Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

TH17 דגם דלקת של לוע תחתון פטרת בעכברים immunodeficient

Published: February 18, 2015 doi: 10.3791/52538
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, School of Dental Medicine, Case Western Reserve University

Protocol

הערה: הניסויים באמצעות עכברים בוצעו בהתאם לועדת רווחת בעלי החיים המוסדיים (IACUC) הנחיות.

1. לשחזר את סמרטוט-1 - / - העכברים עם תאים אני n חוץ הגופייה בתרבית TH17 (שלושה ימים לפני זיהום)

  1. להקמת תאי TH17, תרבות תאי T מסוג CD4 + הנאיבי CD44low CD62Lhigh CD25- (3 x 104) ב 96 צלחות U-תחתונה גם לבד, או שיתוף תרבותם יחד עם 3 x 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs בנוכחות מסיסה α-CD3, α-CD28 (2 מיקרוגרם / מיליליטר) נוגדנים ותאי הצגת אנטיגן, בתנאי TH17 (מקוטב באמצעות IL-6 (25 ng / ml), β TGF- (2 ng / ml) (1 מיקרוגרם / מיליליטר) , Α-IFN-γ (2 מיקרוגרם / מיליליטר) ו-IL-4 α (2 מיקרוגרם / מיליליטר)) לשלוש עד ארבעה ימים.
    הערה: תאים נאיביים ובתקנות T מוינו באמצעות תא קרינה המופעל מיון (FACS)ד נהלי בידוד תא מגנטי ותרבותי כפי שתואר לעיל 19-22.
  2. ביום 4, לאחר resuspending תאי TH17 באמצעות פיפטה, לאסוף אותם מתרבויות, וצנטריפוגות בתנאים סטריליים.
    1. קח aliquot קטן של תאים אלה לבחינת הכדאיות שלהם ועבור phenotyping. Resuspend אותם 500 μl של מדיום RPMI, להוסיף יודיד propidium (200 ng / ml) ולהעריך את הכדאיות שלהם באופן מיידי על ידי cytometry זרימה. בצע phenotyping ידי cytometry זרימת ההערכה של ייצור IL-17 א לאחר restimulation (ראה סעיף 6.3).
  3. צנטריפוגה ולשטוף את הנפח העיקרי של התאים בPBS סטרילי ב 480 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C בכל השלבים, אלא אם כן צוין אחרת.
  4. להשתמש בתאים אלה להעברת מאמצת לCD45.2 Rag1 6-8 שבוע ישן - / - עכברי immunodeficient.
    1. Resuspend התאים בצפיפות תאי 1 x 10 7 תאים / מיליליטר באמצעות PBS סטרילי הקר.
    2. הזרק של התאים 100 μl ידי intrapהזרקת eritoneal, באמצעות 25 מחטים G על 1 מיליליטר מזרקים טוברקולין, כך שעכבר אחד מקבל 1 x 10 6 תאים. עכברים מסוימים יקבלו תאי PBS או TH17 בלבד, ועכברים אחרים יקבלו תאי TH17 שהיו שיתוף תרבותי עם תאי Treg.
      הערה: בצע את כל שלבי סביבה נקיה מחיידקים.

2. גידול C. אלביקנס לזיהום (יום אחד לפני זיהום)

  1. לפני החיסון, לפזר חמש מושבות של ג CAF2-1 זן אלביקנס מעבדה בהשעית PBS סטרילי 100 μl, ומוסיף את ההשעיה למרק סטרילי.
  2. לחסן 5 מושבות של ג אלביקנס ב 50 מיליליטר של בסיס חנקן שמרים (YNB ללא חומצות אמינו) / Peptone / בינוני דקסטרוז מרק ודגירה בחממה שייקר ב 30 מעלות צלזיוס למשך 15-18 שעות ב 130 סל"ד.
  3. לפקח על המרק לעננות, כפי שהיא אינדיקציה לצמיחה של הפטרייה.

3. קנדידהקציר וסדר ספירה (ביום של זיהום)

