Abstract
İndirimli omurilik kan akımı (SCBF) (yani, iskemi) travmatik omurilik yaralanması (SKY) patofizyolojisinde önemli bir rol oynar ve bu doğrultuda nöron koruyucu tedaviler için önemli bir hedeftir. Çeşitli teknikler SCBF değerlendirmek için tarif edilmiş olmasına rağmen, hepsi önemli sınırlamalar vardır. İkincisi aşmak için, gerçek zamanlı kontrastlı ultrason görüntüleme (CEU) kullanımını öneriyoruz. Burada SKY sıçan kontüzyon modelinde bu tekniğin uygulanmasını açıklar. Bir boyun kateterine sahip birinci kontrast ajanı kükürt heksafluorür kapsüllenmiş mikro-kabarcıkların bir sodyum klorür solüsyonu ile tekrar enjeksiyon için implante edilir. omurga daha sonra bir ısmarlama 3D çerçeve ile stabilize edilir ve omurilik dura mater Thix-ThXII bir laminektomi ile maruz kalmaktadır. ultrason prob, (ultrason jel ile kaplanmış), dura mater arka tarafına konumlandırılır. Ters başlangıçtaki SCBF, tek bir damar içi enjeksiyon (400 ul) değerlendirmekst madde sağlam omurilik mikrovasküler içinden geçişini kaydetmek için uygulanır. Bir ağırlık bırak cihaz, daha sonra SCI bir yeniden üretilebilen deneysel kontüzyon modeli oluşturmak için kullanılır. Kontrast madde sonrası SKY SCBF değişiklikleri değerlendirmek için yaralanma sonrası 15 dakika re-enjekte edilir. CEU Gerçek süre ve in vivo SCI, aşağıdaki SCBF değişikliklerin değerlendirilmesi sağlar. Yaralanmamış hayvanda, ultrason görüntüleme bozulmamış omurilik boyunca düzensiz kan akımı gösterdi. SCBF daha uzak sağlam yerlerde muhafaza kalmıştır Ayrıca, 15 dakika sonrası SCI, kritik iskemi üssü seviyesinde oldu. Üssü (rostral ve kaudal her ikisi de) bitişik bölgelerde SCBF önemli ölçüde azaltılmıştır. Bu daha önce açıklanan "iskemik penumbra bölgesi" karşılık gelir. Bu araç iskemi ve SCI sonra ortaya çıkan doku nekrozu sınırlama amaçlı tedavilerin etkilerini değerlendirmek için önemli bir ilgi alanıdır.
Introduction
Travmatik spinal kord yaralanması (SKY) duyusal motorda ciddi bozulma ve özerk fonksiyonlar giden bir yıkıcı bir durumdur. Bugüne kadar, tedavi hastalardaki etkinliğini göstermiştir. Böyle nedenle, potansiyel tedavilerin değerlendirmesini artıracak ve daha fazla yaralanma pathiophysiology 1 aydınlatmak yeni teknikler belirlemek önemlidir.
SCI olarak birincil ve ikincil yaralanma adlandırılan iki ardışık aşamadan oluşur. Birincil yaralanma ilk mekanik hasara karşılık gelir. Ayrıca ilk lezyon, doku hasarı ve dolayısıyla nörolojik defisit 2,3 ilerici genişlemesine katkıda ikincil yaralanma grupları (örneğin inflamasyon, oksidatif stres ve hipoksi gibi) çeşitli biyolojik olayların bir çağlayan Oysa.
SCI akut aşamasında, nöro-koruyucu tedaviler ikincil yaralanma patoloji ve sh azaltılması hedefleniyorbuna göre nörolojik sonuçlarını iyileştirmek ould. Birçok ikincil yaralanma olayları arasında, iskemi çok önemli bir rol oynar 4,5'ten. SCI merkez üssü düzeyinde, hasarlı parankimal mikrodamarlar etkili omurilik kan akımını (SCBF) engel. Ayrıca, SCBF de önemli ölçüde hasar merkezinden, özellikle "iskemik penumbra bölgesi" olarak bilinen bir alanı çevreleyen bölgede azalır. SCBF hızlı bir şekilde bu bölgeler içinde geri alınamaz ise, iskemi ek parankimal nekroz ve daha fazla sinir doku hasarına neden olabilir. Hatta en ufak bir doku koruma fonksiyonu önemli etkileri olabilir gibi, iskemi sonrası SCI azaltabilir ilaçlar ve tedaviler geliştirmek için önemli ilgi alanıdır. Bu olguyu vurgulamak için, önceki çalışma miyelinli akson sadece% 10 olduğunu göstermiştir korunması SKY sonrası 6 kedilerde yürüyüş izin için yeterli oldu.
Çeşitli teknikler SCBF değerlendirmek için tarif edilmiş olmasına rağmeny tüm önemli sınırlamaları vardır. Örneğin, radyoaktif mikro-7,8 ve C14-iodopyrine otoradyografi 9'a göre bir kullanım daha sonra hayvan kurban gerektirir ve daha sonraki zaman noktalarında tekrarlanmaz. Hidrojen boşluk tekniği 10 daha omuriliğe zarar verebilir intraspinal elektrotlar, ekleme bağlıdır. Lazer Doppler görüntüleme, 14,15 photoplethysmography ve in vivo ışık mikroskobu 16 ölçüm 11-13 çok sınırlı derinlik / alan varken.
