Summary
Sebrafisk er et populært verktøy for å modellere kronisk nyresykdom (CKD). Men gjør sin lille størrelse det umulig å vurdere nyrefunksjonen ved hjelp av tradisjonelle metoder. Vi beskriver et fluorescerende fargestoff nyre clearance-analyse som tillater en kvantitativ analyse av sebrafisk nyrefunksjon hos CKD.
Abstract
Sebrafisk embryo tilbyr en medgjørlig modell for å studere organogenesis og modellere menneskelige genetisk sykdom. Til tross for sin relative enkelhet, utvikler sebrafisk nyre og fungerer på omtrent samme måte som mennesker. En stor forskjell i konstruksjonen av det humane nyre er tilstedeværelsen av millioner av nephrons forhold til sebrafisk som har bare to. Men forenkle en så kompleks system i grunnleggende funksjonelle enheter har hjulpet vår forståelse av hvordan nyrene utvikler og drifter. I sebrafisk, er midtlinjen beliggende glomerulus ansvarlig for den første blodfiltrering i to pronephric tubuli som divergerer for å kjøre ned bilateralt den embryonale akse før den festes til hverandre ved cloaca. De pronephric tubuli er tungt befolket av bevegelige flimmerhår som letter bevegelsen av filtratet langs segmentert tubuli, slik at utveksling av ulike oppløste stoffer før slutt avslutter via cloaca 2-4. Mange gener ansvarlig for CKD, incInkl de som er knyttet til ciliogenesis, har blitt studert i sebrafisk 5. Men en stor trekke tilbake har vært problemer med å evaluere sebrafisk nyrefunksjon etter genetisk manipulasjon. Tradisjonelle analyser for å måle nyre dysfunksjon hos mennesker har vist seg ikke translasjonsforskning til sebrafisk, hovedsakelig på grunn av sin vannmiljøet og liten størrelse. For eksempel er det ikke er fysisk mulig å trekke ut blod fra embryonisk trinnvis fisk for analyse av urea og kreatinin-innhold, da de er for små. I tillegg trenger sebrafisk produserer ikke nok urin for å teste på en enkel proteinuri 'peilepinnen ", som ofte utføres under innledende pasientundersøkelser. Vi beskriver en fluoriserende analyse som benytter den optiske gjennomsiktigheten på sebrafisk for kvantitativt å overvåke clearance av et fluorescerende fargestoff, over tid, fra vaskulaturen og ut gjennom nyrene, for å gi en utlesning av nyrefunksjonen 1,6-9.
Introduction
Den menneskelige nyre spiller en avgjørende rolle i å filtrere metabolske avfall fra blodet og utvinne nødvendige oppløste stoffer for å opprettholde cellulære homeostase. Det finnes en rekke genetiske sykdommer som forårsaker svikt i nyrefunksjonen. Den vanligste arvelig nyresykdom er autosomal dominant polycystisk nyresykdom (ADPKD) preget av utviklingen av væskefylte blærer i nephritic tubuli; skader forårsaket av cystogenesis er skadelig for nyrefunksjonen 10. ADPKD har en forekomst på 1: 800-1: 1000 og står for 8-10% av pasienter i siste stadium nyresvikt (ESRF) 11. Flere gener har vært innblandet å forårsake ADPKD inkludert polycystin-1 (PKD1) og -2 (PKD2), og står for ca 85% og 15% av tilfellene henholdsvis 12,13. Videre genproduktene for PKD1 og -2 lokalisere til cilium og er grunnleggende for ciliogenesis 14,15. Det er nå en anerkjent familie av menneskelige genetiske lidelser, kjent somde ciliopathies, som påvirker flimmerhårene funksjon og resultere i CKD 16.
Det økende antall menneskelige genetiske sykdommer som påvirker stråle utvikling og funksjon er tegning global interesse i denne gang regnet rudimentært organelle. Cilium, et hår-lignende mobil utvekst, er beriket med reseptorer og ionekanaler som er nødvendige for transduksjon av viktige cellesignale hendelser. Cilium består av et mikrotubulus-basert axoneme, vanligvis strukturert i ni radielt anordnede mikrotubul dubletter, med eller uten et sentralt par av sing mikrotubuli. Den axonemal strukturen definerer type og virke ciliare handling. Den 9 + 2 mikrotubuli arrangement overfører motilitet til cilium hvor det er benyttet i bevegelse av fluider på tvers av epiteliale overflater. Den 9 + 0-konfigurasjon er ikke bevegelige, men antas å hovedsakelig funksjon i cellulære signal hendelser 17. Bortsett fra CKD, konsekvensene av ciliary dysfunksjon er et sett av karakteristiskeciliopathy funksjoner som inkluderer, fedme, retinal degenerasjon, polydactyly, og kognitiv svikt 16. Imidlertid er CKD blant de mest skadelig for pasientens livskvalitet og derfor en viktig drivkraft bak utviklingen av passende in vivo modeller for ciliary relatert CKD.