  1. לאסוף 10 מיליליטר של מרק קנדידה ב 15 מיליליטר צינורות. לנפחים גדולים יותר, לאסוף קנדידה בצינורות 50 מיליליטר.
  2. צנטריפוגה blastospores ב1,900 XG במשך 5 דקות בRT בכל השלבים, אלא אם כן צוין אחרת. גלולה blastospores ידי צנטריפוגה, ואחריו הסרת supernatant.
  3. אם יש צינור אחד או יותר, בריכת blastospores קנדידה מצינורות מרובים, הוספת PBS סטרילי לכדורים וresuspend אותם 10 מיליליטר של PBS לספירה.
  4. קח 20 μl של blastospores בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge, להוסיף 20 μl של paraformaldehyde 2X ולדגור על RT במשך 15-20 דקות. רוזן blastospores הקבוע באמצעות hemocytometer מתחת למיקרוסקופ.
    הערה: Paraformaldehyde הוא מסרטנת. פתח את הפתרון חי רק במנדף.
  5. בינתיים, לחזור על שטיפת blastospores לפחות פעמיים, על ידי צנטריפוגה tמכפלת בPBS, וpelleting blastospores. שמור את כדורים ב 15 מיליליטר צינורות ב RT, בשכונה ABSL1, מוכן לזיהום.
  6. להשאיר כמה PBS סטרילי בRT לresuspending blastospores לזיהום.
  7. לאחר ספירה, להוסיף PBS סטרילי לגלולת blastospore להתאים את מספרי תא השמרים blastospore עד 2 x10 8 תאים / מיליליטר שמרים. זה ההשעיה blastospore שישמש להדביק עכברים.
    הערה: בצע את כל שלבי סביבה נקיה מחיידקים.

4. זיהום עכברים (3-5 ימים לאחר העברת Cell)

הערה: הליך הזיהום הבסיסי מבוצע כפי שתואר לעיל 19,23-25.

  1. לשקול את סמרטוט-1 - / - העכברים שקיבלו PBS או תאי שלושה ימים קודם לכן.
  2. לחשב את המינון של חומרי הרדמה באמצעות משקל גופם. להרדים את העכברים על ידי מתן קטמין / תערובת xylazine (16.1 מ"ג / מיליליטר ו -1.6 מ"ג / מיליליטר), באמצעות 25 מחטים G על 1 מיליליטר מזרקים טוברקולין, על ידי מילת קריאההזרקת aperitoneal.
    1. לנהל 50 μl לכל 10 גרם של משקל גוף. (כלומר, 0.8 מ"ג של קטמין ו0.08 מ"ג של xylazine / 10 גרם של משקל גוף או 80 מ"ג של קטמין ו -8 מ"ג xylazine לכל קילוגרם של משקל גוף בהתאמה). שים לב לתגובת קמצוץ הבוהן כל 15 דקות לאחר הרדמה.
      הערה: מינון זה יגרום 60-90 דקות של הרדמה, וזה מספיק להליך הזיהום.
    2. החל המשחה הסיכה עיניים בעיניים של העכברים כדי למנוע את הקרניות מהתייבשות. כחומר הסיכה העין עלולה להתייבש, לחזור על שימון עיניים כל 45 דקות.
  3. הזרק 1 מיליליטר של תמיסת מלח (0.9% NaCl) תת עורי בגב הצמוד לforelimb, כדי לסייע להחזרת נוזלים של העכברים במהלך הרדמה.
  4. להשיג כלוב חדש, נקי. בצע את עכבר הליך אחד זיהום בזמן, הצבת כל עכבר לכלוב החדש הנגוע פעם. בצע את PBS / זיהום הדמה ראשון, ולאחר מכן להמשיך לGro זיהום קנדידהעליות.
  5. להרים את העכבר הרדים ולפתוח את הפה הרחב כדי לחשוף את בסיס הלשון.
    1. הנח כותנה קוטר כדור 3 מ"מ רווי עם 50 μl של PBS או blastospore השעיה, sublingually בחלל הפה למשך 90 דקות. הפוך את העכברים כל חזית 15 דקות וחזרתי למניעת גודש ריאה, על מנת להבטיח שכדורי צמר גפן לא זזו.
  6. הגדרת טיימר לכל עכבר כדי להבטיח 90 דקות של חיסון שאם או קנדידה בחלל הפה.
  7. שמור אותם בכלוב תחת מנורת החום (4 מטרים), וכל עכבר על כריות ג'ל חום.
  8. ודא כי הלשון תבוטל בתוך ומחוץ לשיניים, כדי למנוע את השיניים ופצעו את הלשון.
  9. בתום 90 דקות, להסיר את כדור צמר גפן מפיו של העכבר. Watch עבור כל עכבר שעשוי להתאושש מהרדמה מוקדם מ -75 דקות. במקרה כזה, להרדים אותם שוב עם קטמין (40 מ"ג / קילוגרם) בלבד.

5. ההודעה Procedurדואר ניטור (בהרדמת 90 דקות)

  1. השתמש ברפידות ג'ל החום במהלך ההרדמה 90 דקות.
    1. כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ולמנוע חנק, אל תאפשר עכברים להתאושש על מצעי עכבר התירס של הרגילים.
  2. לאחר ההתאוששות מהרדמה, לנהל 1 מיליליטר נוסף של 0.9% מתחת לעור NaCl סטרילי בשני מקומות על הגב.
  3. שמור עד חמש PBS (דמה) עכברים מחוסן בכל כלוב. בית עכברים נגועים רק 1-2 בכל כלוב.
  4. מלא את כרטיס ההליך בראשי תיבות בכל יום לאחר ההליך כדי לרשום את השינויים במשקל הגוף, טיפוח הרגלים ועל בריאות כללית.