Ekibimiz daha önce kontrastlı ultrason (CEU) görüntüleme gerçek zamanlı değerlendirmek için kullanılabileceğini gösterdi ve in vivo sıçan omurilik parankimi 17 SCBF değişir. Benzer bir teknik, Huang ve arkadaşları tarafından uygulanmış olduğunu not etmek önemlidir. SCI 18 bir domuz modelinde. CEU gri tonlama morfolojik im ilişkilendirmek sağlar ultrason görüntüleme belirli bir mod uygularkan akımı 19 mekansal dağılımı ile (konvansiyonel B-mode ile elde edilir) yaşları. SCBF görüntüleme ve miktar eko-kontrast maddelerin intravasküler enjeksiyonu dayanır. kontrast madde (ortalama çapa, yaklaşık 2.5 mm ve çapı en az 6 um olan% 90) kükürt heksafluorür mikro-kabarcıkları oluşur fosfolipidler ile stabilize. mikro kabarcıklar böylece kan ekojenisitesini ve kan akışına göre dokuların artan kontrast artırıcı prob yaydığı ultrason ışınını yansıtacak. Bu yansıyan sinyalin yoğunluğuna göre ilgi konusu bir bölgedeki kan akışını değerlendirmek mümkündür. mikro-kabarcıklar, aynı zamanda, güvenli ve klinik olarak, insanlarda uygulanmıştır. kükürt heksafluorür hızlı bir şekilde temizlenir (terminal yarılanma ömrü anlamına 12 dk) ve kullanılan kükürt heksaflorür fazla% 80, enjeksiyondan sonra 2 dakika içinde nefes verme hava geri kazanılır. Bu protokol CEU im kullanmak için basit bir yol sağlarsıçan SCBF değişiklikleri değerlendirmek için yaşlanma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu yazıda anlatılan yöntemleri Tıp, Paris, Fransa (CEEALV / 2011-08-01) arasında Lariboisière Okulu Biyoetik Komitesi tarafından onaylandı.
1. Enstrüman Hazırlık
- Hazırlayın ve kateter aşağıdaki araçları temizleyin: Mikro forseps, mikro-makas, mikro vasküler kelepçe, büyük makas, cerrahi iplik (Siyah örgülü ipek 4-0) ve 14 G kateter. Bir heparin çözeltisi (5000 U / ml) ile kateter Heparinize.
- Hazırlayın ve laminektomi için aşağıdaki araçları temizleyin: Büyük makas, neşter ve kemik kesici. Laminektomi (Şekil 1) sırasında omuriliği zarar riskini azaltmak için tasarlanmış bir ısmarlama kemik kesici ile laminektomi gerçekleştirin.
- Set-up hayvan konumlandırılması ve stabilizasyonu için kullanılan 3D-çerçeve. ısmarlama çerçeve forseps ile birlikte bir Eksternal Fiksatör Hoffman 3 unsurları ile inşa edilmiştir yüklenebileceğinih hayvanın bel omurgasını uyması için kavisli oylandı.
- Omurilik yaralanması biyomekanik için kullanılan ağırlık bırak cihazı (çarpma) hazırlayın.
NOT: ısmarlama çarpma cihazı 3D yazılımı ile tasarlandı ve 3D basılmıştır. - Ultrason Makineyi açın.
- Kontrast madde sulandırma için kiti hazırlayın.
Not: Kit liyofilize edilmiş toz, 25 mg, 5 ml sodyum klorür ve bir mini başak transfer sistemi (Şekil 2) ihtiva eden 1, önceden doldurulmuş bir şırınga ihtiva eden 1 şişe içerir. kontrast madde yeniden oluşturulmak üzere adımlar (5. bölümünde) aşağıda detaylandırılmıştır.
2. Juguler Ven Kateterizasyon (Şekil 3)
- % 4 izofluran ile hayvan anestezisi. Yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. Pençeleri bir forseps ile sıkışmak zaman hayvan tepkisiz sağlayarak doğru anesthetization onaylayın. Und sırasında kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem sürüner anestezi.
- Boyun Tıraş ve cildi temizleyin. Boynun orta hat üzerinde bir kesi yapmak. Internal juguler ven bulmak için sternocleidomastoidian kas geri çekin. Ven rostral kısmında bir bitişik harfleri sıkın.
- Ven, ligature altında 1 cm üzerinde bir mikrovasküler kelepçe uygulayın. Sadece kelepçe bırakıldığında sıkın olmaya hazır düğümlü kelepçe altında, ven etrafında başka geçirin.
- Kelepçe ve rostral dikilen arasındaki damar (venotomi) duvarını açın. Ven lümeninde 14 G kateter tanıtılması ve kalbin doğru itin.
- Bu kelepçe karşı karşıya gelince, ikincisi bırakın ve daha fazla kateter itin. Sıkıca iç kateter ile damara düğüm sıkarak, ven kateteri sabitleyin.
