Summary
zebrafish क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) मॉडल के लिए एक लोकप्रिय उपकरण है। हालांकि, उनके छोटे आकार का यह असंभव पारंपरिक तरीकों का उपयोग गुर्दे समारोह का मूल्यांकन करने के लिए बनाता है। हम सीकेडी में zebrafish गुर्दे समारोह के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है कि एक फ्लोरोसेंट रंजक गुर्दे की निकासी परख एक वर्णन।
Abstract
zebrafish भ्रूण जीवोत्पत्ति के अध्ययन और मानव आनुवंशिक रोग मॉडल के लिए एक विनयशील मॉडल प्रदान करता है। उसके रिश्तेदार सादगी के बावजूद, zebrafish गुर्दे विकसित और मनुष्य के रूप में लगभग एक ही तरह से काम करता है। मानव गुर्दे के निर्माण में एक बड़ा अंतर केवल दो है कि zebrafish की तुलना में नेफ्रॉन के लाखों लोगों की उपस्थिति है। हालांकि, बुनियादी कार्यात्मक इकाइयों में इस तरह के एक जटिल प्रणाली को सरल बनाने के गुर्दे विकसित और कैसे संचालित की हमारी समझ सहायता प्राप्त है। Zebrafish में, ग्लोमेर्युल्स स्थित midline के क्लोअका में एक दूसरे के लिए fusing से पहले भ्रूण अक्ष नीचे द्विपक्षीय चलाने के लिए हट जाना कि दो pronephric नलिकाओं में प्रारंभिक रक्त को छानने का काम के लिए जिम्मेदार है। pronephric नलिकाओं भारी अंत में क्लोअका 2-4 के माध्यम से बाहर निकलने से पहले विभिन्न विलेय के आदान प्रदान के लिए अनुमति देता है, खंडों छोटी नली के साथ छानना की आवाजाही की सुविधा है कि गतिशील सिलिया द्वारा बसा रहे हैं। सीकेडी, इंक के लिए जिम्मेदार कई जीनोंciliogenesis से संबंधित उन luding, zebrafish 5 में अध्ययन किया गया है। हालांकि, एक प्रमुख आकर्षण वापस आनुवंशिक हेरफेर के बाद zebrafish गुर्दे समारोह का मूल्यांकन करने में कठिनाई हो गया है। मनुष्य के कारण मुख्य रूप से उनके जलीय पर्यावरण और छोटे आकार के, zebrafish गैर translational को साबित कर दिया है में पारंपरिक assays के गुर्दा रोग को मापने के लिए। उदाहरण के लिए, यह भ्रूण यूरिया और क्रिएटिनिन सामग्री के विश्लेषण के लिए मछली का मंचन से वे बहुत छोटे हैं, के रूप में खून निकालने के लिए शारीरिक रूप से संभव नहीं है। इसके अलावा, zebrafish अक्सर प्रारंभिक रोगी परीक्षाओं के दौरान किया जाता है जो एक साधारण प्रोटीनमेह 'डिपस्टिक', पर परीक्षण के लिए पर्याप्त मूत्र का उत्पादन नहीं करते। हम गुर्दे समारोह 1,6-9 के बाहर एक पढ़ने देने के लिए, वाहिका संरचना से और बाहर गुर्दे के माध्यम से, मात्रात्मक समय के साथ, एक फ्लोरोसेंट डाई की निकासी की निगरानी के लिए zebrafish के ऑप्टिकल पारदर्शिता इस्तेमाल करता है कि एक फ्लोरोसेंट परख का वर्णन है।
Introduction
मानव गुर्दे रक्त से चयापचय अपशिष्ट छानने और सेलुलर homeostasis को बनाए रखने के लिए आवश्यक विलेय उबरने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। गुर्दा रोग का कारण है कि मानव आनुवंशिक रोगों के एक नंबर रहे हैं। सबसे आम विरासत गुर्दे की बीमारी गुरदे नलिकाओं के भीतर तरल पदार्थ भरा थैलियों के विकास के द्वारा होती ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग (ADPKD) है; cystogenesis की वजह से नुकसान गुर्दे समारोह 10 के लिए हानिकारक है। 800-1: ADPKD एक की एक घटना है 1000 और 8 के लिए खातों - अंत मंच वृक्क विफलता (ESRF) 11 में रोगियों का 10%। कई जीनों लगभग 85% और क्रमशः 12,13 मामलों के 15% के लिए लेखांकन, polycystin -1 (PKD1) और -2 (PKD2) सहित ADPKD पैदा करने के लिए फंसाया गया है। इसके अलावा, जीन PKD1 के लिए उत्पादों और -2 पपनी करने के लिए स्थानीय बनाना और ciliogenesis 14,15 के लिए मौलिक हैं। के रूप में जाना मानव आनुवंशिक विकारों की एक मान्यता प्राप्त परिवार अब भी हैसिलिया कार्य प्रभावित और सीकेडी 16 में जो परिणाम ciliopathies,।
