Protocol
OPMERKING: De experimenten met muizen werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele dierenwelzijn commissie (IACUC) richtlijnen.
1. Bereiding van de Rag-1 - / - muizen met I n Vitro Gekweekte Th17 cellen (Drie dagen voorafgaand aan de infectie)
- Voor de vaststelling Th17 cellen kweek CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- naïeve T-cellen (3 x 104) in U-bodem 96 putjes alleen of co-kweken ervan met 3 x 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs in aanwezigheid van oplosbare α-CD3 (1 ug / ml), α-CD28 (2 ug / ml) antilichamen en antigen presenterende cellen, onder Th17 omstandigheden (gepolariseerde middels IL-6 (25 ng / ml), TGF-β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) en α-IL-4 (2 ug / ml)) gedurende 3-4 dagen.
OPMERKING: Naïve cellen en T-regs werden naargelang het gebruik van fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) eend magnetische celisolatie procedures en gekweekt zoals eerder 19-22 beschreven. - Op dag 4 na het resuspenderen Th17 cellen met de pipet, verzamel uit kweken en centrifugeer ze onder steriele omstandigheden.
- Neem een kleine hoeveelheid van deze cellen om hun levensvatbaarheid en voor fenotyperen onderzoeken. Resuspendeer ze in 500 pl RPMI medium, voeg propidiumjodide (200 ng / ml) en hun levensvatbaarheid onmiddellijk bepalen door flowcytometrie. Voeren fenotyperen door flowcytometrie beoordeling van IL-17A de productie na restimulatie (zie paragraaf 6.3).
- Centrifugeer en was het grootste deel van de cellen in steriele PBS bij 480 xg gedurende 6 min bij 4 ° C in alle stappen tenzij anders vermeld.
- Gebruik deze cellen voor adoptieve overdracht in 6-8 weken oude CD45.2 RAG1 - / - immunodeficiënte muizen.
- Resuspendeer de cellen in 1 x 10 7 cellen / ml celdichtheid met koud steriel PBS.
- Injecteer 100 ui van de cellen door intraperitoneal injectie, met behulp van 25 G naalden op 1 ml tuberculine spuiten, zodanig dat één muis ontvangt 1 x 10 6 cellen. Sommige muizen zal PBS of Th17 cellen alleen te ontvangen, en andere muizen zullen Th17 cellen die samen gekweekt met Treg cellen waren ontvangen.
OPMERKING: Voer alle stappen aseptisch.
2. Groeiende C. albicans voor infectie (een dag voor infectie)
- Voor enting, verspreiden vijf kolonies van de CAF2-1 C. albicans laboratoriumstam in 100 ul steriele PBS schorsing, en voeg de ophanging aan de steriele bouillon.
- Inoculeer 5 kolonies van de C. albicans in 50 ml van de gist stikstof base (YNB zonder aminozuren) / pepton / Dextrose kweekmedium en geïncubeerd in een shaker incubator bij 30 ° C gedurende 15-18 uur bij 130 rpm.
- Controleer de bouillon voor troebelheid, als een indicatie voor de groei van de schimmel.
3. CandidaOogsten en Counting Procedure (Op de Dag van de infectie)
- Verzamel 10 ml Candida bouillon in 15 ml buizen. Voor grotere hoeveelheden, verzamel Candida in 50 ml buizen.
- Centrifugeer blastosporen 1900 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in alle stappen tenzij anders vermeld. Pellet blastosporen door centrifugeren, gevolgd door verwijdering van het supernatant.
- Als er meer dan één buis, verzamel het Candida Blastosporen van meerdere buizen, toevoegen steriele PBS om de pellets en resuspendeer ze in 10 ml PBS te tellen.
- Neem 20 pi van blastosporen in 1,5 ml microcentrifuge buizen, voeg 20 ul van 2X paraformaldehyde en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15-20 min. Tel de vaste blastosporen met de hemocytometer onder de microscoop.
OPMERKING: Paraformaldehyde is kankerverwekkend. Open de onverdunde oplossing alleen in de zuurkast. - Intussen herhalen wassen blastosporen ten minste tweemaal door centrifugeren tzoom in PBS, en pelletiseren de blastosporen. Houd de pellets in 15 ml buisjes bij kamertemperatuur in de ABSL1 kap, klaar voor infectie.