- Kateter venöz kan küçük bir miktar geri çekilmesi ve daha sonra daha sonra heparinize tuzlu su ile yıkama ile kateterin açıklığı değerlendirmek. Bu c tıkanıklığı önlerpotansiyel bir kan pıhtısı ile atheter.
- Kontrast madde (mikro kabarcıklar) daha enjeksiyon için kateter esnek boruyu bağlayın. Kullanıma hazır olana kadar (mühürlü) kapalı tutun.
3. Spine erişme laminektomi ve Rat Konumlandırma (3D-çerçevede)
- Düz eğilimli yatay konumda hayvan yerleştirin. Tıraş ve hayvan arkasını (torakal bölge) temizleyin.
- Palpasyon (Şekil 4) son kaburga (sıçan XIII) tanımlayın. Bu kimse XIII torakal vertebra (ThXIII) yerini tahmin etmek için izin verir.
- ThXIII merkezli orta hat üzerinde 4 cm'lik cilt kesisi, emin olun. Cilt insizyonu ve altta yatan bursa açın. Arka kasların künt yanı sıra omurga omurga süreçlerinin ipuçlarını dikkate alın.
- Dikkatle XIII kaburga palpe edilerek ThXIII omurga sürecini lokalize.
Not: XIII yiv bu yüzden ThXIII bağlanır ve loca kolay temsil ederThXIII tanımlanması için te anatomik dönüm. Bu adım, ThXII lokalizasyonu spinöz olarak L1 ve L2 (birinci ve ikinci bel vertebralar) Thix sağlar. - Kas künt kesin ve L2 Thix dan spinöz süreçleri, laminalar ve faset eklemleri açığa iki tarafında kasları ayırın. Enine süreçlerden kasları ayırarak L1 ve L2 lateral yönlerini Açığa.
- Pozisyon (Şekil 5) sabitlemek için 3D-çerçeve üzerinde hayvanın kesici dişleri Hook. Modifiye forseps ile L1 ve L2 vertebralar kelepçe. Hayvan stabilize etmek için, 3D-çerçeveye modifiye forseps bağlayın.
- Yavaşça tüm omurgayı sıkın ve tezgah toraks yükseltmek amacıyla kaudal lomber omurga tutan forseps çekin.
Not: Açıklanan düzenleme ile, hayvan nefes mümkün olmalıdır. Ayrıca, göğüs kafesi, omurga ve omurga solunum hareketlerinin rağmenkordon da hareketsiz kalmalıdır. - Thix gelen ThXII için spinöz prosedürlerinden çıkarın. Yavaşça ThXII sol lamina altında kemik kesici alt bıçak yerleştirin ve sonra lamina (Şekil 6) kesmek için kemik kesici kapatın.
- Doğru lamina için aynı manevrayı tekrarlayın ve art arda arka kemer çıkarın. Dört seviyesi laminektomi elde etmek için Thix üzere omurganın ThXI önceki adımları tekrarlayın. Her omur hem faset eklemleri kaldırın.
NOT: prosedür boyunca, yerel kanamadan operasyon alanını temizleyin. Bunun için, ılık tuzlu su ile pamuk bezlerden ve sulama kullanın. Hemostaz sistematik dakika içinde gerçekleşir.
4. CEU Probe Konumlandırma
- Ultrason jeli ile duramateri örtün. Bu prob ve omurilik (Şekil 7) arasındaki ultrason dalgalarının etkili iletimi sağlar.
- Ultrason probu zekâ stabilizeDaha sonra, bir mafsallı kol ile 3D-çerçeveye bağlanabilir hektar kelepçesi. El ile prob yerleştirin. Sonda eğik bir boyuna sagital dilim elde etmek odaklı olduğundan emin olun. Doğru bir konumda, omurilik görüntü dikey ise ve omurilik merkezi kanal omurilik tam segmenti boyunca görülebilir.
NOT: Konumlandırma ultrason makinesinin ekranda gerçek zamanlı B-mod görüntü ile yönlendirilmelidir. ultrason probunun odak mesafesi omuriliğin merkezi kanal ile aynı hizada olmalıdır. Şu anda, omurilik arka yüzleri sonuçta çarpma konumlandırılması için sağlayacak erişilebilir. - Ne zaman optimal pozisyonu stabilize etmek için eklemli kol kilitleyin.
Kontrast Agent 5. Hazırlık - mikro-Sulandırma
- Ticari sulandırma kiti içeriğini kullanarak ve tig onu sıkarak piston kolu bağlamakhtly şırınga (saat yönünde) içine. Transfer sistemi blister açın ve şırınga ucu kapağı çıkarın. Transfer sistemi kapağını açın ve transfer sistemi şırınga bağlayın (sıkıca bağlayın).
- Flakon koruyucu diski çıkarın. Şeffaf kovan içine flakon kaydırın
- transfer sistemi ve sıkıca bastırın yerine flakon kilitlemek için.
- Dalgıç çubuk üzerinde iterek şişenin içine şırınga içeriğini boşaltın. Beyaz renkteki bir sütümsü homojen bir sıvı elde etmek için bir küçük şişe içinde, tüm içerikleri karıştırmak için 20 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır.
