Summary
Le poisson zèbre est un outil populaire pour modéliser la maladie rénale chronique (CKD). Cependant, leur petite taille, il est impossible d'évaluer la fonction rénale en utilisant des méthodes traditionnelles. Nous décrivons une fluorescente reins de colorant jeu dosage qui permet une analyse quantitative de la fonction rénale dans le poisson zèbre CKD.
Abstract
L'embryon de poisson zèbre offre un modèle souple pour étudier l'organogenèse et modéliser les maladies génétiques humaines. Malgré sa simplicité relative, le rein et le poisson zèbre développe fonctions dans presque la même manière que les humains. Une différence importante dans la construction du rein humain est la présence de millions de néphrons par rapport au poisson-zèbre ne possède que deux. Cependant, la simplification d'un système aussi complexe en unités fonctionnelles de base a aidé notre compréhension de la façon dont le rein développe et exploite. Chez le poisson zèbre, la ligne médiane située glomérule est responsable de la filtration du sang initial en deux tubules pronephrique qui divergent afin de fonctionner bilatéralement long de l'axe embryonnaire avant de fusionner les uns aux autres au cloaque. Les tubules pronephrique sont fortement peuplées par des cils mobiles qui facilitent le mouvement de filtrat le long du tubule segmenté, permettant l'échange de différents solutés avant de finalement sortir via le cloaque 2-4. De nombreux gènes responsables de la maladie rénale chronique, incLUDING ceux liés à ciliogenèse, ont été étudiés chez le poisson zèbre 5. Cependant, une attraction majeure de retour a été la difficulté d'évaluer la fonction rénale poisson zèbre après manipulation génétique. Essais traditionnels pour mesurer le dysfonctionnement du rein chez l'homme ont prouvé non translationnelle poisson zèbre, principalement en raison de leur environnement aquatique et de petite taille. Par exemple, il ne est pas physiquement possible d'extraire le sang de l'embryon organisé poissons pour l'analyse de l'urée et de la créatinine contenu, car ils sont trop petits. En outre, le poisson zèbre ne produisent pas suffisamment d'urine pour tester sur une simple protéinurie 'jauge', qui est souvent effectuée lors des examens initiaux des patients. Nous décrivons un dosage par fluorescence qui utilise la transparence optique du poisson zèbre pour contrôler quantitativement le dégagement d'un colorant fluorescent, au fil du temps, du système vasculaire et en sortie par le rein, pour donner une lecture de la fonction rénale 1,6-9.
Introduction
Le rein humain joue un rôle crucial dans le filtrage des déchets métaboliques du sang et la récupération de solutés nécessaires pour maintenir l'homéostasie cellulaire. Il existe un certain nombre de maladies génétiques humaines qui provoquent un dysfonctionnement rénal. La maladie rénale héréditaire la plus fréquente est autosomique polykystose rénale dominante (PKD) caractérisé par le développement des sacs remplis de fluide dans les tubules néphrétiques; les dommages causés par la cystogénèse est préjudiciable à la fonction rénale 10. ADPKD a une occurrence de 1: 800-1: 1000 et représente 8 à 10% des patients en insuffisance rénale au stade terminal (ESRF) 11. Plusieurs gènes ont été impliqués pour provoquer ADPKD y compris polycystine-1 (PKD1) et -2 (PKD2), représentant environ 85% et 15% des cas respectivement 12,13. En outre, les produits de gènes pour PKD1 et -2 localiser le cil et sont fondamentales pour ciliogenèse 14,15. Il ya maintenant une famille reconnue de troubles génétiques humains, connus sous le nomles ciliopathies, qui affectent la fonction des cils et se traduisent par CKD 16.