6. הערכת הדלקת

משקל 6.1) הפסד

  1. לשקול את העכברים בכל יום במהלך הזיהום, החל מהיום לפני הליך זיהום.
    הערה: בדרך כלל, עכברי immunodeficient הוזרקו תאי TH17 וללא את תקנות T להיכנע עד 2030% ירידה במשקל עקב העלייה פטרייתי נטל 19 והחריפה את דלקת.

6.2) ניקוד היסטולוגיה של הלשון

  1. להקריב את העכברים על ידי CO 2 מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם.
  2. פתח את הלסתות ולנתח את הלשון עם מספריים ומלקחיים. שימוש במלקחיים בוטים להחזיק את הלשון, ובאמצעות המספריים להגיע לחלק האחורי של הפה כדי לחתוך את הקצה האחורי של הלשון.
  3. לhematoxylin immunocytochemical וeosin מכתים (H & E) של רקמות הלשון, לשטוף את רקמות לשון עם קרח הקר PBS. הוסף 5 מיליליטר של פורמלין 10% במשך 2-3 לשונות ולתקן אותם O / N ב 15 מיליליטר צינורות.
    1. למחרת, להסיר את פורמלין ולטבול את הרקמות ב 5 מיליליטר של אתנול 70% כדי למנוע היפר-קיבעון. שלח אותם לשירות מסחרי להמשיך עם הטבעת פרפין, חתך וצביעת חלקי פרפין.
      הערה: שירות היסטולוגיה מסחרי משמשת כדי לבצע שלבים אלה.
    2. ברגע השקופיות חזרו משירות היסטולוגיה המסחרי, הכיתה הדלקת על ידי התבוננות בסעיפי הרקמות תחת מיקרוסקופ אור.
      1. ציון 0-5, עם 0 להיות לא דלקת, ו -5 להיות הדלקת החמורה ביותר. ציון הדלקת באמצעות טבלה 1.

    6.3) ייצור ציטוקינים על ידי תאי TH17

    הערה: ייצור TNF-α מופרז היא אחד מהקריאות לimmunopathology מוגזם. כאשר עכברים מועברים adoptively עם תאי TH17 רק, זה גורם immunopathology המשויך לייצור TNF-α מוגזם בתאי TH17.

    1. לאסוף השעיה תא בודדת מטחול, בלוטות לימפה בצוואר הרחם, lymphnodes בבית השחי, ולשון, תוך שימוש בשיטות שתוארו קודם לכן 19.26.
    2. Restimulate התאים עם אצטט myristate phorbol (PMA) (50 ng / ml) וionomycin (500 ng / ml) במשך שעה 4 עם Brefeldin (10 מיקרוגרם / מיליליטר) הוסיף בlAST שעה 2. לשטוף את התאים עם PBS ולתקן אותם באמצעות ערכת הקיבוע / permeabilization מסחרית בהתאם להוראות יצרן.
    3. לבצע מכתים ציטוקינים סלולריים תוך שימוש באנטי TNF-α fluorochrome מצומדות, אנטי-IL-17 א ונוגדני ROR-γt כפי שתואר לעיל 19.
    4. בקצרה, resuspend תאי חיץ permeabilization 1X עם הקוקטייל של אנטי TNF-α, אנטי-IL-17 א ונוגדני ROR-γt, כל נוגדן ל 2 - 3 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי.
    5. דגירה התאים עבור שעה 1 ב RT.
    6. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם חיץ permeabilization 1X.
    7. Resuspend התא גלולה ב 500 μl של PBS עם 0.5% אלבומין בסרום שור לניתוח cytometry זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במודל זה, שני עכברי קנדידה -infected ועכברים נגוע בסמרטוט-1 - / - רקע immunodeficient הועבר adoptively עם תאי TH17 3-5 ימים לפני הזיהום. בסך הכל 10-12 עכברים שימש לניסויים, עם 2 עכברים בכל קבוצות שאם נגוע, ו4-5 בכל אחת מהקבוצות נגועות קנדידה. תאים נאיביים נגזרו מעכברי Thy1.1 או CD45.1 congenic, כך שתאי TH17 הזריקו אותרו in vivo באמצעות Thy1.1 או CD45.1 צביעת בהתאמה (איור 1 א). את תקנות T-הועבר Co נגזרו מעכברי CD45.2 כדי להבדילם מתאי CD45.1 TH17. עבור חלק מניסויים, CB-17 Thy1.2 עכברי נמען SCID, תאי תורם TH17 שהתקבלו בעכברי Thy1.1 BALB / C ובתקנות T שהתקבלו בעכברי Thy1.2 congenic היו בשימוש. רק קנדידה -infected עכברים, אבל לא העכברים נגוע הציגו הגיוס והרחבת CD45.1 מחדש + (איור 1 א). התוצאות מייצגות נתונים מעכבר אחד בכל קבוצה.