- Sistemi ters çevirin ve dikkatlice şırınga içine kontrast madde çıkarın. Transfer sisteminden şırınga sökün. (Belirtildiği gibi), sulandırıldıktan sonra elde edilen dispersiyon, 1 ml mikro-kabarcıkların 8 ul kükürt heksafluorür içerir. 100 ml'lik enjektöre kabarcıkların süspansiyon çizin. Elektrikli pompa içine 100 ml şırınga yerleştirin. Kapağı kapatın.
- Yeniden sürekli ajitasyon başlatOluşturduğu mikro-kabarcıklar. Mikro-kabarcık süspansiyonu tutar şırınga, yavaş dönmesi ile elde edildi sabit bir ajitasyon. Esnek tüp yoluyla boyun kateter pompası bağlayın. "Harmonic Mode" ultrason makinesi olarak ayarlayın.
Not: mikro-kabarcıklar özellikle algılanabilir ve görsel edilebileceği moduna ikinci uygun olmasıdır. Bu mod B-mod aksine mikrokabarcıkları yok etmez, düşük mekanik endeksi vardır. - Kontrast maddenin bir birinci doz (400 | il) infüzyonu ile kateter temizleyin. Bu ilk infüzyon sırasında mikro kabarcıklar ultrason ekranında görünmüyor olmadığını kontrol edin. Bu (sıçan kan dolaşımına şırınga) Bütün devre sağlam ve açık olduğunu doğrular.
- Omurilik parankimi ve kan dolaşımında kalan birkaç kabarcıkların yıkımı görselleştirmek için "B-modu" ultrason makinesi olarak ayarlayın. "B-Mode" yüksek frekans tranarıza onları sağlayan mikro kabarcık için Smits yüksek enerji.
- Hayvan yaklaşık 30 dakika boyunca hareketsiz yatıyordu edelim. Bu dönem hemodinamik parametrelerin stabilizasyonu için izin verir.
Bozulmamış Omurilik içinde SCBF 6. Değerlendirilmesi
- "Harmonic Mode" ultrason makinesi olarak ayarlayın. Kontrast madde (400 ul), ve (2) kronometre eş zamanlı olarak (1) infüzyon başlatın.
NOT: infüzyon sırasında, kan mikro-kabarcıkların konsantrasyonu omurilik (Şekil 8) kontrast dusunme sağlayan artmalıdır. Mikro kabarcıklar hızla tahrip olduğundan, mikrokabarcıkların kan konsantrasyonu enjeksiyonu omurilik kontrast görselleştirme ilerici bir azalma üretir tamamlandığında azalan başlar. - 1 dakika, select (basın) ultrason makinesinde "Clip Store" butonuna sonra. Bu r 1 dakika tasarruf sağlayacak biraw ultrason verileri ve kayıt görüntüleme, video (daha önce ultrason ekranında görüntülenen).
- "B-Mode" ultrason makinesi olarak ayarlayın. Bu kalan mikrokabarcıkları ortadan kaldıracaktır.
7. Deneysel SCI
- ThX ve ThXI arasındaki kavşakta, çarpma ucu (spinal kord orta hatta üzerine) dura mater ile temas, böylece kilo damla çarpma cihazı yerleştirmek 3D çerçeveye bağlı mikromanipülatör kullanarak (Şekil 9) .
NOT: Bu seviye ultrason aleti ile görülen omurilik segmentin orta uygun olmalıdır. vurucu ve çarpma gövde çapı 8 mm'dir. yaralanma üretecektir çarpma ucu, çapı 3 mm dir. - 10 cm yüksekliğindeki pozisyonda çarpma cihazının forvet yerleştirin. Impaksiyon cihazın forvet bırakarak deneysel omurilik neden olur. forvet düşer ve bültenleri incie çarpma, omurilik yaralanmasına. ölçüye impaksiyon bir 10 g ağırlığına bir darbe eşdeğeri 10 cm yükseklikten düşürülen sunar.
SCBF 5 dk Sonrası SCI 8. Değerlendirilmesi
- Bölüm 6 (SCBF Değerlendirilmesi) 'de açıklanan adımları tekrarlayın. microbubbles (Şekil 10) koyu kalır hasarlı mikrovasküler ve yaralanma merkez üssü geçmesi mümkün olmayacaktır.
9. Hayvan Kurban
- Pentobarbital intra-peritoneal öldürücü enjeksiyon (100 mg) ile bir hayvan ile öldürülür.
Çevrimdışı Analizi SCBF 10. Kantitasyonu
- (Ultrason makinede) ölçümü için kullanılan Ultra uzatın Yazılımı başlatın. "Dosyayı" seçin ve ardından önceden kaydedilmiş ham veriyi seçin ve ilişkili dosyaları açın. (Seçerek) "Chi Q" tuşuna basarak "miktar modu" etkinleştirin. Select "Set ROI" (düğme) ve dairesel bir şekil seçin.
- "Yatırım getirisi Beraberlik" ı seçin (düğme) ve omurilik (Şekil 11) faiz yedi bitişik dairesel bölgeleri (ROI) çizin. "Montaj" menüsünü açın ve işlev "Eğri değerini" seçeneğini seçin. Her bir ROI içindeki mikro kabarcık konsantrasyonu değişikliklerine karşılık, birkaç eğrileri görüntüleyen yazılım gözlemleyin.
