Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Th17 Inflammation Modell av orofaryngeal candidiasis i möss med immunbrist

Published: February 18, 2015 doi: 10.3791/52538

Protocol

OBS: De experiment med möss utfördes i enlighet med den institutionella djurskyddskommitté (IACUC) riktlinjer.

1. bereder Rag-1 - / - möss med I n Vitro Odlade Th17 celler (Tre dagar före infektion)

  1. För etablering Th17 celler, kultur CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- naiva T-celler (3 x 104) i U-botten 96 brunnar ensam, eller samodling dem tillsammans med 3 x 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + tregs i närvaro av lösliga α-CD3 (1 ug / ml), α-CD28 (2 ng / ml) antikroppar och antigenpresenterande celler, under Th17 betingelser (polarise med användning av IL-6 (25 ng / ml), TGF β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 | ig / ml) och α -IL-4 (2 | ig / ml)) i tre till fyra dagar.
    OBS: Naiva celler och T regs sorterades med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) end magnetisk cellisoleringsprocedurer och odlas som beskrivits tidigare 19-22.
  2. På dag 4, efter återsuspendering av Th17-celler med användning av pipett, samla dem från kulturer, och centrifugera dem under sterila förhållanden.
    1. Ta en liten portion av dessa celler för att undersöka deras livskraft och för fenotypning. Resuspendera dem i 500 l av RPMI medium, till propidiumjodid (200 ng / ml) och bedöma deras livskraft omedelbart genom flödescytometri. Utför fenotypning med flödescytometri bedömning av IL-17A produktion efter restimulering (se avsnitt 6.3).
  3. Centrifugera och tvätta huvuddelen av cellerna i steril PBS vid 480 xg under 6 min vid 4 ° C i alla steg om inte annat anges.
  4. Använd dessa celler för adoptiv överföring till 6-8 veckor gamla CD45.2 Rag1 - / - immundefekta möss.
    1. Resuspendera cellerna vid 1 x 10 7 celler / ml celldensitet med användning av kall steril PBS.
    2. Injicera 100 pl av cellerna genom intraperitoneal injektion, med hjälp av 25 G nålar på 1 ml tuberkulinsprutor, så att en mus får 1 x 10 6 celler. Vissa möss erhåller PBS eller Th17 celler endast, och andra möss erhåller Th17 celler som samodlades med Treg celler.
      OBS: Utför alla steg aseptiskt.

2. Odling C. albicans för infektion (en dag före infektion)

  1. Före ympning, skingra fem kolonier av CAF2-1 C. albicans laboratoriestam i 100 l sterilt PBS fjädring, och lägg suspensionen till den sterila buljong.
  2. Inokulera 5 kolonier av C. albicans i 50 ml av jästkvävebas (YNB utan aminosyror) / pepton / dextros-buljong-medium och inkubera i en skakinkubator vid 30 ° C under 15-18 h vid 130 rpm.
  3. Övervaka buljongen för grumlighet, eftersom det är en indikation för tillväxten av svampen.

3. CandidaSkörd och Counting Tillvägagångssätt (På dagen av infektion)

  1. Samla 10 ml Candida buljong i 15 ml tuber. För större volymer, samla Candida i 50 ml tuber.
  2. Centrifugera blastosporer vid 1900 xg under 5 min vid RT i alla steg om inte annat anges. Pellets blastosporer genom centrifugering, följt av avlägsnande av supernatanten.
  3. Om det finns fler än ett rör, pool Candida blastosporer från flera rör, tillsätta steril PBS till pellets och återsuspendera dem i 10 ml PBS för räkning.
  4. Ta 20 | il av blastosporer i 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 20 | il av den 2X paraformaldehyd och inkubera vid RT i 15 till 20 minuter. Räkna de fasta blastosporer använder hemocytometer i mikroskop.
    OBS: Paraformaldehyd är cancerframkallande. Öppna outspädd lösning endast i dragskåp.
  5. Under tiden upprepa tvätta blastosporer minst två gånger, genom centrifugering tfåll i PBS, och pelletering av blastosporer. Håll pellets i 15 ml tuber vid RT, i ABSL1 huva, redo för infektion.
  6. Lämna lite steril PBS vid RT resuspending de blastosporer för infektion.
  7. Efter inventeringen lägg steril PBS till Blastospora pelleten för att justera jäst Blastospora cellantalet till 2 x10 8 av jäst celler / ml. Detta är den Blastospora suspensionen som kommer att användas för att infektera mössen.
    OBS: Utför alla steg aseptiskt.