सिलिअरी विकास और समारोह को प्रभावित मानव आनुवंशिक रोगों की बढ़ती संख्या इस बार माना बाक़ी organelle में वैश्विक ब्याज आ रहा है। पपनी, एक बाल की तरह सेलुलर फलाव, रिसेप्टर्स और चाबी सेल संकेत घटनाओं के पारगमन के लिए आवश्यक आयन चैनल के साथ समृद्ध है। पपनी आम तौर पर साथ या स्वेटर सूक्ष्मनलिकाएं के एक केंद्रीय जोड़ी के बिना नौ त्रिज्यात व्यवस्था की सूक्ष्मनलिका दोहरी में संरचित एक सूक्ष्मनलिका आधारित axoneme, के होते हैं। axonemal संरचना सिलिअरी कार्रवाई के प्रकार और विधा को परिभाषित करता है। 9 + 2 के सूक्ष्मनलिका व्यवस्था यह उपकला सतहों के पार तरल पदार्थ के आंदोलन में उपयोग किया जाता है, जहां पपनी को गतिशीलता प्रदान करता है। 9 + 0 विन्यास गैर गतिशील है, लेकिन सेलुलर संकेत घटनाओं में 17 में मुख्य रूप से कार्य करने के लिए माना जाता है। इसके अलावा सीकेडी से, सिलिअरी शिथिलता के परिणामों विशेषता का एक सेट है, मोटापा, रेटिना अध: पतन, polydactyly, और संज्ञानात्मक हानि 16 शामिल है कि ciliopathy सुविधाओं। हालांकि, सीकेडी रोगी के जीवन की गुणवत्ता के लिए सबसे अधिक हानिकारक है और इसलिए सिलिअरी संबंधित सीकेडी के लिए विवो मॉडल में उपयुक्त के विकास के पीछे एक प्रमुख प्रेरक बल के बीच है।
zebrafish मानव आनुवंशिक रोग के एटियलजि को समझने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। उनका त्वरित विकास, अंडे की बड़ी संख्या है, पारदर्शी ऊतक, और पूर्व utero विकास के उत्पादन के लिए zebrafish विकास की प्रक्रिया कल्पना और जैविक घटनाओं में काफी आसानी के साथ छेड़छाड़ किए जाने की अनुमति देता है। जीन आनुवांशिक रूप से, जीनोम संपादन उपकरण (CRISPR 18 और TALENS 19) की हाल की सफलता का उपयोग कर बदल antisense morpholino प्रौद्योगिकी 20 का उपयोग कर नीचे गिरा दिया, या औषधीय उनके जलीय पर्यावरण के लिए यौगिकों के अलावा द्वारा विनियमित किया जा सकता है। दरअसल, zebrafish ई शुरू करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैंअन्य पशु मॉडल में अनुमोदक नहीं कर रहे हैं कि xperiments। Zebrafish whilst वे मनुष्यों के साथ आम में कई कार्यात्मक संरक्षित अंगों, जीन, और संकेत प्रक्रियाओं शेयर (मनुष्यों की तुलना में) अपेक्षाकृत सरल रीढ़ हैं। उदाहरण के लिए, zebrafish गुर्दे मनुष्य 21,22 की तुलना में संरचना और समारोह में उल्लेखनीय समान है। हालांकि, चरणों की एक उत्तराधिकार के माध्यम से विकसित करता है कि स्तनधारी गुर्दे के विपरीत, प्रत्येक एक और अधिक विकसित गुर्दे (pronephros, mesonephros, और metanephros) द्वारा चिह्नित, भ्रूण zebrafish केवल एक pronephros, एक गुर्दा के सबसे अपरिपक्व फार्म विकसित करता है। नेफ्रॉन के लाखों स्तनधारी गुर्दे की इमारत ब्लॉकों के गठन पाया जा सकता है, whilst zebrafish भ्रूण केवल दो के पास है। प्रारंभिक रक्त छानना के लिए अनुमति देते हैं, जो ग्लोमेरुली, महाधमनी के midline के सिर्फ उदर में जुड़े हुए हैं। क्लोअका के माध्यम से बाहर निकलने के लिए पूर्व fusing, अक्ष के साथ दुमदारी चलने वाले pronephric नलिकाओं में ग्लोमेरुली के माध्यम से रक्त फिल्टर। pronephric टीयूbules भारी दुम बाहर निकलें 3,4 की ओर छानना के प्रवाह के लिए अनुमोदक हैं कि गतिशील सिलिया के साथ रोमक कर रहे हैं। यह सरल pronephric संरचना वे अंततः एक अधिक जटिल mesonephros संरचना 21 में विकसित जहां लार्वा विकास के कई हफ्तों के माध्यम से zebrafish homeostasis को बनाए रखता है। हालांकि, zebrafish एक metanephros 21 विकसित करता है कभी नहीं। Zebrafish idiosyncrasies के बावजूद, zebrafish नेफ्रॉन स्तनधारियों में मनाया बराबर जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ खंडित है और इस तरह nephrogenesis 3,22 के लिए vivo मॉडल में एक बेजोड़ प्रदान करता है।
नियमित रूप से मरीजों के रक्त और मूत्र परीक्षण की एक श्रृंखला के माध्यम से गुर्दे समारोह के लिए परीक्षण कर रहे हैं। आमतौर पर रक्त भंग लवण, यूरिया और क्रिएटिनिन के लिए विश्लेषण किया है। यूरिया, क्रिएटिनिन और असामान्य नमक सांद्रता के उच्च स्तर गुर्दे समारोह के साथ समस्याओं का संकेत कर रहे हैं। एक वर्णमिति डिपस्टिक का उपयोग कर urinalysis प्रोटीन, Bloo के असामान्य स्तर का पता लगाता हैडी, मवाद, बैक्टीरिया और मूत्र के नमूने में चीनी मौजूद। रक्त की 10 मिलीलीटर - इस तरह के परीक्षण में सामान्य रूप से मूत्र की लगभग 30 मिलीलीटर या 5 की आवश्यकता होती है। यह मुख्य रूप से की वजह से परख करने के लिए पर्याप्त रक्त या