Le nombre croissant de maladies génétiques humaines qui affectent le développement et la fonction ciliaire suscite l'intérêt mondial dans cet organite résiduelle autrefois considéré. Le cil, une saillie cellulaire ressemblant à des cheveux, est enrichi avec les récepteurs et les canaux nécessaires à la transduction des événements de signalisation cellulaire clés d'ions. Le cil est constitué d'une base de axoneme microtubules, typiquement structuré en neuf doublets de microtubules disposés radialement, avec ou sans une paire centrale de microtubules de singulet. La structure de axonémale définit le type et le mode d'action ciliaire. L'arrangement des microtubules 9 + 2 confère à la motilité du cil où il est utilisé dans le déplacement des fluides à travers les surfaces epitheliales. La configuration 9 + 0 est non mobiles, mais est considéré principalement fonction des événements de signalisation cellulaire 17. En dehors de CKD, les conséquences de la dysfonction ciliaire sont un ensemble de caractéristiquescaractéristiques de ciliopathie qui comprennent, l'obésité, la dégénérescence rétinienne, une polydactylie, et la déficience cognitive 16. Cependant, CKD est parmi les plus préjudiciables à la qualité de vie du patient et donc une force motrice majeure derrière le développement de appropriée dans des modèles in vivo pour ciliaire liés CKD.
Le poisson zèbre est un excellent modèle pour comprendre l'étiologie de la maladie génétique humaine. Leur développement rapide, la production d'un grand nombre d'œufs, tissu transparent, et la croissance ex utero permet processus de développement de poisson zèbre pour être visualisées et événements biologiques manipulés avec beaucoup d'aisance. Les gènes peuvent être génétiquement modifiés en utilisant le récent succès d'outils d'édition de génome (CRISPR 18 et 19 TALENS), renversé en utilisant la technologie antisens morpholino 20, ou pharmacologiquement réglementés par l'addition de composés à leur environnement aquatique. En effet, le poisson zèbre offre une plate-forme pour entreprendre eXperiments qui ne sont pas permissives dans d'autres modèles animaux. Alors que le poisson-zèbre sont des vertébrés relativement simples (par rapport à l'homme), ils partagent de nombreux organes fonctionnellement conservés, des gènes et des processus de signalisation en commun avec les humains. Par exemple, le rein poisson zèbre est remarquablement similaire en structure et la fonction par rapport à l'homme 21,22. Cependant, contrairement au rein de mammifère qui se développe à travers une succession de phases, chacune marquée par un rein plus développé (pronéphros, mésonéphros métanéphros), et, le poisson zèbre embryonnaire ne se développe un pronéphros, la forme la plus immature d'un rein. Alors que des millions de néphrons peuvent être trouvés formant les blocs de construction de rein de mammifère, l'embryon de poisson zèbre possède seulement deux. Le glomérules, qui permettent pour le filtrat sanguin initial, sont fusionnés à la ligne médiane ventrale juste à l'aorte. filtres de sang dans les glomérules dans les tubules pronephrique qui se exécutent caudale long de l'axe, la fusion avant la sortie via le cloaque. Le pronephrique tubules sont fortement ciliés de cils motiles qui sont permissives pour l'écoulement du filtrat vers la sortie caudale 3,4. Cette structure pronephrique simples maintient l'homéostasie poisson zèbre par plusieurs semaines de croissance larvaire où ils finissent par se transformer en une structure plus complexe mésonéphros 21. Cependant, le poisson zèbre ne se développe jamais un métanéphros 21. Malgré les particularités de poisson zèbre, le néphron poisson zèbre est segmenté avec des profils d'expression génique égal à celui observé chez les mammifères et offre ainsi un incomparable modèle in vivo pour néphrogenèse 3,22.