Sebrafisk er en utmerket modell for å forstå etiologien av human genetisk sykdom. Deres rask utvikling, tillater produksjon av store antall egg, gjennomsiktig vev, og ex utero vekst sebrafisk utviklingsprosesser som skal visualiseres og biologiske hendelser manipulert med stor letthet. Gener kan genetisk endret ved hjelp av den siste suksess av genomet redigeringsverktøy (CRISPR 18 og TALENS 19), slås ned ved hjelp av antisense-morfolino-teknologi 20, eller farmakologisk regulert ved tilsetning av forbindelsene til deres vannmiljøet. Faktisk, sebrafisk tilby en plattform for å gjennomføre experiments som ikke er ettergivende i andre dyremodeller. Mens sebrafisk er relativt enkle virveldyr (i forhold til mennesker) de deler mange funksjonelt konserverte organer, gener og signalprosesser i felles med mennesker. For eksempel er den sebrafisk nyre bemerkelsesverdig lik i struktur og funksjon i forhold til mennesker 21,22. Men i motsetning til pattedyrnyre som utvikler seg gjennom en rekkefølge av faser, som hver er merket med et mer utviklet nyre (pronephros, mesonephros og metanephros), den embryoniske sebrafisk bare utvikler en pronephros, de mest umodne form av en nyre. Mens millioner av nephrons kan bli funnet danner byggesteinene i pattedyr nyre, bare sebrafisk embryo eie to. Glomeruli, som gir mulighet for den første blod filtratet blir kondensert på midtlinjen bare til ventral aorta. Blod filtreres gjennom glomeruli inn i pronephric tubuli som kjører caudally langs aksen, fusing før avslutte via cloaca. Den pronephric tubules er tungt cilierte med bevegelige cilier som er ettergivende for strømmen av filtrat inn i caudal exit 3,4. Denne enkle pronephric strukturen opprettholder sebrafisk homeostase gjennom flere uker med larve vekst der de til slutt utvikle seg til en mer kompleks mesonephros struktur 21. Men sebrafisk aldri utvikler en metanephros 21. Til tross for de sebrafisk særegenheter, er sebrafisk nephron segmentert med genekspresjonsprofiler lik den som ble observert hos pattedyr og gir dermed en uovertruffen in vivo modell for nephrogenesis 3,22.
Rutinemessig pasienter blir testet for nyrefunksjonen gjennom en serie av blod- og urinprøver. Typisk blodet blir analysert for oppløste salter, urea og kreatinin. Høye nivåer av urea, kreatinin og unormale konsentrasjoner salt indikerer problemer med nyrefunksjonen. Urinanalyse ved hjelp av en kolopeilepinnen oppdager unormale nivåer av protein, blood, puss, bakterier og sukkeret er tilstede i urinprøver. Slike tester krever normalt ca 30 ml urin eller 5 - 10 ml blod. Det har vært vanskelig å oversette disse typer av assay for små in vivo modellorganismer, slik som sebrafisk, hovedsakelig på grunn av det umulige natur samle tilstrekkelig blod eller urin for å utføre analysen. Her tar vi av mangel på egnede sebrafisk nyre funksjonstester og beskrive en innovativ teknikk for sin studie. Ved å injisere et fluorescerende fargestoff inn i blodstrømmen er vi i stand til å overvåke og individuelt kvantifisere over tid filtrering og utskillelse av fluoriserende aktivitet fra blodet gjennom nyrene. Denne metoden kan brukes til å studere nyreskade forårsaket av sykdom, som vi gi et eksempel på.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Animal vedlikehold, reindrift, og prosedyrene er definert og kontrollert av Dyr (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986. Alle dyreforsøk har blitt utført under konsesjoner gitt av innenriksminister (PIL nr 70/7892) i samsvar med biologisk Tjenester Management Group og biologisk Services Etisk Komité, SGUL, London, UK. Alle forsøk ble gjort for å redusere antall dyr som brukes og for å avgrense både prosedyrer og dyrehold for å minimere lidelse og forbedre velferden.
