Summary
Der Zebrafisch ist ein beliebtes Tool zur chronischen Nierenerkrankung (CKD) zu modellieren. Allerdings macht ihre geringe Größe es unmöglich, die Nierenfunktion zu bewerten mit traditionellen Methoden. Wir beschreiben einen Fluoreszenzfarbstoff Nieren-Clearance-Test 1, die quantitative Analyse von Zebrafisch Nierenfunktion bei CKD ermöglicht.
Abstract
Die Zebrafischembryo bietet eine praktische Zwecke geeigneten Modells zur Organogenese studieren und modellieren menschliche genetische Erkrankung. Trotz ihrer relativen Einfachheit der Zebrafisch Niere entwickelt und Funktionen in fast der gleichen Weise wie Menschen. Ein Hauptunterschied in der Konstruktion der menschlichen Niere ist die Anwesenheit von Millionen von Nephronen gegenüber dem Zebrafisch, der nur zwei hat. Jedoch vereinfacht eine solche komplexe System in die Grundfunktionseinheiten ist unser Verständnis, wie die Niere entwickelt und betreibt unterstützt. Im Zebrafisch ist der Mittellinie befindet Glomerulus für die erste Blutfiltration in zwei pronephric Tubuli, die beidseitig entlang der embryonalen Achse laufen vor dem Verschmelzen miteinander an der Kloake abweichen verantwortlich. Die pronephric Tubuli sind stark von bewegliche Zilien, die die Bewegung Filtrat entlang der segmentierten Röhrchen zu erleichtern bevölkert, die den Austausch von verschiedenen gelösten Stoffe, bevor sie schließlich Verlassen durch die Kloake 2-4. Viele Gene, die für CKD, inc verantwortlichLuding diejenigen zu ciliogenesis Zusammenhang wurden im Zebrafisch 5 untersucht. Allerdings ist eine große Nachteil ist die Schwierigkeit bei der Beurteilung Zebrabärbling Nierenfunktion nach der Genmanipulation. Traditionelle Assays zu Funktionsstörungen der Nieren messen beim Menschen nicht translationale zu Zebrafisch erwiesen, vor allem wegen ihrer aquatischen Umwelt und der geringen Größe. Beispielsweise ist es physikalisch nicht möglich ist, Blut zu extrahieren aus embryonalen statt Fische zur Analyse von Harnstoff und Kreatinin-Gehalt, da sie zu klein sind. Hinzu kommt, dass Zebrafisch nicht genug Urin produzieren, für die Prüfung auf einem einfachen Proteinurie "Messstab", die oft bei der ersten Untersuchung von Patienten durchgeführt wird. Wir beschreiben einen Assay, der die fluoreszierende optische Transparenz der Zebrafisch verwendet, um den Abstand von einem fluoreszierenden Farbstoff quantitativ zu überwachen, mit der Zeit aus dem Gefäßsystem und durch die Niere, um eine Ausgabe der Nierenfunktion 1,6-9 ergeben.
Introduction
Die menschliche Niere spielt eine entscheidende Rolle bei der Filterung von metabolischen Abfällen aus dem Blut und Gewinnung erforderlich Solute zellulären Homöostase aufrechtzuerhalten. Es gibt eine Reihe von menschlichen genetischen Krankheiten, Funktionsstörungen der Nieren verursachen. Die häufigste vererbte Nierenerkrankung wird autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD), gekennzeichnet durch die Entwicklung von mit Flüssigkeit gefüllten Säckchen im Nieren Tubuli; der Schaden, den cystogenesis verursacht beeinträchtigt die Nierenfunktion 10. ADPKD hat ein Auftreten von 1: 800 bis 1: 1000 und ist für 8 - 10% der Patienten im Endstadium der Niereninsuffizienz (ESRF) 11. Mehrere Gene wurden in Verbindung gebracht zu ADPKD verursachen einschließlich Polycystin-1 (PKD1) und 2 (PKD2), einem Anteil von ca. 85% und 15% der Fälle bzw. 12,13. Ferner können die Genprodukte für PKD1 und -2 zu lokalisieren Ciliums und sind von grundlegender Bedeutung ciliogenesis 14,15. Es gibt nun eine anerkannte Gruppe von menschlichen genetischen Erkrankungen, bekannt alsdie Ziliopathien, die Zilien Funktion beeinträchtigen und zu CKD 16.