NOT: Her eğri bir "perfüzyon-deperfusion" profile sahiptir. eğrinin ilk aşaması düz ve kabarcıkların gelmeden önce döneme tekabül eder. İkinci aşamada, mikro-kabarcıkların konsantrasyonu hızlı infüzyon sonucu olarak artmaktadır. Bunlar kan disintegratse infüzyon tamamlandıktan sonra başlar, üçüncü aşamada, mikro-kabarcıkların konsantrasyonu giderek azalır. - C ikinci fazın başlangıcında ilk dikey çizgi yerleştirinurve ve "SET" i seçin. Bu analiz başlamak için yazılım bildirir.
- "SET" seçeneğini bir kez daha kaydının sonunda ikinci dikey çizgi koyun ve. Bu analiz durdurmak için bir yazılım bildirir.
- "Cv" menüsünden bakmak ve analiz "Eğri Altındaki Alan" karşılık "EAA" değeri, kayıt. Bu değer, karşılık gelen ROI içinde SCBF orantılıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolü, yukarıda tarif edilen ile, uzunlamasına bir omurga sagital segmenti boyunca SCBF harita mümkündür.
Sağlıklı omurilik olarak parenkima (Şekil 12) içinde SCBF düzensizlikler gibi görünüyor. Bu başka bir hayvandan radiculo-medüller arterlerin değişken dağılımı (RMA) ile izah edilebilir. RMA ön spinal arter (ASA) ulaşmak ve bu nedenle omurilik parankimi kan akımı sağlayan atardamarların segmental anlamına gelir. Buna karşılık, radiküler arterler omurilik kan akımını vermeyin nedenle ASA ulaşmak ve yok arterler, segmental karşılık gelmektedir. Bu nedenle, RMA ASA ile anastomoz spinal kord segmentlerinde, (bizim sonuçlarımızda gösterilir) daha fazla kan akışı vardır.
SCI sonra, gerçek zamanlı CEU görüntüleme yaralanma merkez üssünde dolaşımda bir eksiklik görülmektedir. merkez üssü, koyu (kontrast ajan sinyali) kalıraktif kan akımı var gibi. Birkaç İB'leri kullanarak kan akımının daha detaylı analiz üç benzersiz kan akımı toprakları gösterir. Birincisi, merkez üssü düzeyinde, kan akımı yaklaşık -90 ortalama% azalma ile en düşük düzeydedir. İkincisi, merkez üssü (rostral ve kaudal her ikisi de) bitişik bölgelerde, SCBF da önemli ölçüde (-50 ila% -80% arasında değişen) azalmıştır. Üçüncüsü, sağlam dokuya gelen en uzak bölgelerde, SCBF korunur. ikinci bölüm, potansiyel nöro-koruyucu terapilerin hedefi olmalıdır "iskemik penumbra bölge" e karşılık gelir. Kolayca SCBF görselleştirmek ve ölçmek için güçlü olmak SKY sonrası doku iskemisi azaltmayı hedefleyen tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için yararlıdır değiştirir ve bu nedenle bu teknikle (Şekil 13) önemini vurgulamaktadır.
Mikrokabarcıklar sulandırma için kit ve mikro kabarcıklar infüzyon için kullanılan pompa ° Vueject Şekil 2. şematik gösterimi. transfer sistemi şişe ve şırınga arasındaki mikro kabarcık ve tuzlu teslimat için izin verir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3. Juguler kateter Şekil. Kateter juguler ven eklenecek, daha sonra kalbin doğru itti ve bir düğümle sabitleyin nihayet. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Vertebra düzeyleri doğru tanımlama için 4. Yöntem Şekil. Sıçanlarda, son kaburga XIII vertebraya takılır. İkincisi son torakal vertebranın için bir dönüm noktası, XIII olarak deri yoluyla palpe edilebilir. Kaslar spinöz proses iki tarafında ayrılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3D-çerçeve içinde hayvan 5. İstikrar. Birinci ve ikinci bel omurganın (L1 ve L2) ısmarlama forseps ile kenetlenir ise (1) kesici dişler çerçeve bağımlısı. (2) lomber omurga hafifçe böylece omurga hareketlerinin olmadan solunum hareketleri sağlayan, hayvan stabilize ve tezgah toraks yükseltir hangi sıkılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil laminektomi 6. Teknik detaylar. Birincisi, ısmarlama kemik kesici ince bıçak lamina altında geçirilir omuriliği zarar vermeden. Daha sonra, kemik kesici, kapalı olan Cıuts ve lamina bir kısmını ortadan kaldırır. Prosedür, dört seviyede laminektomi elde etmek için her iki tarafında ve TxIX için ThXII tekrarlanır. Son olarak, vardır da kaldırıldı faset eklemleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ağırlık bırak çarpma dura arka yönü karşı konabilir, böylece ultrason probu ve sıkıştırma cihazının Şekil 7. Konumlandırma. Prob, omurilik paralel ve (20-30 °) hafifçe eğik olduğunu. Omurilik ultrason görüntüleme "B-Mode" ile ilgili orta segmentte boyunca merkez kanal varken görünür olmalıdır. görmek için buraya tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonu.
