Summary
الزرد هو أداة شعبية لنموذج مرض الكلى المزمن (CKD). ومع ذلك، حجمها صغير يجعل من المستحيل لتقييم وظائف الكلى باستخدام الطرق التقليدية. نحن تصف الفلورسنت الكلى صبغ إزالة الفحص 1 التي تسمح التحليل الكمي وظائف الكلى الزرد في CKD.
Abstract
يقدم الجنين الزرد نموذج لين العريكة لدراسة توالد ونموذج مرض وراثي البشري. وعلى الرغم من بساطتها النسبية، والكلى الزرد يتطور وظائف في تقريبا بنفس طريقة البشر. وهناك فرق كبير في بناء الكلى البشرية هو وجود الملايين من النيفرون مقارنة الزرد التي لديها اثنين فقط. ومع ذلك، وتبسيط مثل هذا النظام المعقد إلى وحدات وظيفية أساسية ساعدت فهمنا لكيفية تطور الكلى ويعمل. في الزرد، خط الوسط تقع الكبيبة هو المسؤول عن ترشيح الدم الأولي إلى قسمين الأنابيب سليفة الكلوة أن تتباعد لتشغيل ثنائيا أسفل محور الجنينية قبل التفجير لبعضها البعض في مجرور. يتم ملؤها الأنابيب سليفة الكلوة بشدة من أهداب متحركة تسهل حركة الترشيح على طول أنبوب صغير مجزأة، والسماح للتبادل مختلف المواد المذابة قبل أن تخرج في النهاية عن طريق مجرور 2-4. العديد من الجينات المسؤولة عن CKD، المؤتمر الوطني العراقيluding تلك المتعلقة تكون الأهداب، وقد درس في الزرد 5. ومع ذلك، تجذب أعدادا كبيرة وقد ظهر صعوبة في تقييم وظائف الكلى الزرد بعد التلاعب الجيني. المقايسات التقليدية لقياس خلل في الكلى في أثبتت البشر غير متعدية إلى الزرد، ويرجع ذلك أساسا إلى بيئتها المائية وحجم صغير. على سبيل المثال، فإنه من غير الممكن جسديا لاستخراج الدم من الجنينية نظمت الأسماك لتحليل اليوريا والكرياتينين المحتوى، كما أنها صغيرة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، الزرد لا تنتج ما يكفي من البول لاختبار على بروتينية بسيطة "مقياس"، والتي غالبا ما يتم تنفيذ أثناء الفحوص الأولية المريض. نحن تصف فحص الفلورسنت التي تستخدم الشفافية البصرية من الزرد لمراقبة كميا إزالة صبغة الفلورسنت، مع مرور الوقت، من الأوعية الدموية والخروج من خلال الكلى، لإعطاء قراءة من وظيفة الكلى 1،6-9.
Introduction
الكلى البشري يلعب دورا حاسما في تصفية النفايات الأيضية من الدم واستعادة المواد المذابة اللازمة للحفاظ على التوازن الخلوي. وهناك عدد من الأمراض الوراثية البشرية التي تسبب خلل في الكلى. المرض الكلوي ورثت الأكثر شيوعا هو مرض وراثي جسمي الكلى المتعدد الكيسات (ADPKD) التي تتميز تطوير السوائل تملأ الأكياس داخل الأنابيب الكلوية. الأضرار الناجمة عن تكون الكيسة يضر ظائف الكلى 10. ADPKD لديه قوع 1: 800-1: 1،000 والحسابات لمدة 8 - 10٪ من مرضى الفشل الكلوي في المرحلة النهائية (ESRF) 11. قد تورطت عدة جينات أن تسبب ADPKD بما في ذلك polycystin-1 (PKD1) و-2 (PKD2)، وهو ما يمثل حوالي 85٪ و 15٪ من الحالات على التوالي 12،13. وعلاوة على ذلك، والمنتجات الجين لPKD1 و-2 توطين إلى هدب وأساسية لتكون الأهداب 14،15. هناك الآن عائلة المعترف بها من الاضطرابات الجينية البشرية، والمعروفة باسموciliopathies، والتي تؤثر على وظيفة الأهداب ويؤدي في CKD 16.