Die wachsende Zahl von menschlichen genetischen Erkrankungen ciliary Entwicklung und Funktion zeichnet globale Interesse an dieser einst als verkümmerte Organelle. Die Zilien, eine haarähnliche Zellüberstand wird mit Rezeptoren und Ionenkanäle für die Weiterleitung von wichtigen Zellsignalwege erforderlich bereichert. Die Zilien aus einem Mikrotubuli-basierte Axonem, typischerweise in neun radial angeordnet Mikrotubulus Dubletts mit oder ohne zentralen Paar von Singulett Mikrotubuli strukturiert. Die axonemal Struktur definiert die Art und Weise der ciliary Aktion. Die 9 + 2 Mikrotubuli Anordnung verleiht Motilität Ciliums wo sie bei der Bewegung von Fluiden über epitheliale Oberflächen ausgenutzt. Die 9 + 0-Konfiguration ist nicht beweglich, sondern wird angenommen, dass in erster Linie Funktion in der zellulären Signalwege 17. Abgesehen von CKD, sind die Folgen der ciliary Dysfunktion ein Satz charakteristischerZiliopathie Funktionen, die umfassen, Übergewicht, Netzhautdegeneration, Polydaktylie und kognitive Beeinträchtigung 16. Allerdings ist CKD zu den am meisten nachteilig auf die Lebensqualität des Patienten und damit eine treibende Kraft hinter der Entwicklung geeigneter In-vivo-Modelle für ciliary bezogenen CKD.
Der Zebrafisch ist ein ausgezeichnetes Modell, um die Ätiologie der menschlichen genetischen Krankheit zu verstehen. Ihre schnelle Entwicklung, ermöglicht die Herstellung einer großen Anzahl von Eiern, transparenten Gewebe und ex utero Wachstumszebrafischentwicklungsvorgänge visualisiert werden und biologische Ereignisse mit großer Leichtigkeit manipuliert. Gene können gentechnisch verändert werden, mit dem jüngsten Erfolg der Genom-Editing-Tools (CRISPR 18 und TALENS 19), niedergeschlagen mit Antisense-Morpholino-Technologie 20 oder pharmakologisch durch die Zugabe von Verbindungen, um ihre Gewässer geregelt. In der Tat, Zebrafisch eine Plattform bieten zu unternehmen eXperimente die nicht permissive in anderen Tiermodellen sind. Während Zebrabärbling sind relativ einfach Vertebraten (gegenüber Menschen) sie viele funktionell konservierten Organen, Gene und Signalprozesse gemeinsam mit dem Menschen. Beispielsweise ist die Zebrafisch Niere in Struktur und Funktion bemerkenswert ähnlich im Vergleich zum Menschen 21,22. Im Gegensatz zu der Säugetierniere, die durch eine Folge von Phasen entwickelt, die jeweils durch einen weiter entwickelten Niere (pronephros, mesonephros und Metanephros) gekennzeichnet, entwickelt der embryonalen Zebrabärbling nur pronephros, die meisten unreifen Form einer Niere. Während Millionen von Nephronen zu finden sind, welche die Bausteine der Säugetierniere, nur der Zebrafischembryo besitzt zwei. Die Glomeruli, die für die anfängliche Blutfiltrat zu ermöglichen, sind an der Mittellinie gerade ventral zur Aorta fusioniert. Blutfilter durch die Glomeruli in die pronephric Tubuli, die kaudal laufen entlang der Achse, Absicherung vor über die Kloake zu verlassen. Die pronephric tuBules stark mit motilen Zilien, die permissive zur Strömung des Filtrats nach caudal und Austritts 3,4 sind Flimmerepithel. Diese einfache pronephric Struktur beibehält Zebrafisch-Homöostase durch mehrere Wochen das Larvenwachstum wo sie schließlich in eine komplexere Struktur Mesonephros 21 zu entwickeln. Allerdings entwickelt sich der Zebrafisch nie eine Metanephros 21. Trotz der Zebrafisch-Eigenheiten, ist der Zebrafisch Nephron mit Genexpressionsprofile gleich bei Säugetieren beobachtet segmentiert und bietet so einen unvergleichlichen In-vivo-Modell für Nephrogenese 3,22.
