Abstract
Hjärnan består av fyra primära celltyper inklusive neuroner, astrocyter, mikroglia och oligodendrocyter. Även om de inte är den vanligaste celltypen i hjärnan, nervceller är den mest studerade av dessa celltyper med tanke på deras direkta roll i att påverka beteenden. Andra celltyper i hjärnan påverkar också neuronal funktion och beteende via signalmolekyler som de producerar. Neuro måste förstå samspelet mellan celltyperna i hjärnan för att bättre förstå hur dessa interaktioner påverkar neural funktion och sjukdom. Hittills är den vanligaste metoden för att analysera protein eller genuttryck utnyttjar homogenisering av hela vävnadsprov, vanligtvis med blod, och utan hänsyn till celltyp. Detta tillvägagångssätt är en informativ strategi för att undersöka generella förändringar i genen eller proteinuttryck som kan påverka nervfunktion och beteende; Men denna analysmetod inte lämpar sig för en ökad förståelse av cell-typ specifikt genuttryck och effekten av cell-till-cellkommunikation på nervfunktionen. Analys av beteende epigenetik har varit ett område av ökande fokus som undersöker hur modifieringar av deoxiribonukleinsyra (DNA) struktur effekter på lång sikt genuttryck och beteende; dock, kan denna information endast vara relevant om analyseras i en celltyp specifikt sätt med tanke på differential härstamning och därmed epigenetiska markörer som kan förekomma på vissa gener enskilda neurala celltyper. Den fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) teknik som beskrivs nedan tillhandahåller ett enkelt och effektivt sätt att isolera enskilda neurala celler för efterföljande analys av genexpression, proteinuttryck, eller epigenetiska modifieringar av DNA. Denna teknik kan även modifieras för att isolera mer specifika neurala celltyper i hjärnan för efterföljande celltyp-specifik analys.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | reactivity for rat |
| APC-conjugated CD11b antibody | Biolegend | 201809 | reactivity for rat |
| Rabbit anti-GLT1 | Novus Biologicals | NBP1-20136 | reactivity for rat or human |
| PE-conjugated anti-rabbit secondary antibody | eBioscience | 1037259 | secondary antibody for anti-GLT1 |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 (Thy1) mouse antibody | Biolegend | 202504 | reactivity for rat |
References
- Schwarz, J. M., Smith, S. H., Bilbo, S. D. FACS analysis of neuronal-glial interactions in the nucleus accumbens following morphine administration. Psychopharmacology. 230 (4), 525-535 (2013).
- Schwarz, J. M., Hutchinson, M. R., Bilbo, S. D. Early-life experience decreases drug-induced reinstatement of morphine CPP in adulthood via microglial-specific epigenetic programming of anti-inflammatory IL-10 expression. J Neurosci. 31 (49), 17835-1523 (2011).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31 (11), 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124 (1), 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128 (1), 173-185 (2013).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2000).
- Okana, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Bogdanović, O., Veenstra, G. J. DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function. Chromosoma. 118 (5), 549-565 (2009).
- Iwamoto, K., et al. Neurons show distinctive DNA methylation profile and higher inter-individual variations compared with non-neurons. Genome Res. 21 (5), 688-696 (2011).
- Nishioka, M., et al. Neuronal cell-type specific DNA methylation patterns of the Cacna1c gene. Int J Dev Neurosci. 31 (2), 89-95 (2013).
- Kozlenkov, A., et al. Differences in DNA methylation between human neuronal and glial cells are concentrated in enhancers and non-CpG sites. Nucleic Acid Res. 42 (1), 109-127 (2014).
- Russo, S. J., et al. Nuclear factor kappa B signaling regulates neuronal morphology and cocaine reward. J Neurosci. 29 (11), 3529-3537 (2009).
- Bhatt, D., Ghosh, S. Regulation of the NF-κB-Mediated Transcription of Inflammatory Genes. Front Immunol. 5, 71 (2014).
- Okada, S., et al. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. J Cell Physiol. 226 (2), 552-558 (2011).