عدد متزايد من الأمراض الوراثية البشرية التي تؤثر على التنمية الهدبية وظيفة يستحوذ على اهتمام العالمية في هذا عضية أثرية مرة واحدة في الاعتبار. وهدب، نتوء الخلوي يشبه الشعر، وأثرى مع مستقبلات والقنوات الأيونية اللازمة لتنبيغ أحداث خلية يشير الرئيسية. يتكون هدب من الخيط المحوري القائم على أنيبيب، منظم عادة إلى تسع الحلل أنيبيب ترتيب شعاعيا مع أو بدون زوج المركزي من الأنابيب الدقيقة القميص. يحدد هيكل axonemal نوع وطريقة العمل الهدبي. الترتيب أنيبيب 9 + 2 يضفي حركية إلى هدب حيث يتم استغلاله في حركة السوائل عبر الأسطح الظهارية. التكوين 9 + 0 هو غير متحركة ولكن يعتقد أن وظيفة بشكل رئيسي في أحداث الإشارات الخلوية 17. وبصرف النظر عن CKD، عواقب ضعف الهدبية هي مجموعة من الخصائصميزات ciliopathy التي تشمل، والسمنة، وتنكس الشبكية، كثرة الأصابع، وضعف الادراك 16. ومع ذلك، CKD هو من بين الأكثر تضر نوعية حياة المريض، وبالتالي قوة دافعة رئيسية وراء تطوير الاقتضاء في النماذج الحية لالهدبية المتعلقة CKD.
الزرد هو نموذج ممتاز لفهم مسببات مرض وراثي البشري. تطور سريع، وإنتاج عدد كبير من البيض والأنسجة شفافة، ونمو الرحم السابقين يسمح العمليات التنموية الزرد إلى أن تصور والأحداث البيولوجية التلاعب مع سهولة كبيرة. الجينات يمكن تعديلها وراثيا باستخدام النجاح الذي تحقق مؤخرا من أدوات التحرير الجينوم (كريسبر 18 و TALENS 19)، طرقت أسفل باستخدام العقاقير تكنولوجيا morpholino 20، أو ينظم دواء عن طريق إضافة مركبات لبيئتها المائية. في الواقع، الزرد توفر منصة للقيام البريدxperiments التي ليست متساهلة في النماذج الحيوانية الأخرى. في حين الزرد هي الفقاريات بسيطة نسبيا (مقارنة مع البشر) أنها تشترك في العديد من أجهزة الحفظ وظيفيا، والجينات، والعمليات يشير مشتركة مع البشر. على سبيل المثال، الكلى الزرد يشبه بشكل ملحوظ في البنية والوظيفة مقارنة مع 21،22 البشر. ولكن، خلافا الكلى الثدييات التي تطور من خلال سلسلة من المراحل، وتميز كل من الكلى أكثر تطورا (سليفة الكلوة، mesonephros، والكلوة التالية)، والزرد الجنينية يتطور إلا سليفة الكلوة، الشكل الأكثر غير ناضجة من الكلى. بينما الملايين من النيفرون يمكن العثور على تشكيل اللبنات في الكلى الثدييات، الجنين الزرد تمتلك اثنين فقط. وتنصهر الكبيبات، والتي تسمح للرشاحة الدم الأولي، في خط الوسط فقط بطني إلى الشريان الأورطي. مرشحات الدم خلال الكبيبات في الأنابيب سليفة الكلوة التي تعمل نحو caudally على طول المحور، التفجير قبل الخروج عبر مجرور. وتو سليفة الكلوةومهدبة bules بشكل كبير مع أهداب متحركة التي تبيحه لتدفق الترشيح نحو الخروج الذيلية 3،4. يحافظ هذا الهيكل سليفة الكلوة بسيط التوازن الزرد من خلال عدة أسابيع من نمو اليرقات حيث تطوير في نهاية المطاف إلى mesonephros بنية أكثر تعقيدا 21. ومع ذلك، فإن الزرد أبدا يطور الكلوة التالية 21. وعلى الرغم من الخصوصيات الزرد، ومجزأة وكليون الزرد مع ملامح التعبير الجيني مساوية لتلك التي لوحظت في الثدييات، وبالتالي يوفر منقطع النظير في نموذج الجسم الحي لتكون الكلية 3،22.