मूत्र इकट्ठा करने का असंभव प्रकृति के कारण, ऐसे zebrafish के रूप में vivo मॉडल जीवों में छोटा करने के लिए assays के इन प्रकार अनुवाद करने के लिए मुश्किल हो गया है। यहाँ, हम उचित zebrafish गुर्दे समारोह परीक्षण की कमी को संबोधित करने और अपने अध्ययन के लिए एक नवीन तकनीक का वर्णन है। रक्त प्रवाह में एक फ्लोरोसेंट डाई इंजेक्शन द्वारा हम गुर्दे के माध्यम से रक्त से निस्पंदन और फ्लोरोसेंट गतिविधि के उत्सर्जन पर नजर रखने और अलग-अलग समय के साथ यों करने में सक्षम हैं। इस विधि को हम का एक उदाहरण प्रदान जो बीमारी की वजह से गुर्दे की क्षति, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
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Protocol
आचार कथन: पशु रखरखाव, पशुपालन, और प्रक्रियाओं पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 के सभी पशु प्रयोग जैविक के अनुपालन में गृह सचिव (जनहित याचिका संख्या 70/7892) द्वारा दी लाइसेंस के तहत बाहर किया गया है द्वारा परिभाषित और नियंत्रित कर रहे हैं सेवा प्रबंधन समूह और जैविक सेवा नैतिक समिति, SGUL, लंदन, ब्रिटेन। सभी प्रयासों प्रयुक्त जानवर की संख्या को कम करने के लिए और कल्याण पीड़ा को कम करने और बढ़ाने के क्रम में दोनों प्रक्रियाओं और पशुपालन को निखारने के लिए किए गए थे।
1. उपकरण, संवेदनाहारी की तैयारी, और फ्लोरोसेंट रंजक
- एक micropipette खींचने और (तंतु) के बिना borosilicate मानक दीवार केशिकाओं microinjection (चित्रा 1 ए) के लिए उचित लंबाई की सुई खींचने का उपयोग करना।
- पेरीकार्डियम (चित्रा 1 बी) में आसान इंजेक्शन के लिए भ्रूण के उन्मुखीकरण के लिए एक agarose मोल्ड बनाओ। गोंद लगभग दस गिलास खुर्दबीन SLएक साथ इडस ऑफसेट स्लाइड्स की एक 'सीढ़ी' के रूप में। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, प्रत्येक स्लाइड के केंद्र में तेजी से सेट epoxy राल गोंद की एक बूंद का उपयोग करें।
- निकालने के लिए, एक लेम्प बर्नर गरम स्केलपेल का उपयोग दो 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक pipettes के माध्यम से लंबाई आधे रास्ते में लगभग 78 मिमी के एक वर्ग बाहर कट पिपेट के रूप में उपयुक्त समाप्त होता है। संलग्न और खड़ी गिलास स्लाइड के लिए गोंद (epoxy राल) पिपेट वर्गों ढालना एक 90 मिमी पेट्री डिश में डुबकी के लिए अनुमति देने के लिए स्थिरता प्रदान करने के लिए। स्लाइड कोनों पेट्री डिश मंजिल को सीधा संरेखित सुनिश्चित करने के लिए हर संभव प्रयास करें। गोंद का समय निर्धारित करने की अनुमति दें।
- मछली पानी में किए गए एक 2% agarose समाधान में ढालना कास्ट (मछलीघर से प्राप्त)। एक 90 मिमी पेट्री डिश में agarose डालो और खड़ी स्लाइड agarose सतह के नीचे एक कोण पर डूब किनारों की अनुमति खुला पेट्री डिश के शीर्ष पर ढालना जगह है। 30 मिनट के लिए प्रयोगशाला बेंच पर सेट करने के लिए छोड़ दें।
- स्लाइड डाली निकालें और ताजा मछली पानी के साथ स्लाइड अंकित agarose कवरTricaine संवेदनाहारी युक्त 01:25 के अनुपात में (कदम 1.9 देखें)।
- Rhodamine dextran (आरडी) डाई का समाधान करें। Resuspend rhodamine बी 10,000 मेगावाट 50 मिलीग्राम / एमएल के एक शेयर एकाग्रता बनाने के लिए autoclaved ultrapure पानी में dextran के लेबल। Microinjection के लिए, आगे autoclaved ultrapure पानी में 5 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए शेयर पतला।
नोट: pigmented कोशिकाओं 24 घंटा बाद निषेचन (HPF) से zebrafish में अंतर करने के लिए शुरू हो; इन छवि अधिग्रहण के दौरान फ्लोरोसेंट मार्करों अस्पष्ट कर सकते हैं। - ब्लॉक टायरोसिनेस के निषेध के माध्यम से melanogenesis जो एन -Phenylthiourea (पी टी यू), का उपयोग करके मेलानोसाईट गठन को बाधित। पूरी तरह से solubilize करने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर मछलीघर पानी, गर्मी के समाधान में पी टी यू पाउडर भंग करके पी टी यू की एक 0.003% शेयर समाधान करें।
- , Methylene नीले समाधान, एक हल्के कवकनाशी में zebrafish भ्रूण सेते फंगल खिलता रोकने के लिए और जीवित रहने की वृद्धि हुई है। यू में 0.1% Methylene नीले युक्त, methylene नीले शेयर समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ेंltrapure पानी, एक मानक भ्रूण माध्यम के रूप में मछलीघर पानी और उपयोग की एक एल।
