enquanto FSME ficaram preservados nas áreas mais remotas intacta. Nas regiões adjacentes do epicentro (ambos rostral e caudal), FSME foi significativamente reduzida. Isto corresponde à "zona de penumbra de isquemia" anteriormente descrito. Esta ferramenta é de grande interesse para a avaliação dos efeitos das terapias destinadas a limitar a isquemia e necrose do tecido resultante após a SCI.

Introduction

Lesão medular traumática (SCI) é uma condição devastadora levando a prejuízo significativo no motor, sensorial e funções autônomas. Até à data, nenhum tratamento tem demonstrado a sua eficácia em pacientes. Por tal razão, é importante para identificar novas técnicas que irão melhorar a avaliação dos tratamentos potenciais e pode elucidar melhor lesão pathiophysiology ^1.

SCI é dividido em duas fases sequenciais, como a que se refere a lesões primárias e secundárias. A lesão primária corresponde ao insulto mecânica inicial. Considerando que os grupos de lesões secundárias uma cascata de vários eventos biológicos (como a inflamação, o estresse oxidativo e hipóxia), que contribuem ainda mais para a expansão progressiva da lesão inicial, dano tecidual e, portanto, neurológica ^2,3 déficit.

Na fase aguda da SCI, terapias neuroprotetoras visam reduzir a patologia lesão secundária e should melhorar a conformidade resultados neurológicos. Entre os muitos eventos de lesões secundárias, isquemia desempenha um papel ^4,5 crucial. Ao nível do epicentro SCI, os microvasos parênquima danificadas impedir o fluxo de sangue da medula espinhal eficaz (SCBF). Além disso, FSME também é significativamente reduzida na região em torno do epicentro lesão, uma área especificamente conhecido como a "zona de penumbra de isquemia". Se FSME não pode ser rapidamente restabelecida dentro destas regiões, a isquemia pode levar a necrose do parênquima complementar e danos no tecido nervoso adicional. Como até mesmo a preservação de tecido mais leve pode ter efeitos substanciais de função, é de grande interesse para desenvolver medicamentos e terapias que podem reduzir isquemia pós-SCI. Para realçar este fenómeno, o trabalho anterior mostrou que a preservação de apenas 10% dos axônios mielinizados foi suficiente para permitir a pé em gatos pós-SCI ^6.

Embora vários técnicas tenham sido descritas para avaliar FSME, oy todos têm limitações significativas. Por exemplo, o uso de microesferas radioactivas ^7,8 e C14-iodopyrine autorradiografia ⁹ requer subsequente sacrifício dos animais e não pode ser repetido em pontos temporais posteriores. A técnica de depuração de hidrogénio ¹⁰ depende da inserção de eléctrodos intraspinal, que pode danificar ainda mais a medula espinhal. Enquanto Doppler a laser, fotopletismografia ^14,15 e in vivo microscopia ^de luz ¹⁶ tem uma profundidade muito limitada / área de medição ^11-13.

A nossa equipa foi anteriormente mostrado que o contraste de ultra-sons melhorada (CEU) de imagem pode ser usada para avaliar o tempo real e in vivo as alterações FSME no parênquima medula espinal de rato ^17. É importante notar que uma técnica semelhante foi aplicada por Huang et al., Em um modelo suíno de SCI ^18. CEU aplica um modo específico de imagens ultra-sónicas que permite associar tons de cinza im morfológicaidade (obtidos pelo modo B convencional) com a distribuição espacial do fluxo sanguíneo ^19. A imagem SCBF e quantificação baseia-se na injecção intravascular de agentes de eco-contraste. O agente de contraste é composta por microbolhas de hexafluoreto de enxofre (diâmetro de cerca de 2,5 significa um e 90% têm um diâmetro inferior a 6 mm) estabilizada por fosfolípidos. As microbolhas de reflectir o feixe de ultra-som emitido pela sonda aumentando assim a ecogenicidade sangue e aumentar o contraste dos tecidos de acordo com o seu fluxo sanguíneo. Por conseguinte, é possível avaliar a fluxo de sangue de uma dada região de interesse de acordo com a intensidade do sinal reflectido. As microbolhas são também seguras e que têm sido clinicamente aplicada em seres humanos. O hexafluoreto de enxofre é rapidamente apagada (tempo de semi-vida terminal é de 12 min) e mais do que 80% do hexafluoreto de enxofre administrada é recuperada no ar exalado dentro de 2 minutos após a injecção. Este protocolo fornece uma maneira simples de usar CEU imenvelhecimento para avaliar as mudanças SCBF em ratos.