4. Möss Infektion (3-5 dagar efter cellöverföring)

OBS: Den grundläggande infektion Proceduren utförs såsom beskrivits tidigare 19,23-25.

  1. Väg den Rag-1 - / - möss som erhöll PBS eller cellerna tre dagar tidigare.
  2. Beräkna dosen av narkosmedel som använder sin kroppsvikt. Bedöva möss genom administrering av ketamin / xylazin-blandning (16,1 mg / ml och 1,6 mg / ml), med användning av 25 G nålar på en ml tuberkulinsprutor, genom intraperitoneal injektion.
    1. Administrera 50 pl per 10 gram kroppsvikt. (Dvs, 0,8 mg ketamin och 0,08 mg xylazin / 10 g kroppsvikt eller 80 mg ketamin och 8 mg xylazin per kg kroppsvikt respektive). Observera för tå nypa respons var 15 min efter anestesi.
      OBS: Denna dos kommer att inducera 60-90 min av anestesi, vilket är tillräckligt för infektionen förfarandet.
    2. Applicera oftalmologiska smörjmedels salvan i ögonen på mössen för att förhindra att hornhinnor från att torka ut. Som ögat smörjmedel kan torka ut, upprepa oftalmologiska smörjning varje 45 min.
  3. Injicera 1 ml saltlösning (0,9% NaCl) subkutant på baksidan intill forelimb, för att hjälpa till rehydrering av mössen under anestesi.
  4. Skaffa en ny, ren bur. Följ infektionen proceduren en mus i taget, placera varje mus i den nya buren gång smittats. Utför PBS / bluff infektion först, och sedan vidare till Candida infektion groups.
  5. Plocka upp den sövda musen och öppna munnen bred för att avslöja tungbasen.
    1. Placera en 3 mm diameter bomullstuss indränkt med 50 ul av PBS eller Blastospora suspension, sublingualt i munhålan under 90 min. Vänd mössen var 15 min fram och bak för att förhindra lung trängsel, se till att bomullstussar inte flytta.
  6. Ställ in en timer för varje mus för att garantera 90 min av Sham eller Candida ympning i munhålan.
  7. Förvara dem i en bur under värmelampa (4 meter bort), och varje mus på värme gel pads.
  8. Kontrollera att tungan dras tillbaka inuti och bort från tänderna, för att undvika tänder lacerating tungan.
  9. Vid slutet av 90 minuter, ta bort bomullsboll från mynningen av musen. Se upp för alla mus som kan återhämta sig från anestesi tidigare än 75 minuter. I ett sådant fall, söva dem igen med ketamin (40 mg / kg) endast.

5. Post procedure Övervakning (under 90 min Anesthesia)

  1. Använd värme gel pads under 90 min anestesi.
    1. För att upprätthålla kroppstemperaturen och för att förhindra kvävning, låt inte möss att återhämta sig på den reguljära corn-cob mus sängar.
  2. Efter återhämtning från anestesi, administrera ytterligare 1 ml av steril 0,9% NaCl subkutant i två ställen på ryggen.
  3. Håll dig fem PBS (sham) ympas möss per bur. Hus bara 1-2 infekterade möss per bur.
  4. Fyll i proceduren kort med initialer varje dag efter ingreppet för att anteckna de förändringar i kroppsvikt, grooming vanor och allmänna hälsa.

