Summary
O peixe-zebra é uma ferramenta popular para modelar doença renal crônica (DRC). No entanto, seu pequeno tamanho torna impossível avaliar a função renal através de métodos tradicionais. Nós descrevemos um teste de eliminação fluorescente rim corante 1, que permite a análise quantitativa da função renal zebrafish em CKD.
Abstract
O embrião de peixe-zebra oferece um modelo tratável para estudar a organogênese e modelo de doença genética humana. Apesar da sua relativa simplicidade, o rim do peixe-zebra e desenvolve funções em quase da mesma maneira como os seres humanos. Uma diferença importante na construção do rim humano é a presença de milhões de nefrónios em comparação com o peixe-zebra que possui apenas dois. No entanto, simplificando um sistema tão complexo em unidades funcionais básicas ajudou nossa compreensão de como o rim desenvolve e opera. No peixe-zebra, a linha média localizada glomérulo é responsável pela filtragem do sangue inicial em duas túbulos pronephric que divergem para funcionar bilateralmente a partir do eixo embrionário antes da fusão para o outro na cloaca. Os túbulos pronephric são fortemente povoada por cílios motilidade que facilitam a circulação de filtrado ao longo do túbulo segmentada, permitindo a troca de vários solutos antes de finalmente sair através da cloaca 2-4. Muitos genes responsáveis pela DRC, including aqueles relacionados à ciliogênese, têm sido estudadas em peixes-zebra 5. No entanto, um grande atrativo para trás tem sido a dificuldade em avaliar a função renal zebrafish após manipulação genética. Ensaios tradicionais para medir a disfunção renal em humanos provaram não translacional de peixe-zebra, principalmente devido ao seu ambiente aquático e pequeno porte. Por exemplo, não é fisicamente possível para extrair sangue de peixes embrionários encenado para análise do teor de ureia e creatinina, como eles são muito pequenos. Além disso, o peixe-zebra não produzem urina suficiente para testar em um simples proteinúria 'vareta', que muitas vezes é realizado durante os exames iniciais dos pacientes. Descreve-se um ensaio fluorescente que utiliza a transparência óptica do peixe-zebra para monitorar quantitativamente a depuração de um corante fluorescente, ao longo do tempo, a partir da vasculatura e para fora através do rim, para dar uma leitura de função renal 1,6-9.
Introduction
O rim humano desempenha um papel crucial na filtragem de resíduos metabólicos do sangue e recuperando os solutos necessários para manter a homeostase celular. Há um número de doenças genéticas humanas que causam disfunção renal. A doença renal hereditária mais comum é a doença renal policística autossómica dominante (ADPKD) caracterizada pelo desenvolvimento de sacos cheios de fluido dentro dos túbulos nefríticos; os danos causados por cistogénese é prejudicial para a função renal a 10. ADPKD tem uma ocorrência de 1: 800-1: 1000 e responsável por 8 - 10% de doentes com insuficiência renal em fase terminal (ESRF) 11. Vários genes têm sido implicados para causar ADPKD incluindo policistina-1 (PKD1) e -2 (PKD2), representando cerca de 85% e 15% dos casos, respectivamente, 12,13. Além disso, os produtos do gene PKD1 para localizar e -2 para o cílio e são fundamentais para ciliogênese 14,15. Existe agora uma família reconhecida de doenças genéticas humanas, conhecidas comoos ciliopathies, que afetam a função dos cílios e resultam em CKD 16.
O crescente número de doenças genéticas humanas que afetam o desenvolvimento e função ciliar está despertando o interesse global nesta organela vestigial uma vez considerado. O cílio, uma saliência celular cabelo semelhante, é enriquecido com os receptores e canais necessários para a transdução de eventos de sinalização celular chave de iões. O cílio consiste de um axoneme à base de microtúbulos, normalmente estruturada em nove duplas de microtúbulos dispostos radialmente com ou sem um par central de microtúbulos singletos. A estrutura axonemais define o tipo e modo de acção ciliar. O arranjo de microtúbulos 9 + 2 confere a motilidade do cílio, onde é utilizada no movimento de fluidos através de superfícies epiteliais. A configuração 9 + 0 é não móveis, mas acredita-se principalmente a função em eventos de sinalização celular 17. Além de CKD, as conseqüências da disfunção ciliar são um conjunto de característicasciliopathy características que incluem, obesidade, degeneração da retina, polidactilia, e disfunção cognitiva 16. No entanto, a DRC está entre as mais prejudiciais para a qualidade de vida do paciente e, portanto, uma importante força motriz por trás do desenvolvimento adequado em modelos in vivo para ciliar relacionado CKD.