Régulièrement patients sont testés pour la fonction rénale par une série de tests sanguins et urinaires. Typiquement, le sang est analysé pour les sels dissous, l'urée et la créatinine. Des niveaux élevés de l'urée, la créatinine et les concentrations de sel anormales sont révélateurs de problèmes avec la fonction rénale. L'analyse d'urine en utilisant une jauge colorimétrique détecte des niveaux anormaux de protéines, blood, du pus, de bactéries et de sucre présente dans les échantillons d'urine. Ces essais nécessitent normalement environ 30 ml d'urine ou de 5 à 10 ml de sang. Il a été difficile de traduire ces types d'essais à petite dans des organismes modèles in vivo, tels que le poisson-zèbre, principalement en raison de la nature impossible de collecter le sang ou l'urine suffisante pour réaliser le dosage. Ici, nous abordons l'absence de tests de la fonction rénale poisson zèbre appropriées et décrivons une technique innovante pour son étude. En injectant un colorant fluorescent dans le sang nous sommes en mesure de suivre et de quantifier individuellement dans le temps de la filtration et de l'excrétion de l'activité de fluorescence à partir du sang par les reins. Cette méthode peut être utilisée pour étudier des dommages aux reins causée par la maladie, ce qui nous fournissons un exemple de.
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Protocol
Déclaration éthique: animaux, l'élevage, l'entretien et les procédures sont définies et contrôlées par la Loi 1986. Tous expérimentation animale a été réalisée sous licences accordées par le ministre de l'Intérieur (PIL n ° 70/7892) en conformité avec biologique Animaux (Scientific Procedures) Services de Groupe de gestion et le comité d'éthique services biologique, SGUL, Londres, Royaume-Uni. Tous les efforts ont été faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés et d'affiner les procédures et l'élevage afin de minimiser la souffrance et améliorer le bien-être.
1. Préparation des instruments, anesthésique et Fluorescent Dye
- Utilisation d'un étirage de micropipettes et les capillaires standard de borosilicate de paroi (sans filaments) tirer les aiguilles de longueur appropriée pour la micro-injection (figure 1A).
- Faire un moule agarose pour l'orientation des embryons pour injection facile dans le péricarde (figure 1B). Colle environ dix verre microscope slides ensemble pour former un «escalier» de diapositives offset. Pour de meilleurs résultats, utilisez une goutte de colle époxy rapide jeu de résine dans le centre de chaque diapositive.
- Découpez une section d'environ 78 mm de longueur à mi-chemin à travers deux pipettes 10 ml en plastique à l'aide d'un scalpel chauffé bec Bunsen, retirez pipette se termine comme il convient. Attachent et les articles de la colle (résine époxy) de pipette aux lames de verre empilés pour fournir la stabilité pour permettre le moule de puiser dans un plat de 90 mm de Pétri. Faites tous les efforts pour assurer les coins de diapositives alignent perpendiculaire à la chaussée plat Petri. Prévoyez du temps de colle à définir.
- Casting de moule dans une solution d'agarose à 2% dans l'eau fait de poisson (obtenu à partir de l'aquarium). Verser agarose dans une boîte de Pétri de 90 mm et placez le moule sur le dessus de la boîte de Pétri ouverte, permettant la diapositive empilés bords de submerger à un angle sous la surface de la gélose. Laisser reposer sur le banc de laboratoire pendant 30 min.
- Retirer le casting de diapositives et couvrir l'agarose coulissant imprimé avec de l'eau du poisson fraiscontenant Tricaine anesthésie (voir l'étape 1.9) dans un rapport 1:25.
- Assurez solutions de rhodamine dextran (RD) colorant. Remettre en suspension rhodamine B 10 000 MW étiqueté dextran dans l'eau ultra-pure autoclave pour obtenir une concentration du stock de 50 mg / ml. Pour la micro-injection, diluer davantage le stock à une concentration finale de 5 mg / ml dans l'eau ultra-pure autoclave.
NOTE: cellules pigmentées commencent à se différencier chez le poisson zèbre de 24 heures après la fécondation (HPF); ceux-ci peuvent obscurcir marqueurs fluorescents lors de l'acquisition d'image. - Inhiber la formation des mélanocytes à l'aide de N -Phenylthiourea (PTU), qui bloque la mélanogenèse par inhibition de la tyrosinase. Faire une solution d'achat d'actions de 0,003% des PTU en dissolvant la poudre dans de l'eau PTU aquarium, solution de la chaleur à 60 ° C pour solubiliser totalement.
- Incuber embryons de poisson zèbre en solution de bleu de méthylène, un fongicide doux, pour éviter la prolifération de champignons et augmenter la survie. Ajouter 2 ml de solution stock méthylène bleu, contenant 0,1% de bleu de méthylène dans ueau ltrapure, à 1 L d'eau de l'aquarium et de l'utilisation en tant que moyen d'embryons standard.
- Faire un 15 mM concentration stock de tricaïne méthanesulfonate / éthyl-3 benzoate comme indiqué dans «Le poisson zèbre livre '23. Anesthésier les embryons et par conséquent les immobilisé pour effectuer la procédure de micro-injection.
- Après anesthésier les embryons, les orienter, pour l'imagerie en utilisant les propriétés non-toxiques et visqueux de méthylcellulose. Pour faire un 200 ml préparation de 3% de méthylcellulose, chill 130 ml d'eau à -20 ° C pendant 30 min et placer sur la glace. Chauffer 70 ml d'eau à 80 ° C dans un bêcher en verre, ajouter 6 g de méthylcellulose, et agiter à l'aide d'une baguette de verre jusqu'à ce que toutes les particules sont mouillées et dispersées uniformément. Ajouter l'eau glacée, mélanger et laisser la préparation refroidir à 4 ° C pendant 30 min avant aliquotage en tubes de 50 ml.
REMARQUE: abaissement de la température permet la méthylcellulose à devenir soluble. La solution deviendra plus épaiscomme les hydrates de poudre. 3% de méthylcellulose peut être stocké sans croissance bactérienne pour de courtes périodes d'une semaine à 4 ° C ou plus à -20 ° C. Assurez-vous que la méthylcellulose a atteint RT avant utilisation. - Pour effectuer des injections de colorant fluorescent dans le poisson zèbre utiliser un micro-injection set-up standard (figure 1C). Il se agit d'un compresseur d'air relié à un système de régulation de pression qui alimente un porte-pipette directement pour une utilisation avec 1,0 capillaires de diamètre extérieur. Le titulaire de la pipette doit être logé à l'intérieur d'un micromanipulateur compact contrôle 3-MM33 axe solidaire d'une plaque de base en acier par un support magnétique. Les embryons peuvent être visualisées, manipulé et injecté au moyen d'un microscope à dissection stéréo.
2. poisson zèbre élevage et de traitement pré-injection
- Maintenir le poisson zèbre comme décrit précédemment 23. Utilisez un aquarium set-up qui fournit l'eau de recirculation fourni à une température constante de 28,5 ° C, Conditionné à un pH de 6.8 à 7.2 et une conductivité de 450 à 550 pS avec du bicarbonate de sodium et Instant Ocean sel de mer, respectivement. Utilisez type sauvage ou des lignes de poisson zèbre transgénique, le cas échéant à l'expérience, le maintien d'une densité de stockage de 15 hommes 15 femmes par 8 L réservoir. Réglez le photocycle des installations de poisson à 14 h de la lumière du jour entre 9 heures-23 heures.
- Frai du poisson zèbre commence au début de la photocycle, lorsque les lumières se allument dans la matinée. Pour assurer un maximum d'œufs peuvent être collectées sans déranger les poissons, plongez bassins d'élevage (contenant des inserts en mesh, disponibles auprès des spécialistes de poisson zèbre) dans les réservoirs de stockage de type sauvage le soir avant la collecte.
- Le jour de la collecte, permet 30 à 40 min pour les poissons pour frayer, après quoi recueillir et rincer œufs à l'aide d'une passoire à thé et de l'eau de l'aquarium frais. Déposer les œufs nettoyés dans un milieu contenant des embryons de 90 mm de boîte de Pétri et incuber à 28,5 ° C.
- Traiter les embryons avec PTU pour inhiber mélanogenèse. A 8 HPF, transférer des embryons viables dans le liquide minimal pour des plats frais de Pétri contenant 1: 100 PTU à moyen de l'embryon et incuber encore à 28,5 ° C jusqu'à 72 HPF.
REMARQUE: PTU peut causer des anomalies de développement se il est utilisé à des stades antérieurs devraient donc être restreintes pour poster huit étapes de HPF, mais peut être traitée aussi tard que 24 HPF. Plus tardive des PTU ne bloque pas entièrement la pigmentation des yeux, mais est généralement couronnée de succès et en inhibant la formation de tronc mélanocytes.
3. microinjection
NOTE: Le péricarde entoure le cœur, mais est séparé pour la protection et la facilité de mouvement cardiaque par le fluide dans la cavité péricardique. L'objectif de cette procédure consiste à injecter RD dans la cavité péricardique, cela permet une absorption rapide du colorant au système de vascularisation.
- aiguilles de charge avec 6 pi - dilués RD, à l'aide des conseils de microloader et sécurisé dans le support de l'aiguille du micromanipulateur. Casser la fin de l'aiguille à l'aide bien tippforceps ed (figure 1A). Déplacez la solution de RD à la pointe de l'aiguille en maximisant la durée d'impulsion pour le réglage des minutes, revenir à msec une fois terminé.
- Utiliser un micromètre, le régulateur de pression, et des améliorations à la longueur de la pointe de l'aiguille (en utilisant une pince) pour ajuster la taille de la gouttelette expulsé à 100 m de diamètre, ce qui équivaut à un volume de 0,5 nl (figure 2A).
REMARQUE: Lorsque l'aiguille se casse, veillez à ne pas casser trop large sinon il fera calibrer le volume d'injection difficile. Si nécessaire, briser encore la pointe de l'aiguille d'augmenter la taille des gouttes cependant conserver une épaisseur d'aiguille qui permet l'entrée dans le péricarde sans flexion excessive ou des dommages aux tissus. - Avant l'injection, anesthésier les embryons dans le milieu de l'embryon contenant tricaïne. Mettre en place 2 x 35 mm boîtes de Pétri contenant 5 ml de milieu d'embryon, une étiquette 'Tricaine' et l'autre 'Recovery'.
- Ajouter 200ul de stock tricaïne à l'antenne dûment étiquetés. Une fois prêt à injecter, sélectionnez un embryon individuelle à 72 HPF et transférer dans un liquide minimale au plat tricaïne. Surveiller l'activité de l'embryon, tester l'embryon est anesthésié et immobilisé par agitation douce en utilisant une pointe de microloader tronquée.
- Transférer l'embryon anesthésié au moule d'injection et orienter l'embryon à l'intérieur d'une auge d'agarose sorte que le côté gauche soit vers le haut, le positionnement du coeur à la gauche du champ de vision.
- Pour injecter la RD dans le cœur, le péricarde percer avec l'aiguille et injecter 1 nl de RD dans la cavité péricardique de l'embryon anesthésié (figure 2B, panneau de droite). Retirer l'aiguille après l'injection. Transférer l'embryon injecté dans le liquide minimal à 'plat de récupération "et surveiller pendant 1 min. Transférer l'embryon individu à une plaque de 24 puits contenant 1 ml de milieu d'embryons frais (contenant PTU) et étiqueter correctement.
REMARQUE: Le péricarde est difficile, mais il ya un point faible notable à l'intersection où le péricarde répond aux arcs pharyngiens ventro-caudal et dorso-rostrale sac vitellin (figure 2B) flèche. L'aiguille doit être adressée à cette rainure. Lorsque l'aiguille est en place, un robinet cabinet d'un doigt sur le dessus du micromanipulateur va faciliter l'entrée dans la cavité péricardique. - Répétez les étapes 3.2 à 3.6 pour au moins 10 embryons par groupe expérimental, placez chaque poisson dans un puits séparé et unique labelto permis individuels expérimentaux suivis. Incuber à 28,5 ° C pendant 3 heures.
4. Imaging Acquisition
- À 3 h injection de poste (HPI) anesthésier embryons comme décrit précédemment et transférer dans un plat de 35 mm de Pétri contenant 3% de méthylcellulose. Poussez doucement embryons dans la méthylcellulose et d'orienter de sorte que le côté latéral peut être imagée.
- Acquérir une image de l'embryon sous UV en utilisant un filtre pour la visualisation of lumière émise à 570 nm (figure 2C). Après l'acquisition de l'image, permet de récupérer l'embryon avant de remplacer dans le puits désigné. Acquérir des images pour tous les embryons injectés et incuber encore à 28,5 ° C.
NOTE: Dans ce protocole, nous avons utilisé un stéréomicroscope fluorescente avec un jeu de filtres de TXR, une caméra DFC300FX et logiciels d'application respective. Prenez note des paramètres d'acquisition exactes pour l'acquisition de l'image suivante. - Au 24 HPI, acquérir un second tour d'images tel que décrit ci-dessus. Une fois que toutes les images ont été acquises, à la fois à 3 et 24 HPI HPI, humainement disposer des embryons ou à d'autres moyens expérimentaux par exemple, immunohistochimie.
5. Traitement d'image
- Quantifier intensité de fluorescence de chaque embryon injecté, à 3 et 24 HPI HPI, en analysant des images en utilisant le logiciel ImageJ du NIH. Pour mesurer l'intensité de fluorescence, ouvrir une image dans ImageJ et spécifiez une région d'intérêt (ROI) à 100 px (sélection Edit → → préciser) 2.
- Positionner le coeur dans le centre de la ROI (figure 2C), réglez mesures pour y inclure l'échelle de gris moyen et environs (Analyser → ensemble des mesures), effectuer une mesure (Analyser → mesure). Remplissez pour chaque ensemble d'images, à 3 et 24 HPI HPI, par embryon et de transférer des valeurs moyennes d'échelle de gris vers un tableur pour traitement ultérieur.
NOTE: Nous avons choisi une taille de roi fixe de 100 px 2 car cela englobe coeurs individuels entre embryons. Le cœur a été choisi pour effectuer des mesures en raison de la taille importante qui permet à un emplacement commode pour mesurer la teneur fluorescent du sang avant d'entrer dans le rein. - Effectuer une analyse statistique en utilisant un logiciel statistique appropriée. Comparer des groupes de signification statistique en utilisant le test t de l'élève.
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Representative Results
Syndrome de Bardet-Biedl (BBS) est une ciliopathie hétérogène rare qui affecte environ 1: 160 000 personnes dans le monde 16. Les patients présentent un certain nombre de problèmes liés notamment reins polykystiques, suite patients ont souvent besoin de dialyse rénale ou une transplantation 24. ESRF est la cause la plus fréquente de décès chez BBS, avec environ 30% des patients CKD en développement 16. Actuellement, 20 gènes non liés ont été impliqués dans BBS sans association génotype-phénotype publié. Les protéines BBS part domaines de protéine localisation communes au sein des organes de cil et basales qui, avec les traits caractéristiques des patients, en terme de diagnostic de ciliopathie. BBS9 code B1 Parathyoid hormone-sensibles (PTHB1) protéine qui avec d'autres BBS (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) protéines forment le noyau BBSome complexe responsable de la formation du cil primaire 24. Des mutations dans BBS9 compte pour 6% des BBS cAses 24. En outre, la PTH a été impliquée dans la formation de kystes du rein par la promotion de rénale prolifération des cellules épithéliales, ce qui suggère que la perte de fonction de bbs9 chez le poisson zèbre peut afficher défauts rénales 25. Les rapports précédents en utilisant un modèle de poisson zèbre bbs9 knockdown excluent une description du rein, présentant la possibilité de démontrer le rein décrit la fonction dosage 26. Knockdown de fonction bbs9 a été réalisée chez le poisson zèbre par injection, au stade de 1 à 4 cellules, un morpholino antisens pour bloquer la traduction de bbs9 spécifique du gène et en parallèle un morpholino témoin négatif norme par rapport à une mutation intronique en bêta-globine humaine (4 ng bbs9 MO, séquence: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA et 4 ng commande MO, séquence: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). Nous avons constaté que la perte de fonction de bbs9 entraîné dans 40% des embryons présentant des kystes pronephrique de 5 dpf, suggérant que ce était un modèle approprié pour analyserla fonction rénale en utilisant l'essai de dégagement rhodamine dextrane. Nous avons observé que les poissons morphant ont une réduction significative de leur capacité à éliminer le colorant fluorescent après 24 hpi comparées aux témoins (figure 3) - con: 14,8 ± 1,2 SEM, n = 9; bbs9 MO: 61,0 ± 10,3 SEM, n = 10 ; non apparié valeur de P t-test: 0,002). Pour écarter le potentiel qui a réduit la clairance pourrait être due à une réduction de la circulation sanguine, les embryons ont été évalués pour les cellules de battement de coeur et de sang de recirculation, à la fois témoins et des poissons morphant avaient fréquence cardiaque comparables et la circulation sanguine. Ces données indiquent que la fonction rénale est altérée en morphants bbs9. En effet, les embryons de morphant bbs9 développer tubules kystiques pronephrique concurrentes à celle observée chez les patients BBS.