عادة يتم اختبار المرضى لوظائف الكلى من خلال سلسلة من اختبارات الدم والبول. وعادة ما يتم تحليل الدم لمدة الأملاح الذائبة واليوريا والكرياتينين. مستويات عالية من اليوريا والكرياتينين وتركيز الملح غير طبيعية تدل على مشاكل في وظائف الكلى. تحليل البول باستخدام مقياس اللونية بالكشف عن مستويات غير طبيعية من البروتين، blooد، والقيح، والبكتيريا والحاضر السكر في عينات البول. هذه الاختبارات تتطلب عادة حوالي 30 مل من البول أو من 5 - 10 مل من الدم. فقد كان من الصعب ترجمة هذه الأنواع من المقايسات للمشاريع الصغيرة في الكائنات نموذج الجسم الحي، مثل الزرد، ويرجع ذلك أساسا إلى طبيعة مستحيلة لجمع الدم أو البول الكافي لإنجاز الفحص. هنا، نحن معالجة نقص الزرد اختبارات وظائف الكلى المناسبة ووصف تقنية مبتكرة لدراستها. عن طريق حقن صبغة الفلورسنت في مجرى الدم ونحن قادرون على رصد وتحديد فردي مع مرور الوقت الترشيح وإفراز النشاط الفلورسنت من الدم عن طريق الكلى. هذه الطريقة يمكن استخدامها لدراسة تلف الكلى الناجمة عن المرض، ونحن نوفر مثال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: يتم تعريف الحيوان الصيانة، وتربية، والإجراءات والتي تسيطر عليها الحيوانات (إجراءات علمية) لعام 1986. وقد تم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات تحت الرخص التي تمنحها وزير الداخلية (PIL رقم 70/7892) في الامتثال البيولوجية المجموعة خدمات الإدارة واللجنة الأخلاقية الخدمات البيولوجية، SGUL، لندن، المملكة المتحدة. تم بذل كافة الجهود لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة وتحسين كل الإجراءات وتربية من أجل تقليل المعاناة وتعزيز الرفاه.
1. إعداد الآلات، مخدر، ونيون صبغ
- باستخدام مجتذب ممص مكروى والشعيرات الدموية معيار البورسليكات جدار (بدون خيوط) سحب الإبر من طول مناسب ل microinjection (الشكل 1A).
- جعل العفن الاغاروز عن التوجه للأجنة للحقن سهلة في التامور (الشكل 1B). الغراء ما يقرب من عشرة الزجاج المجهر SLايديس معا لتشكيل "درج" من الشرائح الإزاحة. للحصول على أفضل النتائج، استخدم قطرة من مجموعة السريع راتنجات الايبوكسي الغراء في وسط كل شريحة.
- قطع قسم من حوالي 78 ملم في الطول في منتصف الطريق من خلال اثنين من الماصات البلاستيكية 10 مل باستخدام مشرط ساخنة بنسن الموقد، وإزالة ماصة تنتهي حسب مقتضى الحال. نعلق وأقسام الغراء (راتنجات الايبوكسي) ماصة على الشرائح الزجاجية مكدسة لتوفير الاستقرار للسماح القالب الى الانخفاض الى 90 ملم طبق بتري. بذل كل جهد ممكن لضمان زوايا الشريحة محاذاة عمودية على الأرض طبق بتري. إتاحة الوقت الغراء لتعيين.
- يلقي العفن في حل الاغاروز 2٪ مصنوعة في أسماك المياه (تم الحصول عليها من الحوض). صب الاغاروز إلى 90 مم طبق بتري ووضع القالب على رأس طبق بيتري مفتوحة، والسماح الشريحة مكدسة حواف لغمر في زاوية تحت سطح الاغاروز. تترك لتعيين على مقاعد البدلاء المختبر لمدة 30 دقيقة.
- إزالة يلقي الشرائح وتغطية الاغاروز-مطبوع الشريحة مع أسماك المياه العذبةتحتوي تريكين مخدر (راجع الخطوة 1.9) في نسبة 01:25.
- جعل حلول رودامين ديكستران (RD) صباغة. في resuspend رودامين B 10،000 ميغاواط المسمى ديكستران في الماء عالى النقاء تعقيمها لجعل تركيز الأسهم من 50 ملغ / مل. ل microinjection، مما يخفف من الأسهم إلى التركيز النهائي من 5 ملغ / مل في تعقيمها الماء عالى النقاء.
ملاحظة: تبدأ الخلايا الصباغية للتمييز في الزرد من 24 الإخصاب آخر ساعة (HPF)؛ هذه يمكن أن يحجب علامات الفلورسنت خلال الحصول على الصور. - تمنع تشكيل الخلايا الصباغية باستخدام N -Phenylthiourea (PTU)، الذي يمنع استحداث الميلانين عن طريق تثبيط التيروزينات. جعل 0.003٪ محلول المخزون من PTU عن طريق إذابة مسحوق PTU في مياه حوض السمك، حل الحرارة عند 60 درجة مئوية إلى ذوبان تماما.