Bozulmamış omurilik Şekil 8. Kontrast görüntüleme. Kontrast modunda art arda rakamlar (turuncu renkli görüntüler) kontrast madde (mikro kabarcıklar) giderek böylece omurilik kontrastını arttırmak, infüzyon takip nasıl göründüğünü gösterir. Bolus infüzyon yaklaşık 10 saniye sürer ve kontrast verileri 1 dakika boyunca kaydedildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 9. Deneysel SKY aşağıdaki B-mod değişiklikler. Bir hiperekoik lezyon ilk parankimal h karşılık gelen parankiminde içinde görünen emorrhage SKY sonrası. Histoloji (H & E boyama): parankiminde kan ekstravazasyonu (sarı ölçek çubuğu = 2,000 mm) giden küçük kan damarlarının yoğun travmatik bozulması kanama sonucu. impaksiyon cihaz sağda gösterilir. forvet, 10 cm yüksekliğinde serbest ve daha sonra omurilik yaralanması üretir çarpma çarpıştığı edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Onlar omurilik mikrovasküler geçerken 15 dakika sonrası SKY. Benzer 8 Şekil Şekil 10. Kontrast görüntüleme, mikro kabarcıklar görülebilir. Merkez üssü (yıldız), kan akımı mikrovasküler bozulma ile tıkanmış.10large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
SCBF ölçümü için Şekil 11. Protokol. Ultra-Extend Yazılımı ile faiz (ROI) yedi dairesel ve komşu bölgelerde boyuna omurilik resmin üzerine çizilir. İlk ROI yaralanma merkez üssü yerleştirilir. Her ROI, yazılım perfüzyon-deperfusion eğrisini oluşturur ve bu eğri altında kalan alan hesaplar. Bu değer, bu alanda kan akımı ile ilişkilidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Boyunca kan akışı Şekil 12. Heterojeniteomurilik. Bu grafikler omurilik kan akımının heterojenliğini yanı sıra hayvanlar arasında değişkenlik gösterir. Bu büyük ölçüde omurilik vasküler anatomi ile açıklanabilir. Ancak, heterojenite ve değişken vasküler anatomi nedeniyle bir önceki temel olarak yaralanma (her ROI) kan akımı ölçümleri kullanmanız gerekir. Aşağıdaki zaman noktalarında (post-SCI) yapılan ölçümler başlangıca yüzdeleri değişikliği olarak ifade edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 13. Deneysel omurilik yaralanması neden olduğu omurilik kan akımı (SCBF) değişiklikler (SCI). SCBF kalırken merkez üssü düzeyinde kritik iskemi p orada SKY sonrasında 15 dakikaDaha uzak sağlam bölgelerde aittir. (Rostral ve kaudal her ikisi de) merkez üssü komşu bölgelerde, SCBF önemli ölçüde azalır. Bu daha önce açıklanan "iskemik penumbra bölgesi" karşılık gelir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz sıçan SKY kontüzyon modelinde CEU nasıl kullanılacağını tarif olmasına rağmen, bu protokol, diğer deneysel hedefleri veya SCI modellerini uyacak şekilde modifiye edilebilir. Biz ancak zaman noktalarının sayısı ve SCBF ölçümleri arasındaki gecikme, diğer çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için adapte edilebilir, (yaralanma ve 15 dakika sonrası SKY öncesi) sadece iki kez noktalarında SCBF ölçmek için seçtiniz. Örneğin, önceki çalışmaları 17, ilk saat sonrası SCI genelinde beş ardışık zaman noktalarında SCBF ölçüldü. Bu Sham grubunda (hayır SCI), biz SCBF ilerici bir azalma gözlemlemek için sürpriz olduğunu not etmek önemlidir. Biz başlangıçta tekrarlanan mikrokabarcık infüzyon omurilik damarsal, ayrıca deney (yayınlanmamış veriler) zarar korktu ederken bu değişikliklerin ilerici laminektomi tarafından uyarılan lokal doku fizyolojik koşullar değişiklikler (sıcaklık, hidrasyon) yanı sıra uzun süreli neden olduğunu doğruladı t fuarO dura ve ortam havası ve ultrason jel dokuyu çevreleyen. Dolaşım birçok parametreye son derece hassas ve vascoconstriction veya vazodilatasyona nedenle eğilimli olduğu bu sorunlar, mikrosirkülasyonda ile ilgili tüm deneylerde yaygındır. Bu nedenle, cerrahi yara açık kaldığı süre mümkün olduğunca kısa olmasını öneririz. Birden SCBF ölçümleri uzun bir süre boyunca ihtiyaç varsa, etrafında fizyolojik koşulların geri yüklemek için ve omurilik içindeki satın almalar arasında hayvan kesi kapatmak için tercih olacaktır.
Bu şekil, boyut, konum ve SCBF analizi için ROI'ler sayısını değiştirmek de mümkündür. CEU önemli avantajlarından biri, ölçümleri kaydedilen veriler çevrimdışı işleyerek deneysel tamamlanmasının ardından her zaman yapılabilir olmasıdır. Bu ölçümler tekrarlamak ya da gerekirse ölçüm ayarlarını / standartları değiştirmek de mümkündür.