- 'Zebrafish बुक' 23 में निर्देश के रूप में Tricaine / एथिल 3-aminobenzoate methanesulfonate नमक की एक 15 मिमी शेयर एकाग्रता अप करें। भ्रूण anesthetize और फलस्वरूप microinjection के कार्यविधि को पूरा करने के लिए उन्हें स्थिर।
- भ्रूण anesthetizing के बाद, methylcellulose के गैर विषैले और चिपचिपा गुणों का उपयोग करके इमेजिंग के लिए, उन्हें पूरबी। , 3% methylcellulose के एक 200 मिलीलीटर की तैयारी कर बर्फ पर 30 मिनट के लिए और जगह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर पानी की 130 मिलीलीटर ठंडा करने के लिए। एक गिलास बीकर में 80 डिग्री सेल्सियस के लिए पानी की 70 मिलीलीटर गर्मी methylcellulose के 6 ग्राम जोड़ने के लिए, और सभी कणों गीला और समान रूप से बिखरे हैं जब तक एक गिलास छड़ी का उपयोग कर आंदोलन। , ठंडा पानी जोड़ें, मिश्रण और तैयारी के 50 मिलीलीटर ट्यूबों में aliquoting से पहले 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
नोट: तापमान को कम methylcellulose घुलनशील बनने के लिए अनुमति देता है। समाधान मोटा हो जाएगापाउडर हाइड्रेट्स के रूप में। 3% methylcellulose बैक्टीरियल 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह से कम समय के लिए विकास या -20 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक बिना संग्रहित किया जा सकता है। Methylcellulose उपयोग करने से पहले आरटी पर पहुँच गया है सुनिश्चित करें। - Zebrafish में फ्लोरोसेंट डाई के इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए एक मानक microinjection के सेट-अप (चित्रा 1C) का उपयोग करें। यह 1.0 बाहरी व्यास केशिकाओं साथ प्रयोग के लिए एक सीधी पिपेट धारक में फ़ीड है कि एक दबाव नियामक प्रणाली से जुड़े एक हवा कंप्रेसर के होते हैं। पिपेट धारक एक चुंबकीय स्टैंड से एक स्टील बेस प्लेट के लिए सुरक्षित एक MM33 कॉम्पैक्ट 3-अक्ष नियंत्रण micromanipulator के भीतर रखा जाना चाहिए। भ्रूण चालाकी, कल्पना और एक स्टीरियो विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग इंजेक्शन जा सकता है।
2. Zebrafish पशुपालन और पूर्व इंजेक्शन उपचार
- पहले से 23 के रूप में वर्णित zebrafish बनाए रखें। 28.5 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर तापमान पर आपूर्ति की रीसर्क्युलेटिंग पानी प्रदान करता है कि एक मछलीघर सेट-अप का उपयोग करें, पीएच 6.8 वातानुकूलित - 7.2 और सोडियम बाइकार्बोनेट और त्वरित महासागर समुद्री नमक, साथ 450-550 μS की चालकता क्रमशः। 8 एल टैंक प्रति 15 महिलाओं के लिए 15 पुरुषों के भंडारण घनत्व को बनाए रखने, प्रयोग करने के लिए उपयुक्त के रूप में wildtype या ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों का प्रयोग करें। 09:00-23:00 के बीच दिन के उजाले के 14 घंटा के लिए मछली सुविधा photocycle सेट करें।
- Zebrafish स्पॉन रोशनी सुबह में पर बारी जब photocycle, की शुरुआत में शुरू होती है। संग्रह से पहले wildtype शेयर टैंक में शाम प्रजनन टैंक (zebrafish विशेषज्ञों से उपलब्ध युक्त जाल आवेषण,) डूब, अधिकतम अंडे मछली परेशान बिना एकत्र किया जा सकता है सुनिश्चित करने के लिए।
- जिसके बाद एक चाय का झरनी और ताजा मछलीघर पानी का उपयोग अंडे इकट्ठा करने और कुल्ला, मछली के लिए 40 मिनट के लिए अंडे - संग्रह के दिन, 30 अनुमति देते हैं। एक 90 मिमी पेट्री डिश युक्त भ्रूण मध्यम में साफ अंडे जमा और 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- Melano को बाधित करने के लिए पी टी यू के साथ भ्रूण समझोउत्पत्ति। 8 HPF में, एक से युक्त ताजा पेट्री डिश के लिए कम से कम तरल में व्यवहार्य भ्रूण स्थानांतरण: भ्रूण माध्यम से 100 पी टी यू और आगे 72 HPF तक 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