Protocol

NOTA: Os métodos descritos neste manuscrito foram aprovados pelo comitê de bioética da Faculdade de Medicina Lariboisière, Paris, França (CEEALV / 2011-08-01).

1. Instrumento Preparação

1. Prepare e limpe os seguintes instrumentos para a inserção do cateter: micro-fórceps, tesouras, micro-micro-vascular braçadeira, grandes tesouras, linha cirúrgica (Black trançado de seda 4-0) e um cateter 14 G. Heparinizar o cateter com uma solução de heparina (5000 U / mL).
2. Prepare e limpe os seguintes instrumentos para a laminectomia: grandes tesoura, bisturi e um cortador de osso. Realizar laminectomia com um cortador de osso feito por encomenda concebida para reduzir o risco de prejudicar a medula espinhal durante a laminectomia (Figura 1).
3. Definir-se-a-quadro 3D utilizado para o posicionamento e estabilização do animal. A custom-made quadro é construído com os elementos de um fixador externo Hoffman 3 em associação com fórceps, which ter sido curvada, a fim de se ajustar à coluna lombar do animal.
4. Prepare o dispositivo de peso-drop (pêndulo) utilizado para lesão medular biomecânico.
   NOTA: O dispositivo impactação feito sob medida foi projetado com um software 3D e impresso em 3D.
5. Ligue a máquina de ultra-som.
6. Prepara-se o conjunto para a reconstituição de agente de contraste.
   NOTA: O kit inclui um frasco contendo 25 mg de pó liofilizado, uma seringa pré-cheia que contém 5 ml de cloreto de sódio e um sistema de transferência de mini-pico (Figura 2). Os passos para a reconstituição do agente de contraste estão detalhadas abaixo (na seção 5).

2. Jugular Vein cateterismo (Figura 3)

1. Anestesiar os animais com 4% de isoflurano. Colocar o animal em decúbito dorsal. Confirme anestesia adequada, garantindo que o animal não responder quando as patas são comprimidos com uma pinça. Aplicar veterinário pomada nos olhos para evitar o ressecamento enquanto undanestesia er.
2. Raspar a garganta e limpar a pele. Realizar uma incisão na linha média do pescoço. Retrair o músculo sternocleidomastoidian a fim de encontrar a veia jugular interna. Aperte uma ligadura na parte rostral da veia.
3. Aplicar um grampo microvascular na veia, 1 cm abaixo da ligadura. Passe outra linha em torno da veia, logo abaixo da braçadeira com o nó pronto para ser apertar quando a braçadeira é libertado.
4. Abra a parede da veia (venotomia) entre o grampo ea ligadura rostral. Introduzir um cateter de 14 G no lúmen da veia e empurrá-lo para o coração.
5. Quando se trata-se contra o grampo, solte o último e empurrar o cateter ainda mais. Fixar o cateter na veia, por firmemente apertar o nó na veia com o cateter para dentro.
6. Avaliar a permeabilidade do cateter através da retirada de uma pequena quantidade de sangue venoso no cateter e, subsequentemente, em seguida, lavando-o com solução salina heparinizada. Isto impede a obstrução do catheter por um coágulo de sangue potencial.
7. Conecte tubagem flexível ao cateter para posterior injeção de agente de contraste (microbolhas). Mantenha-o fechado (selado) até que esteja pronto para uso.