- Laat wat steriele PBS bij kamertemperatuur resuspenderen de blastosporen voor infectie.
- Na tellen, voeg steriel PBS aan de blastospore pellet aan de gist blastospore celaantallen 2 x10 8 van gistcellen / ml toegepast. Dit is de blastospore suspensie die wordt gebruikt om de muizen te infecteren.
OPMERKING: Voer alle stappen aseptisch.
4. Muizen Infectie (3-5 dagen na de Cel Transfer)
OPMERKING: De basis infectie procedure wordt uitgevoerd zoals eerder 19,23-25 beschreven.
- Weeg de Rag-1 - / - muizen die PBS of de cellen drie dagen eerder ontvangen.
- Bereken de dosis anesthetica met hun lichaamsgewicht. Verdoven de muizen door toedienen van ketamine / xylazine mengsel (16,1 mg / ml en 1,6 mg / ml), met 25 G naalden op 1 ml tuberculine spuiten, door intraperitoneal injectie.
- Dien 50 ui per 10 g lichaamsgewicht. (Dwz 0,8 mg ketamine en 0,08 mg xylazine / 10 g lichaamsgewicht of 80 mg ketamine en 8 mg xylazine per kg lichaamsgewicht respectievelijk). Observeren voor teen knijpen respons om de 15 min na de anesthesie.
LET OP: Deze dosering zal 60-90 min van anesthesie, wat genoeg is voor de infectie procedure induceren. - Breng de oftalmische zalf smeermiddel in de ogen van de muizen te voorkomen dat de hoornvliezen uitdroogt. Als het oog smeermiddel kan uitdrogen, herhaal oogheelkundige smering elke 45 min.
- Dien 50 ui per 10 g lichaamsgewicht. (Dwz 0,8 mg ketamine en 0,08 mg xylazine / 10 g lichaamsgewicht of 80 mg ketamine en 8 mg xylazine per kg lichaamsgewicht respectievelijk). Observeren voor teen knijpen respons om de 15 min na de anesthesie.
- Injecteer 1 ml zoutoplossing (0,9% NaCl) subcutaan aan de achterzijde grenzend aan de voorpoot, rehydratatie van de muizen helpen tijdens anesthesie.
- Vraag een nieuwe, schone kooi. Volg de procedure infectie één muis tegelijk plaatsen elke muis in de nieuwe kooi eenmaal geïnfecteerd. Voer de PBS / schijnvertoning infectie eerste, en vervolgens overgaan tot de Candida-infectie groups.
- Pak de verdoofde muis en de mond wijd aan de basis van de tong onthullen openen.
- Plaats een 3 mm diameter watten verzadigd met 50 pl PBS of blastospore suspensie, sublinguaal in de mondholte gedurende 90 min. Flip de muizen om de 15 min voorzijde en terug naar long congestie te voorkomen, ervoor te zorgen dat de katoenen ballen niet bewegen.
- Een timer voor elke muis 90 min Sham of Candida inoculatie waarborgen in de mondholte.
- Houd ze in een kooi onder de warmtelamp (4 meter afstand), en elke muis op warmte gel pads.
- Zorg ervoor dat de tong binnen en weg wordt onttrokken aan de tanden, tanden verscheurende de tong te voorkomen.
- Aan het einde van de 90 minuten, verwijder de katoenen bal uit de mond van de muis. Kijk uit voor elke muis die kan herstellen van anesthesie eerder dan 75 minuten. In dat geval verdoven ze weer met slechts ketamine (40 mg / kg).
5. Bericht procedure Monitoring (tijdens de 90 min Anesthesie)
- Gebruik warmte gel pads tijdens de 90 min anesthesie.
- Om het lichaam op temperatuur te houden en om verstikking te voorkomen, staan niet toe dat de muizen om te herstellen op de reguliere corn-cob muis beddengoed.
- Na het herstel van anesthesie, toedienen eens 1 ml steriele 0,9% NaCl subcutaan op twee plaatsen op de rug.
- Blijf op de vijf PBS (sham) geënt muizen per kooi. Huis slechts 1-2 geïnfecteerde muizen per kooi.
- Vul de procedure kaart met initialen elke dag na de procedure noteren de veranderingen in het lichaamsgewicht, verzorgen gewoonten en de algehele gezondheid.
