Summary
Zebrafisken er et populært værktøj til at modellere kronisk nyresygdom (CKD). Deres lille størrelse gør det imidlertid umuligt at evaluere nyrefunktionen ved hjælp af traditionelle metoder. Vi beskriver et fluorescerende farvestof nyre clearance assay 1, der tillader kvantitativ analyse af zebrafisk nyrefunktion i CKD.
Abstract
Zebrafisken embryo tilbyder en medgørlig model til at studere organogenese og modellere menneskelig genetisk sygdom. På trods af sin relative enkelhed, den zebrafisk nyre udvikler og funktioner i næsten samme måde som mennesker. En væsentlig forskel i konstruktionen af det humane nyre er tilstedeværelsen af millioner af nefroner forhold til zebrafisk, der kun har to. Men forenkling et så komplekst system, i grundlæggende funktionelle enheder har hjulpet vores forståelse af, hvordan nyrerne udvikler og driver. I zebrafisk, midterlinjen placeret glomerulus er ansvarlig for den indledende filtrering blod i to pronephric tubuli, der afviger køre bilateralt ned embryonale akse, inden den brændes til hinanden på kloakken. De pronephric tubuli er stærkt befolket af bevægelige cilier, der letter bevægelsen af filtratet langs segmenterede tubulus, mulighed for udveksling af forskellige opløste stoffer, før endelig kommer ud via kloakken 2-4. Mange gener, der er ansvarlige for CKD, including dem, der vedrører ciliogenesis, er blevet undersøgt i zebrafisk 5. Men en større draw back har været vanskeligheden ved at vurdere zebrafisk nyrefunktion efter genetisk manipulation. Traditionelle assays til måling af nyre dysfunktion hos mennesker har vist sig ikke translationel til zebrafisk, hovedsagelig på grund af deres vandmiljø og lille størrelse. For eksempel er det ikke fysisk muligt at udtrække blod fra embryonale trinvis fisk til analyse af urinstof og kreatinin indhold, da de er for små. Hertil kommer, at zebrafisk ikke producerer nok urin til at teste på en simpel proteinuri 'oliepinden «, som ofte udføres under indledende patientundersøgelser. Vi beskriver et fluorescerende assay, der anvender optisk transparens af zebrafisk til kvantitativt at overvåge clearance af et fluorescerende farvestof, over tid, fra vaskulaturen og ud gennem nyrerne, for at give en udlæsning af nyrefunktionen 1,6-9.
Introduction
Den humane nyre spiller en afgørende rolle i filtrering metaboliske affald fra blodet og udvinding nødvendige opløste til at opretholde cellulær homøostase. Der er en række genetiske sygdomme hos mennesker, der forårsager nyresvigt. Den mest almindelige arvelig nyresygdom er autosomal dominant polycystisk nyresygdom (ADPKD), kendetegnet ved udviklingen af væskefyldte sække inden nefrotisk tubuli; skader forårsaget af cystogenesis skader nyrefunktionen 10. ADPKD har en forekomst på 1: 800 til 1: 1.000 og udgør 8 - 10% af patienterne i slutstadiet nyresvigt (ESRF) 11. Adskillige gener er blevet impliceret at forårsage ADPKD herunder polycystin-1 (pKD1) og -2 (PKD2), der tegner sig for ca. 85% og 15% af tilfældene henholdsvis 12,13. Desuden genprodukterne til pKD1 og -2 lokalisere til cilium og er væsentlige for ciliogenesis 14,15. Der er nu en anerkendt familie af humane genetiske sygdomme, kendt somde ciliopathies, som påvirker cilia funktion og resulterer i CKD 16.
Det stigende antal humane genetiske sygdomme hos ciliaere udvikling og funktion er at trække den globale interesse for denne engang betragtet vestigial organel. Den cilium, et hår-lignende cellulære fremspring, er beriget med receptorer og ionkanaler, der er nødvendige for transduktionen af vigtige celle signalering begivenheder. Den cilium består af en mikrotubulus-baserede axoneme, typisk opdelt i ni radialt anbragte mikrotubulus dubletter med eller uden en central par af singlet mikrotubuli. Den axonemal struktur definerer typen og tilstanden af ciliær handling. Den 9 + 2 mikrotubuli arrangement giver motilitet til cilium hvor den er brugt i bevægelsen af væsker tværs epitelial overflader. Den 9 + 0 konfiguration er ikke motil men menes hovedsageligt funktion i cellulære signaleringsbegivenheder 17. Bortset fra CKD, konsekvenserne af ciliære dysfunktion er et sæt af karakteristiskciliopathy funktioner, der omfatter, fedme, retinal degeneration, polydaktyli og kognitiv svækkelse 16. Men CKD er blandt de mest skadelige for patientens livskvalitet og dermed en væsentlig drivkraft bag udviklingen af relevante in vivo modeller for ciliær relaterede CKD,.