O peixe-zebra é um excelente modelo para compreender a etiologia da doença genética humana. O seu desenvolvimento rápido, a produção de um grande número de ovos, tecido transparente, e crescimento ex utero permite que os processos de desenvolvimento de peixe-zebra para ser visualizado e eventos biológicos manipulados com facilidade considerável. Genes podem ser geneticamente alterada usando o recente sucesso de ferramentas de edição do genoma (CRISPR 18 e TALENS 19), derrubou usando antisense tecnologia morfolino 20, ou farmacologicamente regulado pela adição de compostos ao seu ambiente aquático. De fato, peixe-zebra oferecer uma plataforma para realizar experiments que não são permissivas em outros modelos animais. Embora peixe-zebra são animais vertebrados relativamente simples (em comparação com os seres humanos) que partilham muitos órgãos funcionalmente conservadas, genes e processos de sinalização em comum com os seres humanos. Por exemplo, o rim do peixe-zebra é notavelmente semelhante em estrutura e função de comparação para os seres humanos 21,22. No entanto, ao contrário do rim de mamíferos que se desenvolve através de uma sucessão de fases, cada uma marcada por um rim mais desenvolvida (pronephros, mesonephros e metanephros), o peixe-zebra embrionário desenvolve apenas um pronephros, a forma mais imatura de um rim. Enquanto milhões de nefrónios podem ser encontrados formando os blocos de construção de rim de mamífero, o embrião do peixe-zebra possuem apenas dois. Os glomérulos, que permitem o filtrado do sangue inicial, são fundidos na linha média ventral apenas para a aorta. Filtros de sangue através dos glomérulos nos túbulos pronephric que correm caudalmente ao longo do eixo, fundindo antes de sair através da cloaca. O pronephric tutúbulos são fortemente ciliada com cílios motilidade que são permissivas para o fluxo de filtrado para o caudal de saída de 3,4. Esta estrutura pronephric simples mantém a homeostase do peixe-zebra através de várias semanas de crescimento larval onde eventualmente evoluir para uma estrutura mais complexa mesonephros 21. No entanto, o peixe-zebra nunca desenvolve um metanephros 21. Apesar das idiossincrasias de peixe-zebra, o néfron peixe-zebra é segmentado, com perfis de expressão gênica iguais aos observados em mamíferos e, portanto, oferece uma inigualável no modelo vivo para nefrogênese 3,22.
Rotineiramente, os pacientes são testados quanto à função renal através de uma série de análises de sangue e urina. Tipicamente, o sangue é analisado por sais dissolvidos, ureia e creatinina. Altos níveis de ureia, creatinina e concentrações anormais de sal são indicativas de problemas com a função renal. O exame de urina usando uma vareta colorimétrico detecta níveis anormais de proteínas, Blood, pus, bactérias e açúcar presente em amostras de urina. Tais ensaios requerem normalmente cerca de 30 ml de urina ou de 5 - 10 ml de sangue. Tem sido difícil de traduzir estes tipos de ensaios para pequeno em organismos modelo in vivo, tais como o peixe-zebra, principalmente devido à natureza impossível de recolha de sangue ou de urina suficiente para realizar o ensaio. Aqui, vamos abordar a falta de testes de função do rim zebrafish adequadas e descrever uma técnica inovadora para o seu estudo. Ao injectar um corante fluorescente para a corrente sanguínea que são capazes de monitorizar e quantificar individualmente ao longo do tempo a filtração e a excreção de actividade fluorescente a partir do sangue pelo rim. Este método pode ser usado para estudar os danos causados por doença renal, que fornecem um exemplo de.
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Protocol
Declaração de Ética: Animal de manutenção, criação e procedimentos são definidos e controlados pelos Animais (Scientific Procedures) Act de 1986. Todos os experimentos com animais foi efectuada ao abrigo de licenças concedidas pelo Ministro da Administração Interna (PIL No. 70/7892), em conformidade com Biológica Serviços de Gestão do Grupo e da Comissão de Ética do Serviço Biológica, SGUL, Londres, Reino Unido. Foram feitos todos os esforços para reduzir o número de animais utilizados para refinar e ambos os procedimentos e pecuária, a fim de minimizar o sofrimento e melhorar o bem-estar.