6. Het beoordelen van de Ontsteking
6.1) Gewichtsverlies
- Weeg de muizen elke dag tijdens de infectie, ingaande op de dag voorafgaand aan de infectie procedure.
OPMERKING: Typisch, de immunodeficiënte muizen geïnjecteerd met Th17 cellen en zonder T regs bezwijken voor 20-30% Gewichtsverlies door toegenomen schimmelbelasting 19 en verergerd ontsteking.
6.2) Histologie scoring van de tong
- Offeren de muizen door CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Open de kaken en ontleden de tong met een schaar en pincet. Gebruik stompe tang om de mond te houden en met de schaar reiken aan de achterkant van de mond naar de achterkant van de tong insnijden.
- Voor immuuncytochemische hematoxyline en eosine (H & E) kleuring van de tong weefsels, spoel de tong weefsels met ijskoude PBS. Voeg 5 ml van 10% formaline voor 2-3 tongen en ze op te lossen O / N in 15 ml buizen.
- De volgende dag, verwijder de formaline en dompel de weefsels in 5 ml 70% ethanol hyper-fixatie te voorkomen. Stuur ze naar commerciële dienst te gaan met inbedden in paraffine, snijden en kleuring van paraffine secties.
OPMERKING: Commerciële histologie dienst wordt gebruikt om deze stappen uit te voeren. - Als de dia's zijn terug van de commerciële histologie, de rang van de ontsteking en houdt de weefselcoupes onder een lichtmicroscoop.
- Score van 0 tot 5, waarbij 0 geen ontsteking, en 5 het meest ernstige ontsteking. Score de ontsteking met behulp van tabel 1.
6.3) Cytokineproductie door Th17 cellen
OPMERKING: Overmatige TNF-α productie is één van de uitlezingen op overmatige immunopathologie. Bij muizen adoptief overgebracht met Th17 cellen alleen veroorzaakt immunopathologie die wordt geassocieerd met overmatige productie van TNF-α in Th17 cellen.
- Verzamel een enkele celsuspensie van de milt, cervicale lymfeknopen, axillaire lymfeklieren en tong, met eerder beschreven werkwijzen 19,26.
- Restimulate de cellen met forbolmyristaatacetaat (PMA) (50 ng / ml) en Ionomycine (500 ng / ml) gedurende 4 uur met Brefeldine A (10 ug / ml) in het last 2 uur. Was de cellen met PBS en bevestig ze met een commercieel fixatie / permeabilisatie kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer intracellulaire cytokine kleuring met fluorochroom geconjugeerde anti-TNF-α, anti-IL-17A en ROR-γt antilichamen zoals eerder 19 beschreven.
- Kort resuspendeer de cellen in de 1X permeabilisatie buffer met de cocktail van anti-TNF-α, anti-IL-17A en ROR-γt antilichamen, elk antilichaam bij 2-3 ug / ml eindconcentratie.
- Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij KT.
- Na de incubatie was de cellen met 1X permeabilisatie buffer.
- Resuspendeer de celpellet in 500 gl PBS met 0,5% runderserumalbumine voor flowcytometrie analyse.
- De volgende dag, verwijder de formaline en dompel de weefsels in 5 ml 70% ethanol hyper-fixatie te voorkomen. Stuur ze naar commerciële dienst te gaan met inbedden in paraffine, snijden en kleuring van paraffine secties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit model, zowel de Candida geïnfecteerde muizen en niet-geïnfecteerde muizen in Rag-1 - / - immuundeficiënte achtergrond werden adoptief overgebracht met Th17 cellen 3-5 dagen voor de infectie. Een totaal van 10-12 muizen werden gebruikt voor de experimenten met 2 muizen in elke Sham geïnfecteerde groepen en 4-5 in elk van de Candida geïnfecteerde groepen. Naïeve cellen werden afgeleid van congenic Thy1.1 of CD45.1 muizen, zodat ingespoten Th17 cellen werden bijgehouden in vivo gebruik Thy1.1 of CD45.1 vlekken respectievelijk (Figuur 1A). -Co overgedragen T regs werden afgeleid uit CD45.2 muizen om ze te onderscheiden van CD45.1 Th17 cellen. Voor sommige experimenten, CB-17 scid Thy1.2 ontvangende muizen, Th17 donor verkregen Thy1.1 Balb / C muizen en T regs verkregen congenic Thy1.2 muizen cellen gebruikt. Alleen Candida geïnfecteerde muizen, maar niet de niet-geïnfecteerde muizen vertoonden de werving en uitbreiding van gereconstitueerde CD45.1 + (Figuur 1A). De resultaten geven gegevens van één muis in elke groep.