Zebrafisken er en fremragende model til at forstå ætiologien af human genetisk sygdom. Deres hurtige udvikling, produktion af store antal æg, gennemsigtige væv, og ex utero vækst giver zebrafisk udviklingsprocesser skal visualiseres og biologiske begivenheder manipuleret med stor lethed. Gener kan være genetisk ændret ved hjælp af den seneste succes af genom redigeringsværktøjer (CRISPR 18 og Talens 19), bankede ned ved hjælp antisense morpholino teknologi 20, eller farmakologisk reguleret ved tilsætning af forbindelser til deres vandmiljøet. Faktisk zebrafisk tilbyder en platform til at foretage experiments, der ikke er eftergivende i andre dyremodeller. Mens zebrafisk er relativt simple hvirveldyr (i forhold til mennesker) de deler mange funktionelt konserverede organer, gener og signaleringsprocesser fælles med mennesker. For eksempel zebrafisk nyre er bemærkelsesværdigt ens i struktur og funktion i forhold til mennesker 21,22. Men i modsætning til pattedyr nyre, der udvikler sig gennem en række faser, der er markeret med en mere udviklet nyre (pronephros, mesonephros og metanephros) kun embryonale zebrafisk udvikler en pronephros, de mest umodne form af en nyre. Mens millioner af nefroner kan findes danner byggestenene i pattedyrs nyre, kun zebrafisk embryo besidde to. Glomeruli, som tillader den oprindelige blod filtratet er fusioneret ved midterlinjen lige ventrale til aorta. Blodfiltre gennem glomeruli i de pronephric tubuli, der kører kaudalt langs aksen, fusing før afslutte via kloakken. Den pronephric tubules er stærkt cilierede med bevægelige cilier, som er tolerante for strømmen af filtratet i den bageste udgang 3,4. Denne enkle pronephric struktur opretholder zebrafisk homeostase gennem flere ugers larvernes vækst, hvor de til sidst udvikler sig til en mere kompleks mesonephros struktur 21. Imidlertid zebrafisk aldrig udvikler en metanephros 21. På trods af de zebrafisk idiosynkrasier, er zebrafisk nephron segmenteret med genekspressionsprofiler lig, der blev observeret i pattedyr og dermed giver en uovertruffen in vivo model for nephrogenesis 3,22.
Rutinemæssigt patienter testes for nyrefunktion gennem en række af blod og urin tests. Typisk blodet analyseres for opløste salte, urinstof og kreatinin. Høje niveauer af urinstof, kreatinin og unormale saltkoncentrationer er vejledende problemer med nyrefunktionen. Urinanalyse hjælp af en kolorimetrisk oliepinden registrerer unormale niveauer af protein, Blood, pus, bakterier og sukker til stede i urinprøver. Sådanne test kræver normalt ca. 30 ml urin eller 5 - 10 ml blod. Det har været vanskeligt at omsætte disse typer assays til lille in vivo-model organismer, såsom zebrafisk, hovedsagelig på grund af det umulige karakter samle tilstrækkeligt blod eller urin for at udføre analysen. Her fat vi manglen på egnede zebrafisk nyre funktionstest og beskrive en innovativ teknik til sin undersøgelse. Ved at injicere et fluorescerende farvestof i blodet er vi i stand til at overvåge og individuelt kvantificere over tid filtrering og udskillelse af fluorescerende aktivitet fra blodet via nyrerne. Denne metode kan bruges til at studere nyreskader forårsaget af sygdom, som vi giver et eksempel på.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiske retningslinjer: Animal vedligeholdelse, dyrehold, og procedurer defineres og kontrolleres af Dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986. Alle dyreforsøg er blevet udført under tilladelser, som indenrigsministeren (PIL No. 70/7892) i overensstemmelse med den biologiske Services Management Group og den biologiske Services Etisk Udvalg, SGUL, London, UK. Blev gjort alt for at nedbringe antallet af dyr, der anvendes, og at forfine både procedurer og dyrehold for at minimere lidelse og forbedre velfærden.