1. Preparação de Instrumentos, anestésico, e corante fluorescente
- Usando um extractor de micropipeta e capilares padrão de borosilicato de parede (sem filamentos) puxam agulhas de comprimento adequado para microinjecção (Figura 1A).
- Fazer um molde de agarose para orientação de embriões para injecção fácil no pericárdio (Figura 1B). Glue aproximadamente dez vidro microscópio slides juntos para formar uma "escada" de lâminas de compensado. Para melhores resultados, usar uma gota de cola de resina epoxi rápida conjunto no centro de cada lâmina.
- Cortar uma seção de aproximadamente 78 mm de comprimento no meio duas pipetas de 10 ml de plástico com um bico de Bunsen bisturi aquecido, remova pipeta termina conforme o caso. Encaixe e secções de cola (resina epóxi) de pipeta para as lâminas de vidro empilhadas para proporcionar estabilidade para permitir que o molde de mergulhar em uma placa de Petri de 90 mm. Faça todos os esforços para garantir os cantos de slides alinhar perpendicular ao chão placa de Petri. Dê tempo cola para definir.
- Lançar o molde em uma solução de agarose 2% feita em peixes de água (obtido a partir do aquário). Pour agarose em uma placa de Petri de 90 milímetros e colocar o molde por cima do prato de Petri abertas, permitindo que a lâmina de orlas empilhadas para submergir num ângulo abaixo da superfície de agarose. Deixar para definir sobre a bancada do laboratório durante 30 minutos.
- Retirar o elenco slide e cobrir a agarose impressa-slide com água peixe frescocontendo tricaina anestésico (veja o passo 1.9) a uma razão de 1:25.
- Faça soluções de rhodamine dextrano corante (RD). Ressuspender rodamina B 10.000 MW marcado de dextrano em água ultrapura esterilizada para fazer uma concentração de estoque de 50 mg / ml. Para micro-injecção, dilui-se ainda mais o material a uma concentração final de 5 mg / ml em água ultrapura esterilizada.
NOTA: Pigmentado células começam a se diferenciar no peixe-zebra a partir de 24 horas pós fecundação (hpf); estes podem obscurecer marcadores fluorescentes na aquisição da imagem. - Inibir a formação de melanócitos usando N -Phenylthiourea (PTU), que bloqueia a melanogênese através da inibição da tirosinase. Adicione uma solução de estoque de 0,003% do PTU dissolvendo PTU pó em água do aquário, solução de calor a 60 ° C para solubilizar por completo.
- Incubar embriões de peixes-zebra em solução de azul de metileno, um fungicida leve, para evitar blooms fúngicas e aumentar a sobrevida. Adicionar 2 ml de solução de estoque de azul de metileno, contendo 0,1% de azul de metileno em uágua ltrapure, para 1 L de água do aquário e utilização como meio de embrião padrão.
- Certifique-se uma concentração de estoque 15 mM de tricaina sal metano / acetato de 3-aminobenzoate conforme as instruções em 'O Livro Zebrafish »23. Anestesiar os embriões e, consequentemente, eles imobilizadas para executar o procedimento de microinjecção.
- Depois de anestesiar os embriões, orientá-los, para geração de imagens usando as propriedades não-tóxicos e viscosos de metilcelulose. Para fazer uma preparação de 3% de metilcelulose 200 ml, chill 130 ml de água à temperatura de -20 ° C durante 30 minutos e colocar em gelo. Aquecer 70 ml de água a 80 ° C numa proveta de vidro, adiciona-se 6 g de metilcelulose, e agita-se usando uma vareta de vidro, até que todas as partículas são molhadas e uniformemente dispersas. Adicionar a água com gelo, mistura, e permitir que a preparação para arrefecer a 4 ° C durante 30 min antes de alíquotas em tubos de 50 ml.