नोट: पी टी यू इसलिए 8 HPF चरणों पोस्ट करने के लिए प्रतिबंधित किया जाना चाहिए पहले चरण में प्रयोग किया जाता है अगर विकासात्मक दोष पैदा कर सकता है, लेकिन रूप में देर से 24 HPF के रूप में इलाज किया जा सकता है। पी टी यू के स्वर्गीय इसके अलावा पूरी तरह से आंख रंजकता ब्लॉक, लेकिन आम तौर पर सफल और ट्रंक मेलानोसाईट गठन बाधा है नहीं करता है।
3. Microinjection
नोट: पेरीकार्डियम दिल encases लेकिन पेरिकार्डियल गुहा के भीतर तरल पदार्थ से संरक्षण और हृदय आंदोलन में आसानी के लिए अलग है। इस प्रक्रिया का उद्देश्य इस वाहिका प्रणाली के लिए डाई का तेजी से तेज के लिए अनुमति देता है, पेरिकार्डियल गुहा में आरडी इंजेक्षन करने के लिए है।
- 6 μl के साथ लोड सुइयों - microloader युक्तियों का उपयोग, आरडी पतला और micromanipulator के सुई धारक में सुरक्षित है। ठीक TIPP का उपयोग कर सुई के अंत तोड़एड संदंश (चित्रा 1 ए)। , मिनट स्थापित करने के लिए पल्स अवधि अधिकतम द्वारा सुई की नोक के लिए आरडी समाधान हटो एक बार पूरा मिसे वापस करने के लिए स्विच करें।
- व्यास में 100 माइक्रोन के लिए निष्कासित कर दिया छोटी बूंद के आकार को समायोजित करने के लिए (संदंश का प्रयोग करके) सुई टिप लंबाई करने के लिए एक मंच सुक्ष्ममापी, दबाव नियामक, और शोधन का प्रयोग करें, यह एक 0.5 nl मात्रा (2A चित्रा) के लिए equates।
नोट: सुई तोड़ने करते हैं, अन्यथा यह मुश्किल इंजेक्शन की मात्रा औजार बनाना होगा बंद बहुत ज्यादा तोड़ने के लिए नहीं सावधान रहना होगा। यदि आवश्यक हो, आगे, हालांकि बूंद का आकार बढ़ाने के ऊतकों को अत्यधिक झुका या क्षति के बिना पेरीकार्डियम में प्रवेश परमिट कि एक सुई मोटाई बनाए रखने के लिए सुई की नोक टूट गया। - इंजेक्शन से पहले, Tricaine युक्त भ्रूण मध्यम में भ्रूण anesthetize। 5 मिलीलीटर भ्रूण मध्यम, लेबल एक 'Tricaine' और 'अन्य' वसूली 'युक्त 2 एक्स 35 मिमी पेट्री डिश सेट करें।
- 200 जोड़ेंउचित लेबल डिश के लिए शेयर Tricaine के μl। इंजेक्षन करने के लिए एक बार तैयार, 72 HPF पर एक व्यक्ति भ्रूण का चयन करें और Tricaine डिश के लिए कम से कम तरल में हस्तांतरण। भ्रूण की गतिविधि पर नजर रखने, भ्रूण anesthetized और एक छोटा microloader टिप का उपयोग कोमल आंदोलन से स्थिर है परीक्षा।
- इंजेक्शन मोल्ड करने के लिए संवेदनाहृत भ्रूण हस्तांतरण और बाईं ओर, ऊपर का सामना करना पड़ देखने के क्षेत्र के बाईं ओर दिल स्थिति है ताकि एक agarose गर्त भीतर भ्रूण मालूम।
- दिल में आरडी इंजेक्षन करने के लिए, सुई के साथ पेरीकार्डियम पियर्स और anaesthetized भ्रूण (चित्रा 2B, सही पैनल) की पेरिकार्डियल गुहा में आरडी की एक nl इंजेक्षन। इंजेक्शन के बाद सुई वापस ले लें। 'रिकवरी पकवान' करने के लिए कम से कम तरल में इंजेक्ट भ्रूण स्थानांतरण और 1 मिनट के लिए निगरानी। 1 मिलीलीटर ताजा भ्रूण मध्यम (पी टी यू युक्त) युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए अलग-अलग भ्रूण स्थानांतरण और उचित लेबल।
ध्यान: पेरीकार्डियम कठिन है, हालांकि पेरीकार्डियम ventro-दुम ग्रसनी मेहराब और Dorso-व्याख्यान चबूतरे वाला जर्दी थैली (चित्रा 2B नोक) से मिलता है, जहां चौराहे पर एक उल्लेखनीय कमजोर बिंदु है। सुई इस नाली को निर्देशित किया जाना चाहिए। सुई जगह में है, micromanipulator के शीर्ष पर एक उंगली की एक फर्म नल पेरिकार्डियल गुहा में प्रवेश की सुविधा होगी। - एक अलग और अच्छी तरह से विशिष्ट labelto परमिट व्यक्तिगत प्रयोगात्मक अनुवर्ती अप में प्रत्येक मछली जगह है, प्रायोगिक समूह के अनुसार कम से कम 10 भ्रूण के लिए 3.6 - दोहराएँ 3.2 कदम। तीन घंटे के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
4. इमेजिंग अधिग्रहण
- पहले से वर्णित के रूप में 3 घंटा पोस्ट इंजेक्शन (HPI) में भ्रूण anesthetize और 3% methylcellulose युक्त एक 35 मिमी पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण। धीरे methylcellulose में भ्रूण धक्का और पार्श्व की ओर imaged किया जा सकता है ताकि मालूम।
- दृश्य ओ के लिए एक फिल्टर का उपयोग कर, यूवी के तहत भ्रूण की एक छवि मोलएफ 570 एनएम (चित्रा -2) पर प्रकाश उत्सर्जित। छवि अधिग्रहण के बाद, भ्रूण अच्छी तरह से नामित में जगह से पहले ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं। सभी इंजेक्शन भ्रूण के लिए छवियों का मोल और आगे 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