1. Fremstilling af instrumenter, narkose, og fluorescerende farve
- Ved hjælp af en mikropipette aftrækker og borsilicat standard væg kapillærer (uden filamenter) Træk nåle af passende længde til mikroinjektion (figur 1A).
- Foretag en agarose støbeform til orientering af embryoer til let injektion i hjertesækken (figur 1B). Lim ca. ti glas mikroskop slIDES sammen til en "trappe" af offset dias. Du opnår de bedste resultater ved at bruge en dråbe hurtig sæt epoxyharpiks lim i midten af hvert dias.
- Klip en sektion på ca. 78 mm i længden halvvejs gennem to 10 ml plastik pipetter hjælp af en bunsenbrænder opvarmet skalpel, fjerne pipette ender efter behov. Vedhæft og lim (epoxy) pipette sektioner til de stablede objektglas at skabe stabilitet for at tillade formen at dykke ned i en 90 mm petriskål. Gør alt for at sikre de slide hjørner tilpasse vinkelret petriskålen gulvet. Tillad lim tid til at sætte.
- Cast formen i en 2% agaroseopløsning fremstillet i fisk vand (opnået fra akvariet). Hæld agarose i en 90 mm petriskål og placere formen oven på den åbne petriskålen tillader stablet slide kanter at dykke i en vinkel under agarose overflade. Lad indstillet på laboratoriebordet i 30 minutter.
- Fjern slide støbt og dækker slide-præget agarose med frisk fisk vandindeholdende tricaine bedøvelsesmiddel (se trin 1.9) ved en 1:25 ratio.
- Gør opløsninger af rhodamin dextran (RD) farvestof. Resuspender rhodamin B 10.000 MW mærket dextran i autoklaveret ultrarent vand for at lave en bestand koncentration på 50 mg / ml. For mikroinjektion yderligere fortynde lager til en endelig koncentration på 5 mg / ml i autoklaveret ultrarent vand.
BEMÆRK: Pigmenteret celler begynder at differentiere i zebrafisk fra 24 timer efter befrugtning (HPF); disse kan tilsløre fluorescerende markører under billedoptagelse. - Spærring melanocyte dannelse ved at bruge N -Phenylthiourea (PTU), der blokerer melanogenese gennem hæmning af tyrosinase. Lav en 0,003% stamopløsning af PTU ved at opløse PTU pulver i akvariet vand, varme opløsning ved 60 ° C til fuldstændig solubilisering.
- Inkubér zebrafisk embryoner i opløsning af methylenblåt, en mild fungicid, for at forebygge svampesygdomme blomstrer og øge overlevelsen. Tilsæt 2 ml af methylenblåt stamopløsning, indeholdende 0,1% Methylenblåt iultrapure vand til 1 liter akvarium vand og anvendelse som en standard embryo medium.
- Der fyldes op en 15 mM bestand koncentration af tricaine / ethyl-3-aminobenzoat methansulfonatsalt som anvist i "zebrafisk Book« 23. Bedøve embryoner og dermed immobiliseret dem til at udføre mikroinjektion procedure.
- Efter bedøve embryonerne, orientere dem, til billeddannelse ved hjælp af ikke-giftige og viskose egenskaber methylcellulose. For at gøre en fremstilling af 3% methylcellulose 200 ml, chill 130 ml vand ved -20 ° C i 30 minutter og anbring på is. Opvarm 70 ml vand til 80 ° C i et bægerglas tilsættes 6 g methylcellulose og agitere med en glasstav, indtil alle partiklerne befugtes og jævnt fordelt. Tilsæt iskoldt vand, blandes og tillade præparatet at afkøle ved 4 ° C i 30 minutter før alikvotere i 50 ml rør.
BEMÆRK: Sænkning af temperaturen tillader methylcellulose bliver opløselige. Opløsningen bliver tykkeresom pulverhydrater. 3% methylcellulose kan opbevares uden bakterievækst i korte perioder på en uge ved 4 ° C eller længere ved -20 ° C. Sørg for, at methylcellulose har nået RT før brug. - For at udføre injektioner af fluorescerende farvestof i zebrafisk bruge en standard mikroinjektion set-up (Figur 1C). Denne består af en luftkompressor forbundet til en trykregulator, der føder ind i en lige pipette holder til brug med 1,0 kapillærer ydre diameter. Pipette Indehaveren af bør anbringes i et MM33 kompakt 3-akse kontrol mikromanipulator fastgjort til en stål bundplade med en magnetisk stativ. Embryoner kan visualiseres, manipuleres og injiceres ved hjælp af en stereo dissektionsmikroskop.