6. Bedöma Inflammation

6.1) Viktminskning

  1. Väg mössen varje dag under infektionen, med start på dagen före infektion förfarande.
    OBS: Typiskt immundefekta möss injicerade med Th17 celler och utan T regs vika för 20-30% Viktförlust på grund av ökad svamp börda 19 och förvärras inflammation.

6.2) Histologi poängsättning av tungan

  1. Offra mössen genom CO2 kvävning följt av halsdislokation.
  2. Öppna käftarna och dissekera ut tungan med sax och pincett. Använd trubbig pincett för att hålla tungan, och använda saxen nå ut till baksidan av munnen till incisionsfilm den bakre änden av tungan.
  3. För immunocytokemisk hematoxylin och eosin (H & E) färgning av tungan vävnader, skölj tung vävnader med iskall PBS. Tillsätt 5 ml av 10% formalin för 2-3 tungor och rätta till dem O / N i 15 ml tuber.
    1. Nästa dag, ta bort formalin och fördjupa vävnaderna i 5 ml 70% etanol för att förhindra hyperfixering. Skicka ut dem till kommersiell tjänst för att fortsätta med paraffininbäddning, sektione och färgning av paraffin.
      OBS: Kommersiell histologi tjänst används för att utföra de här stegen.
    2. När bilderna är tillbaka från den kommersiella histologi tjänsten, klass inflammationen genom att observera vävnadssnitt under ett ljusmikroskop.
      1. Betyg från 0 till 5, där 0 är ingen inflammation, och 5 är den mest allvarlig inflammation. Betyg inflammationen med hjälp av tabell 1.

    6,3) Cytokinproduktion av Th17-celler

    OBS: Överdriven TNF-α produktion är en av avläsning för överdriven immunopatologi. När möss adoptivt överförd med Th17 celler endast, orsakar det immunopatologi som är associerad med överdriven TNF-α produktion i Th17 celler.

    1. Samla en enda cell avstängning från mjälte, cervikala lymfkörtlar, axillära lymfkörtlar, och tungan, med hjälp av tidigare beskrivna metoder 19,26.
    2. Restimulate cellerna med forbolmyristatacetat (PMA) (50 ng / ml) och Ionomycin (500 ng / ml) under 4 h med Brefeldin A (10 | ig / ml) tillsattes i Last 2 tim. Tvätta cellerna med PBS och fixa dem med en kommersiell Fixering / permeabilization kit enligt tillverkarens instruktioner.
    3. Utför intra cellulär cytokin-färgning med användning av fluorokrom-konjugerad anti-TNF-α, anti-IL-17A och ROR-γt antikroppar såsom beskrivits tidigare 19.
    4. I korthet, resuspendera cellerna i 1X permeabilization buffert med cocktail av anti-TNF-α, anti-IL-17A och ROR-γt antikroppar, varje antikropp vid 2-3 pg / ml slutkoncentration.
    5. Inkubera cellerna i 1 h vid RT.
    6. Efter inkuberingen tvättas cellerna med 1X permeabilization buffert.
    7. Resuspendera cellpelleten i 500 | il PBS med 0,5% bovint serumalbumin för flödescytometrianalys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denna modell, både Candida infekterade möss och oinfekterade möss i Rag-1 - / - immunbrist bakgrund var adoptivt överförd med Th17 celler 3-5 dagar före infektionen. Totalt 10-12 möss användes för experimenten, med två möss i varje Sham infekterade grupper och 4-5 i varje av de Candida-infekterade grupperna. Naiva celler härleddes från kongena Thy1.1 eller CD45.1 möss, så att injicerade Th17 celler spåras in vivo med användning Thy1.1 eller CD45.1 färgning respektive (Figur 1A). Co-överförda T regs härleddes från CD45.2 möss för att skilja dem från CD45.1 Th17 celler. För vissa experiment, CB-17 Thy1.2 scid mottagarmöss ades Th17 givarceller erhållna från Thy1.1 Balb / C-möss och T regs erhållna från kongena Thy1.2 möss användes. Endast Candida infekterade möss, men inte den oinfekterade möss uppvisade rekrytering och expansion av rekonstituerad CD45.1 + (Figur 1A). Resultaten representerar data från en mus i varje grupp.