רק בעכברים, כי הם משתפים הועברו עם את תקנות T, CD4 + השלילי תאי Foxp3 + CD45.1 אותרו בCLN. זה מראה כי את תקנות T הזריקו גם גויסו לאתר של זיהום (איור 1). התוצאות מייצגות נתונים מעכבר אחד בכל קבוצה. בעוד נגוע סמרטוט-1 - / - במשקל לרדת במשקל והתאושש לאחר 4 ימים של זיהום, עכברי immunosuppressed קורטיזון לא התאוששו אבל אבוד נוסף, כפי שהוצג קודם 27. שתי הקבוצות של עכברים שקיבלו את תאי TH17 בנוכחותו או היעדריו של את תקנות T ירדו במשקל בהתחלה. עם זאת, העכברים שקיבלו את תקנות T התאוששו מירידה במשקל ופתרו את הזיהום. 2 מ 'קרח שימש בקבוצה שאם נגוע, ו- 4 בכל קבוצה נגועה קנדידה. היו שם 3 עכברים בקבוצת קורטיזון. העכברים שקיבלו את תאי TH17 בלבד, ירדו במשקל בהדרגה (איור 2) 19. חלק מהעכברים שבקבוצה היה צריך להיות מורדמים. תוצאות אלו מראות הממוצעת של המשקולות של כל העכברים שבקבוצה. למרות נויטרופילים נדרשים לאישור הראשוני של הזיהום, נוכחותם המתמדת וגיוס ברקמה הוא סימן לדלקת לא פתורה. לכן חדירת נויטרופילים נבדקה בלשון נגועה, על ידי קביעת הביטוי של סמן נויטרופילים, Gr-1, בנקודות זמן מאוחר יותר כגון יום-7 לאחר הדבקה. עכברים שקיבלו את תאי TH17 רק, היו מחלחל גבוה דלקתי (איור 3 א), ובכלל זה Gr-1 + נויטרופילים אפילו יום-4 לאחר הדבקה, בהשוואה לעכברים שהוזרקו עם את תקנות T (איור 3). תוצאות אלו מראות כי בpresencדואר של את תקנות T, עכברים פתרו את הדלקת ביעילות רבה יותר והתאוששו מהזיהום.

ביום 7 לאחר הדבקה, רקמות טחול (SPLN), CLN והלשון היו מבודדות, והשעיות תא בודדות נעשו לזרימת cytometry ניתוח. CLN חשף מוגבר תאי CD45.1 TH17 (איור 1) וייצור TNF-α מוגבר (איור 4 א, ​​4 ב) בעכברים שקיבלו את תאי TH17 בלבד. מצד השני, T רג המקבלים הראו ירידה בתדירות של תאי TH17 וייצור TNF-α מופחת על ידי תאי TH17 (איור 1 & 4 א, ​​4 ב). בניסויים אלה, נתונים מCLN של עכבר אחת, ורקמות לשון שנקטפו ונקוו מ 2 עכברים מוצגים. אם כי בנקודתי זמן מוקדמות ייצור IL-17 א היה גבוה יותר בT רג מקבלי 19, בנקודות זמן מאוחר יותר בשתי הקבוצות, ייצור IL-17 א על ידי תאי TH17 היה מינימאלי (מידע לא מוצג). צביעה של החומצה שיף תקופתיתשל הלשון הראה גדילת פטריית העובש בעכברים שקיבלו את תאי TH17 בלבד, ואילו עכברים שקיבלו את תקנות T פינו גם הפטרייה ביום-5 ויום-7 לאחר ההדבקה (איור 5). יתר על כן, ניקוד histopathology של דלקת הלשון הראה גם ציוני דלקת מופחתים בעכברים שקיבלו את תקנות T, בהשוואה לעכברים שקיבלו רק תאי TH17 (איור 6). ניקוד הדלקת התבסס על הפרמטרים לשון histopathological כגון, נוכחות של גבשושיות, שלמותו של השכבה השטחית אפיתל, השמרים גלויים או העובש, העובש הפולש המצביע על אי-פתרון זיהום, העיבוי של שכבת בסיס (מעידה על תיקון רקמות מתמשך), ואת הנוכחות של חדירת תאי מערכת חיסון (תאי נויטרופילים וTH17). תוצאות אלו הפגינו הזרקה של תאי TH17 שלא ישירות להפחית זיהום, אך הגדילו את הנטל פטרייתי וimmunopathology נגרמים על ידי C. העיקרי infec אלביקנסtion, ואילו שיתוף העברת את תקנות T להשתפר immunopathology.