Figure 1. Préparation de l'équipementet mise en place. Capillaires (A) de borosilicate doit être tiré pour la microinjection l'aide d'un extracteur de aiguille appropriée. L'aiguille exige la rupture avec une pince (ligne pointillée) pour permettre à la RD pour quitter l'aiguille, il faut prendre soin de ne pas casser l'aiguille trop rendu une aiguille qui ne peut être étalonné. Barre d'échelle:. 200 um (B) Un moule agarose pour la manipulation et l'orientation embryon peut être façonné en collant ensemble des lames de verre et des pipettes en plastique (C) La microinjection set-up standard.. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
Figure 2. microinjection de la rhodamine dextran dans le sac péricardique. (A) Calibrer la taille des gouttes à 10 incbeso (100 um) sur un réticule de stade 1 mm. (B) de positionnement correct de l'aiguille (flèches noires) dans le marquage de l'intersection entre la caudale arc pharyngien, jaune sac et le cœur facilitera percer le tissu (tête de flèche) crevasse. Barre d'échelle:. 200 um (C) rhodamine dextran peut être vu rapidement absorbé par l'ensemble du système vasculaire (flèches blanches). 100 px deux régions d'intérêts couvrant un cœur centralisée (carré jaune) devrait être utilisé pour prendre des mesures de la valeur de gris moyen et donc pixel / intensité de fluorescence. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Knockdown de bbs9 provoque défectueuse reins FUNCtion chez le poisson zèbre. (A) Les embryons injecté dans le péricarde avec de la rhodamine dextran à 3 et 24 HPI HPI, haut et bas deux panneaux respectivement, dans le contrôle ou embryons bbs9 de morphant. Pointes de flèches indiquent le cœur; flèche indique la formation d'un kyste pronephrique. (B) Pourcentage intensité fluorescente restant après 24 hpi en contrôle contre embryons bbs9 MO. Les barres d'erreur montrent l'erreur standard de la moyenne (SEM), ** P ≤ 0,01. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Poisson zèbre offre un outil précieux pour modéliser les maladies génétiques humaines, leur utilisation comme un instrument scientifique pour la recherche in vivo ont permis des études détaillées de la répartition génétique de nombreux systèmes biologiques, y compris le rein. Une grande partie est maintenant compris comment le rein poisson zèbre se développe et fonctionne. Les similitudes frappantes avec néphrogenèse humaine et d'homologie avec la maladie causant des gènes 21 a montré comment le poisson zèbre sont devenus fondamentale pour comprendre comment les défauts dans le gène fonction plomb à la pathologie de la maladie rénale. En effet, la manipulation génétique peut être facilement atteint en utilisant le poisson zèbre antisens morpholino technologie knockdown ou du génome ciblé outils d'édition plus avancées telles que TALENS ou CRISPR. Création de modèles démontables ou mutantes pour les gènes qui causent la maladie rénale suspectée est la première étape dans la compréhension de leur implication dans la manifestation de la maladie. Pour cela un test fiable pour la fonction rénale est sollicitépour indiquer si un gène candidat est probablement responsable de la pathologie observée chez les patients.
tests de la fonction du rein sont simples et relativement pas cher à effectuer sur les humains, en général à la recherche à des niveaux de solutés présents dans le sang ou l'urine. Cependant, ces méthodes ne sont pas applicables chez le poisson zèbre en raison de sa petite taille et de l'habitat aquatique. Le test décrit ici rhodamine dextrane utilise la capacité des tubules pronephrique pour filtrer les composants de faible poids moléculaire à partir du sang. Les podocytes positionnés à l'intérieur de la capsule de Bowman du rein, qui enveloppe les capillaires du glomérule, permettent la libre passage de petites molécules telles que l'eau, des sels ioniques et de glucose à travers un diaphragme à fente 27. Les fentes de filtration fonctionnent en outre pour empêcher la perte de protéines à partir du sang de macro. Filtration est limité pour les molécules supérieures à 5 kDa et presque complètement bloqué à la taille de l'albumine sérique 28 (environ0; 65 kDa). En injectant un colorant fluorescent dextran d'environ 10 kDa, à une concentration connue dans la cavité péricardique, nous sommes en mesure de mesurer l'intensité de fluorescence du sang au fil du temps. Dans des conditions normales d'environ 85% de la fluorescence initiale est perdue par le sang sur une période de 24 heures, grâce à la sécrétion par les reins. Il convient de noter que l'injection dans l'espace péricardique est seulement possible avec le dextrane de faible MW qui passe librement dans le système vasculaire. Ainsi, cet essai ne donne qu'une température lue pour le taux d'élimination pour les composants de bas poids moléculaire et ne donne aucune information sur l'efficacité de la filtration glomérulaire. Celui-ci peut être évaluée en utilisant des colorants plus directement de haut poids moléculaire supérieur à 70 kDa, ce qui nécessite l'injection dans le système vasculaire et non dans l'espace péricardique. En effet, les dextranes MWs de divers peuvent être utilisés pour disséquer en outre la fonction rénale 28.
Les tubules pronephrique poisson zèbre sont fortement ciliés avec mocils de tuiles qui facilitent le mouvement de filtrat vers le cloaque 3,4. Défauts dans les machines ciliaire ont été impliqués dans les maladies rénales. BBS est un, transmission autosomique récessive génétiquement hétérogène caractérisée par une dégénérescence de la rétine débutant dans l'enfance, l'obésité précoce, les troubles cognitifs, la polydactylie et une malformation rénale 24. À ce jour, 20 gènes BBS (BBS1-20) ont été identifiés. Perturbation des bbs conduit à la formation de kyste rénal et la fonction pronephrique défectueuse chez le poisson zèbre neuf. BBS9 interagit avec d'autres protéines BBS pour former le BBSome responsable ciliogenèse échéant, des mutations qui représentent 6% des cas BBS 24. Alors un modèle bbs9 de knockdown poisson zèbre a été rapporté, une description du phénotype rénale manquait 26. Par abattre bbs9 chez le poisson zèbre, en utilisant l'approche de morpholino, nous démontrons l'utilisation de l'essai de la clairance rénale comme une méthode pour déterminerla fonction rénale dans un modèle de maladie rénale. Ici, nous montrons que les embryons bbs9 de morphant affichent jeu fluorescente empêché de la circulation sanguine, ce qui indique que le rein a omis d'enlever solutés MW faibles. Ainsi, en raison de l'implication de bbs9 dans ciliogenèse, et le rôle des cils pronephrique pour faciliter le mouvement de filtrat, la clairance rénale observée dans morphants est probablement dû à la fonction des cils aberrante. Cette méthode représente un outil précieux pour évaluer la fonction rénale chez les modèles de maladies de poisson zèbre.
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Disclosures
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Assistance technique fournie par Jaipreet Bharj. Ce travail a été financé par des subventions du FP7-UE (SYSCILIA -241 955) et le rein Fondation néerlandaise (CP11.18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , Academic Press. (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