Alleen in de muizen die zijn mede-overgedragen met T regs, werden Foxp3 + CD45.1 negatieve CD4 + cellen gedetecteerd in het CLN. Hieruit blijkt dat de geïnjecteerde T regs ook gerekruteerd voor de plaats van infectie (figuur 1B). De resultaten geven gegevens van één muis in elke groep. Overwegende dat besmet Rag-1 - / - gewicht en herstelde na 4 dagen van de infectie te verliezen, heb cortisone immuungesuppresseerde muizen niet herstellen, maar verder verloren gewicht, zoals eerder 27 getoond. Beide groepen van muizen die Th17 cellen ontvangen in de aanwezigheid of afwezigheid van T regs verloren gewicht aanvankelijk. De muizen die T regs verhaald gewichtsverlies ontvangen en loste de infectie. 2 mijs werden gebruikt in de Sham geïnfecteerde groep en 4 in elke Candida geïnfecteerde groep. Er waren 3 muizen in cortisone groep. Alleen de muizen die Th17 cellen ontvangen afgevallen progressief (figuur 2) 19. Sommige muizen in die groep moesten worden gedood. Deze resultaten tonen het gemiddelde van de gewichten van alle muizen in die groep. Hoewel neutrofielen nodig zijn voor de initiële speling van de infectie, de continue aanwezigheid en rekrutering in het weefsel is een teken van ontsteking onopgelost. Daarom werd neutrofielinfiltratie onderzocht de geïnfecteerde tong, door bepaling van de expressie van een neutrofiel marker, Gr-1, op latere tijdstippen zoals dag 7 na infectie. Muizen die Th17 cellen ontvingen alleen, hadden hogere inflammatoire infiltraten (figuur 3A), waaronder Gr-1 + neutrofielen zelfs dag 4 na infectie, in vergelijking met de muizen geïnjecteerd met T regs (figuur 3B). Deze resultaten toonden dat in de Presence van T regs, muizen opgelost de ontsteking efficiënter en hersteld van de infectie.
Op dag 7 na infectie werden de milt (SPLN), CLN en de tong weefsels geïsoleerd, en enkele cel suspensies werden gemaakt voor flowcytometrie analyses. CLN onthuld verhoogde CD45.1 Th17 cellen (figuur 1) en verhoogde TNF-α productie (Figuur 4A, 4B) bij muizen die alleen Th17 cellen ontvangen. Anderzijds, T reg ontvangers vertoonden verminderde frequentie van Th17 cellen en verminderde TNF-α door Th17 cellen (Figuur 1 en 4A, 4B). In deze experimenten worden de data van CLN van één enkele muis en tong weefsels geoogst en samengevoegd 2 muizen weergegeven. Hoewel op vroege tijdstippen IL-17A productie hoger was T reg ontvangers 19, op latere tijdstippen in beide groepen, IL-17A productie van Th17 cellen was minimaal (gegevens niet getoond). Perjoodzuur Schiff kleuringvan de tong toonden toegenomen schimmeldraden in muizen die alleen Th17 cellen ontvangen, terwijl muizen die T regs ontvangen en maakte de schimmel op dag 5 en dag 7 na infectie (Figuur 5). Bovendien histopathologie scoren van de tong ontsteking bleek ook verminderde ontsteking scores in muizen die T regs ontvangen, vergeleken met muizen die alleen Th17 cellen (figuur 6) ontvangen. Maken van de ontsteking was gebaseerd op de tong histopathologische parameters zoals de aanwezigheid van papillen, de intactheid van de oppervlakkige epitheellaag, zichtbaar gist of hyfen, invasie hyfen wijst op niet-oplossing infectie, verdikking van de basale laag (indicatief lopende weefselherstel), en de aanwezigheid van infiltrerende immuuncellen (neutrofielen en Th17 cellen). Deze resultaten toonden aan dat de injectie van Th17 cellen niet direct verminderen infectie, maar verhoogde de schimmel lasten en immunopathology veroorzaakt door primaire C. albicans infectie, terwijl co-overdracht van T-regs verbeterd immunopathologie.
Figuur 1. Ingespoten Th17 cellen en T-cellen reg werven en uit te breiden in de drainerende lymfeklieren (CLN) van de C albicans geïnfecteerde muizen (A) Vod-1 -.. / - CD45.2 muizen werden gereconstitueerd met Th17 cellen of Th17 + T reg cellen die waren gepolariseerd onder Th17 omstandigheden gedurende 5 dagen. Th17 cellen werden verkregen van CD45.1 congene muizen en T reg cellen werden verkregen van CD45.2 muizen. Sommige muizen leverde geen cellen (Sham of Candida + PBS) te ontvangen. Ontvanger muizen in elke groep werden besmet met sham controles of met C. albicans. Op dag 5 na infectie, CLN waren isolated om een enkele celsuspensie te maken en volgen de geïnjecteerde CD45.1 expressie Th17 cellen door flowcytometrie (gated alle leukocyten in FSC, SSC verstrooiing) (B) Rag-1 -. / - CD45.2 muizen gereconstitueerd met Th17 cellen of Th17 + T reg cellen als in "A" en geïnfecteerd met C. albicans. CLN werden geïsoleerd om een celsuspensie te maken en meten CD45.1 en intracellulaire Foxp3 expressie door flow cytometrie (gated alle CD4 cellen). De T reg poorten in de kavels tonen de CD45.1 negatieve, Foxp3 + CD4 + cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Injected Th17 cellen veroorzaken gewichtsverlies in C . Albicans besmette muizen en gelijktijdige toediening van T regs verbetert herstel van gewichtsverlies. CB-SCID 17 muizen werden gereconstitueerd met Th17 cellen of Th17 + T reg cellen zoals in figuur 1A. 3 dagen later werden de ontvangende muizen geïnfecteerd met C. albicans. Sommige muizen in elke groep waren geïnfecteerd met sham controles. Immunosuppressie muizen kregen cortison acetaat (Cort) injectie. De procentuele gewichtsverandering in muizen gereconstitueerd met aangegeven cellen en geïnfecteerd met C. albicans, met betrekking tot d-1 (één dag voor infectie) weergegeven. De gegevens zijn genormaliseerd ten opzichte van het gewicht gegevens van niet-geïnfecteerde (Sham + PBS) muizen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
"Src =" / files / ftp_upload / 52538 / 52538fig3highres.jpg "/>
Figuur 3. Injected Th17 cellen veroorzaken tong immunopathology in C. Albicans geïnfecteerde muizen en gelijktijdige toediening van T regs vermindert de immunopathologie. Histologische evaluatie van de tongen van de C. albicans geïnfecteerde muizen. Muizen werden gereconstitueerd met aangeduide cellen en geïnfecteerd zoals in figuur 1A. Op dag 5 na infectie werden tongen geïsoleerd uit muizen. (A) sagittale secties van de tongen werden gekleurd met H & E ontsteking en infiltratie (IF) van de immuuncellen beoordelen. (Pa) en (Ep) duiden papillen en de epitheellaag van de tong respectievelijk. Microscopische beelden van de dia's bekeken at50X vergroting. (B) histologische immunostaining voor Gr-1 neutrofielen marker met behulp van anti Gr-1 antilichaam (CLOne: 1A8-Ly6g) in de tong secties op dag 5 na infectie (bruin, aangeduid door IF). Microscopische beelden van de dia's bekeken bij 100X vergroting worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Gelijktijdige toediening van T regs vermindert TNF-α in geïnjecteerd Th17 cellen. (A) Rag-1 - / - CD45.2 muizen gereconstitueerd met Th17 cellen of Th17 + T reg cellen en geïnfecteerd met C. albicans zoals in figuur 1A. Op dag 5 na infectie, CLN en tong weefsels werden geïsoleerd om een celsuspensie te maken. Deze cellen werden opnieuw gestimuleerd met PMA en Ionomycin voordat intracellulaire staining en flowcytometrie analyses. Flow cytometrische contourdiagrammen intracellulaire ROR-γt en TNF-α expressie van de Th17 cellen getoond (gated op CD4 + cellen). (B) statistische weergave van het percentage TNFαpositive cellen van experimenten uitgevoerd zoals in "A". Gegevens vertegenwoordigen 4 muizen in niet-geïnfecteerde groep en 6 muizen in elke geïnfecteerde groep en worden samengevoegd uit twee onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. verhoogde immunopathologie is ook geassocieerd met verhoogde schimmelbelasting C. Albicans geïnfecteerde muizen. CB-17 scid mice werden gereconstitueerd met Balb / C Th17 cellen of Th17 + T reg cellen in Figure1A en geïnfecteerd met C. albicans. Histologisch onderzoek van de tong van geïnfecteerde muizen wordt getoond. Op dag 7 na infectie werden tongen geoogst en gekleurd met perjoodzuur Schiff (PAS) voor schimmel laesies, ontsteking en infiltratie (IF) cellen beoordelen en schimmel sporen (Ca). De dia's werden bekeken at100X vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. T regs verbeteren immunopathology in C. Albicans geïnfecteerde muizen. scid muizen werden gereconstitueerd met Balb / C Th17 cellen of Th17 + T reg cellen zoals in figuur 1A en geïnfecteerd met C. albicans. Statistische weergave van de gemiddelde histologische scores van de tongen van geïnfecteerde muizen beoordeeld als in figuur 5. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Partituur | Karakteristieken |
| 0 | 0 - geen zichtbare gist of hyfen, intacte oppervlakkige epitheel op dorsale oppervlak van de tong, papillen duidelijk aanwezig en onbeschadigd (al dan niet infiltrerende mononucleaire cellen in het weefsel), geen verdikking van de basale laag, zonder infiltrerende immuuncellen. |
| 1 | 1 - geen zichtbare gist of Schimmeldraade, rafelige of licht beschadigde oppervlakkige epitheel, papillen duidelijk aanwezig met minimale schade en zeldzaam infiltreren immuuncellen. |
| 2 | 2 - papillen verminderd, maar aanwezig met schade, verdikking van de basale laag en frequente infiltreren immuuncellen. |
| 3 | 3 - incidentele clusters van zichtbare gist en het binnenvallen van schimmeldraden, het bewijs van beschadigde papillen, af en toe laesies van beschadigde epitheel, verdikking van de basale laag en en kleine clusters van het infiltreren van immuuncellen. |
| 4 | 4 - frequente clusters van zichtbare gist en het binnenvallen van schimmeldraden, het bewijs van beschadigde papillen, frequente letsels van beschadigde epitheel, minimale infiltratie van immuuncellen, verdikking van de basale laag en frequente clusters infiltrerende immuuncellen. |
| 5 | 5 - wijdverspreid bewijs van binnenvallende hyfen, zwaar beschadigd epitheel over het dorsale oppervlak, grote infiltratie vanimmuuncellen, weinig of geen detecteerbare papillen, verdikking van basale laag en hoog frequente en grote clusters van infiltrerende immuuncellen. |
Tabel 1: Histologische Scoren Waarden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit model is gebaseerd op het induceren van orale C. albicans infectie afhankelijk Th17 ontsteking. Door de afwezigheid van T regs, de Th17 cellen geïnduceerde ontsteking ongeremd en leidt tot slechte resolutie immunopathologie. In vitro verkregen naïeve CD4-cellen als gepolariseerde Th17 cellen werden gebruikt voor de adoptieve overdracht. 40 - 50% van de gekweekte CD4 + -cellen tonen detecteerbaar IL-17A expressie rond dag 3 (Th17 cellen), en daarom werden gebruikt voor de injectie bij muizen. Het grote voordeel van het model is dat Th17 cellen veroorzaken infectie specifieke immunopathologie die efficiënt kunnen worden verbeterd met T reg injectie. Aldus kan het model worden gebruikt voor immunomodulatie strategieën T reg injectie getest als een positieve controle. Ontsteking is gemakkelijk beoordeeld op basis van het gewichtsverlies, histopathologische scores en pro-inflammatoire cytokine productie door de Th17 cellen van de geïnfecteerde muizen.
Na thij adoptieve overdracht van Th17 cellen die gemigreerd secundaire lymfoïde organen en verschillende weefsels zoals de tong, de voornaamste plaats van infectie. Na de infectie werden andere ontstekingscellen ook gerekruteerd voor de tong om de infectie te doen verdwijnen. Echter, zonder T reg gemedieerde immunomodulatie, Th17 cellen zelf niet oplossen van de infectie, maar veroorzaakt verhoogde immunopathologie. Co-overdracht van T regs volledig opgelost de ontsteking. Interessant muizen met verergerd ontsteking in de afwezigheid van T regs, ook toonde verhoogde schimmelbelasting. Onze vorige rapport toonde aan dat dit te wijten was aan een verminderde productie van IL-17A in muizen, in vergelijking met degenen met T regs. Onze huidige experimenten ondersteunen de gedachte dat het ook mogelijk als gevolg van verhoogde TNF-α dat de ontsteking verslechterd, ook door het verlengen epitheliale cellen apoptose en verhoogde schimmelbelasting 28. Gezien de immunobeschermende effecten van IL-17A op de mucosa, Zijn wij van mening dat inflammatoire pathologie die we waarnemen met toenemende schimmel last is niet te wijten aan IL-17A geproduceerd door Th17 cellen of gebrek aan host resistentie. Het wordt veroorzaakt door TNF-α en eventueel andere pro-inflammatoire cytokinen die door geïnjecteerd Th17 cellen. Dit kan worden bevestigd door de waarneming dat Rag - / - muizen zonder Th17 cellen vertonen slechts minimale ontsteking en daaropvolgende resolutie van infectie en alleen die ontvangen Th17 cellen bezweken aan ernstig gewichtsverlies (figuur 1). Consistente om deze gegevens, het is ook eerder aangetoond dat Rag - / - muizen duidelijk de primaire OPC-infectie zonder veel immunopathologie 27. Onder deze omstandigheden hebben compensatiemechanismen afhankelijk zijn van IL-17A produceren aangeboren immuunsysteem cellen is aangetoond dat de besmetting duidelijk in Rag - / - muizen 17,29,30. Samen genomen, hoewel IL-17A geproduceerd door Th17 cellen en neutrofielen werving zijn een beschermende rol bij de initiële fase van de infectie te spelen, excessive productie van TNF-α en andere cytokinen door Th17 cellen en de voortdurende aanwezigheid van neutrofielen oorzaken verergerd immunopathologie. De rol van cytokines naast TNF-α door Th17 cellen nog worden onderzocht in de context van immunopathologie.
De belangrijkste beperking van het model is de vraag of het fysiologisch relevante menselijke OPC. Hoewel Th17 cellen getoond pathologische bemiddelaars in diverse orale aandoeningen van chronische activatie van Th17 cellen pathogeen in OPC kunnen nog worden onderzocht. Met de recente bevindingen impliceren de rol van C. albicans bij kanker en inflammatie, Th17 immunopathologie in de mondholte is een actief gebied van onderzoek 31. Dus het model dat hier wordt beschreven, kan worden gebruikt om meer zorgvuldig te bestuderen specifieke rollen van Th17 cellen en hoe ze omgaan met aangeboren immuunsysteem cellen, met gedetailleerde inzichten in de orale immunologische ziekten en mondkanker.
De kritische stap in de techniek is de juiste werving en uitbreiding van de adoptief overgedragen Th17 cellen. Dit is sterk afhankelijk van de levensvatbaarheid en IL-17A productie van de in vitro gepolariseerde Th17 cellen vóór de overdracht. Het is het beste om hun levensvatbaarheid en cytokine productie door flowcytometrie analyseert 19 testen. Goede uitvoering van de Th17-cel injectie en muizen infectie zal leiden tot infectie afhankelijk Th17 immunopathologie. Dit model kan worden toegepast strategieën testen Th17 immunopathologie en orale ontsteking dwarsbomen in de context van andere infecties ook. Ook het gebruik van dit model, kan secundaire herinfecties voeren en analyse van de rol van Th17 cellen verergeren immunopathologie in de context van chronische infecties. Aangezien dit model gaat immunodeficiënte muizen, kan het zeer relevant orale dysbiosis waargenomen bij AIDS en PID patiënten die lijden aan chronische terugkerende Candida-infecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CAF-2 | University of Pittsburgh (Sarah Gaffen) | - | Candida culture |
| U-bottom 96 well plates | Fisher | 055588 | Used for cell culture |
| a-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| m-IL-6 | Bio Basic | RC232 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| h-TGF-b | R&D | 240-B | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IFN-g | eBiosciences | 16-7311-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IL-4 | eBiosciences | 16-7041-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| α-IL17A ef660 | eBiosciences | 50-7177-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| α-TNFa-PE-Cy7 | eBiosciences | 25-7423-41 | Used for cell culture - 1:100 |
| α-RORgt PE | eBiosciences | 12-6981-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium | Bio Basic | S507.SIZE | Mediium for candida growth |
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4300 | Incubation growth for candida |
| 15 ml tubes | Bio Basic | BT888-SY | Used for cell culture and candida growth |
| 50 ml tubes | Bio Basic | CT 788-YS | Used for cell culture and candida growth |
| Table top Centrifuge | VWR International LLC | 82017-654 | For pelleting candida -900 g |
| Allegra Centrifuge | Beckman Coulter | 392302 | Cell culture - 480 g |
| 1.5 ml eppendorf tubes | Bio Basic | BT620-NS | Preparing final concentration of candida |
| 2x paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixing candida for count |
| Hemocytometer | VWR International LLC | 15170-172 | Counting cells |
| PBS - Phosphate Buffered Saline | Bio Basic | PD8117 | Preparation of buffers |
| Ketamine/xylazine | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | Obtained from ARC approved protocol for anesthesia |
| Ophthalmic lubricant ointment | Allergan | - | Eye ointment for animals to prevent dryness |
| Saline (0.9% NaCl) | G Biosciences | 786-561 | Administerd to animals to prevent dehydration |
| 3-mm-diameter cotton wool ball | VWR International LLC | BP7603 | 3 mm balls for candida infection |
| Heat gel pads | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | for maintaining the body temperaturre and fast recovery |
| Hematoxylin and Eosin staining | Histoserv - MD | - | Tissue histology |
| 10% formalin | Electron Microscopy Sciences | JC1111/MC | Tissue histology |
| 70% ethanol | VWR International LLC | 97064-490 | Sterilization purpose |
| PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | Restimulation of cells |
| Ionomycin | Life Technologies | 124222 1mg | Restimulation of cells |
| Fixation permeabilization kit | eBiosciences | E16913-106 | Fixing cells for Flow cytometry |
| Tuberculin syringes | BD Biosciences | 309659 | Mice injection |
| 25 G x 3/8 needles | BD Biosciences | 309626 | Mice injection |
| Rag1 -/- mice | Jackson laboratories | Stock no: 002216 | Recipient mice |
| CD45.1 congenic mice | Jackson laboratories | Stock no:002014 | Donor Th17 cells |
| CB17-SCID mice | Jackson laboratories | Stock no: 001303 | Recipient mice |
| Balb/c mice | Jackson laboratories | Stock no: 000651 | Donor Th17 cells |
References
- Allam, J. P., et al. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).
- Loesche, W. J. Periodontal disease: link to cardiovascular disease. Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).
- Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. Association between periodontal disease and stroke. Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).
- Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy. Arthritis Research & Therapy. 14 (4), 217 (2012).
- Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In. Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).
- Canabarro, A., et al. Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis. Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).
- Urzua, B., et al. Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets. Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).
- Ergun, S., et al. Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome. Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).
- Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment. Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).
- Gall, F., et al. Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions. The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).
- Grady, J. F., Reade, P. C. Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia. Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).
- Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia. Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).
- Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense. Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).
- Marodi, L., Johnston, R. B. Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms. Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).
- Kumamoto, C. A. Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In. Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).
- Kraneveld, E. A., et al. The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults. PloS One. 7 (8), e42770 (2012).
- Hernandez-Santos, N., et al. Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).
- Hasina, R., et al. ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis. Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).
- Pandiyan, P., et al. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model. Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).
- Pandiyan, P., et al. The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes. J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).
- Pandiyan, P., Lenardo, M. J. The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival. Biology Direct. 3 (6), (2008).
- Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells. Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., et al. Animal models for candidiasis. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. 105, 11-19 (2014).
- Conti, H. R., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
- Kamai, Y., et al. New model of oropharyngeal candidiasis in mice. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).
- Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. Isolation of T cells from mouse oral tissues. Biological Procedures Online. 16 (1), 4 (2014).
- Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
- Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation. International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).
- Bishu, S., et al. The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).
- Quintin, J., et al. Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice. Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).
- Ramirez-Garcia, A., et al. Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression. Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).