איור 1
איור 1. הזריק תאי TH17 ותאי T reg לגייס ולהרחיב בבלוטות לימפה ניקוז (CLN) של C albicans נגוע עכברים () Rag-1 -.. / - עכברי CD45.2 היו מחדש עם תאי TH17 או TH17 + T רג תאים שמקוטבים בתנאי TH17 במשך 5 ימים. תאי TH17 התקבלו מעכברי CD45.1 congenic ותאי T reg התקבלו מעכברי CD45.2. עכברים כלשהי לא קיבלו את כל תאים (Sham או קנדידה + PBS). עכברי נמען בכל קבוצה היו נגועים בבקרת אחיזת עיניים או עם ג אלביקנס. ביום 5 לאחר הדבקה, CLN היה בידוד עed לעשות השעיה תא בודדת ולעקוב אחר CD45.1 הזריק לבטא בתאי TH17 ידי cytometry זרימה (נשלטים על כל כדוריות הדם לבנות בFSC, פיזור SSC) (B) Rag-1 -. / - CD45.2 עכברים מחדש עם תאי TH17 או תאי TH17 + T reg כמו "A" ונגוע בC. אלביקנס. CLN בודדו לעשות השעיה תא בודדת ולמדוד CD45.1 וביטוי תאיים Foxp3 ידי cytometry זרימה (נשלטים על כל תאי CD4). שערי reg T בחלקות להראות CD45.1 השלילי, Foxp3 + CD4 + תאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
תאי TH17 איור 2. יצוקה לגרום לירידה במשקל בC . עכברים נגועים אלביקנס ושיתוף ממשל של את תקנות T משפרים התאוששות מירידה במשקל. SCID CB-17 עכברים מחדש עם תאי TH17 או תאי reg TH17 + T כמו באיור 1 א. 3 ימים לאחר מכן, עכברי הנמען היו נגועים בג אלביקנס. עכברי חלק בכל קבוצה היה נגוע בבקרת אחיזת עיניים. עכברי immunosuppressed קיבלו אצטט קורטיזון הזרקה (קורט). אחוז השינוי במשקל בעכברים מחדש עם תאים מצויינים ונגועים באלביקנס ג, ביחס לd-1 (לפני הדבקת יום אחד) מוצג. הנתונים מנורמלים על נתוני משקל מעכברים נגוע (Sham + PBS). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Src =" / קבצים / ftp_upload / 52,538 / /> 52538fig3highres.jpg "
תאי TH17 איור 3. יצוקה לגרום immunopathology הלשון בC. אלביקנס נגוע עכברים ושיתוף ממשל של את תקנות T מפחית את הערכת immunopathology. היסטולוגית של הלשונות של ג אלביקנס נגוע עכברים. עכברים מחדש עם תאים המצוין ונגועים כמו באיור 1 א. ביום 5 לאחר הדבקה, לשונות היו מבודדות מעכברים. (א) סעיפי sagittal של הלשונות הוכתמו H & E להעריך דלקת והסתננות (IF) של תאי מערכת החיסון. (אבא) ו- (EP) נסמן גבשושיות ושכבת האפיתל של לשון בהתאמה. תמונות מיקרוסקופיות של השקופיות נצפו הגדלה at50X. (ב) immunostaining היסטולוגית לסמן נויטרופילים Gr-1 באמצעות נוגדן Gr-1 אנטי (קלהne: 1A8-Ly6g) בסעיפי הלשון ביום 5 לאחר ההדבקה (חום, כונה על ידי IF). תמונות מיקרוסקופיות של השקופיות שנצפו בהגדלה 100X מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. Co-מנהל של את תקנות T מפחית α TNF- בתאי TH17 מוזרקים. () Rag-1 - / - עכברי CD45.2 היו מחדש עם תאי TH17 או תאי reg TH17 + T ונגוע בג אלביקנס כמו באיור 1 א. ביום 5 לאחר הדבקה, רקמות CLN והלשון בודדו לעשות השעיה תא בודדת. תאים אלה restimulated עם PMA וionomycin לפני staini תאיתng ולזרום מנתח cytometry. חלקות גובה cytometric זרימת ROR-γt תאיים וTNF- α ביטוי של תאי TH17 מוצגות (נשלטים על CD4 + תאים). (ב) ייצוג סטטיסטי של אחוז תאי TNFαpositive מניסויים שבוצע כמו "". הנתונים מייצגים 4 עכברים בקבוצה נגוע, ו6 עכברים בכל קבוצה נגועה, והם אספו משני ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
immunopathology איור 5. מוגבר קשור גם עם נטל פטרייתי מוגבר בC. אלביקנס נגוע עכברים. CB-17 מיקרופון SCIDדואר היו מחדש עם תאי BALB / C TH17, או תאי reg TH17 + T כמו בFigure1A, והיו נגועים בג אלביקנס. הערכה היסטולוגית של הלשון מעכברים נגועים מוצגת. ביום 7 לאחר הדבקה, לשונות נקצרו ומוכתם בשל תקופתי החומצה שיף (PAS) כדי להעריך את הנגעים פטרייתיים, דלקת והסתננות (IF) של תאים, וכדי לזהות פטרייה (Ca). השקופיות נתפסו הגדלת at100X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. את תקנות T לשפר immunopathology בC. עכברים נגועים אלביקנס. SCID היו מחדש עם תאי BALB / C TH17, או תאי reg TH17 + T כמו באיור 1 א, והיו נגועים בג אלביקנס. ייצוג סטטיסטי של הציונים היסטולוגית הממוצעים של הלשונות מעכברים נגועים העריכו כמו באיור 5. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ציון מאפיינים
0 0 - ללא שמרים גלויים או העובש, האפיתל שטחי שלם על פני השטח הגבי של לשון, גבשושיות להציג באופן ברור ושאינם פגומות (יכול או לא יכול להיות שחדר תאי mononuclear בתוך הרקמה), אין עיבוי של שכבת בסיס, לא תאים חיסוניים שחדר.
1 1 - ללא שמרים או hypha גלוייםדואר, מרופט או אפיתל השטחי מעט פגום, גבשושיות להציג באופן ברור עם מינימאלי נזק ותאי חיסון שחדר נדירים.
2 2 - גבשושיות מופחתות אבל הווה עם נזק, עיבוי של שכבת בסיס ותאים חיסוניים המסתננים תכופים.
3 3 - מדי פעם אשכולות של שמרים גלויים ועובש פולש, עדות לגבשושיות פגומות, מדי פעם נגעים של האפיתל פגום, עיבוי של שכבת בסיס ואשכולות קטנים של חדירת תאי מערכת חיסון.
4 4 - אשכולות תכופים של שמרים גלויים ועובש פולש, עדות לגבשושיות פגומות, נגעים תכופים של האפיתל פגום, חדירה מינימאלית של תאי מערכת חיסון, עיבוי של שכבת בסיס ואשכולות תכופים של חדירת תאי מערכת חיסון.
5 5 - ראיות נרחבות של האפיתל פולש העובש, נפגע בהרחבה על פני הגב, חדירה גדולה שלתאי מערכת חיסון, מעט או לא גבשושיות לזיהוי, עיבוי של שכבת בסיס ואשכולות תכופים והגדולים ביותר של חדירת תאי מערכת חיסון.