नोट: हम एक TXR फिल्टर सेट, एक DFC300FX कैमरा और संबंधित आवेदन सॉफ्टवेयर के साथ एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope के लिए प्रयोग किया जाता इस प्रोटोकॉल में। बाद में छवि अधिग्रहण के लिए सटीक अधिग्रहण सेटिंग्स का एक नोट करें। - ऊपर वर्णित के रूप में 24 HPI में, छवियों का एक दूसरे दौर के अधिग्रहण। सभी छवियों का अधिग्रहण किया गया है एक बार, तीन HPI और 24 HPI दोनों में, नम्रता से भ्रूण के निपटान या अन्य प्रयोगात्मक साधन जैसे, immunohistochemistry के लिए इस्तेमाल करते हैं।
5. छवि प्रसंस्करण
- एनआईएच के ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण करके, 3 HPI और 24 HPI में हर इंजेक्ट भ्रूण के फ्लोरोसेंट तीव्रता यों। , फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने ImageJ में एक छवि खोलने के लिए और एक पर ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र निर्दिष्ट करने के लिए00 पिक्सल 2 (संपादन → चयन → निर्दिष्ट)।
- रॉय (चित्रा -2) के केंद्र में दिल स्थिति, (→ उपाय विश्लेषण) माप प्रदर्शन, (→ सेट माप का विश्लेषण करें) मतलब ग्रे स्केल और क्षेत्र शामिल करने के लिए माप की स्थापना की। भ्रूण प्रति, 3 HPI और 24 HPI पर, छवियों के प्रत्येक सेट के लिए पूर्ण और आगे की प्रक्रिया के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए औसत ग्रे स्केल मूल्यों हस्तांतरण।
नोट: इस भ्रूण के बीच अलग-अलग दिलों शामिल हैं के रूप में हम 100 पिक्सल 2 की एक निश्चित लागत पर लाभ का आकार चुने गए। दिल की वजह से पहले गुर्दे में प्रवेश करने के लिए रक्त के फ्लोरोसेंट सामग्री को मापने के लिए एक सुविधाजनक स्थान में सक्षम बनाता है कि अपने बड़े आकार के लिए माप प्रदर्शन करने के लिए चुना गया था। - उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं। एक छात्र की टी परीक्षण का उपयोग सांख्यिकीय महत्व के लिए समूहों की तुलना करें।
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Representative Results
दुनिया भर में 16 160,000 लोग: Bardet-Biedl सिंड्रोम (बीबीएस) लगभग 1 को प्रभावित करता है कि एक दुर्लभ विषम ciliopathy है। पॉलीसिस्टिक गुर्दे सहित संबंधित समस्याओं का एक नंबर के साथ उपस्थित मरीजों, बाद में रोगियों को अक्सर किडनी डायलिसिस या प्रत्यारोपण 24 की आवश्यकता है। ESRF सीकेडी 16 विकासशील रोगियों के लगभग 30% के साथ, बीबीएस में मौत का सबसे आम कारण है। वर्तमान में, 20 गैर संबंधित जीन कोई प्रकाशित जीनोटाइप-फेनोटाइप एसोसिएशन के साथ बीबीएस में फंसाया गया है। बीबीएस प्रोटीन मरीजों के लक्षण लक्षण के साथ-साथ, एक ciliopathy निदान अनुमान है कि, पपनी और बेसल शरीर के भीतर आम प्रोटीन स्थानीयकरण डोमेन के साझा करें। BBS9 एक साथ अन्य बीबीएस के साथ (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) प्रोटीन प्राथमिक पपनी 24 के गठन के लिए BBSome जटिल जिम्मेदार कोर कि फार्म Parathyoid हार्मोन जिम्मेदार बी 1 (PTHB1) प्रोटीन encodes। बीबीएस सी के 6% के लिए BBS9 खाते में उत्परिवर्तनases 24। इसके अलावा, PTH गुर्दे दोषों 25 प्रदर्शित हो सकता है zebrafish में bbs9 समारोह की कि नुकसान का सुझाव दे, गुर्दे उपकला सेल प्रसार को बढ़ावा देने के माध्यम से गुर्दे पुटी गठन में फंसा दिया गया है। एक bbs9 पछाड़ना zebrafish मॉडल का उपयोग करते हुए पिछली रिपोर्टों में वर्णित गुर्दे समारोह परख 26 को प्रदर्शित करने का अवसर पेश, गुर्दे का वर्णन के बाहर। Bbs9 समारोह की पछाड़ना, 1- 4 सेल चरण में, इंजेक्शन द्वारा zebrafish में मानव बीटा ग्लोबिन में एक intronic उत्परिवर्तन के खिलाफ जीन विशिष्ट bbs9 अनुवाद और समानांतर एक मानक नकारात्मक नियंत्रण morpholino में ब्लॉक करने के लिए एक एंटी-सेन्स morpholino हासिल की थी (4 एनजी bbs9 एमओ, अनुक्रम: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA और 4 एनजी नियंत्रण एमओ, अनुक्रम: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA)। हम इस विश्लेषण करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल था, सुझाव bbs9 समारोह के नुकसान 5 DPF द्वारा pronephric अल्सर प्रदर्शित करने भ्रूण के 40% के परिणामस्वरूप पाया गया किrhodamine dextran निकासी परख का उपयोग गुर्दे समारोह। 