3. Acesso a Espinha, laminectomia e Rat Posicionamento (no-frame 3D)

1. Colocar o animal numa posição horizontal plana propenso. Raspar e limpar a parte de trás (região torácica) do animal.
2. Identificar a última costela (o XIII no rato) por palpação (Figura 4). Isto permite estimar a localização da vértebra torácica XIII (ThXIII).
3. Faça uma incisão na pele 4 centímetros na linha média, centrado em ThXIII. Abra a incisão na pele, bem como a bursa subjacente. Observe a aponeurose dos músculos das costas, bem como as pontas dos processos da coluna vertebral.
4. Localizar cuidadosamente o processo de espinha de ThXIII pela palpação as costelas XIII.
   NOTA: A costela XIII está ligado a ThXIII e, portanto, representa um fácil de locate marco anatômico para a identificação de ThXIII. Este passo permite que a localização da ThXII para ThIX processo espinal, bem como L1 e L2 (primeira e segunda vértebras lombares).
5. Corte a aponeurose muscular e separar os músculos de cada lado para expor os processos espinhosos, as lâminas e as articulações de ThIX para L2. Expor os aspectos laterais dos L1 e L2, desprendendo músculos dos processos transversais.
6. Gancho dentes incisivos do animal sobre a armação-3D para fixar a posição (Figura 5). Aperte as vértebras L1 e L2 com a pinça modificados. Ligue o fórceps modificados para o quadro-3D, a fim de estabilizar o animal.
7. Puxe delicadamente caudal a pinça segurando a coluna lombar, a fim de apertar toda a coluna vertebral e para elevar o tórax do banco.
   NOTA: Com a disposição descrita o animal deve ser capaz de respirar. Além disso, apesar dos movimentos respiratórios da caixa torácica, a coluna vertebral e da medulacabo também deve permanecer imóvel.
8. Remover o processess espinhoso de ThIX para ThXII. Insira cuidadosamente a lâmina inferior do cortador de osso abaixo da lâmina esquerda de ThXII e feche o cortador de osso, a fim de cortar a lâmina (Figura 6).
9. Repita a mesma manobra para a lâmina direita e remova sucessivamente o arco posterior. Repetir os passos anteriores para o ThXI vértebra a ThIX, a fim de alcançar uma laminectomia de quatro níveis. Retire as duas articulações para cada vértebra.
   NOTA: Durante o procedimento, limpe o campo operatório de sangramento local. Para isso, use cotonetes e irrigação com soro fisiológico morno. Hemostasia ocorre sistematicamente em poucos minutos.

4. Posicionamento CEU Probe

1. Cubra a dura-máter com gel de ultra-som. Isto permite que a transmissão efectiva das ondas de ultra-som entre a sonda e a medula espinal (Figura 7).
2. Estabilizar a sonda de ultra-som sagacidadebraçadeira ha que podem ser posteriormente conectado à-frame 3D por um braço articulado. Posicionar manualmente a sonda. Certifique-se de que a sonda está orientada para obter uma fatia sagital longitudinal oblíqua. Numa posição correcta, a espinal medula é estritamente horizontal sobre a imagem e o canal central da medula espinal é visível ao longo do segmento completo da medula espinal.
   NOTA: Posicionamento deve ser guiado pela imagem em modo B em tempo real exibida na tela da máquina de ultra-sons. A distância focal da sonda de ultra-som deve ser alinhado com o canal central da medula espinhal. Neste momento, o aspecto posterior da medula espinal é acessível que acabará por permitir o posicionamento do pêndulo.
3. Quando ideal, bloquear o braço articulado para estabilizar a posição.

5. Preparação de Agente de Contraste - Reconstituição de microbolhas

1. Usando o conteúdo de um kit comercial e reconstituição ligar a haste do êmbolo, apertando-o tightly para a seringa (no sentido horário). Abra a ampola do sistema de transferência e retire a tampa da seringa. Abra a tampa do sistema de transferência e introduza a seringa no sistema de transferência (apertar com força).
2. Remover o disco de protecção do frasco. Deslize o frasco na folha transparente do
3. sistema de transferência e pressione firmemente para assentar o frasco no lugar.
4. Esvaziar o conteúdo da seringa no frasco, empurrando a haste do êmbolo. Agita-se vigorosamente durante 20 segundos para misturar todos os conteúdos do frasco para se obter um líquido homogéneo branco leitoso.
5. Inverter o sistema e retirar cuidadosamente o agente de contraste para dentro da seringa. Retire a seringa do sistema de transferência. Após reconstituição (conforme indicado), 1 ml da dispersão resultante contém 8 ul hexafluoreto de enxofre nas microbolhas. Desenhar a suspensão de micro-vesículas com uma seringa de 100 ml. Inserir a seringa de 100 ml para a bomba elétrica. Fechar a tampa.
6. Iniciar agitação constante da remicrobolhas constituído. Obteve-se a agitação constante por rotação lenta da seringa, o que mantém a suspensão de microbolhas. Ligar a bomba para o cateter jugular através da tubagem flexível. Configure o aparelho de ultra-som para o "Modo Harmonic".
   NOTA: esta última corresponde ao modo no qual as microbolhas pode ser especificamente detectada e visualizado. Este modo tem um baixo índice mecânico, que não destrói as microbolhas, em oposição ao modo-B.
7. Purga-se o cateter através da infusão de uma primeira dose (400 ul) de agente de contraste. Durante esta primeira infusão, verifique se as microbolhas que aparecem na tela do ultra-som. Isto confirma que todo o circuito (a partir da seringa para a corrente sanguínea da ratazana) está intacto e aberta.
8. Configure o aparelho de ultra-som para "B-mode" para visualizar o parênquima da medula espinhal ea destruição dos poucos remanescentes microbolhas na corrente sanguínea. A alta freqüência da "B-Mode" tranalta energia smits às microbolhas, o que lhes permite avaria.
9. Deixe o animal ficou imóvel por aproximadamente 30 min. Este período permite a estabilização dos parâmetros hemodinâmicos.

6. Avaliação de SCBF na Medula Espinhal Intact

1. Configure o aparelho de ultra-som para o "Modo Harmonic". Iniciar em simultâneo (1) a infusão de agente de contraste (400 ul) e (2) o cronometro.
   Nota: Durante a infusão, a concentração de microbolhas na corrente sanguínea deve aumentar, permitindo que a imaginação contraste da medula espinhal (Figura 8). Uma vez que as microbolhas são rapidamente destruídas, a concentração sanguínea de microbolhas começa a diminuir uma vez que a injecção está terminada, que gera uma diminuição progressiva na visualização contraste da medula espinal.
2. Após 1 min, selecione (imprensa) o botão "Clip Store" na máquina de ultra-som. Isto irá permitir um para salvar 1 min de raw dados ultra-som eo vídeo de imagem de gravação (que foi anteriormente exibida na tela do ultra-som).
3. Configure o aparelho de ultra-som para "B-Mode". Isto irá eliminar as microbolhas restantes.

7. Experimental SCI

1. Usando o micromanipulador ligado ao quadro-3D, posicionar o dispositivo de compactação de peso-gota, de modo que a ponta do pêndulo entra em contacto com a dura-máter (na linha mediana da medula espinal), na junção entre ThX e ThXI (Figura 9) .
   NOTA: Este nível deve corresponder ao meio do segmento de medula espinal observada com o dispositivo de ultra-som. O atacante eo corpo do pêndulo são de 8 mm de diâmetro. A ponta do pêndulo, o que irá gerar o prejuízo, é de 3 mm de diâmetro.
2. Inserir o percutor do dispositivo de compactação em uma posição de 10 cm de altura. Induzir a SCI experimental, liberando o atacante do dispositivo impactação. O atacante cai e libera the pêndulo, ferindo a medula espinhal. A impacção feito à medida proporciona um impacto equivalente a um peso de 10 g deixado cair de uma altura de 10 cm.

8. Avaliação dos SCBF 5 min pós-SCI

1. Repita os passos descritos no capítulo 6 (Avaliação da SCBF). As microbolhas não será capaz de passar através da microvasculatura danificado e o epicentro lesão permanecerá escuro (Figura 10).