- احتضان الأجنة الزرد في الميثيلين الأزرق الحل، للفطريات معتدل، لمنع تكاثر الفطريات وزيادة البقاء على قيد الحياة. إضافة 2 مل من محلول المخزون الميثيلين الأزرق، تحتوي على 0.1٪ الميثيلين الأزرق في شالمياه ltrapure، إلى 1 L من مياه حوض السمك واستخدام كوسط الجنين القياسية.
- تشكل 15 ملي تركيز الأسهم من تريكين الملح methanesulfonate / إيثيل 3-أمينوبنزوات وفقا للتعليمات في 'الزرد كتاب "23. تخدير الأجنة وبالتالي يجمد لهم لتنفيذ الإجراء حقن مكروي.
- بعد التخدير الأجنة، توجيههم، للتصوير باستخدام خصائص غير سامة وزجة من ميثيل. لجعل إعداد 200 مل من 3٪ ميثيل، هدئ 130 مل من الماء عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ومكان على الجليد. حرارة 70 مل من الماء إلى 80 درجة مئوية في كوب من الزجاج، إضافة 6 غرام من ميثيل، وتستنهض الهمم باستخدام قضيب الزجاج حتى يتم المبللة جميع الجزيئات وفرقت بالتساوي. يضاف الماء المثلج، وخلط، والسماح للإعداد لتبريد عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل aliquoting إلى 50 مل أنابيب.
ملاحظة: تخفيض درجة حرارة يسمح للميثيل لتصبح قابلة للذوبان. فإن الحل يصبح أكثر سمكاكما هيدرات مسحوق. ويمكن تخزين 3٪ ميثيل دون نمو البكتيريا لفترات قصيرة من أسبوع في 4 درجات مئوية أو أكثر في -20 ° C. تأكد من وصلت ميثيل RT قبل الاستخدام. - لأداء حقن صبغة الفلورسنت في الزرد استخدام حقن مكروي القياسية انشاء (الشكل 1C). هذا يتكون من ضاغط الهواء متصلة نظام منظم الضغط الذي يغذي حامل ماصة على التوالي للاستخدام مع 1.0 الشعيرات الدموية قطرها الخارجي. يجب أن يضم حامل ماصة ضمن المدمجة 3 محاور السيطرة مياداة مجهرية MM33 المضمون إلى قاعدة لوحة الصلب من الوقوف المغناطيسي. يمكن تصور الأجنة، التلاعب وحقن باستخدام مجهر تشريح ستيريو.
2. الزرد تربية ومعالجات ما قبل الحقن
- الحفاظ على الزرد كما هو موضح سابقا 23. استخدام حوض للماء انشاء أن توفر المياه إعادة تدوير الموردة في درجة حرارة ثابتة من 28.5 ° C، مكيفة لدرجة الحموضة 6،8-7،2 والتوصيل من 450-550 ميكرو ثانية مع بيكربونات الصوديوم والفوري المحيط ملح البحر، على التوالي. استخدام wildtype أو خطوط الزرد المعدلة وراثيا بما يتناسب مع التجربة، والحفاظ على كثافة التخزين من 15 من الذكور و 15 من الإناث في 8 L دبابات. تعيين photocycle منشأة الأسماك إلى 14 ساعة من ضوء النهار بين 09:00 حتي 11:00.
- يبدأ وضع البيض الزرد في بداية photocycle، عند تشغيل أضواء على في الصباح. لضمان أقصى قدر من البيض يمكن جمع من دون إزعاج الأسماك وتربية غمر الدبابات (التي تحتوي على إدراج عيون، المتاحة من المتخصصين الزرد) في خزانات الأسهم wildtype المساء قبل المجموعة.
- في يوم جمع، والسماح 30 - 40 دقيقة للأسماك لتفرخ، وبعد ذلك جمع وشطف البيض باستخدام مصفاة الشاي والمياه حوض السمك الطازج. إيداع البيض تنظيفها في 90 ملم طبق بتري تحتوي على المتوسط الجنين واحتضان عند 28.5 درجة مئوية.
- علاج الأجنة مع PTU لمنع بميلانوسفر التكوين. في 8 HPF، ونقل الأجنة قابلة للحياة في الحد الأدنى من السائل إلى أطباق بتري الطازجة التي تحتوي على 1: 100 PTU إلى الجنين المتوسطة وزيادة احتضان عند 28.5 درجة مئوية حتى 72 HPF.
ملاحظة: PTU يمكن أن يسبب تشوهات تنموية في حالة استخدامها في المراحل المبكرة لذلك ينبغي أن يقتصر على الرد على 8 مراحل HPF، ولكن يمكن علاجها في وقت متأخر من 24 HPF. بالإضافة متأخرة من PTU لا يمنع تماما تصبغ العين ولكن ناجحا بشكل عام وعرقلة تشكيل جذع الصباغية.
3. حقن مكروي
ملاحظة: التامور يغلف القلب ولكن يتم فصل لحماية وسهولة حركة عضلة القلب عن طريق السوائل داخل تجويف التامور. والهدف من هذا الإجراء هو لحقن RD في تجويف التامور، وهذا يسمح لامتصاص السريع للصبغ لنظام الأوعية الدموية.
- الإبر الحمل مع 6 ميكرولتر - المخفف RD، وذلك باستخدام نصائح microloader وآمنة في حامل إبرة من مياداة مجهرية. كسر نهاية الإبرة باستخدام تيب غرامةملقط إد (الشكل 1A). نقل حل RD إلى رأس الإبرة من خلال تعظيم مدة النبضة إلى الإعداد دقيقة، يعود مرة أخرى الى ميللي ثانية مرة واحدة كاملة.
- استخدام ميكرومتر المرحلة، ومنظم ضغط، والتحسينات على طول طرف الإبرة (باستخدام ملقط) لضبط حجم القطيرات طرد إلى 100 ميكرون في القطر، وهذا يعادل 0.5 حجم نيكولا لانغ (الشكل 2A).
ملاحظة: عندما كسر الإبرة، ويجب الحرص على عدم كسر الكثير من إلا فإنه سوف يجعل معايرة حجم الحقن صعوبة. إذا لزم الأمر، مما كسر رأس الإبرة لزيادة حجم قطرة ومع ذلك، والحفاظ على سمك الإبرة التي تسمح بدخول التامور دون الانحناء المفرط أو تلف الأنسجة. - قبل الحقن، تخدير الأجنة في المتوسط الجنين تحتوي على تريكين. إعداد 2 × 35 مم أطباق بتري تحتوي على 5 مل المتوسطة الجنين، تسمية واحدة "تريكين" و "استعادة" الآخرين.
- إضافة 200ميكرولتر من الأسهم تريكين إلى الطبق المسمى بشكل مناسب. مرة واحدة على استعداد للحقن، حدد الجنين الفردي في 72 HPF ونقل في الحد الأدنى من السائل إلى طبق تريكين. مراقبة نشاط الجنين، اختبار هو تخدير الجنين ويجمد قبل الإثارة لطيف باستخدام طرف microloader اقتطاع.
- نقل الجنين تخدير لحقن القالب وتوجيه الجنين داخل الحوض الصغير الاغاروز وبالتالي فإن الجانب الأيسر يكون مواجها لها، وتحديد المواقع القلب إلى اليسار من مجال الرؤية.
- لحقن RD في القلب، يخترق التامور مع الإبرة وحقن 1 NL من RD في تجويف التامور الجنين مخدرة (الشكل 2B، اللوحة اليمنى). سحب الإبرة بعد الحقن. نقل الأجنة المحقونة في الحد الأدنى من السائل إلى "طبق الانتعاش" ورصد لمدة 1 دقيقة. نقل الجنين الفردية إلى لوحة 24-جيدا تحتوي على 1 مل المتوسطة الجنين العذبة (التي تحتوي على PTU) وتسمية مناسب.
ملاحظة: إن التامور صعبة، ولكن هناك نقطة ضعف بارزة عند تقاطع حيث يلتقي التامور الأقواس البلعومية-ventro الذيلية وظهراني منقاري الكيس المحي (الشكل 2B رأس السهم). وينبغي توجيه الإبرة إلى هذا الأخدود. عندما الإبرة في مكان، وسوف الصنبور حازما من إصبع على رأس مياداة مجهرية تسهيل الدخول إلى جوف التامور. - كرر الخطوات من 3،2-3،6 لا يقل عن 10 الأجنة في المجموعة التجريبية، وضع كل السمك في بئر مستقل وفريد labelto تصريح فرد التجريبية المتابعة. احتضان عند 28.5 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
4. التصوير اكتساب
- في 3 آخر ساعة حقن (HPI) تخدير الأجنة كما هو موضح سابقا ونقل إلى طبق بيتري 35 ملم تحتوي على 3٪ ميثيل. دفع بلطف الأجنة في ميثيل وتوجيه بحيث يمكن تصوير الجانب الوحشي.
- الحصول على صورة للجنين تحت الأشعة فوق البنفسجية، وذلك باستخدام فلتر لالتصور سو ينبعث الضوء في 570 نانومتر (الشكل 2C). بعد الحصول على الصور، والسماح للجنين لاستعادة قبل استبدال في المعين جيدا. الحصول على صور لجميع الأجنة المحقونة ومواصلة احتضان عند 28.5 درجة مئوية.
ملاحظة: في هذا البروتوكول استخدمنا stereomicroscope الفلورسنت مع مجموعة مرشح TXR، وكاميرا DFC300FX وبرامج التطبيق المطلوب. تقديم مذكرة من إعدادات اكتساب الدقيقة لالتقاط صور لاحق. - في 24 HPI، والحصول على جولة ثانية من الصور كما هو موضح أعلاه. مرة واحدة وقد تم الحصول على جميع الصور، سواء HPI 3 و 24 HPI، والتخلص من الأجنة إنسانية أو استخدام وسائل تجريبية أخرى مثل المناعية.
تجهيز 5. صورة
- قياس كثافة الفلورسنت من كل جنين المحقون في 3 و 24 HPI الفقر البشري، من خلال تحليل الصور باستخدام برنامج يماغيج NIH ل. لقياس كثافة الفلورسنت، وفتح صورة في يماغيج وتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في 100 بكسل 2 (تحرير → → اختيار التحديد).
- وضع القلب في مركز العائد على الاستثمار (الشكل 2C)، تعيين القياسات لتشمل يعني مقياس الرمادية والمنطقة (تحليل قياسات → مجموعة)، نفذ القياس (قياس تحليل →). استكمال لكل مجموعة من الصور، في 3 HPI و 24 HPI، في الجنين ونقل متوسط قيم مقياس الرمادية إلى جدول بيانات لمزيد من المعالجة.
ملاحظة: اخترنا حجم العائد على الاستثمار الثابت 100 بكسل (2)، هذا يشمل قلوب الفردية بين الأجنة. وقد تم اختيار القلب لإجراء قياسات نظرا لحجمها الكبير يتيح موقع مناسب لقياس المحتوى الفلورسنت من الدم قبل الدخول في الكلى. - أداء التحليل الإحصائي باستخدام البرامج الإحصائية المناسبة. مقارنة المجموعات إحصائيا باستخدام اختبار t الطالب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي ciliopathy غير متجانسة نادر يصيب حوالي 1: 160،000 شخص في العالم 16. المرضى الحالي مع عدد من المشاكل المرتبطة بما الكلى المتعدد الكيسات، في وقت لاحق المرضى في كثير من الأحيان يتطلب الغسيل الكلوي أو زرع 24. ESRF هو السبب الأكثر شيوعا للوفاة في BBS، مع حوالي 30٪ من المرضى تطوير CKD 16. حاليا، قد تورطت 20 جينات غير ذات الصلة في BBS مع أي ارتباط الوراثي، النمط الظاهري المنشورة. البروتينات BBS تشترك المجالات البروتين توطين المشتركة داخل هدب والقاعدية الهيئات التي، جنبا إلى جنب مع الصفات المميزة للمرضى، نستنتج تشخيص ciliopathy. BBS9 بترميز B1 Parathyoid هرمون المراعية (PTHB1) البروتين الذي جنبا إلى جنب مع غيرها من BBS (BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8) البروتينات تشكل جوهر BBSome مجمع مسؤولة عن تشكيل هدب الأساسي 24. الطفرات في حساب BBS9 لمدة 6٪ من BBS جASES 24. وعلاوة على ذلك، تم PTH المتورطين في تشكيل الكيس الكلى من خلال تعزيز الكلوي انتشار الخلايا الظهارية، مما يشير إلى أن فقدان وظيفة bbs9 في الزرد قد يعرض عيوب الكلى 25. تستبعد التقارير السابقة باستخدام bbs9 ضربة قاضية نموذج الزرد وصفا في الكلى، وتقديم الفرصة لإثبات وصف الكلى وظيفة فحص 26. وقد تحقق ضربة قاضية من وظيفة bbs9 في الزرد عن طريق الحقن، في مرحلة 1- إلى 4 خلايا، وهو morpholino بواسطة العقاقير لمنع الجينات الترجمة bbs9 محددة ومتوازية في معيار سلبي السيطرة morpholino ضد طفرة في intronic البشري بيتا غلوبين (4 نانوغرام bbs9 MO، تسلسل: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA و 4 نانوغرام السيطرة MO، تسلسل: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). وجدنا أن فقدان وظيفة bbs9 أسفرت عن 40٪ من الأجنة عرض الخراجات سليفة الكلوة بنسبة 5 DPF، مما يشير إلى أن هذا نموذج مناسب لتحليلوظائف الكلى باستخدام رودامين ديكستران التخليص الفحص. لاحظنا أن الأسماك morphant لديها انخفاض كبير في قدرتها على مسح صبغة الفلورسنت بعد 24 HPI مقارنة مع الضوابط (الشكل 3) - يخدع: 14.8 ± 1.2 SEM، ن = 9؛ MO bbs9: 61.0 ± 10.3 SEM، ن = 10 . المفردة اختبار t قيمة P: 0.002). استبعاد إمكانية أن انخفاض مساحة يمكن أن يكون نتيجة لانخفاض الدورة الدموية، وجرى تقييم الأجنة للخلايا ضربات القلب وإعادة تدوير الدم، كان كل من السيطرة والأسماك morphant معدل ضربات القلب مقارنة وتدفق الدم. وتشير هذه البيانات إلى أن وظائف الكلى قد انخفضت قيمتها في morphants bbs9. في الواقع، الأجنة morphant bbs9 تطوير الأنابيب سليفة الكلوة الكيسي المتزامنة مع تلك التي لوحظت في مرضى BBS.
الشكل 1. إعداد المعداتوانشاء. يجب أن يتم سحبها الشعيرات الدموية (A) البورسليكات ل microinjection باستخدام مجتذب إبرة المناسب. الإبرة يتطلب كسر بالملقط (خط متقطع) للسماح RD للخروج الإبرة، ينبغي الحرص على عدم كسر الإبرة تقديم الكثير إبرة التي لا يمكن معايرة. شريط مقياس: 200 ميكرون (ب) العفن الاغاروز للتلاعب الجنين والتوجه يمكن صنعت من قبل الإلتصاق معا الشرائح الزجاجية والماصات البلاستيكية (C) القياسية حقن مكروي انشاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم .
الشكل 2. Microinjection من رودامين ديكستران في كيس التامور. (A) معايرة حجم الانخفاض إلى 10 المؤتمر الوطني العراقيrements (100 ميكرون) على 1 مم مرحلة شبيكة الشعر. (ب) تحديد المواقع الصحيحة من الإبرة (الأسهم السوداء) في صدع بمناسبة التقاطع بين الذيلية البلعوم القوس، الكيس المحي والقلب وتسهيل اختراق الأنسجة (رأس السهم). شريط مقياس: 200 ميكرون (C) رودامين ديكستران يمكن أن ينظر إليه اتخذت بسرعة بواسطة الأوعية الدموية كله (السهام البيضاء). 100 بكسل 2 مناطق المصالح تغطي القلب مركزي (المربع الأصفر) وينبغي أن تستخدم لأخذ القياسات من قيمة الرمادية متوسط، وبالتالي بكسل / كثافة الفلورسنت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. ضربة قاضية من bbs9 تسبب المعيبة وظائفها الكلىنشوئها في الزرد. (A) الأجنة حقنها في التامور مع رودامين ديكستران في 3 HPI و 24 HPI، أعلى وأسفل فريقين على التوالي، في إما السيطرة أو الأجنة bbs9 morphant. رؤوس سهام تشير إلى القلب؛ يشير السهم إلى تشكيل الكيس سليفة الكلوة. (ب) نسبة كثافة الفلورسنت متبقية بعد 24 HPI في السيطرة مقابل الأجنة bbs9 MO. تظهر أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط (SEM)، ** P ≤ 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الزرد تقدم أداة قيمة لنموذج مرض وراثي البشري، فإن استخدامها كأداة العلمي لفي الجسم الحي الأبحاث مكنت الدراسات التفصيلية للانهيار الجيني للكثير من النظم البيولوجية، بما فيها الكلى. ومن المفهوم كثيرا الآن عن كيفية تطور الكلى الزرد ووظائفها. أوجه الشبه اللافتة لتكون الكلية الإنسان والتماثل مع المرض الجينات المسببة لل21 وقد بينت كيف الزرد أصبحت أساسية في فهم كيفية العيوب في الجينات وظيفة تؤدي إلى أمراض من أمراض الكلى. في الواقع، والتلاعب الجيني يمكن أن يتحقق جهد في الزرد باستخدام العقاقير morpholino التكنولوجيا ضربة قاضية أو أكثر تقدما الجينوم المستهدفة أدوات التحرير مثل TALENS أو كريسبر. خلق نماذج ضربة قاضية أو متحولة للاشتباه في أمراض الكلى الجينات المسببة هي الخطوة الأولى في فهم مشاركتهم في مظهر من مظاهر المرض. للقيام بذلك يلتمس مقايسة موثوقة لوظائف الكلىللإشارة إلى ما إذا كانت الجينات هي المسؤولة مرشح المحتمل لعلم الأمراض لوحظ في المرضى.