Routine Patienten für die Nierenfunktion durch eine Reihe von Blut- und Urintests geprüft. In der Regel wird das Blut für gelöste Salze, Harnstoff und Kreatinin analysiert. Hohe Konzentrationen von Harnstoff, Kreatinin und abnormalen Salzkonzentrationen weisen auf Probleme mit der Nierenfunktion. Urinanalyse unter Verwendung eines kolorimetrischen Messstab erkennt abnormale Niveaus des Proteins, blood, Eiter, Bakterien und in Urinproben vorhanden Zucker. Solche Tests erfordern normalerweise ca. 30 ml Urin oder 5 - 10 ml der Blut. Es ist schwierig gewesen, diese Art von Assays, um kleine in vivo Modellorganismen wie Zebrafisch zu übersetzen, hauptsächlich aufgrund der Beschaffenheit unmöglich, eine ausreichende Blut oder Urin, um den Assay durchzuführen. Hier wenden wir uns den Mangel an geeigneten Zebrafisch Nierenfunktionstests und beschreibt eine innovative Technik für die Studie. Durch Injizieren eines fluoreszierenden Farbstoffes in dem Blutstrom sind wir in der Lage, über die Nieren zu überwachen und zu quantifizieren, einzeln über die Zeit der Filtration und die Ausscheidung von Fluoreszenzaktivität aus dem Blut. Diese Methode kann verwendet werden, um Nierenschäden aufgrund von Krankheiten, die wir erbringen, ein Beispiel zu untersuchen.
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Protocol
Ethikerklärung: Tier Wartung, Tierhaltung, sowie Prozesse definiert und durch die Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 Alle Tierversuche wurden unter der Innenminister (PIL Nr 70/7892) in Übereinstimmung mit den biologischen erteilten Lizenzen durchgeführt gesteuert Services Management Group und die Biologische Dienstleistungen Ethikkommission, SGUL, London, UK. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um die Zahl der Versuchstiere zu reduzieren und beide Verfahren und Haltung, um das Leiden zu minimieren und zur Verbesserung der Wohlfahrt zu verfeinern.
1. Herstellung des Instruments, Narkosemittel, und Fluoreszenzfarbstoff
- Mit einer Mikropipette Abzieher und Borosilikat-Standard-Wand Kapillaren (ohne Fasern) ziehen Nadeln geeigneter Länge für die Mikroinjektion (1A).
- Machen Sie ein Agarose-Form für die Orientierung von Embryonen für die einfache Injektion in den Herzbeutel (1B). Kleber etwa zehn Glasobjekt slIden zusammen, um eine "Treppe" des Offset-Folien zu bilden. Die besten Ergebnisse erzielen, verwenden Sie einen Tropfen schnellen Satz Epoxidharz Kleber in der Mitte jeder Folie.
- Schneiden Sie einen Abschnitt von etwa 78 mm in der Länge auf halbem Weg durch zwei 10 ml Kunststoffpipetten mit einem Bunsenbrenner erhitzten Skalpell entfernen Pipettenenden als angemessen. Befestigen und Leim (Epoxidharz) Pipettenabschnitte der gestapelten Glasträger um Stabilität zu gewährleisten, damit das Werkzeug in eine 90 mm Petrischale eintauchen. Alle Anstrengungen unternehmen, um sicherzustellen, dass die Schiebe Ecken ausrichten senkrecht zur Petrischale Stock. Lassen Kleber Mal zu setzen.