Endast i möss som samar överförs med T regs, var Foxp3 + CD45.1 negativ CD4 + celler påvisas i CLN. Detta visar att de injicerade T regs också rekryterades till platsen för infektion (Figur 1B). Resultaten representerar data från en mus i varje grupp. Följande skäl infekterade Rag-1 - / - ner i vikt och återhämtade sig efter 4 dagar av infektion, gjorde kortison immunsupprimerade möss inte återhämta sig men ytterligare förlorade vikt, såsom visats tidigare 27. Båda grupperna av möss som erhöll Th17-celler i närvaro eller frånvaro av T-regs förlorade vikt initialt. Men mössen som fick T regs som återvunnits från viktminskning och löst infektionen. 2 mis användes i Sham infekterade gruppen och fyra i varje Candida infekterad grupp. Det fanns 3 möss i kortison grupp. Mössen som fick Th17 celler endast, gått ner i vikt gradvis (Figur 2) 19. Några av mössen i denna grupp erhöll dödshjälp. Dessa resultat visar genomsnittet av vikterna av alla mössen i den gruppen. Även neutrofiler krävs för den initiala clearance av infektionen, är deras ständiga närvaro och rekrytering i vävnaden ett tecken på olöst inflammation. Neutrofil infiltration undersöktes därför i den infekterade tungan, genom att bestämma uttrycket av en neutrofil markör, Gr-1, vid senare tidpunkter såsom dag 7 efter infektion. Möss som fick Th17 celler endast, hade högre inflammatoriska infiltrat (Figur 3A), inklusive Gr-1 + neutrofiler ens dag-4 efter infektion, jämfört med de möss som injicerats med T regs (Figur 3B). Dessa resultat visade att i presence av T-regs, möss löst inflammationen mer effektivt och återhämtat sig från infektionen.

På dag 7 efter infektion, var mjälte (SPLN), CLN och tungan vävnader isolerades och enstaka cellsuspensioner gjordes för flödescytometri analyser. CLN avslöjade ökade CD45.1 Th17 celler (Figur 1) och förhöjd TNF-α produktion (Figur 4A, 4B) hos möss som fick enbart Th17 celler. Å andra sidan, T reg mottagarna uppvisade minskad frekvens av Th17-celler och minskad produktion av TNF-α genom Th17-celler (figur 1 & 4A, 4B). I dessa experiment är data från CLN av en enda mus, och tunga vävnader skördas och poolade från 2 möss visas. Även vid tidiga tidpunkter IL-17A produktionen var högre i T reg mottagare 19, vid senare tidpunkter i båda grupperna, IL-17A produktion av Th17 celler var minimal (data visas ej). Periodisk Acid Schiffs färgningav tungan visade ökad svamphyfer i möss som fick enbart Th17 celler, medan möss som fick T regs samt rensat svampen på dag-5 och dag-7 efter infektion (Figur 5). Dessutom histopatologi poängsättning av tungan inflammation visade också minskad inflammation poäng i möss som fick T regs, jämfört med möss som fick enbart Th17 celler (Figur 6). Scoring inflammationen byggde på tungan histopatologiska parametrar såsom, förekomst av papiller, den intactness av ytliga epitelskiktet, synligt jäst eller hyfer, invaderande hyfer indikerar icke lösa infektion, förtjockning av basallager (tecken på pågående vävnadsreparation), och närvaron av infiltrerande immunceller (neutrofiler och Th17-celler). Dessa resultat visade att injektion av Th17-celler inte direkt minskar infektion men ökade den svamp bördan och immunpatologi orsakad av primär C. albicans Infection, medan samtidig överföring av T regs förbättras immunopatologi.

Figur 1
Figur 1. Injected Th17 celler och T reg celler rekrytera och expandera i dränerande lymfkörtlar (CLN) av C albicans infekterade möss (A) Rag-1 -.. / - CD45.2 möss rekonstitueras med Th17 celler eller Th17 + T reg celler som polarise enligt Th17 betingelser i 5 dagar. Th17 celler erhölls från CD45.1 kongena möss och T reg celler erhölls från CD45.2 möss. Vissa möss har inte fått några celler (Sham eller Candida + PBS). Mottagande möss i varje grupp infekterades med skenkontroller eller med C. albicans. På dag 5 efter infektion, CLN var isolated att göra en enda cellsuspension och spåra den injicerade CD45.1 uttrycker Th17 celler genom flödescytometri (gated på alla leukocyter i FSC, SSC scatter) (B) Rag-1 -. / - CD45.2 möss rekonstitueras med Th17 celler eller Th17 + T reg celler som i "A" och albicans. CLN infekterade med C. isolerades för att göra en enda cell fjädring och mäta CD45.1 och intracellulär Foxp3 uttryck med flödescytometri (gated på alla CD4-celler). De T reg portar i tomterna visar CD45.1 negativt, Foxp3 + CD4 + celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Injected Th17 celler orsaka viktminskning i C . Albicans infekterade möss och samtidig administrering av T regs förbättrar återhämtningen från viktminskning. SCID CB-17 möss rekonstitueras med Th17 celler eller Th17 + T reg celler som i Figur 1A. 3 dagar senare fick mottagarmössen infekterade med C. albicans. Vissa möss i varje grupp var infekterade med skenkontroller. Immunsupprimerade möss fick kortisonacetat (Cort) injektion. Den procentuella viktförändringen hos möss rekonstituerade med angivna cellerna och infekterade med C. albicans, med avseende på d-1 (en dag före infektion) visas. Data är normaliserade relativt viktdata från oinfekterade (Sham + PBS) möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"Src =" / filer / ftp_upload / 52538 / 52538fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Injected Th17 celler orsakar tungan immunopatologi i C. Albicans smittade möss och samtidig administrering av T regs minskar immunopatologi. Histologisk utvärdering av tungor av C. albicans infekterade möss. Möss rekonstituerades med angivna cellerna och infekterades såsom i figur 1A. På dag 5 efter infektion tungor isolerades från möss. (A) sagittala sektioner av tungorna färgades med H & E för att bedöma inflammation och infiltrering (IF) av de immunceller. (Pa) och (Ep) betecknar papiller och epitelskiktet av tungan respektive. Mikroskopiska bilder av bilderna tittade at50X förstoring. (B) Histologisk immunfärgning för Gr-1 neutrofila markör använder anti Gr-1-antikropp (Clone: 1A8-Ly6g) i tungan avsnitten om 5 dagar efter infektion (brun, betecknas med IF). Mikroskopiska bilder av bilderna tittade på 100X förstoring visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Samtidig administrering av T regs reducerar TNF α i injicerade Th17 celler. (A) Rag-1 - / - CD45.2 möss rekonstituerades med Th17 celler eller Th17 + -T reg-celler och infekterades med C. albicans som i Figur 1A. På dag 5 efter infektion, CLN och tunga vävnader isolerades för att göra en enda cell suspension. Dessa celler återstimulerades med PMA och Ionomycin innan intracellulär staining och flödesanalyser cytometri. Flödescytometrisk kontur tomter av intracellulär ROR-γt och TNF α uttryck av Th17 celler visas (gated på CD4 + celler). (B) Statistisk representation av andelen TNFαpositive celler från experiment som i "A". Data representerar fyra möss i oinfekterade gruppen och 6 möss i varje infekterad grupp, och slås samman från två oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Ökad immunopatologi är också förknippat med ökad svamp börda i C. Albicans infekterade möss. CB-17 scid mice rekonstituerades med Balb / C Th17 celler, eller Th17 + T reg celler som i Figure1A, och var infekterade med C. albicans. Histologisk utvärdering av tunga från infekterade möss visas. På dag 7 efter infektion, ades tungor skördas och färgas med periodisk Acid Schiffs (PAS) för att bedöma svamp lesioner, inflammation och infiltration (IF) av celler, och för att upptäcka svamp (Ca). Glasen ses at100X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. T regs lindra immunopatologi i C. Albicans infekterade möss. SCID-möss rekonstituerades med Balb / C-Th17 celler eller Th17 + -T reg-celler som i fig 1A, och infekterades med C. albicans. Statistisk representation av de genomsnittliga histologiska poängen för de tungor från infekterade möss bedöms som i Figur 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Värdering Kännetecken
0 0 - ingen synlig jäst eller hyfer, intakt ytliga epitel på ryggytan tungan, papiller tydligt närvarande och oskadad (kanske eller kanske inte är infiltrerande mononukleära celler i vävnaden), ingen förtjockning av basallager, inga infiltrerande immunceller.
1 1 - ingen synlig jäst eller hyphae, trasiga eller lätt skadat ytliga epitel, papiller tydligt närvarande med minimala skador och sällan infiltrerande immunceller.
2 2 - papiller minskat men närvarande med skador, förtjockning av basallager och täta infiltrerande immunceller.
3 3 - enstaka kluster av synliga jäst och invaderande hyfer, tecken på skadade papiller, enstaka lesioner av skadad epitel, förtjockning av basalskiktet och små kluster av infiltrerande immunceller.
4 4 - frekventa kluster av synliga jäst och invaderande hyfer, tecken på skadade papiller, täta lesioner av skadad epitel, minimal infiltration av immunceller, förtjockning av basallager och täta kluster av infiltrerande immunceller.
5 5 - omfattande bevis på att invadera hyfer, omfattande skador epitel över dorsala ytan, stor infiltration avimmunceller, få eller ingen påvisbar papiller, förtjockning av basallagret och mycket täta och stora kluster av infiltrerande immunceller.

Tabell 1: Histologiska Scoring Värden

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna modell bygger på att framkalla muntlig C. albicans infektion beroende Th17 inflammation. På grund av frånvaron av T-regs är Th17 cellen inducerad inflammation ohämmad och leder till dåligt upplöst immunopatologi. In vitro härledda naiva CD4-celler polarise som Th17 celler användes för adoptiv överföring. 40-50% av den odlade CD4 + celler visar detekterbar IL-17A uttryck runt dag 3 (Th17 celler), och därför användes för injektion i möss. Den stora fördelen med modellen är att Th17 celler orsakar infektion specifik immunpatologi som effektivt kan förbättras med T reg injektion. Sålunda modellen kan användas för att testa immunmodulestrategier med T reg injektion som en positiv kontroll. Inflammation är lätt bedöms utifrån viktminskning, histopatologiska scoring och pro-inflammatoriska cytokiner produktion av Th17 celler i infekterade möss.

Efter tHan adoptiv överföring av Th17 celler, migrerade de sekundära lymfoida organ och olika vävnader inklusive tungan, den primära platsen för infektion. Efter infektionen, var andra inflammatoriska celler också rekryterats till tungan för att rensa infektion. Utan T reg medierad immunmodule, Th17 celler själva inte lösa infektionen men orsakade förhöjd immunopatologi. Samtidig överföring av T-regs helt löst inflammationen. Intressant möss med förvärras inflammation i frånvaro av T-regs, också visade ökad svamp börda. Vår tidigare rapport visade att detta berodde på minskad IL-17A produktion i möss, jämfört med dem med T regs. Våra nuvarande experiment stöder tanken att det också kan bero på ökad TNF-α som förvärrades inflammationen, eventuellt genom att öka epitelceller apoptos och ökad svamp börda 28. Med tanke på de immun effekterna av IL-17A på slemhinnanVi tror att inflammatorisk patologi som vi observerar med ökande svamp bördan beror inte på IL-17A producerad av Th17 celler eller brist på värdresistens. Det orsakas på grund av TNF-α och eventuellt andra proinflammatoriska cytokiner som produceras av injicerade Th17 celler. Detta kan valideras av observationen att Rag - / - möss saknar Th17 celler visar endast minimal inflammation och efterföljande upplösning på infektion och bara de som fått Th17 celler dukade till svår viktminskning (Figur 1). Konsekvent med dessa data, det har också tidigare visat att Rag - / - möss rensa primära OPC infektionen utan mycket immunopatologi 27. Under dessa förhållanden har kompensationsmekanismer beroende på IL-17A producerande medfödda immunceller visats rensa infektion i Rag - / - möss 17,29,30. Sammantaget även IL-17A producerad av Th17 celler och neutrofila rekrytering spelar en skyddande roll vid inledande faserna av infektion, excessive produktion av TNF-α och andra cytokiner från Th17 celler, och den fortsatta närvaron av neutrofiler orsaker förvärras immunopatologi. Rollerna för proinflammatoriska cytokiner förutom TNF-α producerad av Th17 celler återstår att utredas i samband med immunopatologi.

Den största begränsningen av modellen är frågan om det är fysiologiskt relevant för människors OPC. Även Th17 celler visar sig vara patologiska mediatorer i flera orala sjukdomar, oavsett om kronisk aktivering av Th17 celler är patogen i OPC återstår att utreda. Med nya rön som innebär rollen av C. albicans i inflammation och cancer, är Th17 immunopatologi i munhålan en aktiv undersökningsområde 31. Således den modell som beskrivs här kan användas för att mer noggrant studera specifika roller Th17 celler och hur de interagerar med medfödda immunceller, vilket ger detaljerade insikter i att orala immunologiska sjukdomar och cancer i munhålan.

Det kritiska steget i tekniken är lämplig rekrytering och expansion av de adoptivt överförda Th17 celler. Detta är mycket beroende av livskraft och IL-17A produktionen av in vitro polarise Th17 celler före överföringen. Det är bäst att testa deras livskraft och cytokinproduktion med flödescytometri analyser 19. Korrekt utförande av Th17 cellinjektion och möss infektion leder till infektioner beroende Th17 immunopatologi. Denna modell kan tillämpas för att testa strategier för att omintetgöra Th17 immunopatologi och muntlig inflammation i samband med andra infektioner också. Också använda denna modell, kan man utföra sekundära återinfektioner och studera rollen av Th17 celler i förvärrar immunopatologi i samband med kroniska infektioner. Eftersom denna modell innebär immundefekta möss, kan det vara mycket relevant för oral dysbios ses i AIDS och PID-patienter, som lider av återkommande kroniska Candida infektioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CAF-2 University of Pittsburgh (Sarah Gaffen) - Candida culture
U-bottom 96 well plates  Fisher 055588 Used for cell culture
a-CD3  eBiosciences 16-0031-85 Polarization of cells to Th17 conditions
a-CD28  eBiosciences 16-0281-85 Polarization of cells to Th17 conditions
m-IL-6 Bio Basic RC232 Polarization of cells to Th17 conditions
h-TGF-b  R&D 240-B Polarization of cells to Th17 conditions
a-IFN-g  eBiosciences 16-7311-85 Polarization of cells to Th17 conditions
a-IL-4  eBiosciences 16-7041-85 Polarization of cells to Th17 conditions
α-IL17A ef660 eBiosciences 50-7177-82 Used for cell culture - 1:50
α-TNFa-PE-Cy7 eBiosciences 25-7423-41 Used for cell culture - 1:100
α-RORgt PE  eBiosciences 12-6981-82 Used for cell culture - 1:50
YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium  Bio Basic S507.SIZE Mediium for candida growth
Shaker incubator  New Brunswick Scientific Innova 4300 Incubation growth for candida
15 ml tubes Bio Basic BT888-SY Used for cell culture and candida growth
50 ml tubes Bio Basic CT 788-YS Used for cell culture and candida growth
Table top Centrifuge VWR International LLC 82017-654 For pelleting candida -900 g
Allegra Centrifuge Beckman Coulter 392302 Cell culture - 480 g
1.5 ml eppendorf tubes Bio Basic BT620-NS Preparing final concentration of candida
2x paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Fixing candida for count
Hemocytometer VWR International LLC 15170-172 Counting cells
PBS - Phosphate Buffered Saline Bio Basic PD8117 Preparation of buffers
Ketamine/xylazine  Case Western Reserve University - Animal Resource Center - Obtained from ARC approved protocol for anesthesia
Ophthalmic lubricant ointment  Allergan - Eye ointment for animals to prevent dryness
Saline (0.9% NaCl) G Biosciences 786-561 Administerd to animals to prevent dehydration
3-mm-diameter cotton wool ball  VWR International LLC BP7603 3 mm balls for candida infection
Heat gel pads Case Western Reserve University - Animal Resource Center - for maintaining the body temperaturre and fast recovery
Hematoxylin and Eosin staining Histoserv - MD - Tissue histology
10% formalin  Electron Microscopy Sciences JC1111/MC Tissue histology
70% ethanol  VWR International LLC 97064-490 Sterilization purpose
PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P1585-1MG Restimulation of cells
Ionomycin Life Technologies 124222 1mg Restimulation of cells
Fixation permeabilization kit eBiosciences E16913-106 Fixing cells for Flow cytometry
Tuberculin syringes BD Biosciences 309659 Mice injection
25 G x 3/8 needles BD Biosciences 309626 Mice injection
Rag1 -/- mice Jackson laboratories Stock no: 002216 Recipient mice
CD45.1 congenic mice Jackson laboratories Stock no:002014  Donor Th17 cells
CB17-SCID mice Jackson laboratories Stock no: 001303 Recipient mice
Balb/c mice Jackson laboratories Stock no: 000651 Donor Th17 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allam, J. P., et al. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).
  2. Loesche, W. J. Periodontal disease: link to cardiovascular disease. Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).
  3. Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. Association between periodontal disease and stroke. Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).
  4. Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy. Arthritis Research & Therapy. 14 (4), 217 (2012).
  5. Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In. Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).
  6. Canabarro, A., et al. Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis. Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).
  7. Urzua, B., et al. Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets. Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).
  8. Ergun, S., et al. Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome. Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).
  9. Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment. Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).
  10. Gall, F., et al. Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions. The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).
  11. Grady, J. F., Reade, P. C. Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia. Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).
  12. Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia. Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).
  13. Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense. Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).
  14. Marodi, L., Johnston, R. B. Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms. Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).
  15. Kumamoto, C. A. Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In. Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).
  16. Kraneveld, E. A., et al. The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults. PloS One. 7 (8), e42770 (2012).
  17. Hernandez-Santos, N., et al. Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).
  18. Hasina, R., et al. ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis. Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).
  19. Pandiyan, P., et al. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model. Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).
  20. Pandiyan, P., et al. The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes. J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).
  21. Pandiyan, P., Lenardo, M. J. The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival. Biology Direct. 3 (6), (2008).
  22. Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells. Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).
  23. Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., et al. Animal models for candidiasis. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. 105, 11-19 (2014).
  24. Conti, H. R., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  25. Kamai, Y., et al. New model of oropharyngeal candidiasis in mice. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).
  26. Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. Isolation of T cells from mouse oral tissues. Biological Procedures Online. 16 (1), 4 (2014).
  27. Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  28. Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation. International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).
  29. Bishu, S., et al. The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).
  30. Quintin, J., et al. Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice. Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).
  31. Ramirez-Garcia, A., et al. Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression. Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).

Tags

Medicin Th17 T Musmodell oral inflammation Candida oral infektion och immunpatologi
Th17 Inflammation Modell av orofaryngeal candidiasis i möss med immunbrist
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhaskaran, N., Weinberg, A.,More

Bhaskaran, N., Weinberg, A., Pandiyan, P. Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (96), e52538, doi:10.3791/52538 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter