Summary
Zebra balığı, kronik böbrek hastalığı (KBH) modellemek için popüler bir araçtır. Ancak, kendi küçük boyutu imkansız geleneksel yöntemlerle böbrek fonksiyonlarını değerlendirmek için yapar. Biz CKD zebrafish böbrek fonksiyonunun kantitatif analiz sağlayan bir floresan boya böbrek boşluk tahlil 1 açıklar.
Abstract
Zebra balığı embriyo organogenezi çalışma ve insan genetik hastalık modellemek için bir uysal bir model sunuyor. Göreli basitliğine rağmen, Zebra balığı böbrek geliştirir ve insanlar hemen hemen aynı şekilde çalışır. İnsan böbrek yapımında önemli bir fark sadece iki olan Zebra balığı göre nefron milyonlarca varlığıdır. Ancak, temel fonksiyonel birimler halinde böyle karmaşık bir sistemin basitleştirilmesi böbrek geliştirir ve nasıl çalıştığını anlayışımızı destekli etti. Zebra balığı, glomerulus bulunduğu orta hat cloaca birbirine kaynaştırarak önce embriyonik eksen aşağı ikili çalıştırmak sapmak iki Pronephric tübüllerine ilk kan filtrasyon sorumludur. Pronephric tübüller ağır nihayet cloaca 2-4 vasıtasıyla çıkmadan önce çeşitli çözünenlerin alışverişini sağlayan, parçalı tübül boyunca süzülen maddenin hareketini kolaylaştıran hareketli kirpikler tarafından doldurulur. CKD, inc sorumlu Birçok genlerciliogenesis ile ilgili olanlar luding, zebrabalıkları 5 incelenmiştir. Ancak, büyük bir beraberlik geri genetik manipülasyon sonra Zebra balığı böbrek fonksiyonunu değerlendirmede zorluk olmuştur. İnsanlar çoğunlukla nedeniyle sucul ortamda ve küçük boyutu, Zebra balığı olmayan translasyonel kanıtladık Geleneksel tahliller böbrek disfonksiyonu ölçmek için. Örneğin, embriyonik üre ve kreatinin içeriğinin analizi için balık kademeli gelen bunlar çok küçük oldukları gibi, kan çıkarmak için fiziksel olarak mümkün değildir. Buna ek olarak, Zebra balığı genellikle ilk hasta muayeneleri sırasında yapılan basit bir proteinüri 'yağ çubuğu' üzerinde test için yeterli idrar üretemezler. Böbrek fonksiyonu 1,6-9 üzerinden bir okuma vermek için, damar ile ilgili ve dışarı böbrek yoluyla niceliksel olarak, zaman içinde, bir floresan boya açıklık izlemek için zebrabalıkları optik saydamlığı kullanan bir floresan deneyi tarif eder.
Introduction
İnsan böbrek kanından metabolik atıkların filtreleme ve hücresel homeostazı sürdürmek için gerekli eriyiklerin kurtarma önemli bir rol oynar. Böbrek fonksiyon bozukluğuna neden olan insan genetik hastalıkların bir dizi vardır. En yaygın kalıtsal böbrek hastalığı böbrek tübülleri içindeki sıvı dolu keseler gelişimi ile karakterize otozomal dominant polikistik böbrek hastalığı (polikistik böbrek) 'dir; cystogenesis kaynaklanan hasar böbrek fonksiyonu 10 için zararlıdır. 800-1: polikistik böbrek 1 oluştuğunun vardır 1,000 ve 8 hesapları - son dönem böbrek yetmezliği (SDBY), 11 hastada% 10. Birkaç genler yaklaşık% 85 ve sırasıyla 12,13 vakaların% 15 için muhasebe, polikistin-1 (PKD1) ve -2 (PKD2) dahil ADPKD neden suçlanmıştır. Ayrıca, gen PKD1 ürünleri ve -2 cilium lokalize ve ciliogenesis 14,15 temelidir. Olarak bilinen insan genetik bozukluklar, tanınmış bir aile artık varkirpikler fonksiyonunu etkileyebilir ve CKD 16 neden ciliopathies.
siliyer gelişimini ve fonksiyonunu etkileyen insan genetik hastalıkların giderek artan sayıda bu kez kabul körelmiş organel küresel ilgi çekiyor. kirpik, saç benzeri hücresel çıkıntı, reseptörler ve anahtar hücre sinyal olayları transdüksiyonu için gerekli iyon kanalları ile zenginleştirilmiştir. kirpik tipik olarak ya da tekil mikrotübül merkezi bir çift olmaksızın dokuz radyal olarak düzenlenmiş mikrotübül çifti içine yapılandırılmış bir mikrotübül göre aksonem oluşur. axonemal yapısı siliyer eylem türünü ve modunu tanımlar. 9 + 2 mikrotübül düzenlemesi epitel yüzeyleri boyunca sıvıların hareketi kullanılmaktadır kirpiğin hareketliliğini bahşeder. 9 + 0 yapılandırması olmayan hareketlidir ama hücresel sinyal olaylar 17 ağırlıklı olarak işlev inanılmaktadır. Dışında CKD gelen, siliyer disfonksiyon sonuçları karakteristik bir dizi vardır, obezite, retina dejenerasyonu, polidaktili ve kognitif bozukluk 16 dahil ciliopathy özellikleri. Ancak, CKD hastanın yaşam kalitesi en zararlı ve bu nedenle silier ilgili CKD için vivo modellerde uygun gelişiminin arkasındaki önemli bir itici güç arasındadır.
Zebra balığı, insan genetik hastalığının etyolojisi anlamak için mükemmel bir model. Bunların pratik geliştirme, yumurta, çok sayıda şeffaf doku ve eski in utero büyüme üretimi zebra balığı gelişim süreçleri görsel ve biyolojik etkinlik önemli kolaylıkla idare edilmesine olanak sağlamaktadır. Genler genetik, genom düzenleme araçları (CRISPR 18 ve TALENS 19) son başarısını kullanılarak değiştirilmiş antisens morfolino teknolojisi kullanılarak 20 nakavt, ya da farmakolojik onların su ortamında bileşiklerin eklenmesi ile kontrol edilebilir. Nitekim, Zebra balığı e üstlenmek için bir platform sunuyoruzDiğer hayvan modellerinde izin veren değil xperiments. Zebra balığı iken insanlarda ile birçok ortak işlevsel korunmuş organları, genleri ve sinyalizasyon işlemleri paylaşan (insanlara kıyasla) nispeten basit omurgalılar vardır. Örneğin, Zebra balığı böbrek insanlara 21,22 oranla yapısında ve fonksiyonunda oldukça benzer. Ancak, fazların bir arkaya yoluyla gelişir memeli böbrek aksine, her bir daha gelişmiş böbrek (pronephros, mezonefros ve metanephros) ile işaretlenmiş, embriyonik zebrafish sadece bir pronephros, bir böbreğin en olgunlaşmamış formu geliştirir. Nefron milyonlarca memeli böbrek yapı taşlarını oluşturan bulunabilir iken, Zebra balığı embriyo sadece iki sahip. İlk kan süzülen kısım için izin glomerüller, aort orta hatta sadece ventral olarak kaynaşmıştır. Cloaca yoluyla çıkmak için önce eritme, eksen boyunca kaudal çalıştırmak Pronephric tübüllerine glomerüllerden kan filtreleri. Pronephric tubules ağır kaudal çıkış 3,4 doğru süzülen maddenin akışına toleranslılar hareketli kirpikler ile kirpikli edilir. Bu basit Pronephric yapı onlar sonunda bir daha karmaşık yapıya mezonefros 21 haline larva büyümenin birkaç hafta boyunca Zebra balığı homeostazı korur. Bununla birlikte, zebra balığı, bir metanephros 21 geliştirir olmadı. Zebra balığı özel duruma rağmen, zebra balığı nefron memelilerde görülen eşit gen sentezleme profilleri ile bölümlere ve böylece nefrogenezisi 3,22 in vivo modelinde rakipsiz sunmaktadır.
Rutin hasta, kan ve idrar testleri bir dizi böbrek fonksiyonu için test edilir. Tipik haliyle, kan çözülmüş tuzları, üre, kreatinin için analiz edilir. Üre, kreatinin ve anormal tuz konsantrasyonu yüksek düzeyde böbrek fonksiyonu ile ilgili sorunlar göstergesidir. Bir kolorimetrik çubuğunu kullanarak İdrar tahlili proteini, bloo anormal seviyelerini algılard irin, bakteri ve idrar örneklerinde şeker mevcut. Kanın 10 ml - Bu gibi testler, normal olarak idrar yaklaşık 30 ml ya da 5 gerektirir. Bu esas olarak tahlili gerçekleştirmek için yeterli kan ya da idrar toplama imkansız olması sebebiyle, söz zebrabalıkları gibi in vivo model organizmaların, küçük deneylerde, bu tür çevirmek için zor olmuştur. Burada, biz uygun zebrabalıkları böbrek fonksiyon testleri eksikliğini gidermek ve çalışma için yenilikçi bir teknik tarif. Kan akışı içine bir floresan boya enjekte edilmesi Böbreğin ile kandan süzme ve floresan aktivitesi atılımını izlemek ve ayrı ayrı zaman içinde ölçmek mümkündür. Bu yöntem, bir örnek teşkil hastalığın neden olduğu böbrek hasarı, çalışma için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Hayvan bakım, hayvancılık ve prosedürler Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 Tüm hayvan deneyleri Biyolojik uygun Ana Sekreteri (PIL No 70/7892) tarafından verilen lisanslar altında gerçekleştirilmiştir tarafından tanımlanan ve kontrol edilir Hizmetleri Yönetimi Grubu ve Biyolojik Hizmetleri Etik Komitesi, SGUL, Londra, İngiltere. Tüm çabalar kullanılan hayvanların sayısını azaltmak ve refah acı en aza indirmek ve geliştirmek amacıyla hem usul ve hayvancılık rafine yapılmıştır.
1. Araçların, Anestezik hazırlanması ve Floresan Boya
- Bir mikropipet çektirmesi ve (filamentler olmadan) borosilikat standart duvar kılcal mikroenjeksiyon (Şekil 1A) için uygun uzunlukta iğneler çekin kullanma.
- Perikard (Şekil 1B) içine kolay enjeksiyon için embriyo yönlendirme için bir agaroz kalıp olun. Tutkal yaklaşık on cam mikroskop slBirlikte ides ofset slaytlar bir 'merdiven' oluşturmak için. En iyi sonuçlar için, her slayt merkezinde hızlı set epoksi reçine yapıştırıcı bir damla kullanın.
- Kaldırmak, bir Bunsen beki ısıtılmış neşter kullanılarak iki adet 10 ml'lik plastik pipetler ile uzunluk yarım yaklaşık 78 mm'lik bir bölümünü kesip pipet gibi uygun biter. Takın ve yığılmış cam slaytlar tutkal (epoksi reçine) pipet bölümleri kalıp 90 mm Petri kabı içine daldırma izin istikrar sağlamak. Slayt köşeleri Petri kabı yere dik hizaya sağlamak için her türlü çabayı gösteriyoruz. Tutkal zamanı ayarlamak için izin ver.
- Balık, su içerisinde yapılan% 2 agaroz çözelti içinde kalıp döküm (akvaryum de elde edilmiş). Bir 90 mm Petri kabı içine agaroz dökün ve istiflenmiş slayt agaroz yüzey altında bir açı ile su altında kenarları izin veren açık bir petri kabı üzerine kalıp yerleştirin. 30 dakika için laboratuar bankta ayarlamak için bırakın.
- Slayt döküm çıkarın ve taze balık su ile slayt baskılı agaroz kapakTricaine anestezik içeren 1:25 oranında (adım 1.9 bakınız).
- Rodamin dekstran (RD) boya çözümleri olun. Süspanse rodamin B 10,000 MA, 50 mg / ml'lik bir stok konsantrasyonu için otoklava, aşırı saf su içinde dekstran etiketli. Mikroenjeksiyon için daha otoklavlanmış, aşırı saf su içinde 5 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar stok seyreltin.
NOT: Pigmentli hücreler 24 saat sonra döllenme (hpf) den Zebra balığı ayırt başlar; Bu görüntü alımı sırasında floresan işaretçileri belirsiz olabilir. - Blok tirozinaz inhibe etmek suretiyle melanojenezin K -Phenylthiourea (PTU) kullanarak melanosit oluşumunu inhibe eder. Tam olarak çözündürülmesi için 60 ° C'de akvaryum su, ısı çözeltisi propiltiourasil'in tozunun çözülmesiyle propiltiyourasil'i bir% 0.003 stok solüsyonu olun.
- , Metilen mavisi çözeltisi, hafif fungisit zebrafish embriyolar inkübe mantar blum önlemek ve hayatta kalma artırmak için. U içinde% 0.1 Metilen mavisi ihtiva eden, metilen mavisi stok çözeltisi 2 ml ilave edilirltrapure su, standart bir embriyo ortamı olarak akvaryum su ve kullanım 1 L.
- 'Zebra balığı Kitap' 23 belirtildiği gibi Tricaine / etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu 15 mM stok konsantrasyonu Makyaj. Embriyoların uyutmak ve dolayısıyla mikroenjeksiyon işlemi gerçekleştirmek için onları hareketsiz.
- Embriyoların anestezi sonra, metilselüloz, toksik olmayan ve yapışkan özelliklerini kullanarak görüntüleme için, yönlendirilmesi. % 3 metilselüloz 200 ml'lik bir hazırlık yapmak buz üzerinde 30 dakika karıştırıldı ve bir yer için -20 ° C 'de suyun 130 ml soğuk için. , Bir cam beher içinde, 80 ° C'ye kadar 70 mi kadar su Isı metilselüloz 6 g ekleyin ve bütün parçacıkları ıslatıldığında ve düzgün bir şekilde dağılmıştır kadar bir cam çubuk kullanılarak çalkalayın. Buz soğukluğunda su ekleyin karıştırın ve hazırlama 50 ml tüpler içinde aliko haline önce 30 dakika boyunca 4 ° C'de soğumaya bırakın.
NOT: sıcaklık düşürülmesi metil çözünür olmayı sağlar. Çözelti daha kalın olacakToz hidratlar gibi. % 3 metil bakteriyel 4 ° C 'de bir haftalık, kısa süreler için büyüme ya da -20 ° C'de daha uzun olmayan saklanabilir. Metilselüloz Kullanmadan önce RT ulaşmıştır emin olun. - Zebra balığı içine floresan boya enjekte gerçekleştirmek için bir standart mikroenjeksiyon set-up (Şekil 1C) kullanın. Bu 1.0, dış çap kapiller ile kullanım için düz bir pipet tutucusunun içine besleyen bir basınç düzenleyici sistemine bağlı bir hava kompresörü oluşur. Pipet tutucu bir manyetik stand ile bir çelik taban plakasına sabitlenmiş bir MM33 kompakt 3-eksenli kontrol mikromanipülatör içinde muhafaza edilmelidir. Embriyolar manipüle, görsel ve bir stereo mikroskop kullanarak enjekte edilebilir.
2. Zebra balığı Yetiştirme ve Ön-enjeksiyon tedavisi
- Daha önce açıklandığı gibi 23 zebrafish koruyun. 28.5 ° C sabit sıcaklıkta verilen sirkülasyon suyu sağlayan bir akvaryum set-up kullanınPH 6.8 şartına - 7.2 ve sodyum bikarbonat ve Anında Okyanus Deniz Tuzu ile 450-550 uS iletkenliği sırasıyla. 8 L tank başına 15 kadın 15 erkek bir stoklama yoğunluğu muhafaza, deney uygun olarak yabani-tip veya transgenik zebrabalıkları hatları kullanın. 09:00-23:00 arasında gün ışığı 14 saat balık tesisi photocycle ayarlayın.
- Zebra balığı yumurtlama ışıkları sabah açmak photocycle, başında başlar. Toplamadan önce yabani türde stok tanklarına akşam üreme tankları (zebrabalıkları uzmanları temin içeren örgü ekler,) batığın, maksimum yumurta balık bozmadan toplanabilir sağlamak.
- Sonra bir çay süzgeci ve taze akvaryum su kullanarak yumurta toplamak ve durulayın, balık için 40 dk yumurtlamaya - toplama gününde, 30 izin. Bir 90 mm Petri kabı içeren embriyo ortamda temizlenir yumurta bırakır ve 28.5 ° C sıcaklıkta inkübe edilir.
- Melano inhibe etmek için propiltiyourasil'i embriyo tedavidoğuşu. 8 hpf, 1 içeren taze petri kaplarına minimal sıvı içinde canlı embriyo transferi: embriyo ortamına 100 PTU ve daha 72 hpf kadar 28.5 ° C'de inkübe.
NOT: PTU yani 8 hpf aşamalarını göndermek için sınırlı olmalıdır erken aşamalarında kullanıldığında gelişimsel bozukluklara neden olabilir, ama geç 24 hpf olarak tedavi edilebilir. PTU Geç eklenmesi tamamen göz pigmentasyon engellemek ama genelde başarılı ve gövde melanosit oluşumunu inhibe vermezse.
3. Mikroenjeksiyon
NOT: perikard kalp encases ama perikard boşluğu içinde sıvı ile koruma ve kardiyak hareket kolaylığı için ayrılır. Bu işlemin amacı, bu damar sistemine boya hızlı alımı için izin veren, perikardiyal boşluğuna RD enjekte edilmesidir.
- 6 ul yük iğneler - Microloader ipuçlarını kullanarak, RD seyreltilmiş ve mikromanipülatör iğne tutucu içine sabitleyin. İnce tipp kullanarak iğne ucunu kırıned forseps (Şekil 1A). , Dakika ayarına darbe süresi maksimize ederek iğne ucu RD çözüm taşı kez tam msan geri dönmek.
- Çapı 100 um sınırdışı damlacık boyutunu ayarlamak için (forseps kullanarak) iğne ucu uzunluğu bir sahne mikrometre, basınç regülatörü ve inceliklerini kullanarak, bu 0.5 nl hacmi (Şekil 2A) eşittir.
NOT: İğneyi kırma yaparken, aksi takdirde zor enjeksiyon hacmi kalibre yapacak kapalı çok kırmak için değil dikkatli olun. Gerekirse ayrıca bununla birlikte açılan boyutunu artırmak dokunun aşırı bükme veya zarar vermeden perikard girişi izin veren bir iğne kalınlığı korumak için iğne ucu bölünürler. - Enjeksiyon öncesinde, Tricaine içeren embriyolar embriyo ortamda uyutmak. 5 ml embriyo orta, etiket, bir 'Tricaine' ve diğer 'Kurtarma' içeren 2 x 35 mm Petri kapları ayarlayın.
- 200 ekleuygun şekilde etiketlenmiş çanak stok Tricaine ul. Enjekte etmek kez hazır, 72 hpf bireysel embriyo seçmek ve Tricaine çanak minimal sıvı içinde aktarmak. Embriyonun aktivitesi Monitör, embriyo anestezi uygulandı ve kesilmiş bir Microloader ucu kullanılarak hafif çalkalama ile hareketsiz hale test edin.
- Enjeksiyon kalıp anestezi embriyo transfer ve sol tarafı yukarı bakacak şekilde görüş alanının solunda kalp konumlandırma böylece agaroz çukur içinde embriyo yolunuzu.
- Kalbin içine enjekte RD için, iğne ile perikard delmek ve anestezi embriyo (Şekil 2B, sağ panel) perikard boşluğuna RD 1 nl enjekte. Enjeksiyondan sonra iğneyi çekiniz. 'Kurtarma çanak' minimal sıvı enjekte embriyo transfer ve 1 dakika izlemek. 1 ml taze embriyo ortamı (PTU ihtiva eder) ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bireysel embriyo transferi ve uygun olarak etiketleyin.
NOT: Perikard zor, ancak perikard ventro-kaudal farenks kemerler ve dorso-rostral yolk kesesi (Şekil 2B ok ucu) karşılayan kesiştiği bir kayda değer bir zayıf nokta vardır. İğne bu oluk yönelik olmalıdır. İğne yerinde olduğunda, mikromanipülatör üstünde bir parmak sağlam bir musluk perikard boşluğuna girişini kolaylaştırmak olacaktır. - Ayrı bir kuyu ve benzersiz labelto izin bireysel deneysel takipleri her balık yer, deney grubu başına en az 10 embriyolar için 3.6 - 3.2 tekrarlayın adımları. 3 saat 28.5 ° C'de inkübe edin.
4. Görüntüleme Toplama
- Daha önce tarif edildiği gibi 3 saat sonra, enjeksiyon (HPI) de embriyolar anestezi ve% 3 metilselüloz içeren 35 mm Petri tabağına aktarın. Yavaşça metilselüloz içine embriyolar itmek ve lateral yan görüntülü böylece yolunuzu.
- Görselleştirme o bir filtre kullanılarak, UV altında embriyo bir görüntü eldef 570 nm (Şekil 2C) ışığı yaydığı. Görüntü alındıktan sonra, embriyo iyi belirlenmiş içinde değiştirmeden önce kurtarmak için izin verir. Tüm enjekte embriyolar için görüntü elde ve daha 28.5 ° C'de inkübe.
NOT: Biz TXR filtre seti, bir DFC300FX kamera ve ilgili uygulama yazılımı ile bir floresan stereomikroskopta kullanılan bu protokolde. Sonraki görüntü elde etmek için tam satın alma ayarları bir yere not edin. - Yukarıda açıklandığı gibi 24 HPI anda, görüntülerin bir ikinci tur kazanır. Tüm görüntüleri elde edildikten sonra, 3 HPI ve 24 HPI hem de, insanca embriyoların imha veya diğer deneysel yollarla, örneğin, immunohistokimyasal için kullanın.
5. Görüntü İşleme
- NIH ImageJ yazılımı kullanarak görüntüleri analiz ederek, 3 HPI ve 24 HPI de, her enjekte embriyo floresan yoğunluğu niceliğini. , Floresan yoğunluğu ölçmek ImageJ bir görüntüyü açmak ve 1 faiz (roi) bir bölgeyi belirtmek için00 px 2 (Düzen → seçimi → belirtin).
- Roi (Şekil 2C) merkezinde kalp yerleştirin, (→ tedbir Analiz) ölçümü gerçekleştirmek, (→ set ölçümleri analiz) ortalama gri skala ve bölgeyi kapsayacak şekilde ölçümler ayarlayın. Embriyo başına, 3 HPI ve 24 HPI de, görüntülerin her set için tamamlayın ve daha fazla işlem için bir elektronik tabloya ortalama gri skala değerleri aktarmak.
NOT: Bu embriyolar arasındaki bireysel kalpleri kapsar Biz 100 px 2 sabit roi boyutu seçilir. Kalp nedeniyle önce böbrek girmeden kan floresan içeriğini ölçmek için elverişli bir konuma sağlayan geniş boyutuna ölçümler yapmak için seçildi. - Uygun istatistiksel yazılım kullanarak istatistiksel analiz gerçekleştirin. Bir öğrencinin t-testi kullanılarak istatistiksel anlamlılık için gruplar karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dünya çapında 16 160,000 kişiyi: Bardet-Biedl sendromu (BBS) yaklaşık 1 etkileyen nadir heterojen ciliopathy olduğunu. Polikistik böbrekler olmak üzere ilgili bir takım sorunlar ile başvururlar, daha sonra hastalar sıklıkla böbrek diyaliz veya transplantasyon 24 gerektirir. SDBY CKD 16 gelişmekte olan hastaların yaklaşık% 30 ile, BBS içinde en sık ölüm nedenidir. Şu anda, 20 sigara ile ilgili genler yayınlanmış genotip-fenotip dernek ile BBS suçlanmıştır. BBS proteinleri hastaların karakteristik özellikleri ile birlikte, bir ciliopathy tanı anlaması, kirpik ve bazal organları içinde ortak protein yerelleştirme etki paylaşıyoruz. BBS9 birlikte diğer BBS ile (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) proteinlerinin primer kirpiksi cisim 24 oluşumu için BBSome kompleks sorumlu çekirdeğini oluşturan Parathyoid hormon duyarlı B1 (PTHB1) proteini kodlar. BBS c% 6 BBS9 hesabında mutasyonlargazlar 24. Bundan başka, PTH böbrek kusurları 25 görüntüleyebilir zebrabalıkları bbs9 fonksiyon kaybının işaret böbrek epitelyal hücre çoğalmasının teşvik edilmesi yoluyla böbrek kist oluşumuna işaret edilmiştir. Bir bbs9 demonte Zebra balığı modeli kullanılarak Önceki raporlar açıklanan böbrek fonksiyonu tahlili 26 gösterme fırsatı sunan, böbrek açıklamasını hariç. Bbs9 fonksiyonunun demonte, 1, 4-hücre aşamasında, enjekte edilerek zebrabalıkları insan beta-Globin bir intronik mutasyon karşı gen spesifik bbs9 çeviri ve paralel bir standart negatif kontrol morfolino engellemek için bir anti-duyum morfolino elde edildi (4 ng bbs9 MO sekansı GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA 4 ng kontrol MO sekansı CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). Biz bu analiz için uygun bir model düşündüren, bbs9 fonksiyon kaybı 5 dpf'e tarafından Pronephric kistler görüntüleyen embriyoların 40% sonuçlandı bulundurodamin dekstran boşluk testi kullanılarak böbrek fonksiyonu. 61.0 ± 10.3 SEM, n = 10: bbs9 MO; 14.8 ± 1.2 SEM n = 9: con - Biz 24 hpi kontrollere kıyasla sonra morphant balık (Şekil 3) floresan boya temizlemek için yeteneği önemli bir azalma olduğu görülmektedir ; t-test P değeri: 0.002). Düşük kan dolaşımı nedeniyle olabilir boşluk azaltılmış potansiyeli ekarte etmek için, embriyolar, kalp atım ve devir daim kan hücreleri için değerlendirildi, kontrolü ve morphant balık hem karşılaştırılabilir kalp hızı ve kan akışını vardı. Bu veriler böbrek fonksiyon bbs9 morphants bozulmuş olduğunu göstermektedir. Nitekim, bbs9 morphant embriyolar BBS hastalarında gözlenen ile eşzamanlı kistik Pronephric tübülleri geliştirmek.
Şekil 1. Ekipman hazırlıkve set-up. (A) Borosilikat kılcal damarlar uygun bir iğne çektirmenin kullanarak mikroenjeksiyon için çekilmelidir. iğne iğne çıkmak için RD izin vermek forseps (kesikli çizgi) ile kırma gerektirir, bakım çok kalibre edilemez bir iğne render iğne kırmak için değil alınmalıdır. Ölçek çubuğu:. 200 mikron (B) embriyo manipülasyonu ve yönlendirme için bir agaroz kalıp cam slaytlar ve plastik pipetler birlikte yapıştırma ile moda olabilir (C), standart mikroenjeksiyon set-up.. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
Perikardiyal kese içine rodamin dekstran Şekil 2. Mikroenjeksiyon. (A) 10 inc için damla boyutu kalibrerements 1 mm sahne reticule üzerinde (100 mikron). (B) doku (ok başı) piercing kolaylaştıracak kaudal farengeal kemer, yumurta sarısı kesesi ve kalp arasındaki kavşak işaretleme crevasse içine iğne (siyah oklar) Doğru konumlandırma. Ölçek çubuğu:. 200 mikron (C) Rodamin dekstran hızla tüm damar (beyaz oklar) tarafından alınan görülebilir. 100 px merkezi kalp (sarı kare) kapsayan çıkarları 2 bölgeleri ortalama gri değeri ve dolayısıyla piksel / floresan yoğunluğu ölçümleri almak için kullanılmalıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bbs9 Şekil 3. demonte arızalı böbrek fonk nedenZebra balığı yon. (A), embriyolar kontrol veya bbs9 morphant embriyolar ya da sırasıyla, 3 HPI 24 HPI, üst ve alt iki panel de rodamin dekstran ile perikard içine enjekte edilir. Ok uçları kalp gösterir; ok Pronephric kist oluşumunu gösterir. (B) Yüzde floresan yoğunluğu bbs9 MO embriyolar karşı kontrol 24 HPI sonra kalan. Hata çubukları, ortalama (SEM) standart hata göstermiyor ** P ≤ 0.01. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balığı, insan genetik hastalık modellemek için değerli bir araç sunmak, in vivo araştırma için bilimsel bir enstrüman olarak kullanılması böbrek dahil olmak üzere birçok biyolojik sistemlerin, genetik arıza detaylı çalışmalar sağlamıştır. Çok şimdi Zebra balığı böbrek geliştirir ve işlevleri nasıl anlaşılmaktadır. İnsan nefrogenezisi ve hastalığa neden olan genlerin 21 ile homoloji çarpıcı benzerlikler anlamada temel hale nasıl Zebra balığı resimli nasıl böbrek patolojisi ile gen fonksiyonu kurşun kusurları. Gerçekten de, genetik manipülasyon zahmetsizce antisens morfolino demonte teknolojisi ya da TALENS veya CRISPR gibi daha ileri hedef genom düzenleme araçları kullanılarak zebrabalıkları elde edilebilir. Şüpheli böbrek hastalığı neden olan genlerin için demonte veya mutant modelleri oluşturma hastalık tezahürü katılımlarını anlamak ilk adımdır. Böbrek fonksiyonu güvenilir bir deneydir aranan Bunu yapmak içinBir aday gen hastalarda gözlenen patoloji olasılıkla sorumlu olup olmadığını göstermek için.