9. Sacrifício de Animais

1. Eutanásia dos animais com a injecção letal intra-peritoneal de pentobarbital (100 mg).

10. Quantificação de SCBF pela análise off-line

1. Comece o Software Ultra-Estender utilizado para a quantificação (na máquina de ultra-som). Selecione "Arquivo" e selecione os dados brutos salvas anteriormente e abrir os arquivos associados. Ativar o "modo de quantificação", premindo o botão "Chi Q" (selecção). Select "Set ROI" (botão) e escolher a forma circular.
2. Selecione "Desenhar ROI" (botão) e desenhe sete regiões circulares adjacentes de interesse (ROI) sobre a medula espinhal (Figura 11). Abra o menu "Ajuste" e escolha a função "valor da curva". Observar o software visualizadas várias curvas, cada um correspondendo a mudanças de concentração de microbolhas dentro de uma ROI.
   NOTA: Cada curva tem um perfil "perfusão-deperfusion". A primeira fase da curva é plana e corresponda ao período anterior à chegada de microbolhas. Na segunda fase, a concentração de microbolhas aumenta rapidamente, como resultado da infusão. Na terceira fase, a qual começa quando a infusão está completa, a concentração de microbolhas diminui progressivamente à medida que disintegratse na corrente sanguínea.
3. Coloque a primeira linha vertical no início da segunda fase da curve e selecione "SET". Isso informa ao software onde começar a análise.
4. Coloque a segunda linha vertical no final da gravação e mais uma vez seleccionar "set". Isso informa ao software onde parar análise.
5. Olhe para o menu "Cv" e gravar o valor "AUC", que corresponde à "Área Sob a Curva", analisou. Este valor é proporcional à FSME dentro da ROI correspondente.

Representative Results

Com o protocolo descrito acima, é possível mapear o FSME ao longo de um segmento de coluna vertebral sagital longitudinal.

Na medula espinal intacta, parece haver irregularidades FSME dentro do parênquima (Figura 12). Isto pode ser explicado pela distribuição variável de artérias radiculo-medular (RMA) a partir de um animal para outro. RMA refere-se a segmentar artérias que atingem a artéria espinal anterior (ASA) e, portanto, fornecer o fornecimento de sangue para o parênquima da medula espinal. Em contraste, as artérias radiculares correspondem a segmentar artérias, que não atingem o ASA e, portanto, não fornecem suprimento de sangue da medula espinhal. Portanto, em segmentos da medula espinal, onde a RMA anastomosa com o ASA, há mais fluxo de sangue (como se mostra nos resultados).

Depois de SCI, em tempo real de imagens CEU mostra uma deficiência em circulação no epicentro lesão. O epicentro permanece escuro (sem sinal de agente de contraste),como não há fluxo de sangue activa. Uma análise mais detalhada do fluxo de sangue, utilizando várias ROI mostra três territórios fluxo sanguíneo únicas. Em primeiro lugar, no nível do epicentro, o fluxo sanguíneo é o mais baixo, com uma diminuição média de cerca de -90%. Em segundo lugar, nos territórios adjacentes ao epicentro (ambos rostral e caudal), SCBF foi também diminuiu significativamente (variando de -50% a -80%). Em terceiro lugar, nas áreas mais remotas correspondentes a tecido intacto, SCBF é preservada. A segunda região corresponde à "zona de penumbra de isquemia", o qual deve ser o alvo de terapias neuroprotectores potenciais. Ser capaz de facilmente visualizar e quantificar SCBF muda pós-SCI é útil para avaliar a eficácia de terapias destinadas a reduzir a isquemia tecidual e, portanto, destaca a importância desta técnica (Figura 13).

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Figura 2. Representação esquemática do kit para microbolhas reconstituição e a Vueject ° bomba usada para a infusão microbolhas. O sistema de transferência permite a entrega de microbolhas e soro fisiológico entre o frasco e seringa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. cateter jugular. O cateter será inserido na veia jugular, então empurrado em direção ao coração e, finalmente, prenda com um nó. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Método para a correta identificação dos níveis vertebrais. No rato, a última costela está ligado à vértebra XIII. Este último pode ser palpado através da pele como um marco para o último vértebra torácica, a XIII. Músculos são destacados em ambos os lados dos processos espinhosos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Estabilização do animal no quadro 3D. (1) Os dentes incisivos são viciadas na armação enquanto a primeira e segunda vértebras lombares (L1 e L2) são presas com fórceps feitos sob medida. (2) A coluna lombar é um pouco apertado que estabiliza o animal e eleva o tórax do banco, permitindo assim que os movimentos respiratórios livres sem os movimentos da coluna. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Os detalhes técnicos do laminectomy. Primeiro, a fina lâmina do cortador de osso feitos sob medida é passado por baixo da lâmina sem danificar a medula espinhal. Em seguida, o dispositivo de corte de osso é fechada, o que cUTS e remove uma parte da lâmina. O procedimento é repetido em ambos os lados e a partir de ThXII TxIX, a fim de alcançar uma laminectomia de quatro níveis. Finalmente, as articulações também são removidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Localização da sonda de ultra-sons e o dispositivo de compactação. A sonda é paralela à medula espinal e ligeiramente oblíqua (20-30 °), de modo que o peso do pêndulo-gota pode ser colocada contra a face posterior da dura-máter. A medula espinhal deve ser visível com o canal central em toda a presente segmento médio na ultra-sonografia "B-Mode". Por favor clique aqui para veruma versão maior desta figura.

Figura 8. contraste para imagiologia da medula espinal intacto. As figuras sucessivas em modo de contraste (imagens de cor laranja) mostram a forma como o agente de contraste (microbolhas) progressivamente aparece após a perfusão, aumentando assim o contraste da medula espinhal. Bolus dura cerca de 10 segundos e os dados contraste foi gravado durante 1 min. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9. Alterações em modo-B seguintes SCI experimental. Uma lesão hiperecóica aparece dentro da parênquima, correspondente ao parênquima h inicial emorrhage pós-SCI. Histologia (H & E coloração): Os resultados de hemorragia maciça rompimento traumático de pequenos vasos sangüíneos que conduzem ao extravasamento de sangue no parênquima (escala amarelo bar = 2000 mm). O dispositivo de impactação é mostrado à direita. O atacante é liberada de uma altura 10 centímetros e colide com o pêndulo que posteriormente gera a lesão da medula espinhal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10. imagiologia de contraste 15 min pós-SCI. Semelhante à Figura 8, as microbolhas são visíveis à medida que passam através da microvasculatura da medula espinal. No epicentro (asterisco), o fluxo de sangue é obstruído pela ruptura microvascular."Target =" _ blank 10large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11. Protocolo para SCBF quantificação. Com Ultra-Extend Software, sete regiões circulares e adjacentes de interesse (ROI) são desenhados a imagem da medula espinhal em longitudinal. O primeiro ROI é colocado no epicentro lesão. Em cada ROI, o software gera uma curva de perfusão-deperfusion e calcula a área sob esta curva. Este valor se correlaciona com o fluxo de sangue nesta área. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12. A heterogeneidade do fluxo de sangue ao longoa medula espinhal. Estes gráficos mostram a heterogeneidade do fluxo de sangue da medula espinal, bem como a variabilidade entre os animais. Isto pode ser explicado em grande parte pela anatomia vascular da medula espinhal. No entanto, devido à heterogeneidade e anatomia vascular variável, deve-se utilizar as medições de fluxo de sangue (de cada ROI) antes da lesão como a linha de base. As medições feitas nos seguintes pontos temporais (pós-SCI) são expressos como a percentagem mudança da linha de base. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13. As alterações na espinal fluxo de sangue do cordão umbilical (FSME) induzida pela lesão da medula espinal experimental (SCI). 15 min depois da SCI existe isquemia crítica no nível do epicentro enquanto FSME permaneceu preservados nas áreas intactas mais remotas. Nas regiões adjacentes do epicentro (ambos rostral e caudal), FSME é significativamente reduzida. Isso corresponde à "zona de penumbra isquêmica" descrito anteriormente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Embora tenhamos descrito como usar CEU em um modelo de contusão SCI rato, este protocolo pode ser modificado para atender outros objetivos experimentais ou modelos SCI. Optamos por medir SCBF em apenas dois momentos (antes da lesão e 15 min pós-SCI), no entanto o número de pontos de tempo eo atraso entre as medidas SCBF pode ser adaptado para atender as necessidades de outros estudos. Por exemplo, no nosso trabalho anterior ^17, que mediram FSME em cinco pontos de tempo sucessivos durante a primeira hora de pós-SCI. É importante notar que no grupo sham (sem SCI), ficamos surpresos ao observar uma diminuição progressiva SCBF. Embora inicialmente se temia que a infusão de microbolhas repetida pode prejudicar a vasculatura da medula espinal, mais experimentação (dados não publicados) confirmou que estas alterações foram provocadas por alterações progressivas no tecido local condições fisiológicas (temperatura, hidratação) induzidas pela laminectomia, bem como a prolongada exposição de tele dura e tecido circundante para o ar ambiente eo gel de ultra-som. Estes problemas são comuns em todas as experiências relacionadas com a microcirculação, como a circulação é extremamente sensível a muitos parâmetros e, portanto, sujeito a vascoconstriction ou vasodilatação. Portanto, recomendamos que o período durante o qual a ferida operatória permanece em aberto é o mais curto possível. Se várias medições FSME são necessários ao longo de um período de tempo prolongado, seria preferível para fechar a incisão animal entre as aquisições, a fim de restabelecer as condições fisiológicas em torno e no interior da medula espinal.

É também possível modificar o tamanho, forma, localização e número de ROIs para análise FSME. Uma das principais vantagens da CEU é que as medições podem ser feitas em qualquer altura a seguir à conclusão experimental por processamento dos dados gravados off-line. Também é possível repetir as medições ou para modificar as definições medição / padrões, se necessário.

21 que pode ser facilmente adaptado para medir FSME com este protocolo. Uma vez que a medula espinhal é lesada, um simplesmente precisa colocar o gel de ultra-som sobre a dura-máter e posicionar a sonda de ultra-som. Nós também escolher medir SCBF no nível torácico menor, porque corresponde ao modelo que usamos atualmente em nosso laboratório. No entanto, a mesma técnica pode ser usada em outros níveis da medula espinhal. Desde toda a coluna está estabilizada entre a coluna lombar (aperto na L2) e os dentes incisivos, um simplesmente precisa fazer uma laminectomia no nível desejado e posicionar a sonda em conformidade.

A resolução espacial das imagens de ultra-som é proporcional à freqüência das ondas de ultra-som. Quanto maior for a frequência do ultra-som, a melhor resolução espacial. Nós usamos uma altapela frequência (12-14 MHz) sonda, que fornece uma imagem com uma resolução de pixel de cerca de 100 um. Com os sistemas de altíssima resolução, a frequência aumenta até 55 MHz e cada pixel é de cerca de 20 um ^20. Tais dispositivos podem também ser utilizados para CEU, que descrevem com mais precisão a distribuição de FSME no parênquima. No entanto, os sistemas de muito alta resolução são muito mais caros.

Têm sido propostas várias outras técnicas para medir FSME em SCI, mas todos eles têm limitações exclusivos. Alguns, como microesferas radioativas ^7,8 ou a auto-radiografia-C14-iodo antipyrine ^9, exigem sacrifício animal. Nestes casos, a medula espinal devem ser colhidas para análise. Por outro lado, a técnica de depuração de hidrogénio ^10, requer a inserção do eléctrodo intraespinal que podem, na verdade, modificar o FSME. Além disso, a medição só podem ser feitas numa região muito restrita do parênquima da medula espinal. A microscopia de luzatravés de uma janela da coluna vertebral também fornece uma maneira de avaliar a microcirculação, mas esta abordagem tem uma profundidade muito restrito de observação. Ele só permite observar a circulação na matéria Pia superficial e não dentro do parênquima ^16.

Na literatura, em tempo real avaliação in vivo de SCBF são normalmente realizados por Doppler a laser ^11-13. No entanto, mesmo esta técnica tem várias limitações. Em primeiro lugar, uma vez que o laser é inferior a 1 mm de diâmetro, FSME só pode ser avaliada numa zona muito restrita que corresponde a uma semi-esfera de cerca de 1 mm de diâmetro. Desde medula espinhal de rato é de cerca de 3 mm de diâmetro, a área limitada de análise é um grande constrangimento. Além disso, como já demonstrado que FSME na medula espinal intacto não é homogéneo, é importante medir FSME em uma área maior de uma representação adequada da microcirculação do tecido. Em segundo lugar, o laser tem uma profundidade limitada da penetração e, por conseguinte, detects SCBF superficial. Como resultado, não só mede parenquimatosa FSME, mas também a de a pia-máter (que rodeia o parênquima). Uma vez que a pia-máter tem um único sistema vascular e não está sujeito aos mesmos mecanismos de auto-regulação como vasos parenquimatosas, esta informação pode ser enganadora. Por último, o laser de Doppler não fornece qualquer informação morfológica. CEU supera essas limitações, exibindo imagens morfológicas do cabo (modo B), enquanto que apresenta exclusivamente o agente de contraste que podem ser claramente identificados dentro do parênquima.

Apesar de suas muitas vantagens em outras abordagens, CEU também tem algumas limitações distintas. Uma vez que as medições são feitas sobre uma fatia sagital bi-dimensional (geralmente paralela ao canal central), FSME de outras regiões do parênquima são inacessíveis. Além disso, a informação gerada por um único segmento da medula espinhal sagital bi-dimensional pode não ser representativa de toda a medula. Nevertheless, isto pode ser controlado por várias precauções. Em primeiro lugar, repetindo as medições no mesmo local, a primeira medição feita (medula espinhal intacto) pode ser usado como um valor de linha de base. Em segundo lugar, por uma lesão na linha mediana da medula espinal (lesão bilateral), as alterações FSME deve ser simétrica entre os lados esquerdo e direito (dados não publicados). Estas precauções ajudam a garantir que a análise da única fatia sagital é suficiente para refletir a distribuição longitudinal global de SCBF.

O elevado custo das máquinas de ultra-som é outra limitação. No entanto, existem várias soluções para este problema alvo. Em primeiro lugar, alguns laboratórios podem negociar um empréstimo temporário pelo fabricante para seus experimentos. Como as máquinas de ultra-som são transportáveis, os empréstimos temporários são possíveis. Esta tem sido a abordagem utilizada pelo nosso laboratório. Alternativamente, um grupo de laboratórios podem reunir recursos para comprar a máquina e dividir os custos. Caso contrário, muitas instituições universitárias têm instalações de imagem e máquina de ultra-soms pode ser recomendado como ferramentas essenciais. Assim, os animais podem ser transportados a instalação de imagem para avaliação CEU e depois trazido de volta para outros experimentos.

Para avaliar as alterações vasculares, agente de contraste (microbolhas) deve ser injectado por via intravenosa. Embora o cateterismo da veia jugular ou femoral é invasivo e arriscado, as veias são facilmente acessíveis e claramente identificáveis. Em contraste, a injecção na veia da cauda é muito menos invasiva, mas o navio é pouco distinto / visível para cateterismo adequada. Portanto, há um risco de que a ponta da agulha não irá ser adequadamente colocado no interior da veia ou que pode mover-se durante a injecção, comprometer todo o experimento. Por tal motivo, é preferível utilizar a veia jugular e introduzir um cateter para a infusão de microbolhas consistente.

Vértebras cercam a medula espinhal. Quando as ondas de ultra-som são reflectidas por osso e não pode passar através das lâminas da medula espinal, requer imagiologiaremoção de osso (laminectomia) para abrir uma janela acústica. A maneira mais fácil de abrir o canal vertebral é remover o arco posterior da vértebra por meio de uma laminectomia. Neste protocolo, que exigem um laminectomy quatro níveis de visualizar um longo segmento da medula espinhal, incluindo o epicentro, a zona de penumbra e áreas remotas da medula espinhal intacta. Embora a maioria dos modelos experimentais SCI exigem uma laminectomia (para aplicação clipe ou pêndulo contusão), estes geralmente consistem em remoção de 1-2 lâmina. A extensa laminectomy 4 níveis é outra limitação do nosso estudo. No entanto, se é necessário apenas estudar a zona de penumbra epicentro e, uma laminectomia menos extensa pode ser feito e é recomendada.

Em conclusão, apesar dos vários limites acima descritos, CEU é uma ferramenta útil para avaliar as alterações SCBF e o efeito de várias terapias (fins de investigação). Isto, em tempo real fiável, in vivo abordagem é ideal para olhar para tratamentos para reduzirisquemia e necrose tecidual subseqüente pós-SCI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Fixator Hoffman 3	Stryker, Kalamazoo, USA		Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe
Toshiba Applio	Toshiba, Tokyo, Japan		Ultrasound machine
Sonovue	Bracco, Milan, Italy		Contrast agent : microbubbles
Vueject pump	Bracco, Milan, Italy		Electric pump for infusion of microbubbles bolus
Aquasonic Ultrasound Gel	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA		Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Isovet	Piramal Healthcare, Mumbai, India		Isoflurane used for anesthesia
Ultra Extend	Toshiba, Tokyo, Japan		Software used for quantification of spinal cord blood flow
Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6	Canadian Tire, Toronto, Canada		Set of pliers for Do-it-yourself job