1. Utarbeidelse av instrumenter, Bedøvelse, og Fluorescent Dye
- Ved hjelp av en mikropipette avtrekker og borosilikat standard veggkapillærer (uten filamenter) trekker nåler av passende lengde for mikroinjeksjon (figur 1A).
- Gjør en agarose mold for orientering av embryoer for enkel injeksjon i hjerteposen (figur 1B). Lim omtrent ti glass mikroskop slides sammen for å danne en "trapp" av offset lysbilder. For best resultat, bruk en dråpe rask sett epoxy lim i midten av hvert lysbilde.
- Klipp ut en del av ca 78 mm i lengde halvveis gjennom to 10 ml plastpipetter ved hjelp av en gassbrenner oppvarmet skalpell, fjern pipette ender som passer. Fest og lim (epoxy) pipette seksjoner til de stablet glass for å gi stabilitet slik at formen til å dyppe i en 90 mm petriskål. Gjøre vårt ytterste for å sikre glide hjørner justere vinkelrett på petriskål gulvet. La limet tid til å stille inn.
- Støpt i formen i en 2% agarose løsning laget i fisk vann (oppnådd fra akvariet). Hell agarose inn i en 90 mm petriskål og plassere formen på toppen av det åpne petriskål, tillater den stablede glidekantene for neddykking i en vinkel under agarose overflate. Permisjon for å sette på laboratoriebenken i 30 min.
- Fjern lysbildet støpt og dekke slide-trykt agarose med fersk fisk vanninneholder Tricaine bedøvelse (se trinn 1.9) på en 1:25 ratio.
- Lage løsninger med rhodamine dekstran (RD) fargestoff. Resuspender rhodamin B 10.000 MW merket dekstran i Autoclaved ultrarent vann for å gi en stamkonsentrasjon på 50 mg / ml. For mikroinjeksjon, ytterligere utvanne aksjen til en endelig konsentrasjon på 5 mg / ml i autoklaveres ultrarent vann.
MERK: pigmenterte celler begynner å differensiere i sebrafisk fra 24 timer etter befruktning (HPF); disse kan skjule fluorescerende markører under bildet oppkjøpet. - Hemme melanocyte formasjon ved hjelp av N -Phenylthiourea (PTU), som blokkerer melanogenesis gjennom hemming av tyrosinase. Gjør en 0,003% stamløsning av PTU PTU ved å oppløse pulveret i akvarievannet, varme oppløsningen ved 60 ° C til fullstendig oppløseliggjøring.
- Inkuber sebrafisk embryoer i metylenblått-løsning, en mild fungicid, for å hindre soppoppblomstring og øke overlevelsen. Tilsett 2 ml metylen blå lagerløsning, inneholdende 0,1% metylenblått i ultrapure vann til 1 liter akvarievannet og bruk som en standard embryo medium.
- Utgjør en 15 mM lager konsentrasjon av Tricaine / etyl-3-aminobenzoat metansulfonatsaltet som beskrevet i "The Sebrafisk Book '23. Bedøve embryoene og følgelig immobilisert dem til å utføre mikroinjeksjon prosedyren.
- Etter bedøvelse embryoene, orientere dem, for avbildning ved hjelp av ikke-giftig og viskøse egenskaper metylcellulose. For å gjøre en 200 ml fremstilling av 3% metylcellulose, chill 130 ml vann ved -20 ° C i 30 min og sted på is. Varm 70 ml vann til 80 ° C i et begerglass, tilsett 6 g metylcellulose og agitere ved hjelp av en glasstav inntil alle partikler er fuktet og jevnt dispergert. Tilsett is-kaldt vann, bland og la preparatet for å kjøle ved 4 ° C i 30 min før alikvoteringsprosessen i 50 ml rør.
MERK: Senke temperaturen tillater propylmetylcellulose å bli løselig. Løsningen vil bli tykkeresom pulver hydrater. 3% metylcellulose kan lagres uten bakterievekst i korte perioder på en uke ved 4 ° C eller i lengre tid ved -20 ° C. Kontroller at methylcellulose har nådd romtemperatur før bruk. - Å utføre injeksjoner av fluorescerende fargestoff inn i sebrafisk bruke en standard mikroinjeksjon oppsett (figur 1C). Denne består av en luftkompressor som er koblet til en trykkregulator system som strømmer inn i en rett pipette holder for bruk med 1,0 ytterdiameter kapillærer. Pipetten Holderen skal være plassert innenfor en MM33 kompakt 3-akse kontroll mikromanipluatoren festet til en stålbunnplate av en magnetisk stativ. Embryoer kan visualiseres, manipulert og injiseres med en stereo disseksjonsmikroskop.
2. Sebrafisk Husbandry og Pre-injeksjon Behandling
- Opprettholde sebrafisk som tidligere beskrevet 23. Bruke et akvarium oppsett som gir resirkulerende vann som tilføres ved en konstant temperatur på 28,5 ° C, Kondisjonert til pH 6.8 til 7.2 og ledningsevne av 450-550 iS med natriumbikarbonat og Instant Ocean Sea Salt, henholdsvis. Bruk villtype eller transgene sebrafisk linjer som passer til forsøket, opprettholde en tetthet på 15 hanner til 15 hunner per 8 L tank. Still fisk anlegget foto til 14 timer med dagslys mellom 9 am - 23:00.
- Sebrafisk gytingen starter i begynnelsen av fotosyklusen, når lysene slås på i morgen. For å sikre maksimal egg kan samles uten å forstyrre fisken, senk avl tanker (som inneholder mesh inserts, tilgjengelig fra sebrafisk spesialister) i villtype lager tanks kvelden før samlingen.
- På dagen for innsamling, tillate 30 - 40 min for fisken å gyte, etter som samler inn og skyll egg ved hjelp av en tesil og friskt akvarium vann. Deponere renset egg i en 90 mm petriskål inneholder embryo medium og inkuberes ved 28,5 ° C.
- Unn embryoene med PTU å hemme Melanogenesis. På 8 HPF, overføre levedyktige embryoer i minimal væske til ferske petriskåler som inneholder 1: 100 PTU til embryo medium og videre ruge på 28.5 ° C til 72 HPF.
MERK: PTU kan forårsake utviklingsdefekter hvis brukt på tidligere stadier så bør begrenses til å poste 8 HPF etapper, men kan behandles så sent som 24. HPF. Sen tilsetning av PTU ikke fullstendig blokkere pigmentering øyet, men generelt er suksessfullt, og inhibering av stammen melanocyttstimulerende dannelse.
3. Mikroinjeksjon
MERK: hjerteposen omgir hjertet, men er atskilt for beskyttelse og enkel hjerte bevegelse av væske i perikard hulrom. Formålet med denne prosedyren er å injisere inn i RD pericardial hulrom, dette tillater hurtig opptak av fargestoff til blodkar-systemet.
- Last nåler med 6 mL - utvannet RD, ved hjelp microloader tips og sikre inn nålholderen av mikromanipluatoren. Bryt enden av nålen med fint tipped tang (Figur 1a). Flytt RD løsning til tuppen av nålen ved å maksimere pulsvarigheten til minuttinnstilling, bytte tilbake til msek gang fullført.
- Bruke et stadium mikrometer, trykkregulatoren, og avgrensninger for nålespissen lengde (ved hjelp av tang) for å justere størrelsen på den utviste dråpe til 100 mikrometer i diameter, tilsvarer dette en 0,5 nl volum (figur 2A).
MERK: Når du bryte nålen, være forsiktig med å bryte for mye av ellers vil det gjøre å kalibrere injeksjonsvolumet vanskelig. Hvis det er nødvendig, ytterligere bryte nålespissen å øke dråpestørrelsen imidlertid opprettholde en nål tykkelse som tillater inntreden i posen uten å bøye eller skade på vev. - Før injeksjon bedøve embryoene i embryo medium som inneholder Tricaine. Sett opp 2 x 35 mm petriskåler som inneholder 5 ml embryo medium, etikett ett 'Tricaine "og den andre" Rehabilitering ".
- Tilsett 200ul på lager Tricaine til korrekt merket parabolen. Gang klar til å injisere, velge en individuell embryo ved 72 HPF og overføre i minimal væske til Tricaine parabolen. Overvåke aktiviteten til embryoet, teste embryoet er bedøvet og immobilisert ved lett bevegelse ved hjelp av en avkortet microloader tips.
- Overfør bedøvet embryo til sprøytestøpeformen, og orientere embryoet i en agarose trau slik at venstre side vender opp, posisjonering hjertet til venstre for synsfeltet.
- Å injisere RD inn i hjertet, pierce hjerteposen med nålen og injisere en nl av RD inn perikard hulrom av bedøvet embryo (figur 2B, høyre panel). Trekk nålen etter injeksjonen. Overføre den injiserte embryo i minimal væske til "Recovery parabolen" og overvåke for 1 min. Overfør den enkelte embryo til en 24-brønners plate inneholdende 1 ml friskt embryo medium (inneholdende PTU) og merke på riktig måte.
MERK: Den hjerteposen er tøft, men det er en bemerkelsesverdig svakt punkt i skjæringspunktet hvor hjerteposen oppfyller ventro-caudal svelget buer og dorso-rostralt plommesekken (figur 2B pilspiss). Nålen bør rettes til dette sporet. Når nålen er på plass, vil et fast trykk med en finger på toppen av mikromanipluatoren lette inntreden i perikard hulrom. - Gjenta trinn 03.02 til 03.06 i minst ti embryoer per eksperimentelle gruppen, plasserer hver fisk i en egen brønn og unikt labelto tillatelse individuelle eksperimentelle oppfølging. Inkuber ved 28,5 ° C i 3 timer.
4. Imaging Acquisition
- Ved 3 timer etter injeksjon (hpi) bedøve embryoer, som beskrevet tidligere, og overføre til en 35 mm petriskål inneholdende 3% metylcellulose. Trykk forsiktig embryoer inn i metylcellulose og orientere slik at den laterale side kan avbildes.
- Erverve et bilde av embryoet under UV, ved hjelp av et filter for visualisering of lyset ved 570 nm (figur 2C). Etter image oppkjøpet, la embryoet å gjenopprette før du setter i den utpekte godt. Hente bilder for alle injisert embryoer og videre ruge på 28.5 ° C.
MERK: I denne protokollen brukte vi en fluorescerende stereomikroskop med en TXR filter sett, en DFC300FX kamera og respektive programvare. Noterer nøyaktig oppkjøps innstillingen til senere image oppkjøpet. - Ved 24 HPI, skaffe en ny runde med bilder som beskrevet ovenfor. Når alle bildene er kjøpt, på både tre HPI og 24 HPI, humant avhende embryoene eller bruke til andre eksperimentelle midler f.eks, immunhistokjemi.
5. Bildebehandling
- Kvantifisere fluorescerende intensitet av hver injisert embryo, 3 HPI og 24 HPI, ved å analysere bilder med NIH sin ImageJ programvare. Å måle fluorescerende intensitet, åpner et bilde i ImageJ og angi en region av interesse (ROI) på en00 px 2 (Rediger → utvalg → spesifiser).
- Plasser hjerte i midten av ROI (figur 2C), sett målinger for å inkludere gjennomsnittlig grå skala og området (Analyze → sett målinger), utføre måling (Analyze → mål). Fullfør for hvert sett med bilder, 3 HPI og 24 HPI, per embryo og overføre gjennomsnittlig grå skalaverdier til et regneark for videre behandling.
MERK: Vi valgte en fast avkastning størrelse på 100 px 2 som dette omfatter individuelle hjerter mellom embryoer. Hjertet ble valgt til å utføre målinger på grunn av sin store størrelse som gjør at et passende sted å måle fluorescerende innholdet i blodet før inn i nyrene. - Utføre statistisk analyse ved hjelp av egnet statistisk programvare. Sammenligne grupper for statistisk signifikans ved hjelp av en T-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bardet-Biedl syndrom (BBS) er en sjelden heterogen ciliopathy som rammer ca 1: 160 000 mennesker verden over 16 år. Pasienten har et antall tilhørende problemer inkludert polycystisk nyrer, deretter pasienter ofte krever nyre dialyse eller transplantasjon 24. ESRF er den vanligste dødsårsaken i BBS, med rundt 30% av pasientene utvikler CKD 16. Foreløpig har 20 ikke-relaterte gener vært innblandet i BBS uten publisert genotype-fenotype forening. BBS-proteiner har felles protein lokalisering domener innenfor cilium og basal organer som, sammen med pasientenes karakteristiske trekk, antyde en ciliopathy diagnose. BBS9 koder Parathyoid hormon-responsiv B1 (PTHB1) protein som sammen med andre BBS (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) proteiner utgjør kjernen BBSome komplekse ansvarlig for dannelsen av primære cilium 24. Mutasjoner i BBS9 utgjør 6% av BBS cases 24. Videre har PTH vært innblandet i nyre cyste dannelse gjennom å fremme nyre epitelcelleproliferasjon, noe som tyder på at tap av bbs9 funksjon i sebrafisk kan vise nyreskader 25. Tidligere rapporter ved hjelp av en bbs9 knockdown sebrafisk-modellen utelukke en beskrivelse av nyre, presentere muligheten til å demonstrere den beskrevne nyrefunksjon analysen 26. Knockdown av bbs9 funksjon ble oppnådd i sebrafisk ved å injisere, ved 1- til 4-cellestadiet, et antisense-morfolino å blokkere genet bestemt bbs9 oversettelse og parallelt en standard negativ kontroll morfolino mot en intronic mutasjon i humant beta-globin (4 ng bbs9 MO, sekvens: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA og 4 ng kontroll MO, sekvens: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). Vi fant ut at tap av bbs9 funksjon resulterte i 40% av embryoer som viser pronephric cyster av 5 dpf, noe som tyder på at dette var en passende modell for å analyserenyrefunksjon bruker rodamin dekstran klaring analysen. Vi har observert at morphant fisk har en betydelig reduksjon i sin evne til å fjerne det fluorescerende fargestoff etter 24 hpi sammenlignet med kontroller (figur 3) - con: 14.8 ± 1.2 SEM, n = 9; bbs9 MO: 61.0 ± 10.3 SEM, n = 10 ; uparet t-test P-verdi: 0,002). Å utelukke det potensialet som redusert clearance kan skyldes redusert blodsirkulasjon, ble embryoer evaluert for hjerteslag og resirkulering blodceller, både kontroll og morphant fisken hadde sammenlign puls og blodstrøm. Disse dataene indikerer at nyrefunksjonen er nedsatt i bbs9 morphants. Faktisk bbs9 morphant embryoer utvikler cystisk pronephric tubuli samtidige med det som er observert i BBS pasienter.
Figur 1. Utstyr forberedelseog set-up. (A) Borosilicate kapillarene skal trekkes for mikroinjeksjon ved anvendelse av en egnet nål avtrekker. Nålen krever bryte med pinsett (stiplet linje) for å tillate RD for å gå ut nålen, bør man være forsiktig for ikke å bryte nålen for mye å gjengi en nål som ikke kan kalibreres. Målestokk:. 200 mikrometer (B) En agarose mold for embryo manipulasjon og orientering kan være fashioned ved å lime sammen glassplater og plastpipetter (C) Standarden mikroinjeksjon oppsett.. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Figur 2. Mikroinjeksjon av rhodamine dekstran i perikard sac. (A) Kalibrer dråpestørrelse til 10 incanbud Erfaringer (100 mm) på en 1 mm scene reticule. (B) Riktig plassering av nålen (svarte piler) i bresprekk merking skjæringspunktet mellom hale svelget bue, plommesekken og hjertet vil lette piercing vevet (pilspiss). Skala:. 200 um (C) Rhodamine dekstran kan sees raskt opptas av hele vaskulaturen (hvite piler). 100 px to regioner steder som dekker en sentralisert hjerte (gul firkant) bør brukes til å ta målinger av gjennomsnitts grå verdi og dermed pixel / fluorescerende intensitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. knockdown av bbs9 fører defekt nyre funcsjon i sebrafisk. (A) embryoer injisert i perikardium med rhodamin dekstran 3 hpi og 24 hpi, topp- og bunnplater henholdsvis to, enten kontroll eller bbs9 morphant embryoer. Pilspisser angir hjertet; pil viser dannelsen av en pronephric cyste. (B) Prosent fluorescerende intensitet som gjenstår etter 24 HPI kontroll versus bbs9 MO embryoer. Feilfelt viser standardavvik (SEM), ** P ≤ 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebrafisk gir et verdifullt verktøy for å modellere human genetisk sykdom, er deres anvendelse som et vitenskapelig verktøy for in vivo undersøkelser aktivert detaljerte studier av den genetiske nedbrytning av mange biologiske systemer, inkludert nyre. Mye er nå forstått om hvordan sebrafisk nyre utvikler og funksjoner. Den slående likheter til menneskelig nephrogenesis og homologi med sykdomsfremkallende gener 21 har illustrert hvordan sebrafisk er blitt grunnleggende for å forstå hvordan defekter i gen-funksjon føre til patologi av nyresykdom. Faktisk kan genetisk manipulasjon bli uanstrengt oppnådd i sebrafisk ved hjelp av antisense morfolino- knockdown teknologi eller mer avanserte målrettet genom redigeringsverktøy som TALENS eller CRISPR. Opprette knockdown eller mutant modeller for mistanke om nedsatt sykdomsfremkallende gener er første skritt i å forstå deres engasjement i sykdom manifestasjon. For å gjøre dette en pålitelig analyse for nyrefunksjonen er søktfor å indikere hvorvidt en kandidat gen er sannsynligvis ansvarlig for patologien observert hos pasienter.
Nyrefunksjonstester er enkel og relativt billig å utføre på mennesker, vanligvis ser på nivåer av oppløste stoffer som er tilstede i blod eller urin. Men disse metodene er ubrukelig i sebrafisk på grunn av sin lille størrelse og akvatisk habitat. Den rodamin dekstran analyse beskrevet her utnytter evnen av pronephric rørelementer for å filtrere lavmolekylære komponenter fra blod. De podocytes posisjonert inne i Bowmans kapsel av nyrene, som konvolutter kapillarene i glomerulus, tillate fri passering av små molekyler som vann, ioniske salter og glukose gjennom en spalte diafragma 27. Filtrerings slisser fungere videre å hindre tap av makro proteiner fra blodet. Filtrering er begrenset til molekyler over 5 kDa og nesten fullstendig blokkert på størrelsen av serumalbumin 28 (ca.0; 65 kDa). Ved å injisere et fluorescerende fargestoff dekstran på omtrent 10 kDa, på en kjent konsentrasjon i det perikardiale hulrom, er vi i stand til å måle fluorescerende intensitet av blodet over tid. Under normale forhold er ca. 85% av opprinnelig fluorescens går tapt fra blodet, i løpet av en 24 timers periode, gjennom utskilling via nyren. Man bør merke seg at injeksjon i perikard plass er bare mulig med lav MW dekstran som går fritt inn i blodkar. Dermed denne analysen gir bare en lese-out for frekvensen av klaring for lavmolekylære komponenter og gir ingen informasjon om effekten av glomerulær filtrasjon. Sistnevnte kan vurderes mer direkte ved hjelp av høy molekylvekt over 70 kDa fargestoffer, som krever injeksjon i det vaskulære karet og ikke inn i perikardial plass. Faktisk kan dekstraner med forskjellige mWs bli brukt for ytterligere å dissekere nyrefunksjon 28.
De sebrafisk pronephric rørelementene er svært cilierte med mofliser cilier som letter bevegelsen av filtratet mot cloaca 3,4. Defekter i ciliary maskiner har vært innblandet i nyresykdom. BBS er en genetisk heterogen, autosomal recessiv lidelse preget av barndommen-utbruddet retinal degenerasjon, tidlig debut fedme, kognitiv svikt, polydactyly og nedsatt misdannelse 24. Hittil har 20 BBS gener (BBS1-20) blitt identifisert. Avbrudd av bbs fører til nedsatt cyste dannelse og defekt pronephric funksjon i sebrafisk 9. BBS9 samhandler med andre BBS proteiner for å danne BBSome ansvarlig for passende ciliogenesis, mutasjoner som står for 6% av BBS tilfeller 24. Mens en sebrafisk bbs9 knockdown modellen har blitt rapportert, var en beskrivelse av nedsatt fenotype mangler 26. Ved å slå ned bbs9 i sebrafisk, bruker morfolino- tilnærming, vi demonstrere bruken av renal clearance analysen som en metode for å bestemmenyre-funksjon i en nyresykdom modell. Her viser vi at bbs9 morphant embryoer vise hemmet fluorescerende klaring fra blodet, noe som indikerer at nyrene ikke klarte å fjerne lave MW solutes. Således, på grunn av involvering av bbs9 i ciliogenesis, og rollen til pronephric cilia i å tilrettelegge filtrat bevegelse, er den observerte nyre clearance i morphants sannsynlig å være på grunn av avvik cilier funksjon. Denne metoden representerer et verdifullt verktøy for å vurdere nyrefunksjonen i sebrafisk sykdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Teknisk bistand fra Jaipreet Bharj. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra EU-FP7 (SYSCILIA -241955) og Den nederlandske Kidney Foundation (CP11.18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , Academic Press. (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
