Protocol
NOT: fareler kullanarak deneyler kurumsal hayvan refahı komitesi (IACUC) yönergeleri uygun olarak yapıldı.
(Enfeksiyon Üç gün önce) I n Vitro kültürlü Th17 hücreleri ile Fare - / - 1. Rag-1 yeniden kurgulamak
- Çözünür mevcudiyetinde tek başına U dipli, 96 gözlü levhalar, ya da 3 x 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs ile birlikte ko-kültür bunları Th17 hücreleri, kültür, CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25 naiv T hücreleri (x 104 3) oluşturulması için α-CD3 (1 ug / ml), α-CD28 (2 ug / ml), Th17 koşulları altında antikorlar ve antijen sunan hücreler (IL-6 (25 ng / ml), TGF-β kullanılarak polarize (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) ve α -IL-4 (2 ug / ml)) 3-4 gün karıştırılmıştır.
Not: Saf hücreleri ve T STüz THP kullanılarak dizildi (FACS) birManyetik hücre izolasyon prosedürleri, d ve kültüre daha önce 19-22 açıklandığı gibi. - 4. günde, pipet kullanarak Th17 hücrelerin tekrar asılı tutulmasından sonra, kültürler bunları toplamak ve steril koşullar altında santrifüj.
- Bunların canlılığı ve fenotipleme incelemek için, bu hücrelerin küçük bir kısım al. Propidyum iyodür (200 ng / ml) ekleyin ve akış sitometrisi ile hemen uygulanabilirliğini değerlendirmek, RPMI ortamında 500 ul bunları yeniden süspanse edin. Yeniden uyarıldıktan sonra IL-17A üretiminin değerlendirilmesi flow sitometri ile fenotiplendirilmesini gerçekleştirin (bakınız bölüm 6.3).
- Aksi belirtilmediği sürece, santrifüj ve tüm adımlar 4 ° C'de 6 dakika boyunca 480 xg'de steril PBS içerisinde hücrelerin büyük bir kısmını yıkayın.
- 6-8 haftalık CD45.2 Rag1 içine evlatlık transferi için bu hücreleri kullanın - / - immünyetmezligi fareler.
- Soğuk steril PBS kullanılarak 1 x 10 7 hücre / ml hücre yoğunluğunda tekrar süspansiyon hücreleri.
- Intrap hücrelere 100 ul enjekteeritoneal enjeksiyon, bir fare 1 x 10 6 hücre aldığı şekilde, 1 ml tüberkülin şırınga 25 G iğne kullanarak. Bazı fareler sadece PBS veya Th17 hücreleri alır ve diğer fareler, regülatör T hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde, Th17 hücreleri alır.
NOT: aseptik tüm adımları uygulayın.
2. C Büyüyen enfeksiyon için albicans (bir gün Enfeksiyon önce)
- Aşılamadan önce, CAF2-1 C'de beş koloni dağıtmak albicans laboratuvar steril PBS süspansiyon 100 ul zorlanma, ve steril suyu için süspansiyon ekleyin.
- C. 5 koloni inoküle maya azot baz, 50 ml albicans (amino asit içermeyen YNB) / Pepton / dekstroz et suyu, orta ve 130 rpm'de 15-18 saat süre ile 30 ° C'de çalkalamalı bir inkübatör içinde inkübe edilir.
- Bu mantar büyümesi için bir gösterge olarak, bulutluluk için suyu izleyin.
3. CandidaHasat ve (Enfeksiyon gününde) Sayım İşlemi
- 15 ml tüpler Candida suyu 10 ml toplayın. Daha büyük miktarlar için, 50 ml tüpler içinde Candida toplamak.
- Aksi belirtilmediği sürece, tüm adımlarda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1900 x g'de blastosporlar santrifüjleyin. Üstte kalan sıvı kısmın çıkarılması ve ardından santrifüjle blastosporlar, pelet.
- Birden fazla tüp olması durumunda, topaklar, steril PBS ilave, çok sayıda boruların Candida blastosporlar havuz ve sayım için, 10 ml PBS içinde tekrar süspansiyon haline bunları.
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine blastosporlar 20 ul al 2X paraformaldehit 20 ul ve 15-20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Mikroskop altında hemasitometre kullanarak sabit blastosporlar sayın.
NOT: Paraformaldehyde kanserojen. Sadece davlumbaz sulandırılmamış çözüm açın. - Bu arada, t santrifüjle, en az iki kez blastosporlar yıkama tekrarPBS hem, ve blastosporlar peletleme. Enfeksiyonu için hazır ABSL1 başlığı içinde, oda sıcaklığında 15 ml tüpler peletlerin tutun.
- Enfeksiyon için blastosporlar resuspending RT'de bazı steril PBS bırakın.
- Sayımının ardından, maya hücre / ml'lik 2 x10 8 maya blastospor hücre sayısını ayarlamak için blastospor pelet steril PBS ilave edin. Bu fareleri enfekte etmek için kullanılacak blastospor süspansiyonudur.
NOT: aseptik tüm adımları uygulayın.
4. Fare Enfeksiyon (Hücre Transferi sonrası 3-5 gün)
NOT: Daha önce açıklandığı gibi 19,23-25 temel enfeksiyon prosedürü yapılır.
- / - - PBS veya üç gün önce hücreleri alınan fareler Rag-1 tartılır.
- Kendi vücut ağırlığını kullanarak anestezik ajanların dozu hesaplayın. Intr göre, 1 mi tüberkülin şırınga 25 G iğne kullanılarak, ketamin / ksilazin karışımı (16.1 mg / ml ve 1.6 mg / ml) uygulanması ile fareler anesteziaperitoneal enjeksiyonu.
- Vücut ağırlığının her 10 gramı başına 50 ul uygulayın. (Örneğin, ketamin, 0.8 mg ve vücut ağırlığının ksilazin 10 g / 0.08 mg ya da ketamin 80 mg ve vücut ağırlığındaki her bir kg başına ksilazin 8 mg) mevcuttur. Ayak tutam yanıt anestezi sonrası her 15 dakika gözlemleyin.
NOT: Bu dozaj enfeksiyon prosedürü için yeterli anestezi 60-90 dakika, neden olacaktır. - Kurumasını önlemek için kornealar farelerin gözünde oftalmik yağ merhemi sürün. Göz yağlayıcı kurumasına gibi, oftalmik yağlama her 45 dakikada bir tekrarlayın.
- Vücut ağırlığının her 10 gramı başına 50 ul uygulayın. (Örneğin, ketamin, 0.8 mg ve vücut ağırlığının ksilazin 10 g / 0.08 mg ya da ketamin 80 mg ve vücut ağırlığındaki her bir kg başına ksilazin 8 mg) mevcuttur. Ayak tutam yanıt anestezi sonrası her 15 dakika gözlemleyin.
- Anestezi sırasında farelerin rehidrasyon yardımcı, ön ayakları ile deri altından geri bitişik tuzlu su (% 0.9 NaCl) ile 1 ml enjekte edilir.
- Yeni, temiz bir kafes edinin. Bir kez enfekte yeni kafesin içine fare her yerleştirerek, bir defada enfeksiyon prosedürü bir fare izleyin. İlk PBS / sahte enfeksiyonu gerçekleştirin ve sonra Candida enfeksiyonu Gro devamgüç kaynağı.
- Anestezi fare Pick up ve dil tabanı ortaya çıkarmak için geniş ağzını açın.
- Dil altından, 90 dakika için ağız boşluğu içinde, PBS veya blastospor süspansiyonu, 50 ul ile doyurulmuş 3 mm çapında pamuk yerleştirin. Pamuk topları hareket etmiyor sağlanması, akciğer tıkanıklığı önlemek için geri farelere her 15 dk ön çevirin ve.
- Ağız boşluğu Sham veya Candida aşılamadan 90 dakika sağlamak için her fare için bir zamanlayıcı ayarlayın.
- Isı lambası (4 metre uzaklıkta) altında bir kafes ve ısı jel yastıkları her fare tutun.
- Dil dil laserasyon yaralanmasıdır diş önlemek için, diş içinde ve uzak çekilir emin olun.
- 90 dakika sonunda, fare ağızdan pamuk çıkarın. 75 dakikadan daha kısa sürede anestezi kurtarmak herhangi fare izleyin. Böyle bir durumda, sadece, ketamin (40 mg / kg) ile yeniden anestetize.
5. Mesaj prosedüründee (90 dk Anestezi sırasında) İzleme
- 90 dakika anestezi sırasında ısı jel pedleri kullanın.
- Vücut ısısını korumak için ve boğulma önlemek için, fareler normal mısır koçanı fare yatak üzerinde kurtarmak için izin vermez.
- Anesteziden çıktıktan sonra, arka iki konumda steril% 0.9 NaCl, deri altından ilave 1 ml yönetmek.
- Beş PBS (plasebo) kafes başına aşılanmış farelerde kadar tutun. Kafes başına Evi sadece 1-2 enfekte fareler.
- Alışkanlıkları ve genel sağlık bakım, vücut ağırlığı değişiklikleri not etmek işlem sonrası her gün baş harfleri ile prosedür kartını doldurun.
6. Enflamasyon değerlendirilmesi
6.1) Kilo kaybı
- Enfeksiyon prosedür öncesi gün ile başlayarak, enfeksiyon sırasında, her gün fareler tartılır.
Not: Genellikle, Th17 hücreleri olmadan ve T gruplar gruplar enjekte bağışıklık yetersizliği olan farelere 20 yenikNedeniyle -30% kilo kaybı mantar yükünü 19 artmış ve inflamasyon şiddetlenir.
Dil 6.2) Histoloji puanlama
- Servikal dislokasyon CO2 asfiksiyasyonu ile fareler kurban.
- Çeneleri açın ve makas ve forseps ile dilini incelemek. Dilini tutmayı künt forseps kullanın ve makas ağız arkasına ulaşmak kullanarak dilin arka uç kesilirken.
- Imüno hematoksilin ve eosin dil dokuların (H & E) boyama için, buz gibi soğuk PBS ile dil dokuları yıkayın. 15 ml'lik tüplerde / N 2-3 dil için% 10 formalin 5 ml ekleyin ve O bunları düzeltmek.
- Sonraki gün, formalin çıkarın ve hiper tespit önlemek için% 70 etanol içinde 5 ml doku bırakın. Kesit ve parafin kesitlerin boyanması, parafin gömme devam etmek ticari hizmet için bunları gönderin.
NOT: Ticari histoloji hizmeti adımları gerçekleştirmek için kullanılır. - Slaytlar geri ticari histoloji hizmetinden kez, sınıf bir ışık mikroskobu altında doku bölümleri gözlemleyerek iltihabı.
- 0 hiçbir iltihap olan, ve 5 en şiddetli inflamasyon olmak, 0-5 puan. Tablo 1 kullanılarak iltihabı Puan.
Th17 hücreleri tarafından 6.3) sitokin üretimi
Not: Aşırı TNF-α üretimindeki azalma, aşırı immunopatolojilerinde için okumalar biridir. Farenin adoptif Th17 hücreleri ile transfer edildiğinde, sadece, bunun Th17 hücrelerinde aşırı TNF-α üretimi ile ilişkilidir Immunopathology neden olur.
- Daha önce açıklanan yöntemleri kullanarak 19.26 dalak, servikal lenf nodları, aksiller lymphnodes ve dil tek bir hücre süspansiyonu, toplayın.
- Brefeldin A (10 ug / mi) ile 4 saat için forbol miristat asetat (PMA) (50 ng / ml) ve iyonomisin (500 ng / ml) ile hücrelerin yeniden uyarmak l eklendiast 2 saat. PBS ile hücreleri yıkayın ve üreticinin talimatlarına göre ticari Tespit / permeabilizasyon kiti kullanılarak onları düzeltmek.
- Daha önce tarif edildiği gibi 19 florokrom konjuge anti-TNF-α, anti-IL-17A ve ROR-γt antikorları kullanılarak hücre içi sitokin boyama yapın.
- / Ml nihai konsantrasyon 3 ug - Kısaca anlatmak gerekirse anti-TNF-α, anti-IL-17A ve ROR-γt antikorlar, 2 de her bir antikorun bir kokteyli ile 1X permeabilizasyon tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- Oda sıcaklığında 1 saat süre ile inkübe hücreleri.
- İnkübasyondan sonra, 1X permeabilizasyon tampon maddesi ile hücreleri yıkayın.
- Akışkan sitometri analizi için% 0.5 sığır serum albümini ile PBS içinde 500 ul hücre pelletini.
- Sonraki gün, formalin çıkarın ve hiper tespit önlemek için% 70 etanol içinde 5 ml doku bırakın. Kesit ve parafin kesitlerin boyanması, parafin gömme devam etmek ticari hizmet için bunları gönderin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu modelde, Rag-1 de, Candida ile enfekte olan fareler ve enfekte edilmemiş fareler, her iki - / - bağışıklık yetersizliği olan arka plan adoptif enfeksiyona 3-5 gün önce, Th17 hücreleri ile transfer edilmiştir. 10-12 farelerin toplam 2, her bir Sahte enfekte edilmiş gruptaki farelerin ve Candida enfekte gruplarının her biri 4-5 ile, deneyler için kullanılmıştır. Enjekte Th17 hücreleri, sırasıyla (Şekil 1A) Thy1.1 veya CD45.1 boyaması kullanılarak in vivo olarak takip edilmiştir, böylece naif hücreleri konjenik Thy1.1 veya CD45.1 farelerden elde edilmiştir. Ko-transfer edilebilmekte, T STüz CD45.1 Th17 hücreleri ayırmak için CD45.2 farelerden elde edilmiştir. Bazı deneyler için, CB-17 SCID Thy1.2 alıcı fareler, Thy1.1 Balb / C fareleri ve konjenik Thy1.2 farelerden elde edilen T gruplar gruplar elde Th17 verici hücreleri kullanılmıştır. Sadece + Candida fareler ile enfekte, ancak bulaşmamış fareler işe alma ve yeniden CD45.1 genişleme sergiledi (Şekil 1A) başlatılır göstermektedir. Sonuçlar her bir gruptaki bir fare verileri temsil eder.
Yalnızca T gruplar gruplar ile aktarılmış CO farelerde, Foxp3 + CD45.1 negatif CD4 + hücreleri CLN tespit edilmiştir. Bu enjekte T regs da enfeksiyon yerinde (Şekil 1B) için işe olduğunu göstermektedir. Sonuçlar her bir gruptaki bir fare verileri temsil eder. / - - Rag-1 enfekte Oysa kilo ve enfeksiyon 4 gün sonra kurtarıldı kaybetmek, kortizon bağışıklık sistemi baskılanmış farelerin kurtarmak vermedi ama daha fazla kayıp ağırlık, daha önce 27 gösterildiği. Her iki T gruplar gruplar varlığında veya yokluğunda Th17 hücreleri alan fareler grupları ilk kilo. Bununla birlikte, kilo kaybı alınan T regs alınan ve fareler enfeksiyon çözüldü. 2 m,Buz her Candida enfekte grubu Sham enfekte grubu kullanılır ve 4 edildi. Kortizon grupta 3 fare vardı. Th17 hücreleri alan fareler, sadece, (Şekil 2) 19 kademeli olarak ağırlık kaybetti. Bu gruptaki farelerin bazıları ötenazi gerekiyordu. Bu sonuçlar, bu gruptaki tüm farelerin ağırlıklarının oranı göstermektedir. Nötrofiller enfeksiyon ilk temizlenmesi için gerekli olmasına rağmen, doku içinde kendi sürekli varlığı ve işe çözülmemiş inflamasyon işaretidir. Bu nedenle, nötrofil infiltrasyonu örneğin günde-7 enfeksiyondan sonra olduğu gibi sonraki zaman noktalarında nötrofil işaretleyicinin ekspresyonunu, Gr-1, belirleyerek, enfekte dil incelenmiştir. Th17 hücreleri alan fareler, sadece T gruplar gruplar (Şekil 3B) enjekte edilmiş fareler ile karşılaştırıldığında, Gr-1 +, nötrofillerin da gün 4 enfeksiyondan sonra da dahil olmak üzere daha yüksek bir enflamatuar infiltratlar (Şekil 3A) vardı. Bu sonuçlar göstermiştir ki presenc içindeT regs e, fareler daha verimli inflamasyonu çözüldü ve enfeksiyon kurtarıldı.
Enfeksiyondan sonra 7. günde, dalak (SPLN) CLN ve dil dokular izole edilmiş ve tek hücre süspansiyonları, akış sitometrisi analizi için de yapılmıştır. CLN Th17 hücreleri yalnızca alınan farede CD45.1 Th17 hücreleri (Şekil 1) ve artan TNF-α üretimi (Şekil 4A, 4B) yüksek olduğunu gösterdi. Diğer yandan, T alıcıları Th17 hücreleri (Şekil 1 ve 4A, 4B) ile Th17 hücrelerin sıklığını ve indirgenmiş TNF-α üretiminde azalma gösterdi reg. Bu deneylerde, 2 fareden toplanmış ve bir araya toplanmış, tek fare CLN ve dil dokulardan veriler gösterilmiştir. Erken zaman noktalarında IL-17A üretimi T daha yüksek olmakla birlikte grupları, Th17 hücreleri ile IL-17A üretimi (veriler gösterilmemiştir) çok az hem de daha sonraki zaman noktalarında, alıcı 19 reg. Periyodik Asit Schiff boyamaT regs alan fareler de enfeksiyon (Şekil 5) bir gün sonra-5 ve gün 7 mantar temizlenmiş ise dilin sadece Th17 hücreleri alan fareler mantar hyphae'nin artış gösterdi. Ayrıca, dil iltihabı histopatolojisi puanlaması da sadece Th17 hücreleri (Şekil 6) alınan farelere kıyasla, T regs alan farelerde düşük reaksiyon dereceleri göstermiştir. Inflamasyon Puanlama tür papilla varlığı olarak dil histopatolojik parametreler dayalı, (devam eden doku onarımı göstergesi) olmayan çözme enfeksiyonu gösteren hifaları işgal yüzeyel epitel tabakası, görünür maya veya hif, bir intakt, bazal tabakasının kalınlaşması, ve immün hücrelerin (nötrofiller ve Th17 hücreleri) infiltre varlığı. Bu sonuçlar, doğrudan enfeksiyonu azaltmak vermedi Th17 hücrelerinin bu enjeksiyon gösterdi ancak birincil C'nin neden olduğu mantar yükünü ve Immunopathology arttı albicans enfeksiyonusiyon, T gruplar gruplar ortak transferi Immunopathology iyileştirmiştir ise.
Şekil 1. Enjekte Th17 hücreleri ve T hücreleri Tescil C lenf düğümlerinde (CLN) içinde işe ve genişletmek albicans fareler enfekte (A) Rag-1 -.. / - CD45.2 fareler Th17 hücreleri veya Th17 ile yeniden yapıldı + T, 5 gün boyunca, Th17 koşullar altında polarize edilmiş hücreler reg. Th17 hücreleri CD45.2 farelerden elde edildi CD45.1 konjenik fare ve regülatör T hücrelerinden elde edildi. Bazı fareler herhangi bir hücre (Sham veya Candida + PBS) almadı. Her grupta Alıcı fareler sahte kontrolleri ile veya C ile enfekte edildi albicans arasından seçilir. Enfeksiyondan sonra 5. günde, CLN isolat edildiEd tek bir hücre süspansiyonu yapmak ve (FSC, SSC dağılım tüm lökositler kapılanmış) akış sitometrisi ile Th17 hücrelerini tanımlayan enjekte CD45.1 etiket (B) Rag-1 -. / - fareler Th17 hücreleri ile yeniden-teşekkül ettirilmiştir CD45.2 veya Th17 + regülatör T "A" olarak hücreler ve C ile enfekte edilmiştir. albicans arasından seçilir. CLN tek bir hücre süspansiyonu yapmak ve CD45.1 (tüm CD4 hücreleri kapılanmış) akış sitometrisi ile hücre içi Foxp3 ifadesinin ölçülmesi için izole edilmiştir. Parsellerde T reg kapıları negatif CD45.1, Foxp3 + CD4 + hücreleri göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Enjekte Th17 hücreleri C kilo kaybına neden ., T gruplar gruplar albicans ile enfekte edilmiş fareler ile müştereken-ilaç kilo kaybından haline gelmesini geliştirir. SCID CB-17 fare Şekil 1A olarak Th17 hücreleri veya Th17 + regülatör T hücreleri ile yeniden-teşekkül ettirilmiştir. 3 gün sonra, alıcı fareler C ile enfekte edildi albicans arasından seçilir. Her grupta Bazı farelerde shan kontrolü ile enfekte edilmiştir. İmmunsüprese fareler kortizon asetat (Cort) enjeksiyonu yapıldı. d-1 (bir gün enfeksiyondan önce) gösterilmiştir göre C. albicans ile gösterilen hücreleri ile yeniden enfekte olmuş farelerde bulunan yüzde ağırlık değişimi. Veriler bulaşmamış (Sham + PBS) farelerin ağırlık verilerine göre normalize göredir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
"Src =" / files / ftp_upload / 52.538 / 52538fig3highres.jpg "/>
Şekil 3. Döküm, Th17 hücreleri C dil Immunopathology neden olur. Albicans fare T gruplar gruplar birlikte verilmesini C dillerin immünopatoloji. Histolojik değerlendirme azaltır enfekte albicans fareler enfekte. Fareler, belirtilen hücrelerle yeniden kurulmuş ve Şekil 1A olarak enfekte edilmiştir. Enfeksiyondan sonra 5. günde, diller. Farelerden izole edilmiştir (A), dillerin sagital kesitler enflamasyon ve bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonunu (IF) değerlendirmek için H & E ile boyandı. (PA) ve (Ep) papilla sırasıyla dil epitel tabakası belirtir. At50X büyütme inceledi slaytlar mikroskobik görüntüleri. (B), anti-Gr 1 antikoru kullanılarak Gr-1 nötrofil işaretleyici için histolojik immun (Cıone: IF ile gösterilen enfeksiyondan 5 gün sonra, dil bölümlerde 1A8-Ly6G) (kahverengi). Gösterilir 100X büyütmede inceleyenler slaytlar mikroskobik görüntüleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
T gruplar gruplar Şekil 4. Birlikte uygulama enjekte Th17 hücrelerinde TNF-a α azaltır. (A), Rag-1 - / - fareleri CD45.2 Th17 hücreleri veya Th17 + regülatör T hücreleri ile yeniden kurulmuş ve C ile enfekte edilmiştir albicans Şekil 1A gibi. enfeksiyondan 5 gün sonra, CLN ve dil dokular tek bir hücre süspansiyonu yapmak üzere izole edilmiştir. Bu hücreler, hücre içi staini önce, PMA ve İyonomisin ile yeniden stimüle edilmiştirng ve akış sitometri analizleri. Th17 hücrelerinin hücre içi ROR-γt ve TNF-a α ifade akış sitometrik kontur planlarıdır gösterilmiştir. (B), "A" olarak yapılan deneylerden TNFαpositive hücre yüzdesi istatistiksel temsil (CD4 + hücreleri kapılanmış). Veriler bulaşmamış grupta 4 fare ve her enfekte grupta 6 fareler temsil ve iki bağımsız deneyden elde edilen edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Artan immünopatoloji da C artan mantar yükü ile ilişkilidir. Albicans fareler enfekte. CB-17 scid mikrofone Balb / C Th17 hücreleri ile yeniden, ya da Şekil 1a içinde olduğu gibi, Th17 + regülatör T hücreleri, ve C ile enfekte edilmiştir edildi albicans arasından seçilir. Enfekte olmuş fareler dilin histolojik değerlendirilmesi gösterilmektedir. Enfeksiyondan sonra 7. günde, diller hasat edilmiş ve mantar lezyonlar, iltihaplanma ve infiltrasyon hücrelerinin (IF) değerlendirmek ve (Ca) mantar tespit etmek için periyodik asit Schiff (PAS) ile boyanmıştır. slaytlar at100X büyütme inceledi edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6, T STüz C Immunopathology ortadan kaldırdığım bulmuşlardır. Albicans enfekte edilen fareler. SCID farelerine Balb / C Th17 hücreleri ile yeniden veya Th17 + regülatör T hücreleri, Şekil 1A 'da olduğu gibi, ve C ile enfekte edilmiştir edildi albicans arasından seçilir. Şekil 5 gibi değerlendirilen enfekte olmuş fareler dillerin ortalama histolojik puanlarının istatistiksel gösterimi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Gol | Özellikleri |
| 0 | 0 - Görünür maya veya hif, dilin dorsal yüzeyinde sağlam yüzeysel epitel, açıkça mevcut ve hasarsız papilla (olabilir veya doku içinde mononükleer hücreler infiltre olmayabilir), bazal tabaka hiçbir infiltre bağışıklık hücrelerinin yok kalınlaşma. |
| 1 | 1 - Görünür maya veya hyphae düzensiz veya hafif hasarlı yüzeyel epitel, minimal hasar ve seyrek infiltre bağışıklık hücreleri ile açıkça mevcut papilla. |
| 2 | 2 - papilla azalır ama hasar, bazal tabakanın kalınlaşması ve sık infiltre bağışıklık hücreleri ile mevcut. |
| 3 | 3 - Görünür maya ve işgalci hif, hasarlı papilla, hasarlı epitel arada lezyonlar, bazal tabakanın kalınlaşması ve ve bağışıklık hücreleri infiltre küçük kümeler kanıt arada kümeler. |
| 4 | 4 - görünür maya ve işgalci hif, hasarlı papilla, hasarlı epiteli, bağışıklık hücrelerinin az infiltrasyonu, bazal tabaka ve bağışıklık hücrelerini infiltre sık kümeler kalınlaşma sık lezyonların kanıt sık kümeler. |
| 5 | 5 - dorsal yüzeyi boyunca hifaları istila, yoğun hasarlı epitel büyük infiltrasyonu yaygın kanıtBirkaç immün hücreleri ya da tespit edilebilir papilla bazal tabakasının kalınlaşması ve infiltrasyonlu immün hücrelere oldukça sık ve büyük kümeler. |
Tablo 1: Histolojik Puanlama Değerler
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu model, oral C uyarıcı dayanmaktadır albicans enfeksiyonu bağımlı Th17 iltihabı. Çünkü T regs yokluğu, Th17 hücre kaynaklı inflamasyon sınırsız ve zayıf çözülmesi İmmünopatolojiye yol açar. In vitro Th17 hücreleri evlatlık transferi için kullanılan olarak polarize naif CD4 hücreleri elde edilen. 40 - kültürlenmiş CD4 + hücrelerinin% 50 3. günde yaklaşık keşfedilebilir IL-17A ifade (Th17 hücreleri) gösterir ve bu nedenle, fareler enjeksiyon için kullanıldı. modelin önemli bir avantajı, Th17 hücreleri verimli bir şekilde regülatör T enjeksiyonu ile iyileştirilebilecek enfeksiyon özel Immunopathology neden olmasıdır. Böylece örnek bir pozitif kontrol olarak regülatör T enjeksiyonu ile bağışıklık-stratejileri test etmek için kullanılabilir. İltihap kolayca enfekte farelerde Th17 hücreleri tarafından kilo kaybı, histopatolojik skorlama ve pro-enflamatuar sitokin üretimine dayalı olarak değerlendirilir.
T sonraO Th17 hücre transferi, bu dil, enfeksiyon primer sitesine de dahil olmak üzere, ikincil lenfoid organların ve çeşitli dokulara göç EVLAT EDİNEN. Enfeksiyondan sonra, diğer inflamatuar hücrelerin de enfeksiyon temizlemek için dil alındılar. Ancak, T reg aracılı immünomodülasyon olmadan, Th17 hücreleri kendilerini enfeksiyonu gidermek, ancak artan Immunopathology neden yoktu. T gruplar gruplar Eş-transferi tamamen inflamasyonu çözüldü. İlginç bir şekilde, T gruplar gruplar yokluğunda kuvvetli hale iltihabı olan fareler, mantar yükü artış gösterdi. Daha önceki rapor bu T gruplar gruplar ile karşılaştırıldığında, farelerde indirgenmiş, IL-17A üretimine bağlı olduğunu göstermiştir. Mevcut deneyler de bağlı muhtemelen artan epitel hücre apoptoz ile, inflamasyon kötüleşti ve mantar yükünü 28 arttı artmış TNF-α olabilir fikrini desteklemektedir. Mukozada IL-17A immünoprotektif etkilerini göz önündeBiz mantar yükünü artan gözlemlemek inflamatuar patoloji Th17 hücreleri veya konak direnci eksikliği tarafından üretilen IL-17A nedeniyle değil inanıyorum. Bu nedeniyle, TNF-α, enjekte edilen, Th17-hücreleri tarafından üretilen, muhtemelen diğer pro-inflamatuar sitokinlere neden olur. / - - Th17 hücrelerinin yoksun fareler sadece asgari inflamasyon ve enfeksiyon sonraki çözünürlük ve sadece Th17 hücreleri ciddi kilo kaybı yenik aldığı bu (Şekil 1) göstermek Bu Rag gözlem tarafından onaylanmış olabilir. - / - Farelerde çok immunopatolojilerinde 27 primer OPC enfeksiyonu temizleyebileceğine bu verilere uyumlu olarak, aynı zamanda daha önce bu Rag gösterilmiştir. - / - Farelerde 17,29,30 Bu koşullar altında, bağımsız IL-17A, doğuştan gelen bağışıklık hücreleri üreten telafi edici mekanizmalar Rag enfeksiyonu temizlemek için gösterilmiştir. IL-17A enfeksiyonu ilk aşamalarında koruyucu rol oynayan Th17 hücreleri ve nötrofil işe tarafından üretilen rağmen, birlikte ele alındığında, excTNF-α ve Th17 hücreleri tarafından diğer sitokinler ve nötrofiller nedenleri sürekli bir şekilde mevcudiyeti ve essive üretim Immunopathology şiddetlenir. Th17-hücreleri tarafından üretilen TNF-α yanında pro-enflamatuar sitokinlerin rolü immunopatolojilerinde bağlamında araştırılması gerekmektedir.
Modelin en önemli sınırlama insan OPC için fizyolojik ilgili olup olmadığı sorusudur. Th17 hücreleri Th17 hücrelerin kronik aktivasyonunun OPC patojenik olup çok sayıda ağız hastalıkları patolojik aracılar olduğu gösterilmiştir birlikte araştırılması gerekmektedir. C rolünü ima son bulgularla iltihap ve kanserde albicans, ağız boşluğu Th17 immünopatoloji araştırma 31 aktif bir alandır. Bu yüzden, burada açıklanan model, daha dikkatli Th17 hücrelerinin spesifik rollerini incelemek için kullanılabilir ve nasıl ağızdan bağışıklık hastalıkları ve ağız kanseri için detaylı bir bakış vermektedir, doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ile etkileşime girer.
tekniği kritik adım, uygun işe alım ve adoptively transfer Th17 hücrelerinin genişlemesi olduğunu. Bu aktarılmadan önce in vitro olarak polarize Th17 hücre canlılığı ve IL-17A üretimi son derece bağlıdır. Bu akış sitometri kendi canlılığı ve sitokin üretimini 19 analizleri test etmek en iyisidir. Th17 hücre enjeksiyonu ve fareler enfeksiyon Uygun yürütme enfeksiyonu bağımlı Th17 İmmünopatolojiye yol açacaktır. Bu model, aynı zamanda diğer enfeksiyonlar bağlamında Th17 Immunopathology ve ağız iltihabı önlemek için stratejiler test etmek için uygulanabilir. Ayrıca, bu modeli kullanarak, bir ikincil yeniden enfeksiyonları gerçekleştirmek ve kronik enfeksiyonların bağlamında Immunopathology exacerbating Th17 hücrelerinin rolü eğitim görebilirsiniz. Bu model, bağışık yetmezliği fareler içerir gibi, kronik Candida enfeksiyonları tekrarlayan muzdarip AİDS ve PID hastalarında, görülen ağız dysbiosis çok alakalı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CAF-2 | University of Pittsburgh (Sarah Gaffen) | - | Candida culture |
| U-bottom 96 well plates | Fisher | 055588 | Used for cell culture |
| a-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| m-IL-6 | Bio Basic | RC232 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| h-TGF-b | R&D | 240-B | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IFN-g | eBiosciences | 16-7311-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IL-4 | eBiosciences | 16-7041-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| α-IL17A ef660 | eBiosciences | 50-7177-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| α-TNFa-PE-Cy7 | eBiosciences | 25-7423-41 | Used for cell culture - 1:100 |
| α-RORgt PE | eBiosciences | 12-6981-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium | Bio Basic | S507.SIZE | Mediium for candida growth |
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4300 | Incubation growth for candida |
| 15 ml tubes | Bio Basic | BT888-SY | Used for cell culture and candida growth |
| 50 ml tubes | Bio Basic | CT 788-YS | Used for cell culture and candida growth |
| Table top Centrifuge | VWR International LLC | 82017-654 | For pelleting candida -900 g |
| Allegra Centrifuge | Beckman Coulter | 392302 | Cell culture - 480 g |
| 1.5 ml eppendorf tubes | Bio Basic | BT620-NS | Preparing final concentration of candida |
| 2x paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixing candida for count |
| Hemocytometer | VWR International LLC | 15170-172 | Counting cells |
| PBS - Phosphate Buffered Saline | Bio Basic | PD8117 | Preparation of buffers |
| Ketamine/xylazine | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | Obtained from ARC approved protocol for anesthesia |
| Ophthalmic lubricant ointment | Allergan | - | Eye ointment for animals to prevent dryness |
| Saline (0.9% NaCl) | G Biosciences | 786-561 | Administerd to animals to prevent dehydration |
| 3-mm-diameter cotton wool ball | VWR International LLC | BP7603 | 3 mm balls for candida infection |
| Heat gel pads | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | for maintaining the body temperaturre and fast recovery |
| Hematoxylin and Eosin staining | Histoserv - MD | - | Tissue histology |
| 10% formalin | Electron Microscopy Sciences | JC1111/MC | Tissue histology |
| 70% ethanol | VWR International LLC | 97064-490 | Sterilization purpose |
| PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | Restimulation of cells |
| Ionomycin | Life Technologies | 124222 1mg | Restimulation of cells |
| Fixation permeabilization kit | eBiosciences | E16913-106 | Fixing cells for Flow cytometry |
| Tuberculin syringes | BD Biosciences | 309659 | Mice injection |
| 25 G x 3/8 needles | BD Biosciences | 309626 | Mice injection |
| Rag1 -/- mice | Jackson laboratories | Stock no: 002216 | Recipient mice |
| CD45.1 congenic mice | Jackson laboratories | Stock no:002014 | Donor Th17 cells |
| CB17-SCID mice | Jackson laboratories | Stock no: 001303 | Recipient mice |
| Balb/c mice | Jackson laboratories | Stock no: 000651 | Donor Th17 cells |
References
- Allam, J. P., et al. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).
- Loesche, W. J. Periodontal disease: link to cardiovascular disease. Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).
- Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. Association between periodontal disease and stroke. Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).
- Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy. Arthritis Research & Therapy. 14 (4), 217 (2012).
- Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In. Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).
- Canabarro, A., et al. Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis. Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).
- Urzua, B., et al. Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets. Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).
- Ergun, S., et al. Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome. Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).
- Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment. Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).
- Gall, F., et al. Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions. The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).
- Grady, J. F., Reade, P. C. Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia. Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).
- Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia. Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).
- Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense. Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).
- Marodi, L., Johnston, R. B. Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms. Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).
- Kumamoto, C. A. Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In. Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).
- Kraneveld, E. A., et al. The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults. PloS One. 7 (8), e42770 (2012).
- Hernandez-Santos, N., et al. Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).
- Hasina, R., et al. ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis. Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).
- Pandiyan, P., et al. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model. Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).
- Pandiyan, P., et al. The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes. J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).
- Pandiyan, P., Lenardo, M. J. The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival. Biology Direct. 3 (6), (2008).
- Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells. Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., et al. Animal models for candidiasis. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. 105, 11-19 (2014).
- Conti, H. R., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
- Kamai, Y., et al. New model of oropharyngeal candidiasis in mice. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).
- Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. Isolation of T cells from mouse oral tissues. Biological Procedures Online. 16 (1), 4 (2014).
- Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
- Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation. International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).
- Bishu, S., et al. The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).
- Quintin, J., et al. Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice. Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).
- Ramirez-Garcia, A., et al. Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression. Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).