- Guss die Form in einem 2% igen Lösung in Fisch Wasser (aus dem Aquarium erhalten). Gießen Sie Agarose in ein 90 mm Petrischale und legen Sie die Form auf der Oberseite des offenen Petrischale und erlaubt die Stapelschiebekanten in einem Winkel unter dem Agarose-Oberfläche tauchen. Lassen Sie auf dem Labortisch für 30 Minuten eingestellt.
- Entfernen Sie die Folie Besetzung und decken die Einschubprägt Agarose mit frischem Fisch Wasserenthält Tricaine Narkose (siehe Schritt 1.9) zu einem Verhältnis von 1:25.
- Make Lösungen von Rhodamin-Dextran (RD) Farbstoff. Resuspendieren Rhodamin B 10.000 MW markiertem Dextran in autoklaviertem Reinstwasser, um eine Stammkonzentration von 50 mg / ml zu machen. Für die Mikroinjektion, weiter verdünnt das Lager bis zu einer Endkonzentration von 5 mg / ml in autoklaviert Reinstwasser.
HINWEIS: pigmentierten Zellen beginnen, in Zebrafisch von 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) zu differenzieren; diese können fluoreszierende Marker bei der Bildaufnahme zu verdunkeln. - Hemmen Melanozyten Bildung unter Verwendung N -Phenylthiourea (PTU), die Blöcke Melanogenese durch Hemmung der Tyrosinase. Machen Sie eine 0,003% Stammlösung von PTU PTU durch Auflösen von Pulver im Aquarienwasser, Hitze-Lösung bei 60 ° C vollständig löslich zu machen.
- Inkubieren Zebrafischembryonen in Methylenblau-Lösung, einer milden Fungizid, um Pilzblüte verhindern und die Überlebenszeit. 2 ml Methylenblau-Stammlösung, die 0,1% Methylenblau in ultrapure Wasser auf 1 l Aquarienwasser und Verwendung als Standard Embryo Medium.
- Überlegen Sie sich einen 15 mM Stammkonzentration von Tricaine / Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonatsalz wie in "Der Zebrafisch-Buch" 23 angewiesen. Anesthetize die Embryonen und damit immobilisiert sie, um die Mikroinjektionsverfahren durchzuführen.
- Nach Anästhesierung der Embryonen, orientieren sie zur Bildgebung mit Hilfe der nicht-toxisch und viskosen Eigenschaften Methylcellulose. Um einen 200 ml Herstellung von 3% Methylcellulose, chill 130 ml Wasser bei -20 ° C für 30 min auf Eis stellen. Erhitzen Sie 70 ml Wasser auf 80 ° C in einem Becherglas, fügen Sie 6 g Methylcellulose, und rühren mit einem Glasstab, bis alle Partikel benetzt und gleichmäßig verteilt. Fügen Sie das eiskalte Wasser, mischen, und lassen Sie das Präparat bei 4 ° C für 30 Minuten vor dem Aliquotieren in 50-ml-Röhrchen abkühlen.
HINWEIS: Das Absenken der Temperatur kann der Methylcellulose löslich zu werden. Die Lösung wird dickerals pulverförmigen Hydraten. 3% Methylcellulose ohne Bakterienwachstum für eine kurze Zeit von einer Woche bei 4 ° C oder mehr bei -20 ° C gelagert werden. Achten Sie darauf, die Methylcellulose hat RT vor dem Gebrauch erreicht. - Um Injektionen von Fluoreszenzfarbstoff in den Zebrafisch durchführen mit einem Standard-Mikroinjektion Set-up (1C). Diese besteht aus einem Luftkompressor mit einem Druckregler-System, das in eine gerade Pipettenhalter für die Verwendung mit 1,0 Außendurchmesser Kapillaren zuführt. Der Pipettenhalter sollte innerhalb einer MM33 kompakte 3-Achsen-Steuerung Mikromanipulator mit einer Stahlgrundplatte durch eine magnetische Halterung gesichert untergebracht werden. Embryonen können visualisiert werden, manipuliert und durch ein Stereo Binokular injiziert.