Ultrason görüntüleme uzaysal çözünürlük ultrason dalgalarının frekansı ile orantılıdır. uzamsal çözünürlük daha iyi ultrason frekansı yüksek. Biz yüksek kullandıkyaklaşık 100 mikron piksel çözünürlüğe sahip bir görüntü sağlar -Frekans (12-14 MHz) prob. Çok yüksek çözünürlüklü sistemleri ile, frekans 55 MHz kadar artar ve her piksel, yaklaşık 20 mikron 20'dir. Bu tür cihazlar parenkimde SCBF çok daha hassas bir dağılımı tasvir CEU için de kullanılabilir. Ancak, çok yüksek çözünürlüklü sistemler çok daha pahalıdır.
Birkaç diğer teknikler SCI SCBF ölçmek için önerilen, ama hepsi benzersiz kısıtlamaları vardır oylandı. Böyle radyoaktif mikroküreler 7,8 veya C14-iyot-antipirin otoradyografinin 9 gibi bazı hayvan kurban gerektirir. Bu gibi durumlarda, omurilik analizi için hasat gerekir. Öte yandan, hidrojen klirensi tekniği 10, aslında SCBF değiştirebilir intraspinal elektrot sokulmasını gerektirir. Ayrıca, ölçüm sadece omurilik parankimi çok kısıtlı bölgede yapılabilir. Işık mikroskobuSpinal pencereden de mikrodolaşımı değerlendirmek için bir yol sağlar, ancak bu yaklaşım gözlem çok kısıtlı bir derinliğe sahiptir. Sadece parankimi 16 içinde yüzeysel pia konuda değil dolaşımını gözlemlemek için izin verir.
Literatürde, SCBF gerçek zamanlı in-vivo değerlendirmeler genellikle lazer Doppler 11-13 tarafından yapılmaktadır. Ancak, hatta bu tekniğin çeşitli sınırlamalar vardır. Lazer çapı 1 mm'den az olduğu İlk olarak, SCBF yalnızca çapı yaklaşık 1 mm olan, bir yarı-küre karşı gelen bir çok dar bir alanda değerlendirilebilir. Sıçan omurilik çapı yaklaşık 3 mm olduğundan, analiz sınırlı alan önemli bir kısıt oluşturmaktadır. Biz sağlıklı omurilik bu SCBF homojen değildir göstermiştir Dahası, doku mikrosirkülasyon uygun bir temsili için daha büyük bir alanda SCBF ölçülmesi önemlidir. İkinci olarak, bir lazer nüfuz etme ve dolayısıyla deterjanları sınırlı bir derinliğe sahiptiryüzeysel SCBF cts. Bunun bir sonucu olarak, bu parankimal SCBF değil, aynı zamanda pia mater ki (bu parankimi çevreleyen) büyüklüğüne değil. Pia mater eşsiz bir damar sistemi vardır ve parankimal damarları aynı otomatik düzenleyici mekanizmalar tabi olmadığından, bu bilgilerin yanıltıcı olabilir. Son olarak, lazer Doppler herhangi morfolojik bilgi sağlamaz. CEU benzersiz açıkça parankiminde içinde tespit edilebilir kontrast madde sunarken, kordon (B-mod) morfolojik görüntüleri göstererek bu tür kısıtlamaların üstesinden.
Diğer yaklaşımlar birçok avantajlara rağmen, CEU bazı belirgin sınırlamaları vardır. Ölçümler bi-boyutlu sagital dilim yapılır beri parankimi diğer bölgelerinden, SCBF (genellikle orta kanala paralel) erişilemez. Dahası, bir tek iki boyutlu sagital omurilik segmenti tarafından üretilen bilgilerin tüm kordon temsil olmayabilir. Nevertheless, bu birkaç tedbirlerle kontrol edilebilir. İlk olarak, aynı yerde ölçümler tekrarlandı, ilk ölçüm (sağlam omurilik), bir taban değeri olarak kullanılabilir yaptı. İkincisi, spinal kord orta hatta (bilateral yaralanma) de yaralayarak, SCBF değişiklikleri ve sol sağa (yayınlanmamış veriler) arasındaki simetrik olmalıdır. Bu önlemler SCBF global boyuna dağılımını yansıtacak yeterli tek sagital dilim o analizini sağlamak.
ultrason makineleri yüksek maliyet başka kısıtlamadır. Ancak, çeşitli çözümler bu sorunu hedeflemek için var. Birincisi, bazı laboratuvarlar kendi deneyleri için imalatçı tarafından geçici bir kredi pazarlık yapabilirsiniz. Ultrason makinaları taşınabilir olduğundan, geçici krediler mümkündür. Bu bizim laboratuvarda tarafından kullanılan yaklaşım olmuştur. Alternatif olarak, laboratuarları bir grup makinesi satın almak için kaynak havuzu ve maliyetleri ayırabilirsiniz. Aksi takdirde, birçok üniversite kurumları görüntüleme olanakları ve ultrason makinesi vars temel araçlar olarak tavsiye edilebilir. Böylece hayvanlar CEU değerlendirilmesi için görüntüleme tesisi taşınabilir ve daha sonra diğer deneyler için geri getirdi.