61.0 ± 10.3 SEM, एन = 10: bbs9 एमओ;, 14.8 ± 1.2 SEM के एन = 9: चोर - हम 24 HPI नियंत्रण की तुलना में बाद morphant मछली (चित्रा 3) फ्लोरोसेंट रंजक खाली करने के लिए अपनी क्षमता में एक महत्वपूर्ण कमी है कि मनाया ; अयुगल टी परीक्षण पी मूल्य: 0.002)। कम रक्त परिसंचरण के कारण हो सकता निकासी कम क्षमता है कि शासन से बाहर करने के लिए, भ्रूण दिल की धड़कन और रीसर्क्युलेटिंग रक्त कोशिकाओं के लिए मूल्यांकन किया गया, नियंत्रण और morphant मछली दोनों तुलनीय दिल की दर और रक्त का प्रवाह था। इन आंकड़ों गुर्दे समारोह bbs9 morphants में बिगड़ा हुआ है कि संकेत मिलता है। दरअसल, bbs9 morphant भ्रूण बीबीएस रोगियों में मनाया उस के साथ समवर्ती सिस्टिक pronephric नलिकाओं का विकास।
चित्रा 1. उपकरण तैयारीऔर सेट अप। (ए) Borosilicate केशिकाओं एक उपयुक्त सुई खींचने का उपयोग microinjection के लिए खींच लिया जाना चाहिए। सुई सुई बाहर निकलने के लिए आरडी की अनुमति के लिए संदंश (धराशायी लाइन) के साथ तोड़ने की आवश्यकता है, देखभाल बहुत ज्यादा calibrated नहीं किया जा सकता है कि एक सुई प्रतिपादन सुई को तोड़ने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए। स्केल बार:। 200 माइक्रोन (बी) के भ्रूण में गड़बड़ी और उन्मुखीकरण के लिए एक agarose ढालना गिलास स्लाइड और प्लास्टिक pipettes एक साथ gluing द्वारा जमाने जा सकता है (सी) मानक microinjection के सेट-अप।। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
पेरिकार्डियल थैली में rhodamine dextran के चित्रा 2. Microinjection। (ए) 10 इंक के लिए ड्रॉप आकार जांचनाrements के एक एक मिमी चरण reticule पर (100 माइक्रोन)। (बी) के ऊतक (नोक) छेदने की सुविधा होगी दुम ग्रसनी चाप, जर्दी थैली और दिल के बीच चौराहे अंकन हिम दरार में सुई (काला तीर) की सही स्थिति। स्केल बार:। 200 माइक्रोन (सी) rhodamine dextran तेजी से पूरी वाहिका (सफेद तीर) द्वारा लिया देखा जा सकता है। 100 पिक्सल एक केंद्रीकृत दिल (पीला) वर्ग को कवर करने के हितों के दो क्षेत्रों मतलब ग्रे मूल्य है और इसलिए पिक्सेल / फ्लोरोसेंट तीव्रता का माप लेने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Bbs9 चित्रा 3. पछाड़ना दोषपूर्ण गुर्दे समारोह का कारण बनता हैzebrafish में tion। (ए) के भ्रूण नियंत्रण या bbs9 morphant भ्रूण दोनों में क्रमश: तीन HPI और 24 HPI, ऊपर और नीचे दो पैनलों पर rhodamine dextran साथ पेरीकार्डियम में इंजेक्ट किया। तीर दिल से संकेत मिलता है; तीर एक pronephric पुटी के गठन को इंगित करता है। (बी) का प्रतिशत फ्लोरोसेंट तीव्रता bbs9 एमओ भ्रूण बनाम नियंत्रण में 24 HPI के बाद शेष। त्रुटि सलाखों, मतलब (SEM) के मानक त्रुटि दिखाने ** पी ≤ 0.01। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
Zebrafish मानव आनुवंशिक रोग मॉडल के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करते हैं, vivo में अनुसंधान के लिए एक वैज्ञानिक साधन के रूप में उनके उपयोग गुर्दे सहित कई जैविक प्रणालियों की आनुवंशिक टूटने के विस्तृत अध्ययन के लिए सक्षम है। अब बहुत zebrafish गुर्दे विकसित और कार्यों के बारे में कैसे समझा जाता है। मानव nephrogenesis और बीमारी के कारण जीन 21 के साथ अनुरूपता को हड़ताली समानता को समझने में मौलिक बन गए हैं कैसे zebrafish सचित्र गया है कि कैसे गुर्दे की बीमारी की विकृति के लिए जीन समारोह नेतृत्व में दोष। दरअसल, आनुवंशिक हेरफेर अनायास antisense morpholino पछाड़ना प्रौद्योगिकी या ऐसे TALENS या CRISPR के रूप में और अधिक उन्नत लक्षित जीनोम संपादन उपकरण का उपयोग zebrafish में प्राप्त किया जा सकता है। संदिग्ध गुर्दे की बीमारी के कारण जीनों के लिए पछाड़ना या उत्परिवर्ती मॉडल बनाने के रोग अभिव्यक्ति में उनकी भागीदारी को समझने में पहला कदम है। गुर्दे समारोह के लिए एक विश्वसनीय परख की मांग की है ऐसा करने के लिएएक उम्मीदवार जीन रोगियों में मनाया विकृति के लिए संभावना जिम्मेदार है यह इंगित करने के लिए।