2. zebrafisk Husbandry og Pre-injektion behandling
- Oprethold zebrafisk som tidligere beskrevet 23. Brug et akvarium set-up, der giver recirkulerende vand, der leveres ved en konstant temperatur på 28,5 ° C, Konditioneret til pH 6,8-7,2 og ledningsevne 450-550 uS med natriumbicarbonat og Instant Ocean Sea Salt hhv. Brug vildtype eller transgene zebrafisk linjer hensigtsmæssigt at eksperimentet, at opretholde en belægningsgrad på 15 mænd til 15 kvinder pr 8 L tank. Sæt fisken facilitet photocycle til 14 timer af dagslys mellem 09:00 til 23:00.
- Zebrafisk gydning begynder ved begyndelsen af photocycle, når lysene tændes om morgenen. For at sikre maksimal æg kan indsamles uden at forstyrre fiskene, dykke avl tanke (indeholdende mesh skær, der er tilgængelige fra zebrafisk specialister) i vildtype lager tanke om aftenen før samlingen.
- På dagen for indsamling, tillade 30-40 min for fiskene at gyde, hvorefter indsamle og skyl æg ved hjælp af en tesi og frisk akvarium vand. Depositum de rensede æg i en 90 mm petriskål indeholdende embryo medium og inkuberes ved 28,5 ° C.
- Behandl embryoner med PTU at hæmme MelanoGenesis. Ved 8 HPF, overføre levedygtige fostre i minimal væske til friske petriskåle indeholdende 1: 100 PTU til embryo medium og yderligere inkuberes ved 28,5 ° C, indtil 72 HPF.
BEMÆRK: PTU kan forårsage udviklingsmæssige defekter, hvis de anvendes på tidligere stadier, så bør begrænses for at skrive 8 HPF etaper, men kan behandles så sent som 24 HPF. Sent tilsætning af PTU ikke fuldt ud blokerer øjet pigmentering, men er generelt vellykket og hæmme kuffert melanocyt formation.
3. Mikroinjektion
BEMÆRK: hjertesækken omslutter hjertet, men er adskilt for beskyttelse og let hjerte-bevægelse ved væske i perikardial hulrum. Formålet med denne procedure er at injicere RD i perikardiehulrummet, dette giver mulighed for hurtig optagelse af farvestoffet til vaskulaturen system.
- Load nåle med 6 pi - fortyndet RD, hjælp microloader tips og sikker i nålen indehaveren af mikromanipulator. Bræk enden af nålen med fin tipped pincet (figur 1A). Flyt RD løsning på spidsen af nålen ved at maksimere impulslængde til minut indstilling, skifte tilbage til msek engang færdig.
- Brug en trinmikrometer, trykregulatoren og raffinementer til nålespidsen længde (ved hjælp af pincet) for at justere størrelsen af den udstødte dråber til 100 um i diameter, svarer dette til en 0,5 nl volumen (figur 2A).
BEMÆRK: Når bryde nålen, skal du passe på ikke at bryde for meget fra det ellers vil gøre kalibrering injektionsvolumenet vanskelig. Hvis det er nødvendigt, yderligere bryde nålespidsen for at forøge dråbestørrelsen dog opretholde en nål tykkelse, der tillader indtræden i hjertesækken uden overdreven bøjning eller skade på vævet. - Før injektion bedøve embryonerne i embryo medium indeholdende tricaine. Opsætning 2 x 35 mm petriskåle indeholdende 5 ml embryo medium, label ens tricaine «og det andet" nyttiggørelse ".
- Tilføj 200pi lager tricaine til det korrekt mærkede skålen. Når klar til at injicere, vælge et individuelt foster ved 72 HPF og overføre i minimal væske til tricaine parabol. Overvåge aktiviteten af embryonet, teste embryo bedøves og immobiliseres ved forsigtig omrøring under anvendelse af en trunkeret microloader tip.
- Overfør bedøvede embryo til støbeformen og orientere embryoet i en agarose trug så venstre side vender opad, at positionere hjertet til venstre for synsfeltet.