Böbrek fonksiyon testleri genellikle kanda veya idrarda mevcut solutların seviyelerinde bakarak, insanlar üzerinde gerçekleştirmek için basit ve nispeten ucuz. Ancak bu yöntemler nedeniyle küçük boyutu ve sucul habitat Zebra balığı uygulanamaz bulunmaktadır. Burada tarif edilen rodamin dekstran deney kandan düşük molekül ağırlıklı bileşenler filtre Pronephric tübül kabiliyetini kullanır. Podositler glomerül zarf kapiller, su gibi küçük moleküller, iyonik tuzlarının serbest geçişi sağlamak ve bir yarık diyafram 27 yoluyla glikoz olduğu, böbrek Bowman kapsülü içinde konumlandırılmış. filtrasyon yarıklar ayrıca kan makro protein kaybını önlemek için işlev görürler. Filtrasyon yaklaşık (serum albümin 28 boyutunda bloke moleküllerin 5 kDa üstünde ve neredeyse tamamen için sınırlı0, 65 kDa) sahiptir. Perikardiyal boşluğuna bilinen bir konsantrasyonda, yaklaşık olarak 10 kDa'lık bir floresan boya dekstran enjekte edilerek, zaman içinde kan floresan yoğunluğunun ölçülmesi mümkündür. Normal şartlar altında, ilk floresans yaklaşık% 85 böbrek yoluyla salgılama yoluyla, 24 saatlik bir süre boyunca kan kaybolur. Bir perikard uzaya enjeksiyon damar içine serbestçe geçer, düşük MW dekstran ile mümkün olduğuna dikkat etmelidir. Bu durumda, bu deney, sadece düşük molekül ağırlıklı bileşenler için açıklık oranı için bir okuma verir ve glomerüler filtrasyon etkinliği konusunda herhangi bir bilgi vermemektedir. İkincisi daha doğrudan damar içine değil, perikard uzaya enjeksiyon gerektiren, kDa 70 üzerinden yüksek molekül ağırlıklı boyalar kullanılarak değerlendirilebilir. Aslında, çeşitli MW olarak ve dekstranlar da böbrek fonksiyonu 28 incelemek için kullanılabilir.
Zebra balığı Pronephric tübüller çok mo ile kirpikli edilircloaca 3,4 doğru süzülen maddenin hareketini kolaylaştıran kiremit kirpikler. Siliyer makine Kusur böbrek hastalığında suçlanmıştır. BBS çocukluk başlangıçlı retina dejenerasyonu, erken başlangıçlı obezite, bilişsel bozukluk, polidaktili ve böbrek malformasyon 24 ile karakterize bir genetik olarak heterojen, otozomal resesif bir hastalıktır. Bugüne kadar, 20 BDS genleri (BBS1-20) tespit edilmiştir. Bbs bozulması zebrabalıkları 9 renal kist oluşumu ve kusurlu Pronephric fonksiyonu yol açar. BBS9 BBS durumda 24 6% hesaba mutasyonlar olan uygun ciliogenesis için BBSome sorumlu oluşturulması için diğer BBS proteinleri ile etkileşime girer. Bir Zebra balığı bbs9 demonte modeli bildirilmiştir iken, böbrek fenotip bir açıklama 26 eksik. Morfolino yaklaşımını kullanarak, Zebra balığı bbs9 aşağı vurma, biz belirlemek için bir yöntem olarak renal klirensi tahlil kullanımını göstermekBir böbrek hastalığı modelinde böbrek fonksiyonu. Burada, biz bbs9 morphant embriyolar böbrek düşük MW solutları kaldırmak için başarısız olduğunu belirten, kan akışından engelledi floresan temizlenmesini görüntüler olduğunu göstermektedir. Böylece, söz ciliogenesis içinde bbs9 katılımı ve süzüntü hareketini kolaylaştırmak Pronephric kirpikler rolü, morphants gözlenen böbrek açıklık anormal kirpikler işlevine bağlı olması muhtemeldir. Bu yöntem Zebra balığı hastalık modellerinde böbrek fonksiyonlarını değerlendirmek için değerli bir araç temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Jaipreet Bharj tarafından sağlanan teknik destek. Bu çalışma, AB-FP7 (SYSCILIA -241.955) ve Hollanda Böbrek Vakfı (CP11.18) hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , Academic Press. (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