गुर्दे समारोह परीक्षण आम तौर पर रक्त या मूत्र में मौजूद विलेय के स्तर पर देख रहे हैं, मनुष्यों पर प्रदर्शन करने के लिए सरल और अपेक्षाकृत सस्ते होते हैं। हालांकि, इन तरीकों की वजह से अपने छोटे आकार और जलीय निवास स्थान के लिए zebrafish में अयोग्य हैं। यहाँ वर्णित rhodamine dextran परख रक्त से कम आणविक भार घटक फिल्टर करने के लिए pronephric नलिकाओं की क्षमता का इस्तेमाल करता है। podocytes ग्लोमेर्युल्स के लिफाफे केशिकाओं, इस तरह के पानी के रूप में छोटे अणुओं, आयनिक लवण से मुक्त गुजर अनुमति देते हैं और एक भट्ठा डायाफ्राम 27 के माध्यम से ग्लूकोज कि, गुर्दे की बोमन कैप्सूल के भीतर तैनात। निस्पंदन slits के आगे खून से मैक्रो प्रोटीन की हानि को रोकने के लिए कार्य करते हैं। छानने का काम लगभग (सीरम albumin 28 के आकार पर अवरुद्ध अणुओं 5 केडीए से ऊपर है और लगभग पूरी तरह के लिए प्रतिबंधित है0; 65 केडीए)। पेरिकार्डियल गुहा में एक ज्ञात एकाग्रता में, लगभग 10 केडीए के एक फ्लोरोसेंट dextran डाई इंजेक्शन लगाने के द्वारा, हम समय के साथ खून की फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने के लिए सक्षम हैं। सामान्य परिस्थितियों के अंतर्गत प्रारंभिक प्रतिदीप्ति का लगभग 85% गुर्दे के माध्यम से स्राव के माध्यम से, एक 24 घंटा अवधि के दौरान, खून से खो दिया है। एक पेरिकार्डियल अंतरिक्ष में इंजेक्शन वाहिका में स्वतंत्र रूप से गुजरता है कि कम मेगावाट dextran के साथ ही संभव है कि ध्यान देना चाहिए। इस प्रकार, इस परख केवल कम वजन आणविक घटकों के लिए निकासी की दर के लिए एक पढ़ने के लिए बाहर देता है और केशिकागुच्छीय निस्पंदन की प्रभावकारिता के बारे में कोई जानकारी नहीं देता है। बाद में अधिक सीधे वाहिका संरचना में और न पेरिकार्डियल अंतरिक्ष में इंजेक्शन की आवश्यकता होती है, केडीए 70 से अधिक उच्च आणविक भार रंगों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। दरअसल, विभिन्न मेगावाट की dextrans आगे गुर्दे समारोह 28 काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
zebrafish pronephric नलिकाओं अत्यधिक मो के साथ रोमक रहे हैंक्लोअका 3,4 की ओर छानना की आवाजाही की सुविधा है कि टाइल सिलिया। सिलिअरी मशीनरी में दोष गुर्दे की बीमारी में फंसाया गया है। बीबीएस बचपन शुरुआत रेटिना अध: पतन, जल्दी शुरू होने मोटापा, संज्ञानात्मक हानि, polydactyly और गुर्दे की कुरूपता 24 द्वारा विशेषता एक आनुवंशिक रूप से विषम, ऑटोसोमल पीछे हटने का विकार है। तिथि करने के लिए, 20 बीबीएस जीन (BBS1-20) की पहचान की गई है। बीबीएस के विघटन zebrafish 9 में गुर्दे पुटी गठन और दोषपूर्ण pronephric समारोह की ओर जाता है। BBS9 बीबीएस मामलों में 24 में से 6% के लिए खाते में म्यूटेशन जो की उचित ciliogenesis के लिए BBSome जिम्मेदार फार्म करने के लिए अन्य बीबीएस प्रोटीन, साथ सूचना का आदान प्रदान। एक zebrafish bbs9 पछाड़ना मॉडल सूचित किया गया है whilst, गुर्दे phenotype की एक विवरण 26 की कमी थी। Morpholino दृष्टिकोण का उपयोग कर, zebrafish में bbs9 नीचे दस्तक द्वारा, हम यह निर्धारित करने के लिए एक विधि के रूप में गुर्दे की निकासी परख के उपयोग के प्रदर्शनएक गुर्दा रोग मॉडल में गुर्दे समारोह। यहाँ, हम bbs9 morphant भ्रूण गुर्दे कम मेगावाट विलेय को दूर करने में विफल रहा है कि यह दर्शाता है, रक्त प्रवाह से अवस्र्द्ध फ्लोरोसेंट निकासी को प्रदर्शित करता है। इस प्रकार, क्योंकि ciliogenesis में bbs9 की भागीदारी, और छानना आंदोलन को सुविधाजनक बनाने में pronephric सिलिया की भूमिका की, morphants में मनाया गुर्दे की निकासी न्यायपालिका सिलिया समारोह की वजह से होने की संभावना है। इस विधि zebrafish रोग मॉडल में गुर्दे समारोह का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
Jaipreet Bharj द्वारा प्रदान की तकनीकी सहायता। इस काम में यूरोपीय संघ-FP7 (SYSCILIA -241,955) और डच किडनी फाउंडेशन (CP11.18) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
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