- For at injicere RD ind i hjertet, gennembore hjertesækken med nålen og sprøjt 1 nl af RD i perikardial hulrum i den bedøvede embryo (figur 2B, højre panel). Træk nålen efter injektionen. Overfør det injicerede embryo i minimal væske til 'Recovery fad "og overvåge for 1 min. Overfør individuelle embryo til en 24-brønds plade indeholdende 1 ml frisk embryo medium (indeholdende PTU) og mærke passende måde.
BEMÆRK: Hjertesækken er hård, men der er en bemærkelsesværdig svagt punkt i krydset, hvor hjertesækken opfylder Ventro-caudale svælg buer og dorso-rostrale blommesæk (figur 2B pilespids). Nålen skal rettes til denne rille. Når nålen er på plads, vil et fast tryk på en finger oven på mikromanipulator lette indrejse i perikardial hulrum. - Gentag trin 3,2-3,6 i mindst 10 embryoner pr forsøgsgruppe, placere hver fisk i en separat godt og unikt labelto tillader individuelle eksperimentelle opfølgninger. Inkuber ved 28,5 ° C i 3 timer.
4. Imaging Acquisition
- På 3 timer efter injektion (HPI) bedøver embryoner som tidligere beskrevet, og overføres til en 35 mm petriskål indeholdende 3% methylcellulose. Skub forsigtigt embryoner i methylcellulose og orientere så den laterale side kan afbildes.
- Hente et billede af embryonet under UV, anvendelse af et filter til visualisering of udsendte lys ved 570 nm (figur 2C). Efter billedoptagelse, tillade embryonet at komme sig, før du udskifter i den udpegede godt. Anskaf billeder til alle injicerede embryoner og yderligere inkuberes ved 28,5 ° C.
BEMÆRK: I denne protokol, der bruges vi en fluorescerende stereomikroskop med en TXR filter sæt, en DFC300FX kamera og respektive applikationssoftware. Notér de nøjagtige indstillinger erhvervelse til efterfølgende billedoptagelse. - Ved 24 HPI erhverve en anden runde af billeder som beskrevet ovenfor. Når alle billederne er blevet erhvervet, både på 3 hpi og 24 HPI, humant afhænde embryonerne eller brug for andre eksperimentelle midler fx, immunhistokemi.
5. Billedbehandling
- Kvantificere fluorescerende intensiteten af hver injiceret embryo, ved 3 HPI og 24 HPI, ved at analysere billeder med NIH s ImageJ software. For at måle fluorescerende intensitet, åbner et billede i ImageJ og angiv et område af interesse (ROI) ved 100 px 2 (Edit → valg → nærmere).
- Placer hjerte i midten af ROI (figur 2C), sæt målinger til at omfatte middelværdi gråskala og område (analyse → sæt målinger), udføre målingen (analyse → foranstaltning). Komplet for hvert sæt af billeder, ved 3 HPI og 24 HPI, pr embryo og overføre gennemsnitlige gråskalaværdier til et regneark til videre behandling.
BEMÆRK: Vi valgte en fast ROI størrelse på 100 px 2, da dette omfatter individuelle hjerter mellem embryoner. Hjertet blev udvalgt til at udføre målinger på grund af sin store størrelse, der muliggør en bekvem beliggenhed til at måle fluorescerende indhold i blodet, inden den føres ind i nyren. - Statistisk analyse ved hjælp af passende statistisk software. Sammenlign grupper for statistisk signifikans ved hjælp af en T-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bardet-Biedl syndrom (BBS) er en sjælden heterogen ciliopathy, der påvirker omkring 1: 160.000 mennesker på verdensplan 16. Patienter til stede med en række tilknyttede problemer, herunder polycystisk nyrer, derefter patienter ofte kræver dialysebehandling eller transplantation 24. ESRF er den mest almindelige dødsårsag i BBS, med ca. 30% af patienter, der udvikler CKD 16. I øjeblikket har 20 ikke-relaterede gener været impliceret i BBS med ingen publicerede genotype-fænotype forening. BBS proteiner deler fælles protein lokalisering domæner inden for cilium og basale organer, sammen med patienternes karakteristiske træk, udlede en ciliopathy diagnose. BBS9 koder Parathyoid Hormon-responsive B1 (PTHB1) protein, der sammen med andre BBS (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) proteiner udgør kernen BBSome komplekse ansvarlig for dannelsen af den primære cilium 24. Mutationer i BBS9 udgør 6% af BBS cases 24. Endvidere har PTH været impliceret i nyre cyste dannelse gennem fremme af renal epitelcelleproliferation, tyder på, at tabet af bbs9 funktion i zebrafisk kan vise renale fejl 25. Tidligere rapporter ved hjælp af en bbs9 knockdown zebrafisk model udelukker en beskrivelse af nyrerne, præsentere mulighed for at demonstrere den beskrevne nyrefunktion assay 26. Knockdown af bbs9 funktion blev opnået i zebrafisk ved at injicere ved 1- til 4-celle stadiet, et antisense morpholino at blokere gen-specifik bbs9 oversættelse og parallelt en standard negativ kontrol morpholino mod en intron mutation i humane beta-globin (4 ng bbs9 MO, sekvens: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA og 4 ng kontrol MO, sekvens: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). Vi fandt, at tab af bbs9 funktion resulterede i 40% af fostre udviser pronephric cyster med 5 dpf, tyder dette var en passende model til at analyserenyrefunktion ved hjælp af rhodamin dextran clearance assay. Vi observerede, at morphant fisk har en signifikant reduktion i deres evne til at fjerne det fluorescerende farvestof efter 24 hpi sammenlignet med kontroller (figur 3) - con: 14,8 ± 1,2 SEM, n = 9; bbs9 MO: 61,0 ± 10,3 SEM, n = 10 ; uparret t-test P-værdi: 0,002). For at udelukke det potentiale, nedsat clearance kan skyldes nedsat blodcirkulation, blev embryoner evalueret for hjerteslag og recirkulerende blodlegemer, både kontrol og morphant fisk havde sammenlignelig puls og blodgennemstrømningen. Disse data indikerer, at nyrefunktionen er nedsat hos bbs9 morphants. Faktisk bbs9 morphant embryoner udvikle cystisk pronephric tubuli samtidige med den observeret i BBS patienter.
Figur forberedelse 1. Udstyrog set-up. (A) Borosilikatrør kapillærer skal trækkes til mikroinjektion anvendelse af en passende kanyle aftrækker. Nålen kræver at bryde med en pincet (stiplet linie) for at tillade RD at afslutte nålen skal være forsigtig med ikke at bryde nålen for meget gør en nål, som ikke kan kalibreres. Scale bar:. 200 um (b) en agarose form til embryo manipulation og orientering kan være forældet ved at lime sammen objektglas og plast pipetter (C) Standarden mikroinjektion set-up.. Klik her for at se en større udgave af dette tal .
Figur 2. Mikroinjektion af rhodamin dextran i hjertesaek. (A) Kalibrer dråbestørrelse til 10 incvandskravene (100 um) på en 1 mm trin trådkorset. (B) korrekt positionering af nålen (sorte pile) i gletscherspalte markerer skæringspunktet mellem den kaudale buen, blommesækken og hjerte vil lette gennemboring af væv (pilespids). Scale bar:. 200 um (C) Rhodamin dextran kan ses hurtigt taget op af hele kar (hvide pile). 100 px 2 regioner af interesse, der dækker en centraliseret hjerte (gul firkant) bør anvendes til at tage målinger af middelværdien grå værdi og dermed pixel / fluorescerende intensitet. Venligst klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Knockdown af bbs9 forårsager defekt nyre funktion i zebrafisk. (A) Embryoner injiceret i hjertesækken med rhodamin dextran ved 3 hpi og 24 hpi, øverste og nederste to paneler henholdsvis enten kontrol eller bbs9 morphant embryoner. Pilespidser angiver hjertet; pilen angiver dannelsen af en pronephric cyste. (B) Procentdel fluorescerende intensitet tilbage efter 24 HPI i kontrol versus bbs9 MO embryoner. Error søjler viser standardafvigelsen på middelværdien (SEM), ** P ≤ 0,01. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk tilbyde et værdifuldt værktøj til at modellere menneskelig genetisk sygdom, har deres anvendelse som et videnskabeligt instrument til in vivo forskning aktiveret detaljerede undersøgelser af den genetiske nedbrydning af mange biologiske systemer, herunder nyrerne. Meget er nu forstået, hvordan den zebrafisk nyre udvikler og funktioner. De slående ligheder for menneskers nephrogenesis og homologi med sygdomsfremkaldende gener 21 har illustreret hvordan zebrafisk er blevet grundlæggende at forstå, hvordan fejl i gen-funktion fører til patologien af nyresygdom. Faktisk kan genetisk manipulation ubesværet opnået i zebrafisk hjælp antisense morpholino knockdown teknologi eller mere avancerede målrettede genom redigeringsværktøjer som TALENS eller CRISPR. Oprettelse knockdown eller mutant modeller for mistanke nyresygdom forårsager gener er det første skridt i at forstå deres inddragelse i sygdommens manifestation. For at gøre dette en pålidelig analyse for nyrefunktion søgesat angive, om en kandidat-gen er sandsynligvis ansvarlig for patologi hos patienter.
Nyrefunktionsundersøgelser er ligetil og relativt billige at udføre på mennesker, generelt ser på niveauer af opløste stoffer til stede i blodet eller urinen. Men disse metoder er uanvendelige i zebrafisk på grund af sin lille størrelse og akvatiske levesteder. Rhodamin dextran assay beskrevet her udnytter den evne pronephric tubuli at filtrere lavmolekylære bestanddele fra blodet. Podocytterne anbragt i Bowmans kapsel i nyren, som omslutter kapillærer glomerulus, tillade fri passage af små molekyler, såsom vand, ioniske salte og glucose gennem en spalte membran 27. De filtrering slidser fungere yderligere til at hindre tab af makro proteiner fra blodet. Filtrering er begrænset til molekyler over 5 kDa og næsten helt blokeret på størrelsen af serumalbumin 28 (ca.0; 65 kDa). Ved at injicere en fluorescerende dextran farvestof på ca. 10 kDa, ved en kendt koncentration i perikardiehulrummet, er vi i stand til at måle fluorescensintensiteten af blodet over tid. Under normale forhold ca. 85% af initial fluorescens tabt fra blodet over en 24 timers periode, gennem sekretion via nyrerne. Man bør bemærke, at injektion i perikardiel rum er kun muligt med lav MW dextran, der passerer frit ind i karrene. Således er denne analyse kun giver en udlæsning for hastigheden af clearance for lavmolekylære komponenter, og giver ingen oplysninger om effektiviteten af glomerulær filtration. Sidstnævnte kan vurderes mere direkte ved hjælp af højmolekylære farvestoffer over 70 kDa, der kræver injektion i vaskulaturen og ikke i perikardial rum. Faktisk kan dextraner af forskellige MW anvendes til yderligere at dissekere nyrefunktion 28.
Zebrafisk pronephric tubuli er stærkt cilierede med moflise cilier, der letter bevægelsen af filtratet mod kloaken 3,4. Defekter i ciliær maskiner har været impliceret i nyresygdom. BBS er en genetisk heterogen, autosomal recessiv lidelse karakteriseret ved barndommen debut retinal degeneration, tidlig debut fedme, kognitiv svækkelse, polydaktyli og renal misdannelser 24. Til dato har 20 BBS gener (BBS1-20) blevet identificeret. Afbrydelse af BBS fører til nyrecyste dannelse og mangelfuld pronephric funktion i zebrafisk 9. BBS9 interagerer med andre BBS proteiner for at danne BBSome ansvarlig for passende ciliogenesis, mutationer heraf tegner sig for 6% af BBS sager 24. Mens en zebrafisk bbs9 knockdown model er blevet rapporteret, var en beskrivelse af renal fænotype mangler 26. Ved at vælte bbs9 i zebrafisk, ved hjælp af morpholino fremgangsmåde vi demonstrere brugen af den renale clearance-assay som en metode til at bestemmenyrefunktion i en nyresygdom model. Her viser vi, at bbs9 morphant embryoner vise hindrede fluorescerende clearance fra blodet, hvilket indikerer, at nyren har undladt at fjerne lave MW opløste stoffer. På grund af inddragelse af bbs9 i ciliogenesis, og den rolle, pronephric cilier lette filtrat bevægelse, den observerede nyre clearance i morphants sandsynligvis skyldes afvigende cilia funktion. Denne metode er et værdifuldt redskab til at vurdere nyrefunktionen hos zebrafisk sygdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Teknisk bistand fra Jaipreet Bharj. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra EU-FP7 (SYSCILIA -241.955) og det hollandske Kidney Foundation (CP11.18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , Academic Press. (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