اختبارات وظائف الكلى هي واضحة ورخيصة نسبيا لأداء على البشر، وتبحث عموما عند مستويات المواد المذابة الموجودة في الدم أو البول. ومع ذلك، هذه الأساليب غير قابلة للتطبيق في الزرد نظرا لصغر حجمها والموائل المائية. الفحص ديكستران رودامين الموصوفة هنا يستخدم قدرة الأنابيب سليفة الكلوة لتصفية منخفضة مكونات الوزن الجزيئي من الدم. وpodocytes المتمركزة داخل كبسولة بومان في الكلى، أن المغلفات الشعيرات الدموية من الكبيبة، والسماح بمرور الحر للجزيئات صغيرة مثل الماء والأملاح الأيونية والجلوكوز من خلال الحجاب الحاجز شق 27. الشقوق الترشيح مزيد تعمل لمنع فقدان البروتينات الكلية من الدم. ويقتصر الترشيح لجزيئات فوق 5 كيلو دالتون وسدت تماما تقريبا في حجم ألبومين المصل 28 (حوالي0، 65 كيلو دالتون). عن طريق حقن صبغة الفلورسنت ديكستران ما يقرب من 10 كيلو دالتون، بتركيز معلوم في تجويف التامور، ونحن قادرون على قياس كثافة الفلورسنت من الدم مع مرور الوقت. تحت الظروف العادية يتم فقدان ما يقرب من 85٪ من مضان الأولي من الدم، على مدى فترة 24 ساعة، من خلال إفراز عبر الكلى. ينبغي للمرء ملاحظة أن الحقن في الفضاء التامور هو ممكن فقط مع انخفاض ديكستران MW الذي يمر بحرية في الأوعية الدموية. وهكذا، هذا الاختبار يعطي فقط مهلة قراءة لمعدل إزالة لانخفاض مكونات الوزن الجزيئي، ولا تعطي أي معلومات حول فعالية الترشيح الكبيبي. هذا الأخير يمكن تقييم باستخدام أكثر مباشرة عالية الأصباغ الوزن الجزيئي أكثر من 70 كيلو دالتون، والتي تتطلب الحقن في الأوعية الدموية وليس في الفضاء التامور. في الواقع، dextrans من مختلف ميجاوات يمكن استخدامها لمزيد من تشريح وظائف الكلى 28.
ومهدبة عاليا الأنابيب سليفة الكلوة الزرد مع موأهداب البلاط التي تسهل حركة الترشيح نحو مجرور 3،4. قد تورطت عيوب في الآلات الهدبية في أمراض الكلى. BBS هو، راثي متنحي اضطراب غير متجانسة وراثيا تتميز الطفولة الظهور تنكس الشبكية، في وقت مبكر السمنة الحدوث، الادراكي، كثرة الأصابع وتشوه الكلوي 24. حتى الآن، تم تحديد 20 جينات BBS (BBS1-20). تعطيل BBS يؤدي إلى تشكيل الكيس الكلوي وظيفة سليفة الكلوة المعيبة في الزرد 9. يتفاعل مع البروتينات BBS9 BBS أخرى لتشكيل BBSome المسؤولة عن تكون الأهداب المناسب، والطفرات التي تمثل 6٪ من الحالات BBS 24. في حين تم الإبلاغ عن والزرد نموذج bbs9 ضربة قاضية، وصفا للالنمط الظاهري الكلوي كان يفتقر 26. التي هدمت bbs9 في الزرد، وذلك باستخدام نهج morpholino، ونحن لشرح استخدام التخليص فحص الكلوي كطريقة لتحديدوظيفة الكلى في نموذج أمراض الكلى. هنا، وتبين لنا أن الأجنة bbs9 morphant عرض التخليص الفلورسنت إعاقة من مجرى الدم، مشيرا إلى أن الكلى فشل لإزالة المواد المذابة MW منخفضة. هكذا، وبسبب تورط bbs9 في تكون الأهداب، ودور أهداب سليفة الكلوة في تسهيل حركة الترشيح، وتطهير الكلى لوحظ في morphants من المرجح أن يكون بسبب وظيفة الأهداب الشاذة. ويمثل هذا الأسلوب أداة قيمة لتقييم وظائف الكلى في نماذج المرض الزرد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
المساعدة التقنية التي تقدمها Jaipreet Bharj. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الاتحاد الأوروبي FP7 (SYSCILIA -241955) والكلى الهولندي مؤسسة (CP11.18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , Academic Press. (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