NOTA: A redução da temperatura permite a metilcelulose para se tornar solúvel. A solução torna-se mais espessacomo os hidratos de pó. Metilcelulose a 3% pode ser armazenado sem o crescimento bacteriano por curtos períodos de uma semana a 4 ° C ou mais, à temperatura de -20 ° C. Certifique-se a metilcelulose atingiu RT antes do uso. - Para realizar injecções de corante fluorescente para o peixe-zebra usar microinjecção um set-up padrão (Figura 1C). Este é constituído por um compressor de ar ligado a um sistema regulador de pressão que alimenta um suporte pipeta linear para utilização com 1,0 de diâmetro exterior capilares. O titular da pipeta devem ser alojados dentro de um compacto micromanipulator controle de 3 eixos MM33 preso a uma placa de base de aço por um suporte magnético. Os embriões podem ser visualizados, manipulados e injectados utilizando um microscópio de dissecação estéreo.
2. Zebrafish Pecuária e Tratamento Pré-injeção
- Manter peixe-zebra, como previamente descrito 23. Use um aquário set-up que fornece água de recirculação fornecido a uma temperatura constante de 28,5 ° CCondicionadas ao pH 6,8-7,2 e condutividade de 450-550 uS com bicarbonato de sódio e Instant Oceano Mar Salgado, respectivamente. Use wildtype ou linhas de peixes-zebra transgénicos, conforme apropriado para o experimento, mantendo uma densidade de 15 machos e 15 fêmeas por 8 L tanque. Defina o photocycle facilidade de peixe para 14 horas de luz do dia entre 09:00-23:00.
- Desova do peixe-zebra começa no início do photocycle, quando as luzes se acendem na parte da manhã. Para garantir o máximo de ovos podem ser recolhidos, sem perturbar o peixe, submergir tanques de criação (que contêm inserções de malha, disponíveis a partir de especialistas de peixe-zebra) em tanques de estoque de tipo selvagem a noite antes da coleta.
- No dia da coleta, permitir que 30 - 40 min para os peixes para a desova, após o que coletar e enxaguar ovos usando um coador de chá e água do aquário fresco. Depositar os ovos limpos em um meio contendo embrião 90 milímetros placa de Petri e incubar a 28,5 ° C.
- Trate os embriões com PTU para inibir melanogênese. Às 8 hpf, transferir embriões viáveis em líquido mínimo para placas de Petri fresco com 1: 100 PTU e médio embrião e mais incubar a 28,5 ° C até 72 hpf.
NOTA: PTU pode causar defeitos de desenvolvimento, se usado em fases anteriores por isso deve ser limitado ao postar 8 etapas HPF, mas pode ser tratada tão tarde quanto 24 hpf. Além Late of PTU não bloqueia totalmente a pigmentação do olho, mas é geralmente bem sucedido e inibir a formação de tronco dos melanócitos.
3. Microinjection
NOTA: O pericárdio envolve o coração, mas é separado para a proteção e facilidade de movimento cardíaco por fluido no interior da cavidade do pericárdio. O objectivo deste procedimento é injectar RD na cavidade pericárdica, isto permite a absorção rápida do corante para o sistema vascular.
- Agulhas carga com 6 ul - diluída RD, usando dicas Microloader e seguro no porta-agulha da micromanipulator. Quebre a ponta da agulha usando tipp multafórceps ED (Figura 1A). Mova a solução RD à ponta da agulha, maximizando duração do pulso para a definição dos minutos, voltar para milisegundos, uma vez concluída.
- Usar um micrómetro de plataforma, o regulador de pressão, e refinamentos de comprimento de ponta de agulha (utilizando pinças) para ajustar o tamanho da gotícula expelido a 100 um de diâmetro, isto equivale a um volume de 0,5 nl (Figura 2A).
NOTA: Ao quebrar a agulha, tenha cuidado para não quebrar muito off caso contrário ele irá fazer a calibração do volume de injeção difícil. Se necessário, quebrar a ponta da agulha ainda mais para aumentar o tamanho de gota no entanto, manter uma espessura que permite a entrada da agulha no pericárdio sem uma curvatura excessiva ou danos no tecido. - Antes da injecção, anestesiar os embriões em meio contendo tricaina embrião. Configure 2 x 35 milímetros placas de Petri contendo 5 ml de meio de embrião, uma etiqueta do 'tricaina' eo outro 'Recovery'.
- Adicionar 200ul de estoque tricaina ao prato devidamente rotulados. Uma vez pronto para injetar, selecionar um embrião humano no 72 hpf e transferir em líquido mínimo para o prato tricaina. Monitorizar a actividade do embrião, o embrião é testar anestesiados e imobilizados por agitação suave usando uma ponta microloader truncado.
- Transferir o embrião anestesiado para o molde de injecção e orientação do embrião dentro de uma calha de agarose de modo que o lado esquerdo está virada para cima, o posicionamento do coração para a esquerda do campo de visão.
- Para injectar a RD para o coração, o pericárdio perfurar com a agulha e injectam-se 1 nl de RD na cavidade pericárdica do embrião anestesiados (Figura 2B, painel da direita). Retire a agulha após a injeção. Transferir o embrião injectado no líquido mínimo para o "prato de recuperação 'e monitorar durante 1 min. Transferência do embrião individual a uma placa de 24 poços contendo 1 ml de meio de embrião fresco (contendo o PTU) e etiqueta apropriadamente.
NOTA: O pericárdio é difícil, no entanto, há um ponto fraco notável no cruzamento onde o pericárdio atende aos arcos faríngeos ventro-caudal e dorso-rostral saco vitelino (Figura 2B ponta de seta). A agulha deve ser direcionado para este groove. Quando a agulha está no lugar, uma torneira firme de um dedo na parte superior do micromanipulador vai facilitar a entrada na cavidade pericárdica. - Repita os passos de 3,2-3,6 por pelo menos 10 embriões por grupo experimental, coloque cada peixe em um bem separado e exclusivamente labelto autorização individuais experimentais follow-ups. Incubar a 28,5 ° C durante 3 h.
4. Imaging Acquisition
- Às 3 horas pós injeção (HPI) anestesiar embriões como descrito anteriormente e transfira para um prato de 35 milímetros Petri contendo 3% de metilcelulose. Com cuidado, empurre embriões na metilcelulose e orientar para que o lateral pode ser trabalhada.
- Adquirir uma imagem do embrião sob UV, utilizando um filtro para o visualizaçãof a luz emitida a 570 nm (Figura 2C). Após a aquisição da imagem, permitir que o embrião para se recuperar antes de substituir no poço designado. Aquisição de imagens para todos os embriões injetados e mais incubar a 28,5 ° C.
NOTA: Neste protocolo foi utilizado um microscópio estereoscópico fluorescente com um conjunto de filtros TXR, uma câmera DFC300FX e respectivo software aplicativo. Anote as configurações de aquisição exatas para aquisição de imagem subsequente. - Aos 24 hpi, adquirir uma segunda rodada de imagens como descrito acima. Uma vez que todas as imagens foram adquiridas, tanto a 3 hpi e 24 hpi, humanamente descarte dos embriões ou utilização para outros meios experimentais, por exemplo, imuno-histoquímica.
5. Processamento de Imagem
- Quantificar intensidade de fluorescência de cada embrião injetado, em 3 hpi e 24 hpi, através da análise de imagens usando o software ImageJ do NIH. Para medir a intensidade de fluorescência, abra uma imagem em ImageJ e especificar uma região de interesse (ROI) a 100 px 2 (Edit → seleção → especificar).
- Posicione o coração no centro do roi (Figura 2C), definir as medidas a incluir escala de cinza médio e área (Analisar → medições de conjunto), efectuar a medição (Analisar → medida). Completar para cada conjunto de imagens, em 3 hpi e 24 hpi, por embrião e transferir valores médios de escala de cinza para uma folha de cálculo para posterior processamento.
NOTA: Nós selecionamos um tamanho roi fixa de 100 px 2 como esta engloba corações individuais entre embriões. O coração foi escolhido para realizar medições, devido ao seu grande tamanho que permite uma localização conveniente para medir o teor de fluorescência do sangue antes de entrar no rim. - Realizar a análise estatística usando o software estatístico adequado. Compare grupos para significância estatística usando o teste t de um estudante.
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Representative Results
A síndrome de Bardet-Biedl (BBS) é um ciliopathy heterogêneo rara que afeta cerca de 1: 160 mil pessoas em todo o mundo 16. Os pacientes apresentam uma série de problemas associados, incluindo rins policísticos, posteriormente pacientes frequentemente necessitam de diálise ou transplante renal 24. ESRF é a causa mais comum de morte em BBS, com cerca de 30% dos pacientes em desenvolvimento CKD 16. Actualmente, 20 genes não relacionados têm sido implicados em BBS sem associação genótipo-fenótipo publicada. As proteínas BBS compartilhar domínios localização de proteínas comuns no âmbito das instâncias cilium e basal que, juntamente com os traços característicos dos pacientes, inferir um diagnóstico ciliopathy. BBS9 codifica B1 Parathyoid Hormone-responsive proteína (PTHB1) que, juntamente com outro BBS (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) proteínas formam o núcleo BBSome complexo responsável pela formação do cílio primária 24. Mutações em conta BBS9 para 6% do BBS cases 24. Além disso, a PTH tem sido implicada na formação de quistos nos rins, através da promoção da proliferação de células do epitélio renal, o que sugere que a perda de função bbs9 no peixe-zebra pode exibir defeitos renais 25. Os relatórios anteriores usando um modelo de peixe-zebra bbs9 knockdown excluir uma descrição do rim, apresentando a oportunidade de demonstrar o ensaio de função renal descrito 26. Knockdown da função bbs9 foi conseguida através da injecção no peixe-zebra, na fase de 1 a 4 células, um morfolino anti-sentido para bloquear a tradução de genes específicos bbs9 e em paralelo um controlo negativo morfolino padrão contra uma mutação em intrónica humano beta-globina (4 ng bbs9 MO, seqüência: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA e controle 4 ng MO, seqüência: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). Nós descobrimos que a perda da função bbs9 resultou em 40% dos embriões que apresentam cistos pronephric por 5 dpf, sugerindo que este foi um modelo apropriado para analisarfunção renal utilizando o teste de eliminação de dextrano rodamina. Observou-se que os peixes morphant têm uma redução significativa na sua capacidade para limpar o corante fluorescente depois dos 24 hpi comparação com os controlos (Figura 3) - con: 14,8 ± 1,2 SEM, n = 9; MO bbs9: 61,0 ± 10,3 SEM, n = 10 ; desemparelhado valor P t-teste: 0,002). Para descartar a possibilidade de que uma redução da depuração poderia ser devido à diminuição da circulação sanguínea, os embriões foram avaliados para células batimentos cardíacos e sanguíneos de recirculação, tanto o controle e peixes morphant teve freqüência cardíaca comparável e fluxo sanguíneo. Estes dados indicam que a função renal está prejudicada em morphants bbs9. De fato, os embriões morphant bbs9 desenvolver túbulos pronephric císticas simultâneas com o observado em pacientes BBS.
Figura preparação 1. Equipamentose set-up. Capilares (A) de borosilicato deve ser puxado para microinjeção usando um extrator de agulha apropriada. A agulha é necessário acabar com uma pinça (linha tracejada) para permitir a RD para sair da agulha, deve-se tomar cuidado para não quebrar a agulha muito render uma agulha que não pode ser calibrado. Barra de escala:. 200 mm (B) Um molde de agarose para a manipulação de embriões e orientação pode ser formado colando lâminas de vidro e pipetas de plástico (C) O padrão microinjeção set-up.. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
Figura 2. Microinjeção de rhodamine dextrano no saco pericárdio. (A) Calibrar o tamanho de gota a 10 incexigên- (100 mm) em um palco retícula de 1 mm. (B) O posicionamento correto da agulha (setas pretas) para a marcação a intersecção entre o arco faríngeo caudal, saco vitelino e coração vai facilitar a perfuração do tecido (seta) fenda. Barra de escala:. 200 mm (C) Rhodamine dextrano pode ser visto rapidamente absorvido por toda a vasculatura (setas brancas). 100 px duas regiões de interesses abrangendo um coração centralizado (quadrado amarelo) deve ser usado para fazer medições de o valor de cinza médio e, portanto, de pixel / intensidade de fluorescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Knockdown de bbs9 provoca defeito func rimção no peixe-zebra. (A) Os embriões injectados no pericárdio com rodamina dextrano a 3 hpi e 24 hpi, topo e fundo de dois painéis, respectivamente, em qualquer controlo ou embriões bbs9 morphant. As setas indicam o coração; seta indica a formação de um quisto pronephric. (B) Percentagem de intensidade fluorescente depois de 24 hpi remanescente no controle versus embriões bbs9 MO. As barras de erro mostrar o erro padrão da média (SEM), ** P ≤ 0,01. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Zebrafish oferecer uma ferramenta valiosa para modelar doença genética humana, a sua utilização como um instrumento científico para a pesquisa in vivo têm permitido estudos detalhados sobre a repartição genética de muitos sistemas biológicos, incluindo o rim. Muito se agora sabe sobre como o rim zebrafish desenvolve e funções. As semelhanças com nefrogênese humana e homologia com a doença que causa genes 21 ilustrou como peixe-zebra tornaram-se fundamentais na compreensão de como defeitos em função do gene levam à patologia da doença renal. Na verdade, a manipulação genética pode ser facilmente alcançado em peixes-zebra usando antisense morfolino tecnologia knockdown ou ferramentas de edição do genoma segmentado mais avançadas, como TALENS ou CRISPR. Criando modelos knockdown ou mutantes por suspeita de doença renal causando genes é o primeiro passo para entender a sua participação na manifestação da doença. Para fazer isso um ensaio confiável para a função renal é procuradopara indicar se um gene candidato é provavelmente responsável pela patologia observada em pacientes.
Testes da função renal são simples e relativamente barato para executar em seres humanos, em geral, olhando para os níveis de solutos presentes no sangue ou na urina. No entanto, estes métodos são inaplicáveis no peixe-zebra, devido ao seu pequeno tamanho e habitat aquático. O ensaio de dextrano rodamina descrito aqui utiliza a capacidade dos túbulos pronephric para filtrar os componentes de baixo peso molecular a partir do sangue. Os podócitos posicionado dentro da cápsula de Bowman do rim, envelopes que os capilares do glomérulo, permitir a passagem livre de moléculas pequenas tais como água, sais iónicos e glicose através de um diafragma de fenda 27. As fendas de filtração funcionar mais para prevenir a perda de proteínas macro a partir do sangue. A filtração é restrito para as moléculas acima de 5 kDa e quase completamente bloqueado com o tamanho de albumina de soro de 28 (aproximadamente0; 65 kDa). Ao injectar um corante fluorescente dextrano de cerca de 10 kDa, a uma concentração conhecida na cavidade pericárdica, que é capaz de medir a intensidade de fluorescência do sangue ao longo do tempo. Sob condições normais, cerca de 85% de fluorescência inicial é perdido a partir do sangue, ao longo de um período de 24 horas, através de secreção por via renal. Note-se que a injeção no espaço pericárdico somente é possível com baixo dextrano MW que passa livremente na vasculatura. Assim, este ensaio só dá a ler-out para a taxa de depuração para componentes de baixo peso molecular e não dá qualquer informação sobre a eficácia de filtração glomerular. Este último pode ser avaliada utilizando mais directamente corantes de elevado peso molecular superior a 70 kDa, exigindo a injecção no sistema vascular e não para o espaço pericárdico. Com efeito, dextranos de vários MW podem ser usados para dissecar ainda mais a função renal 28.
Os túbulos pronephric peixe-zebra são altamente ciliada com mocílios telha que facilitam o movimento do filtrado para a cloaca 3,4. Defeitos em máquinas ciliar têm sido implicadas na doença renal. BBS é um, autossômica recessiva desordem geneticamente heterogênea, caracterizada pela degeneração da retina de início na infância, obesidade início precoce, disfunção cognitiva, polidactilia e malformação renal 24. Até à data, 20 genes BBS (BBS1-20) foram identificadas. Rompimento de bbs leva à formação de cisto renal e função pronephric defeito no peixe-zebra 9. BBS9 interage com outras proteínas BBS para formar a BBSome responsável por ciliogênese apropriado, mutações de que são responsáveis por 6% da BBS 24 casos. Enquanto um modelo bbs9 knockdown peixe-zebra tem sido relatada, uma descrição do fenótipo renal faltava 26. Por derrubar bbs9 no peixe-zebra, utilizando a abordagem morfolino, que demonstram a utilização do ensaio de eliminação renal como um método para determinara função renal em um modelo de doença renal. Aqui, nós mostramos que os embriões bbs9 morphant exibir apuramento fluorescente impedido de o fluxo de sangue, o que indica que o rim não conseguiu remover solutos baixo PM. Assim, devido ao envolvimento de bbs9 em ciliogênese, e o papel dos cílios pronephric em facilitar o movimento filtrado, o apuramento do rim observado em morphants é provável que seja devido à função dos cílios aberrante. Este método representa um instrumento valioso para a avaliação da função renal em modelos de doenças de peixes-zebra.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A assistência técnica fornecida por Jaipreet Bharj. Este trabalho foi apoiado por subsídios da UE-FP7 (SYSCILIA -241.955) e The Dutch Kidney Foundation (CP11.18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
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