Vasküler değişiklikleri, kontrast madde (mikro-kabarcıklar) değerlendirmek için intravenöz olarak enjekte edilmelidir. Boyun veya femoral ven kateterizasyonu invaziv ve riskli olmasına rağmen, damarlar kolayca erişilebilir ve net tanımlanabilir. Buna karşılık, kuyruk ven enjeksiyon daha az invaziv, ancak gemi doğru kateterizasyon zayıf / seçkin görünür. Bu nedenle, iğne ucu düzgün ven içine yerleştirilen olmayacak ya da tüm deney ödün, enjeksiyon sırasında hareket edebilir bir riski vardır. Böyle bir nedenden dolayı, biz juguler ven kullanımı ve tutarlı mikrokabarcık infüzyon için bir kateter tanıtmak için tercih ediyor.
Vertebra kemikleri omurilik çevreliyor. Ultrason dalgaları kemik ile yansıtılır ve omurilik laminalara geçemez gibi, görüntüleme gerektirirKemik çıkarma (laminektomi) akustik penceresini açmak için. vertebra kanal açmak için en kolay yolu, bir laminektomi ile vertebra posterior kemer kaldırmaktır. Bu protokol, biz merkez üssü, penumbra bölgesi ve bozulmamış omurilik uzak bölgelerde dahil olmak üzere omurilik uzun bir segmenti, görselleştirmek için dört seviyeli laminektomi gerektirir. Deneysel SCI modellerinin çoğunluğu (klip uygulama veya çarpma kontüzyonu için) laminektomi gerektirmesine rağmen, bunlar genellikle 1-2 lamina çıkarmadan oluşur. Kapsamlı 4 seviyeli laminektomi çalışmamızın başka kısıtlamadır. Biri sadece merkez üssü ve penumbra bölgesini incelemek gerekiyor Ancak, daha az kapsamlı bir laminektomi yapılabilir ve tavsiye edilir.
Sonuç olarak, yukarıda tarif edilen çeşitli sınırlar rağmen CEU SCBF değişimleri ve çeşitli terapiler (araştırma amaçlı) etkisini değerlendirmek için yararlı bir araçtır. Bu güvenilir, gerçek zamanlı, in-vivo yaklaşımı azaltmak için tedavi bakmak için idealdiriskemi ve sonraki doku nekrozu SKY sonrası.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- MacDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Martirosyan, N. L., et al. Blood supply and vascular reactivity of the spinal cord under normal and pathological conditions. J Neurosurg Spine. 15 (3), 238-251 (2011).
- Blight, A. R. Cellular morphology of chronic spinal cord injury in the cat: analysis of myelinated axons by line-sampling. Neuroscience. 10 (2), 521-543 (1983).
- Bassingthwaighte, J. B., et al. Validity of microsphere depositions for regional myocardial flows. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H184-H193 (1987).
- Drescher, W. R., Weigert, K. P., Bunger, M. H., Hansen, E. S., Bunger, C. E. Spinal blood flow in 24-hour megadose glucocorticoid treatment in awake pigs. J Neurosurg. 99 (3 Suppl), 286-290 (2003).
- Golanov, E. V., Reis, D. J. Contribution of oxygen-sensitive neurons of the rostral ventrolateral medulla to hypoxic cerebral vasodilatation in the rat. J Physiol. 495 (Pt 1), 201-216 (1996).
- Ueda, Y., et al. Influence on spinal cord blood flow and function by interruption of bilateral segmental arteries at up to three levels: experimental study in dogs). Spine (Phila Pa 1976). 30 (20), 2239-2243 (2005).
- Carlson, G. D., et al. Sustained spinal cord compression: part II: effect of methylprednisolone on regional blood flow and recovery of somatosensory evoked potentials). J Bone Joint Surg Am. 85-A (1), 95-101 (2003).
- Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 32 (18), 1955-1962 (2007).
- Horn, E. M., et al. The effects of intrathecal hypotension on tissue perfusion and pathophysiological outcome after acute spinal cord injury). Neurosurg Focus. 25 (5), E12 (2008).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Ishikawa, M., et al. Platelet adhesion and arteriolar dilation in the photothrombosis: observation with the rat closed cranial and spinal windows. J Neurol Sci. 194 (1), 59-69 (2002).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (1976).
- Huang, L., et al. Quantitative assessment of spinal cord perfusion by using contrast-enhanced ultrasound in a porcine model with acute spinal cord contusion). Spinal Cord. 51 (3), 196-201 (2012).
- Postema, M., Gilja, O. H. Contrast-enhanced and targeted ultrasound. World J Gastroenterol. 17 (1), 28-41 (2011).
- Soubeyrand, M., Badner, A., Vawda, R., Chung, Y. S., Fehlings, M. Very High Resolution Ultrasound Imaging for Real-Time Quantitative Visualisation of Vascular Disruption After Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. , (2014).
- Akhtar, A. Z., Pippin, J. J., Sandusky, C. B. Animal models in spinal cord injury: a review. Rev Neurosci. 19 (1), 47-60 (2008).