טבלת 1: ערכי ניקוד היסטולוגית

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודל זה מבוסס על גרימת ג האוראלי זיהום אלביקנס דלקת TH17 תלויה. בגלל העדר את תקנות T, דלקת תא TH17 המושרית היא חסרת מעצורים ומובילה לimmunopathology גרוע נפתר. במבחנה נגזרת תאי CD4 נאיביים מקוטבים כמו תאי TH17 שמשו להעברת המאמצת. 40 - 50% מCD4 + תאים בתרבית להראות ביטוי לגילוי IL-17 א סביב יום 3 (תאי TH17), ולכן שמשו להזרקה בעכברים. היתרון העיקרי של המודל הוא שתאי TH17 לגרום immunopathology ספציפי זיהום שיכול להשתפר ביעילות עם הזרקת reg T. כך המודל יכול להיות מועסק על מנת לבחון אסטרטגיות תפקוד מערכת חיסון עם הזרקת reg T כביקורת חיובית. דלקת מוערכת בקלות מבוססת על הירידה במשקל, ניקוד histopathological וייצור ציטוקינים פרו-דלקתי על ידי תאי TH17 של העכברים הנגועים.

לאחר tהוא מאמץ העברה של תאי TH17, הם היגרו לאיברים ורקמות הלימפה משניים שונות, כוללים הלשון, האתר הראשי של זיהום. לאחר ההדבקה, תאים דלקתיים אחרים גם גויסו ללשון כדי לנקות את הזיהום. עם זאת, ללא תפקוד מערכת החיסון reg T בתיווך, תאי TH17 עצמם לא פתרו את הזיהום, אך נגרמו immunopathology המוגבר. Co-העברת את תקנות T נפתרה לחלוטין הדלקת. מעניין, עכברים עם דלקת החמירה בהעדר את תקנות T, גם הראו גדילת פטריות נטל. הדו"ח הקודם שלנו הראה שזה היה בגלל ייצור IL-17 א מופחת בעכברים, בהשוואה לאלו עם את תקנות T. הניסויים הנוכחיים שלנו תומכים ברעיון שזה יכול להיות גם בשל עליית TNF-α שהחמיר את הדלקת, ככל הנראה על ידי אפופטוזיס תא אפיתל הגדלת וגדל פטריית נטל 28. בהתחשב בהשפעות immunoprotective של IL-17 א ברירית, אנו מאמינים כי פתולוגיה דלקתית שאנו רואים עם הגדלת נטל פטרייתי היא לא בשל IL-17 א מיוצרים על ידי תאי TH17 או חוסר התנגדות מארח. הוא נגרם עקב TNF-α וציטוקינים פרו-דלקתיים אחרים ואולי מיוצרים על ידי תאי TH17 מוזרקים. זה יכול להיות מאומת על ידי התצפית שסמרטוט - / - עכברים נטולי תאי TH17 להציג רק מינימאלית דלקת ותוצאה מהחלטת הזיהום ורק מי שקיבל את תאי TH17 נכנעו לירידה במשקל חמורה (איור 1). עקבי לנתונים אלה, זה כבר הראה בעבר גם סמרטוט ש-- / - עכברים לנקות את זיהום OPC העיקרי בלי הרבה immunopathology 27. בתנאים אלה, מנגנוני פיצוי תלוי בIL-17 א לייצור תאים חיסוניים מולדים הוכחו כדי לנקות את הזיהום בסמרטוט - / - עכברים 17,29,30. יחדיו, למרות שIL-17 א מיוצר על ידי תאי TH17 וגיוס נויטרופילים משחקים תפקיד מגן בשלבים ראשוניים של זיהום, EXCייצור essive של TNF-α וציטוקינים אחרים על ידי תאי TH17, ונוכחותם המתמדת של גורמי נויטרופילים החריף immunopathology. התפקידים של ציטוקינים פרו-דלקתיים TNF-α מלבד מיוצר על ידי תאי TH17 להישאר להיחקר בהקשר של immunopathology.

המגבלה העיקרית של המודל היא השאלה אם זה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לOPC האנושי. למרות שתאי TH17 מוצגים להיות מתווכים פתולוגיים במספר מחלות אוראליות, אם הפעלה כרונית של תאי TH17 היא פתוגניים בOPC להישאר להיחקר. עם הממצאים אחרונים רומזים התפקיד של ג אלביקנס בדלקת וסרטן, immunopathology TH17 בחלל הפה הוא שדה פעיל של חקירה 31. כך המודל המתואר כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד יותר בזהירות תפקידים ספציפיים של תאי TH17 וכיצד הם פועלים עם תאים חיסוניים מולדים, נותנים תובנות מפורטות למחלות חיסוניות אוראליות וסרטן פה.

השלב הקריטי בטכניקה הוא הגיוס והרחבת תאי TH17 הועברו adoptively המתאימים. זה תלוי מאוד בייצור הכדאיות וIL-17 א של התאים במבחנה TH17 מקוטבים לפני ההעברה. עדיף לבדוק ייצור הכדאיות וציטוקינים על ידי cytometry זרימת מנתח 19. ביצוע נכון של זיהום הזרקת תאים ועכברים TH17 יוביל לimmunopathology TH17 התלוי זיהום. מודל זה יכול להיות מיושם כדי לבחון אסטרטגיות לסיכול immunopathology TH17 ודלקת אוראלית בהקשר של זיהומים אחרים גם כן. כמו כן, שימוש במודל זה, ניתן לבצע מחדש זיהומים משניים וללמוד את התפקיד של תאי TH17 בהחרפת immunopathology בהקשר של דלקות כרוניות. כמודל זה כרוך עכברי immunodeficient, זה יכול להיות מאוד רלוונטי לdysbiosis האוראלי ראה בחולי איידס וPID, הסובלים מדלקות חוזרות קנדידה כרוניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CAF-2 University of Pittsburgh (Sarah Gaffen) - Candida culture
U-bottom 96 well plates  Fisher 055588 Used for cell culture
a-CD3  eBiosciences 16-0031-85 Polarization of cells to Th17 conditions
a-CD28  eBiosciences 16-0281-85 Polarization of cells to Th17 conditions
m-IL-6 Bio Basic RC232 Polarization of cells to Th17 conditions
h-TGF-b  R&D 240-B Polarization of cells to Th17 conditions
a-IFN-g  eBiosciences 16-7311-85 Polarization of cells to Th17 conditions
a-IL-4  eBiosciences 16-7041-85 Polarization of cells to Th17 conditions
α-IL17A ef660 eBiosciences 50-7177-82 Used for cell culture - 1:50
α-TNFa-PE-Cy7 eBiosciences 25-7423-41 Used for cell culture - 1:100
α-RORgt PE  eBiosciences 12-6981-82 Used for cell culture - 1:50
YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium  Bio Basic S507.SIZE Mediium for candida growth
Shaker incubator  New Brunswick Scientific Innova 4300 Incubation growth for candida
15 ml tubes Bio Basic BT888-SY Used for cell culture and candida growth
50 ml tubes Bio Basic CT 788-YS Used for cell culture and candida growth
Table top Centrifuge VWR International LLC 82017-654 For pelleting candida -900 g
Allegra Centrifuge Beckman Coulter 392302 Cell culture - 480 g
1.5 ml eppendorf tubes Bio Basic BT620-NS Preparing final concentration of candida
2x paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Fixing candida for count
Hemocytometer VWR International LLC 15170-172 Counting cells
PBS - Phosphate Buffered Saline Bio Basic PD8117 Preparation of buffers
Ketamine/xylazine  Case Western Reserve University - Animal Resource Center - Obtained from ARC approved protocol for anesthesia
Ophthalmic lubricant ointment  Allergan - Eye ointment for animals to prevent dryness
Saline (0.9% NaCl) G Biosciences 786-561 Administerd to animals to prevent dehydration
3-mm-diameter cotton wool ball  VWR International LLC BP7603 3 mm balls for candida infection
Heat gel pads Case Western Reserve University - Animal Resource Center - for maintaining the body temperaturre and fast recovery
Hematoxylin and Eosin staining Histoserv - MD - Tissue histology
10% formalin  Electron Microscopy Sciences JC1111/MC Tissue histology
70% ethanol  VWR International LLC 97064-490 Sterilization purpose
PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P1585-1MG Restimulation of cells
Ionomycin Life Technologies 124222 1mg Restimulation of cells
Fixation permeabilization kit eBiosciences E16913-106 Fixing cells for Flow cytometry
Tuberculin syringes BD Biosciences 309659 Mice injection
25 G x 3/8 needles BD Biosciences 309626 Mice injection
Rag1 -/- mice Jackson laboratories Stock no: 002216 Recipient mice
CD45.1 congenic mice Jackson laboratories Stock no:002014  Donor Th17 cells
CB17-SCID mice Jackson laboratories Stock no: 001303 Recipient mice
Balb/c mice Jackson laboratories Stock no: 000651 Donor Th17 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allam, J. P., et al. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).
  2. Loesche, W. J. Periodontal disease: link to cardiovascular disease. Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).
  3. Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. Association between periodontal disease and stroke. Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).
  4. Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy. Arthritis Research & Therapy. 14 (4), 217 (2012).
  5. Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In. Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).
  6. Canabarro, A., et al. Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis. Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).
  7. Urzua, B., et al. Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets. Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).
  8. Ergun, S., et al. Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome. Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).
  9. Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment. Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).
  10. Gall, F., et al. Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions. The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).
  11. Grady, J. F., Reade, P. C. Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia. Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).
  12. Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia. Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).
  13. Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense. Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).
  14. Marodi, L., Johnston, R. B. Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms. Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).
  15. Kumamoto, C. A. Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In. Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).
  16. Kraneveld, E. A., et al. The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults. PloS One. 7 (8), e42770 (2012).
  17. Hernandez-Santos, N., et al. Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).
  18. Hasina, R., et al. ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis. Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).
  19. Pandiyan, P., et al. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model. Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).
  20. Pandiyan, P., et al. The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes. J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).
  21. Pandiyan, P., Lenardo, M. J. The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival. Biology Direct. 3 (6), (2008).
  22. Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells. Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).
  23. Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., et al. Animal models for candidiasis. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. 105, 11-19 (2014).
  24. Conti, H. R., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  25. Kamai, Y., et al. New model of oropharyngeal candidiasis in mice. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).
  26. Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. Isolation of T cells from mouse oral tissues. Biological Procedures Online. 16 (1), 4 (2014).
  27. Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  28. Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation. International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).
  29. Bishu, S., et al. The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).
  30. Quintin, J., et al. Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice. Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).
  31. Ramirez-Garcia, A., et al. Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression. Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).

Tags

רפואה גיליון 96 TH17 T מודל עכבר דלקת פה קנדידה זיהומים וimmunopathology אוראליים
TH17 דגם דלקת של לוע תחתון פטרת בעכברים immunodeficient
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhaskaran, N., Weinberg, A.,… More

Bhaskaran, N., Weinberg, A., Pandiyan, P. Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (96), e52538, doi:10.3791/52538 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter