Abstract
Снижение расхода спинного мозга крови (SCBF) (т.е. ишемии) играет ключевую роль в травматического повреждения спинного мозга (ТСМ) патофизиологии и, соответственно, важной целью для нейропротективных лечения. Хотя несколько методов были описаны для оценки SCBF, все они имеют существенные ограничения. Чтобы преодолеть тот, мы предлагаем использовать в режиме реального времени усиленного контрастом ультразвуковой томографии (CEU). Здесь мы опишем применение этого метода в крысиной модели ушиба ТСМ. Яремную катетер сначала имплантировали для повторного введения контрастного агента, раствора хлорида натрия элегазовых инкапсулированных микропузырьков. Позвоночник затем стабилизировался с заказ 3D-кадра и спинного мозга твердая мозговая оболочка подвергается по ламинэктомией в THIX-ThXII. Ультразвуковой зонд затем устанавливают на задней поверхности твердой мозговой оболочки (покрытого ультразвуковой гель). Для оценки базового SCBF, один внутривенную инъекцию (400 мкл) противопоказанийул агент наносят записать его прохождение через неповрежденную спинного мозга микрососудов. Вес падение устройство затем используется для генерации воспроизводимого экспериментальную модель ушиб SCI. Контрастное вещество повторно вводят через 15 мин после травмы, чтобы оценить после ТСМ SCBF изменения. КЕС позволяет в режиме реального времени и в естественных условиях оценки изменений SCBF следующей ТСМ. В неповрежденной животного, ультразвуковое обследование показало неравномерное кровотока по интактного спинного мозга. Кроме того, 15 мин после ТСМ, было критической ишемии на уровне эпицентре а SCBF сохранился в более отдаленных районах нетронутыми. В районах, прилегающих к эпицентру (как ростральной и хвостовой), SCBF была значительно снижена. Это соответствует ранее описанной "ишемической полутени" зоне. Этот инструмент представляет большой интерес для оценки влияния терапии, направленных на ограничение ишемии и некроза тканей в результате После ТСМ.
Introduction
Травматический травмы спинного мозга (SCI) является разрушительным состояние приводит к значительному нарушению в моторных, сенсорных и автономных функций. На сегодняшний день, никакой терапии не продемонстрировала свою эффективность у пациентов. Для такого причине, важно, чтобы определить новые методы, которые позволят улучшить оценку возможных методов лечения и может в дальнейшем выяснения травмы pathiophysiology 1.
ТСМ разделена на два последовательных этапа, называемого первичных и вторичных повреждений. Первичный травмы соответствует начальной механической инсульта. В то время как вторичное повреждение групп каскадных различных биологических событий (таких как воспаление, окислительный стресс и гипоксии), что дополнительно способствовать прогрессивному расширению первоначального поражения, повреждения тканей и, следовательно, неврологического дефицита 2,3.
В острой фазе ТСМ, нейропротективные лечения направлены на уменьшение вторичной патологии травмы и шульд соответственно улучшить неврологические исходы. Среди многих вторичных событий травмы, ишемия играет решающую роль 4,5. На уровне эпицентра SCI, поврежденные паренхимных микрососудов препятствовать эффективной кровотока спинного мозга (SCBF). Кроме того, SCBF также значительно снижается в области, окружающей эпицентр травмы, площадь специально известный как "ишемической полутени зоне". Если SCBF не может быть быстро восстановлена в течение этих регионах, ишемия может привести к некрозу паренхимы и дополнительного дальнейшего повреждения нервной ткани. Поскольку даже малейшего сохранение ткань может иметь существенные последствия функции, она представляет большой интерес для разработки лекарств и методов лечения, которые могут уменьшить ишемию пост-SCI. Чтобы подчеркнуть это явление, предыдущая работа показала, что сохранение только 10% миелиновых аксонов было достаточно того, чтобы ходить в кошках после ТСМ 6.
Хотя несколько методов были описаны для оценки SCBF, ву всех есть существенные ограничения. Например, использование радиоактивных микросфер 7,8 и С14-iodopyrine авторадиографией 9 требуется последующее жертву животных и не могут быть повторены в более поздние моменты времени. Техника оформление водорода 10 зависит от введения интраспинальных электродов, которые могут дальнейшее повреждение спинного мозга. В то время как лазерный доплеровский изображений, фотоплетизмография 14,15 и в естественных условиях световой микроскопии 16 имеют очень ограниченную глубину / область измерения 11-13.
Наша команда ранее показали, что контраст усиливается ультразвуковое (КЕС) изображения может быть использован для оценки в режиме реального времени и в естественных условиях изменения SCBF в паренхиме спинного мозга крысы 17. Важно отметить, что подобный метод был применен Хуанг и др. В модели свиньи ТСМ 18. КЕС относится конкретный режим ультразвуковой визуализации, которая позволяет связать в оттенках серого морфологический чатвозрастов (полученные с помощью обычного B-режиме) с пространственным распределением кровотока 19. SCBF изображений и количественное опирается на внутрисосудистого введения эхо-контрастных агентов. Контрастное вещество состоит из гексафторида серы микропузырьков (средний диаметр около 2,5 мкм и 90%, имеющие диаметр менее чем 6 мкм), стабилизированный фосфолипидов. Микропузырьки отражают ультразвуковой луч, испускаемый датчиком, таким образом, увеличивая эхогенность крови и увеличение контрастности тканей в соответствии с их кровотока. Таким образом, можно оценить кровоток в данной области, представляющей интерес в зависимости от интенсивности отраженного сигнала. Микропузырьки также безопасен, и они были клинически применены в организме человека. Гексафторид серы быстро очищается (имею в виду терминала полураспада 12 мин) и более 80% от введенной гексафторида серы восстанавливается в выдыхаемом воздухе в течение 2 мин после инъекции. Этот протокол обеспечивает простой способ использовать CEU чатстарения для оценки изменений в SCBF крысы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Методы, описанные в этой рукописи были одобрены комитетом по биоэтике в Lariboisière школы медицины, Париж, Франция (CEEALV / 2011-08-01).
1. Подготовка прибора
- Подготовьте и очистите следующие инструменты для катетера Micro-щипцы, микро-ножницы, микро-сосудистый зажим, большие ножницы, хирургические нити (черный плетеный шелк 4-0) и 14 г катетер. Heparinize катетер с раствором гепарина (5000 ед / мл).
- Подготовьте и очистите следующие инструменты для ламинэктомией: большие ножницы, скальпель и фрезы кости. Выполните ламинэктомию с заказ фрезы кости, направленных на снижение риска причинения вреда спинного мозга во время ламинэктомией (рис 1).
- Настройка 3D-кадр, используемый для позиционирования и стабилизации животного. Заказ кадр построен с элементами внешней фиксации Хоффман 3 в ассоциации с пинцетом, whicч были изогнуты, чтобы соответствовать поясничного отдела позвоночника животного.
- Подготовьте веса падение устройства (ударного), используемый для спинного мозга биомеханической травмы.
ПРИМЕЧАНИЕ: заказ устройство сдавление был разработан с 3D программного обеспечения и печати в формате 3D. - Включите ультразвуковой машины.
- Подготовьте набор для восстановления контрастного вещества.
ПРИМЕЧАНИЕ: Комплект включает в себя 1 флакон, содержащий 25 мг лиофилизированного порошка, 1 предварительно заполненный шприц, содержащий 5 мл хлорида натрия и одну систему передачи мини-шип (рис 2). Шаги для восстановления контрастного агента приведены ниже (в разделе 5).
2. Катетеризация яремной вены (рис 3)
- Обезболить животное с 4% изофлуран. Поместите животное в положении лежа на спине. Подтвердите правильное обезболивания, гарантируя, что животное не реагирует, когда лапы зажаты с пинцетом. Применить ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость то время как ундэ анестезия.
- Бритье шеи и очистить кожу. Сделайте надрез по средней линии шеи. Уберите sternocleidomastoidian мышцы для того, чтобы найти внутреннюю яремную вену. Затянуть лигатуры на ростральной части вены.
- Нанесите капилляров зажим на вену, 1 см ниже лигатуры. Передайте еще нить вокруг вены, чуть ниже зажима с узла готовы быть затяните при зажим выпущен.
- Откройте стену вен (венотомия) между зажимом и ростральной лигатуры. Ввести 14 г катетер в просвет вены и толкать его по направлению к сердцу.
- Когда дело доходит до зажима против отпустить последнего и нажмите катетер дальше. Закрепите катетер в вену, крепко затянув узел на вене катетер с внутри.
- Оценка проходимости катетера путем удаления небольшое количество венозной крови в катетере, а затем затем промывка его с гепаринизированной физиологического раствора. Это предотвращает закупорку Сatheter потенциальным сгустка крови.
- Подключите гибкий шланг с катетером для дальнейшего введения контрастного агента микропузырьков (). Держите его закрытия (опломбированный) до готовности к использованию.
3. Доступ позвоночника, Ламинэктомия и Крыса позиционирования (в 3D-кадр)
- Поместите животное в квартире, склонной горизонтальном положении. Бритье и очистить спину (грудной отдел) животного.
- Определить последнее ребро (XIII-на крысах) при пальпации (рис 4). Это позволяет оценить местоположение грудного позвонка XIII-(ThXIII).
- Сделайте 4 см разрез кожи по средней линии, с центром в ThXIII. Откройте разрез кожи, а также основной Бурса. Соблюдайте апоневроз мышцы спины, а также кончики позвонков позвоночника процессов.
- Тщательно локализовать процесс позвоночника ThXIII пальпацией в XIII-ребра.
ПРИМЕЧАНИЕ: XIII-ребро соединяется с ThXIII и, следовательно, представляет собой легко Locaте анатомические вехой для идентификации ThXIII. Этот шаг позволяет локализация ThXII в THIX остистый отросток, а также L1 и L2 (первый и второй поясничные позвонки). - Вырезать мышечной апоневроз и отсоедините мышцы по обе стороны, чтобы разоблачить остистые отростки, в пластинки и суставы от THIX в L2. Expose боковые аспекты L1 и L2, отсоединив мышцы от поперечных отростков.
- Крюк резцов животного на 3D-кадр, чтобы обеспечить положение (рисунок 5). Зажим позвонки L1 и L2 с измененными щипцами. Подключите измененные щипцы для 3D-кадр для того, чтобы стабилизировать животное.
- Осторожно потяните каудально щипцы, удерживающие поясничного отдела позвоночника, чтобы затянуть весь позвоночник и поднять грудную клетку со скамейки.
Примечание: С описанным устройством животное должно иметь возможность дышать. Кроме того, несмотря дыхательных движений грудной клетки, позвоночника и спинногошнур должен также остаются неподвижными. - Снимите остистый ПРОЦЕССОВ от THIX в ThXII. Аккуратно вставьте нижнюю лезвие резака кости под левой пластинки ThXII и закройте резак кости для того, чтобы сократить пластинку (Рисунок 6).
- Повторите то же самое для маневра правой пластинки и последовательно удалить заднюю арку. Повторите предыдущие шаги для позвонков ThXI к THIX для достижения четыре уровня ламинэктомию. Снимите обе суставы для каждого позвонка.
ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении процедуры, очистить операционное поле от местного кровотечения. Для этого используйте ватные тампоны и орошения прохладной физиологического раствора. Гемостаз систематически происходит в течение нескольких минут.
4. КЕС зонд позиционирования
- Обложка твердую мозговую оболочку с ультразвуковым гелем. Это позволяет эффективную передачу ультразвуковых волн между зондом и спинного мозга (рис 7).
- Стабилизировать УЗИ датчика остроумиега зажим, который может быть затем подключен к 3D-кадра с помощью шарнирного рычага. Вручную позиционировать зонд. Убедитесь, что зонд ориентирован на получение косой продольный срез сагиттальной. В правильном положении, спинной мозг строго горизонтально на изображении и центральный канал спинного мозга видна по всей сегмента спинного мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позиционирование должно руководствоваться в В-режиме реального времени изображения, отображаемого на экране ультразвукового аппарата. Фокусное расстояние от ультразвукового зонда должны быть согласованы с центральным каналом спинного мозга. В это время, задняя сторона спинного мозга доступна, которые в конечном счете позволяют позиционирования ударного. - При оптимальной, заблокировать шарнирное руку, чтобы стабилизировать положение.
5. Подготовка контрастного вещества - микропузырьков Восстановление
- Используя содержимое коммерческого набора восстанавливающей и подключите стержень поршня от его крепления TIGhtly в шприц (по часовой стрелке). Откройте системный перевод пузырь и удалить шприц наконечник крышку. Откройте крышку системы передачи и подключить шприц к системе передачи (крепятся плотно).
- Извлеките защитный диск из флакона. Слайд флакон в прозрачном рукаве
- Система передачи и нажмите твердо, чтобы заблокировать флакон на месте.
- Очистить содержимое шприца во флакон нажатием на штока плунжера. Встряхивать в течение 20 сек, чтобы смешать все содержимое в ампулу с получением белого молочного однородную жидкость.
- Инверсия систему и тщательно снять контрастное вещество в шприц. Отвинтите шприц из системы передачи. После восстановления (по назначению), 1 мл полученной дисперсии содержит 8 мкл гексафторида серы в микропузырьков. Нарисуйте подвеска микропузырьков в 100 мл шприц. Вставьте 100 мл шприц в электронасоса. Закройте крышку.
- Начните постоянное перемешивание Reсоставляли микропузырьки. Полученный постоянном перемешивании медленным вращением шприца, который поддерживает микропузырьков суспензии. Подключите насос к яремной катетер через гибкий шланг. Установите машину ультразвука, чтобы "Harmonic Mode".
ПРИМЕЧАНИЕ: Последнее соответствует в режим, в котором микропузырьки могут быть специально обнаруженного и визуализируется. Этот режим имеет низкую механическую индекс, который не нарушает микропузырьков в отличие от В-режиме. - Очистите катетер вливая первую дозу (400 мкл) контрастного агента. Во время этой первой инфузии, убедитесь, что микропузырьки появляются на экране ультразвука. Это подтверждает, что весь контур (из шприца в кровоток крысы) цела и открытым.
- Установите машину ультразвука, чтобы «Б-режиме», чтобы визуализировать спинной паренхимы мозга и разрушение нескольких оставшихся микропузырьков в кровотоке. Высокая частота «В-режиме" TranСмитс высокой энергии микропузырьков, что позволяет им пробоя.
- Пусть животное неподвижно лежал около 30 мин. Этот период позволяет стабилизации гемодинамических параметров.
6. Оценка SCBF в неповрежденном состоянии спинного мозга
- Установите ультразвуковой аппарат к "Harmonic Mode". Начало одновременно (1) вливание контрастного вещества (400 мкл) и (2) хронометра.
Примечание: Во время инфузии, концентрация микропузырьков в кровотоке следует увеличить, что позволяет контрастности представляя спинного мозга (рисунок 8). Так микропузырьки быстро разрушается, концентрация в крови начинает падать микропузырьков после того, как инъекции завершен, который генерирует к постепенному уменьшению контрастности визуализации спинного мозга. - После 1 мин, выберите (нажмите) кнопку "Клип-магазин" на ультразвуковой машины. Это позволит сохранить одну 1 мин гAW ультразвуковых данных и записи видеоизображения (который ранее был на экране ультразвукового).
- Установите машину ультразвука, чтобы «Б-Mode". Это позволит устранить оставшиеся микропузырьков.
7. Экспериментальная ТСМ
- Использование микроманипулятора, подключенный к 3D-кадра, расположить веса падение столкновение устройство так, чтобы кончик ударного вступает в контакт с твердой мозговой оболочки (на спинной средней линии мозга), на стыке между ThX и ThXI (фиг.9) ,
Примечание: Этот уровень должен соответствовать середине сегмента спинного мозга наблюдается с ультразвуковым устройством. Нападающий и тело ударного 8 мм в диаметре. Кончик ударного, который будет генерировать травмы, 3 мм в диаметре. - Поместите нападающий в сдавление устройства на 10 см высокое положение. Вызвать экспериментальной ТСМ, выпустив нападающего в сдавление устройства. Нападающий падает и релизы йе ударный, ранив спинной мозг. Заказ столкновение доставляет влияние эквивалентно 10 г вес снизился с высоты 10 см.
8. Оценка SCBF 5 мин после SCI
- Повторите действия, описанные в разделе 6 (оценка SCBF). Микропузырьки не сможет пройти через поврежденную микрососудов и травматизма эпицентре останется темным (Рисунок 10).
9. жертвоприношение животных
- Эвтаназии животное с внутрибрюшинным смертельной инъекции пентобарбитала (100 мг).
10. Количественная SCBF по анализу форуме
- Начните Ультра-Продлить программного обеспечения, используемого для количественного (на УЗИ аппарате). Выберите "Файл", а затем выберите ранее сохраненные сырые данные и открыть связанные с ними файлы. Активируйте "Режим количественного", нажав (выбор) Кнопка "Чи Вопрос". СелеКТ "Установить ROI" (кнопка) и выберите круглую форму.
- Выберите "Draw ROI" (кнопка) и нарисовать семь прилегающих круговые области интереса (ROI) на спинной мозг (рисунок 11). Откройте меню "Место" и выберите "Curve" значение функции. Соблюдайте программное обеспечение, отображающее несколько кривых, каждая из которых соответствует изменениям концентрации микропузырьков внутри ROI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая кривая имеет "перфузии-deperfusion" профиль. Первый этап кривой плоская и соответствует периоду до прихода микропузырьков. На втором этапе, концентрация микропузырьков быстро увеличивается в результате инфузии. На третьем этапе, который начинается, когда вливание завершено, концентрация микропузырьков постепенно уменьшается, поскольку они disintegratse в кровотоке. - Поместите первую вертикальную линию в начале второго этапа CUrve и выберите "SET". Это сообщает программа, где, чтобы начать анализ.
- Поместите вторую вертикальную линию в конец записи и снова выберите "SET". Это сообщает программа, где остановиться анализ.
- Посмотрите на меню "CV" и записать значение "AUC", который соответствует "площадь под кривой" анализируемого. Это значение пропорционально SCBF внутри соответствующего ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С описанным выше протокол, можно отобразить SCBF вдоль продольной спинного мозга сагиттальной сегмента.
В неповрежденной спинного мозга, как представляется, SCBF нарушения в паренхиме (рисунок 12). Это может быть связано с переменной распределения radiculo-медуллярной артерии (RMA) от одного животного к другому. RMA относится к сегментарных артерий, которые достигают передней спинальной артерии (ASA) и, следовательно, обеспечивают кровоснабжение спинного мозга паренхимы. В отличие от этого, корешковые артерии соответствуют сегментарных артерий, которые не достигают ASA и, следовательно, не обеспечивают подачу спинного пуповинной крови. Таким образом, в сегментов спинного мозга, где RMA анастомозов с ASA, есть еще кровотока (как показано в наших результатах).
После ТСМ, изображения в режиме реального времени показывает КЕС дефицит в обращении на травмы эпицентра. Эпицентр не остается темным (не контрастное вещество сигнала),как не существует активного кровотока. Более детальный анализ кровотока с использованием нескольких трансформирования показывает три уникальных территорий кровотока. Во-первых, на уровне эпицентра, кровоток является самым низким со средним уменьшением примерно -90%. Во-вторых, в районах, прилегающих к эпицентру (как ростральной и хвостовой), SCBF также значительно сократилось (от -50% до -80%). В-третьих, в самых отдаленных районах, соответствующих неповрежденной ткани, SCBF сохраняется. Вторая область соответствует "зоне ишемической полутени», которая должна быть целевой потенциальных нейропротективных лечения. Будучи в состоянии легко визуализировать и количественно SCBF изменения после ТСМ является полезным для оценки эффективности лечения, направленных на снижение тканевой ишемии и, следовательно, подчеркивает важность этого метода (рис 13).
Рисунок 2. Схематическое представление набора для восстановления микропузырьков и Vueject ° насоса, используемого для микропузырьков инфузии. Система передачи позволяет для доставки микропузырьков и физиологического раствора между флакона и шприца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. яремной катетер. Катетер должен быть вставлен в яремную вену, затем толкнул к сердцу и, наконец, закрепить узел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Метод для правильной идентификации позвонков уровнях. У крыс, последнего ребра присоединена к XIII-позвонка. Последнее может быть пальпируется через кожу в качестве ориентира для последнего грудного позвонка, в XIII-. Мышцы отделяются по обе стороны от остистых процессов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Стабилизация животного в 3D-кадр. (1) резцов подключены к раме, а первый и второй поясничные позвонки (L1 & L2) зажаты с заказных щипцов. (2) поясничного отдела позвоночника слегка затянута, которые стабилизирует животное и поднимает грудную клетку со скамейки, тем самым позволяя бесплатно дыхательных движений без движений позвоночника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Технические детали ламинэктомией. Во-первых, тонкое лезвие из заказного резак костной прошли под пластинки без повреждения спинного мозга. Затем катер кости закрыт, которых сОТС и удаляет часть пластинки. Процедуру повторяют с обеих сторон и с ThXII чтобы TxIX для достижения с четырьмя уровнями ламинэктомии. Наконец, суставы, также удаляются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. позиционирования ультразвукового зонда и сдавление устройства. Зонд параллельно спинного мозга и слегка косо (20-30 °), так что вес падение ударного могут быть размещены против задней поверхности твердой мозговой оболочки. Спинного мозга должны быть видны с центральной настоящее канала по всей среднего сегмента на ультразвуковой визуализации "Б-Mode". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотретькрупная версия этой фигуры.
Рисунок 8. Контраст изображений интактного спинного мозга. Последовательные цифры в режиме контрастного (оранжевого цвета изображения) показывают, как контрастное вещество (микропузырьки) постепенно появляется после инфузии, тем самым повышая контрастность спинного мозга. Болюсной инфузии длится около 10 сек и данные контраст был записан в течение 1 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
9. Изменения в B-режиме следующие экспериментальной ТСМ. Гиперэхогенная поражения появляется внутри паренхимы, соответствующее начальному паренхимы ч emorrhage после ТСМ. Гистология (H & E окрашивание): Результаты кровотечения из массивной травматического разрушения мелких кровеносных сосудов, ведущих к экстравазации крови в паренхимы (желтый масштаб бар = 2,000 мкм). Сдавление устройство показано на рисунке справа. Нападающий освобождается от 10 см высотой и сталкивается с ударного, что впоследствии генерирует травмы спинного мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10. Контраст изображения 15 мин после ТСМ. Подобно Рисунок 8, микропузырьки могут видеть, как они проходят через спинной микрососудов мозга. В эпицентре (звездочки), кровоток затруднен микрососудов нарушения.10large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 11. Протокол количественного SCBF. С ультра-Продлить Software, семь круговые и прилегающих регионов интереса (ROI) рисуются на продольной спинного мозга изображения. Первый ROI находится на травмы эпицентра. В каждом ROI, программное обеспечение генерирует кривую перфузии-deperfusion и вычисляет площадь под этой кривой. Это значение соотносится с током крови в этой области. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 12. Неоднородность кровотока вдольспинной мозг. Эти графики отображения неоднородность кровотока спинного мозга, а также изменчивость между животными. Это может быть в значительной степени объясняется сосудистой анатомии спинного мозга. Тем не менее, из-за неоднородности и переменной сосудистой анатомии, необходимо использовать измерения кровотока (от каждого ROI) до повреждения в качестве базовой линии. Измерения производятся по временных точках (после SCI) выражаются в изменении процентах от базовой линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 13. Изменение кровотока спинного мозга (SCBF), вызванного экспериментальной травмы спинного мозга (SCI). Через 15 мин после ТСМ есть критической ишемии на уровне эпицентра, а SCBF оставались рзащищены в более отдаленных районах нетронутых. В районах, прилегающих к эпицентру (как ростральной и хвостовой), SCBF значительно снижается. Это соответствует ранее описанной "ишемической полутени зоне". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя мы описали, как использовать CEU в крысиной модели SCI ушиб, этот протокол может быть изменен, чтобы соответствовать другим экспериментальных целей или моделей SCI. Мы выбрали для измерения SCBF только в двух временных точках (до того травм и 15 мин после SCI), однако количество временных точек и задержка между измерениями SCBF может быть адаптирована для удовлетворения потребностей других исследований. Например, в нашей предыдущей работе 17, мы измерили SCBF в пяти последовательных временных точках на протяжении первого часа после ТСМ. Важно отметить, что в группе мнимой (не SCI), мы с удивлением наблюдали постепенное уменьшение в SCBF. В то время как мы первоначально опасались, что повторное вливание микропузырьков может повредить спинной сосудистую мозга, дальнейшие эксперименты (неопубликованные данные) подтвердил, что эти изменения были вызваны прогрессивных изменений в местных тканей физиологических условиях (температура, гидратация), индуцированных ламинэктомией, а также длительное Экспозиция тон Dura и окружающие ткани в окружающий воздух и ультразвукового геля. Эти проблемы являются общими во всех экспериментах, связанных с микроциркуляции, а циркуляция чрезвычайно чувствителен к многим параметрам и, следовательно, склонны к vascoconstriction или сосудов. Поэтому, мы рекомендуем период, в течение которого хирургические раны Остается открытым как можно короче. Если многократные измерения SCBF необходимо в течение длительного периода, было бы предпочтительно, чтобы закрыть животных разрез между поглощений в целях восстановления физиологических условий вокруг и внутри спинного мозга.
Кроме того, можно изменить форму, размер, местоположение и количество трансформирования для анализа SCBF. Одним из основных преимуществ является то, что ЦЕУ измерения могут быть выполнены в любое время следующих экспериментальных завершения путем обработки записанного данных в автономном режиме. Кроме того, можно повторить измерения или для изменения параметров измерения / стандарты, если это необходимо.
Пространственное разрешение ультразвуковых изображений пропорциональна частоте ультразвуковых волн. Чем выше частота ультразвука, тем лучше пространственное разрешение. Мы использовали высокое-frequency (12-14 МГц) зонд, который обеспечивает изображение с разрешением пикселей 100 мкм. В системах с очень высоким разрешением, частота увеличивается до 55 МГц, и каждый пиксель примерно 20 мкм 20. Такие устройства также могут быть использованы для ЦЕУ, которые изображают гораздо точнее распределение SCBF в паренхиме. Тем не менее, системы с очень высокой разрешающей способностью значительно дороже.
Несколько другие методы были предложены для измерения SCBF в ТСМ, но все они имеют уникальные ограничения. Некоторые, такие как радиоактивных микросфер 7,8 или С14-йод-антипирин авторадиографии 9, требует жертву животных. В этих случаях, спинного мозга должны быть собраны для анализа. С другой стороны, метод зазор водорода 10, требуется введение в спинной электрод, который может на самом деле модифицировать SCBF. Кроме того, измерение может быть произведено только в очень ограниченной области спинного паренхимы мозга. Световая микроскопиячерез спинной окне также обеспечивает способ для оценки микроциркуляции, но этот подход имеет очень ограниченное глубину наблюдения. Это только позволяет наблюдать циркуляцию в поверхностном мягкой материи, а не в паренхиме 16.
В литературе, в режиме реального времени в естественных оценки SCBF обычно выполняются с помощью лазерной доплеровской визуализации 11-13. Тем не менее, даже этот метод имеет ряд ограничений. Во-первых, поскольку лазерный меньше 1 мм в диаметре, SCBF может быть оценена только в очень ограниченной области, соответствующей полусферы около 1 мм в диаметре. Так спинного мозга крысы составляет около 3 мм в диаметре, ограниченная область анализа является основным препятствием. Кроме того, как мы показали, что SCBF в интактной спинного мозга не является однородным, важно, чтобы измерить SCBF в большей площади для надлежащего представления ткани микроциркуляции. Во-вторых, лазер имеет ограниченную глубину проникновения и, следовательно, DETEк.т.н. поверхностное SCBF. В результате он не только измеряет паренхимы SCBF но также и мягкой мозговой оболочки (который окружает паренхиму). Так мягкая мозговая оболочка имеет уникальный сосудистую систему и не подвергались тем же авто-регуляторных механизмов, как паренхиматозных сосудов, эта информация может ввести в заблуждение. Наконец, лазерный доплеровский не обеспечивает морфологическую информацию. КЕС преодолевает такие ограничения, показывая морфологические изображений мозга (В-режим), в то время как однозначно представляя контрастное вещество, которое может быть четко определены в паренхимы.
Несмотря на многие преимущества перед другими подходами ЦЕУ также имеет некоторые ограничения различных. Поскольку измерения производятся на би-мерном сагиттальной ломтик (обычно параллельно центрального канала), SCBF из других регионов паренхимы недоступны. Кроме того, информация, полученная от одного би-мерном сагиттальной сегменте спинного мозга не может быть представителем всей мозга. NevertheleСС, это можно управлять с помощью нескольких мер предосторожности. Во-первых, с помощью повторных измерений в том же месте, первое измерение сделано (без изменений спинного мозга) может быть использован в качестве исходного значения. Во-вторых, ранив в спинном средней линии мозга (травмы) двусторонняя, изменения SCBF должны быть симметричны между левым и правым (неопубликованные данные). Эти меры предосторожности помогут обеспечить анализ одного среза сагиттальной достаточно, чтобы отразить глобальный продольный распределение SCBF.
Высокая стоимость ультразвуковых машин еще одно ограничение. Тем не менее, существуют несколько решений, чтобы целевой эту проблему. Во-первых, некоторые лаборатории могут договориться временный кредит производителем для своих экспериментов. Как ультразвуковые машины транспортабельны, временные кредиты возможно. Это был подход, используемый нашей лаборатории. Кроме того, группа лабораторий могут объединить ресурсы, чтобы купить машину и разбить расходы. В противном случае, многие университетские учреждения изображений объектов и ультразвуковое машиныс может быть рекомендован в качестве основных инструментов. Таким образом, животные могут перевозиться в центр изображения для оценки CEU, а затем привез для других экспериментов.
Для оценки изменений сосудов, контраст агента (микропузырьки) должен быть введен внутривенно. Хотя катетеризация яремной или бедренной вены является инвазивным и рискованным, вены легко доступны и четко идентифицировать. В отличие от инъекций в хвостовую вену гораздо менее инвазивными, но судно плохо различают / открыты для правильной катетеризации. Таким образом, существует риск того, что кончик иглы не будет правильно размещен внутри вены или что она может перемещаться во время инъекции, ставя под угрозу весь эксперимент. Для такого причине мы предпочитаем использовать яремную вену и ввести катетер для последовательного микропузырьков инфузии.
Позвонка кости окружают спинной мозг. Как ультразвуковые волны отражаются от костей и не может пройти через спинной пластинки мозга, томография требуетсяудаление кости (ламинэктомию), чтобы открыть окно акустический. Самый простой способ, чтобы открыть позвоночный канал, чтобы удалить заднюю арку позвонка через ламинэктомией. В этом протоколе, мы требуем четыре уровня ламинэктомию визуализировать длинный сегмент спинного мозга, в том числе в эпицентре, в зоне полутени и отдаленных районах нетронутыми спинного мозга. Хотя большинство экспериментальных моделях ТСМ требует ламинэктомию (для клипа приложения или ударного контузии), это, как правило, состоят из 1-2 удаления пластинки. Обширная ламинэктомию 4 уровня еще одно ограничение нашего исследования. Тем не менее, если нужно только изучить эпицентр и полутени зону, менее обширные ламинэктомию можно и рекомендуется.
В заключение, несмотря на несколько ограничений, описанных выше, КЕС является полезным инструментом для оценки изменений SCBF и влияние различных методов лечения (научно-исследовательских целей). Этот надежный, в режиме реального времени, в естественных условиях подход идеален для глядя на лечения, чтобы уменьшитьишемия и некроз тканей последующая пост-ТСМ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- MacDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Martirosyan, N. L., et al. Blood supply and vascular reactivity of the spinal cord under normal and pathological conditions. J Neurosurg Spine. 15 (3), 238-251 (2011).
- Blight, A. R. Cellular morphology of chronic spinal cord injury in the cat: analysis of myelinated axons by line-sampling. Neuroscience. 10 (2), 521-543 (1983).
- Bassingthwaighte, J. B., et al. Validity of microsphere depositions for regional myocardial flows. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H184-H193 (1987).
- Drescher, W. R., Weigert, K. P., Bunger, M. H., Hansen, E. S., Bunger, C. E. Spinal blood flow in 24-hour megadose glucocorticoid treatment in awake pigs. J Neurosurg. 99 (3 Suppl), 286-290 (2003).
- Golanov, E. V., Reis, D. J. Contribution of oxygen-sensitive neurons of the rostral ventrolateral medulla to hypoxic cerebral vasodilatation in the rat. J Physiol. 495 (Pt 1), 201-216 (1996).
- Ueda, Y., et al. Influence on spinal cord blood flow and function by interruption of bilateral segmental arteries at up to three levels: experimental study in dogs). Spine (Phila Pa 1976). 30 (20), 2239-2243 (2005).
- Carlson, G. D., et al. Sustained spinal cord compression: part II: effect of methylprednisolone on regional blood flow and recovery of somatosensory evoked potentials). J Bone Joint Surg Am. 85-A (1), 95-101 (2003).
- Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 32 (18), 1955-1962 (2007).
- Horn, E. M., et al. The effects of intrathecal hypotension on tissue perfusion and pathophysiological outcome after acute spinal cord injury). Neurosurg Focus. 25 (5), E12 (2008).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Ishikawa, M., et al. Platelet adhesion and arteriolar dilation in the photothrombosis: observation with the rat closed cranial and spinal windows. J Neurol Sci. 194 (1), 59-69 (2002).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (1976).
- Huang, L., et al. Quantitative assessment of spinal cord perfusion by using contrast-enhanced ultrasound in a porcine model with acute spinal cord contusion). Spinal Cord. 51 (3), 196-201 (2012).
- Postema, M., Gilja, O. H. Contrast-enhanced and targeted ultrasound. World J Gastroenterol. 17 (1), 28-41 (2011).
- Soubeyrand, M., Badner, A., Vawda, R., Chung, Y. S., Fehlings, M. Very High Resolution Ultrasound Imaging for Real-Time Quantitative Visualisation of Vascular Disruption After Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. , (2014).
- Akhtar, A. Z., Pippin, J. J., Sandusky, C. B. Animal models in spinal cord injury: a review. Rev Neurosci. 19 (1), 47-60 (2008).