2. Zebrafisch Haltung und Pre-Injektionsbehandlung
- Pflegen Zebrafisch wie zuvor beschrieben 23. Verwenden Sie ein Aquarium Set-up, das bei einer konstanten Temperatur von 28,5 ° C geliefert Umlaufwasser bietetAuf pH 6,8 konditioniert - 7,2 und die Leitfähigkeit von 450-550 uS mit Natriumbicarbonat und Instant Ocean Meersalz auf. Verwenden Wildtyp oder transgenen Zebrafisch Linien entsprechend dem Experiment, die Aufrechterhaltung einer Besatzdichte von 15 Männern und 15 Frauen pro 8 L Tank. Legen Sie die Fischanlage Photozyklus bis 14 Stunden des Tageslichts zwischen 09.00 Uhr bis 11.00 Uhr.
- Zebrafisch Laich beginnt am Anfang des Photozyklus, wenn das Licht eingeschaltet in den Morgen. Um sicherzustellen, maximalen Eier ohne die Fische zu stören gesammelt werden, tauchen Zuchtbecken (mit Mesh-Einsätzen, von Zebrafisch-Spezialisten) in Wildtyp-Lagertanks am Abend vor der Sammlung.
- Am Tag der Erhebung, ermöglichen 30 bis 40 min für die Fische zum Laichen, danach sammeln und spülen Eier mit einem Teesieb und frische Aquarienwasser. Zahlen Sie die gereinigten Eier in einer 90 mm Petrischale mit Embryo Medium und Inkubation bei 28,5 ° C.
- Behandeln Sie die Embryonen mit PTU zu melano hemmenGenese. Um 8 HPF, überlebensfähige Embryonen in minimal Flüssigkeit auf frische Petrischalen mit 1: 100 PTU zu Embryo-Medium und bei 28,5 ° C weiter inkubiert bis 72 HPF.
HINWEIS: PTU können Entwicklungsstörungen verursachen, wenn in früheren Stadien so sollte eingeschränkt bis 8 HPF Stufen veröffentlichen werden verwendet, kann aber so spät wie 24 HPF behandelt werden. Am späten Zugabe von PTU nicht vollständig Augenpigmentierung blockieren, aber ist in der Regel erfolgreich und Hemmung Stamm Melanozyten Bildung.
3. Mikroinjektion
HINWEIS: Der Herzbeutel umhüllt den Kern jedoch ist für den Schutz und die einfache Herzbewegung von Fluid innerhalb der Perikardhöhle getrennt. Das Ziel dieses Verfahrens ist es, RD in den Herzhohlraum einzuspritzen, dies ermöglicht eine schnelle Aufnahme des Farbstoffs auf das Gefäßsystem.
- Last Nadeln mit 6 ul - verwässert RD, mit Microloader Tipps und sichern in den Nadelhalter des Mikromanipulator. Brechen Sie das Ende der Nadel mit Fein tipped Zange (Figur 1A). Bewegen Sie den RD-Lösung auf die Spitze der Nadel durch die Maximierung der Pulsdauer auf die Minuteneinstellung, wechseln Sie wieder in msec einmal abgeschlossen.
- Verwenden Sie eine Objektmikrometer, den Druckregler, und Verbesserungen an der Nadelspitze Länge (mit einer Pinzette), um die Größe des ausgestoßenen Tröpfchen auf 100 um im Durchmesser einstellen, entspricht dies einer 0,5 nl Volumen (Abbildung 2A).
HINWEIS: Beim Brechen der Nadel darauf achten, zu viel ab, nicht zu brechen sonst wird es machen Kalibrierung des Einspritzvolumens schwierig. Ggf. weiteren brechen die Nadelspitze, um die Tropfengröße jedoch zu steigern sowie eine Nadeldicke, die den Eintritt in den Herzbeutel, ohne übermäßiges Biegen oder Schädigung des Gewebes ermöglicht. - Vor der Injektion anästhesiert die Embryonen in Embryomedium enthaltenden Tricaine. Bis 2 x 35 mm Petrischalen mit 5 ml Embryo Medium, Etikett einer 'Tricaine "und die andere" Verwertung "ein.
- Geben Sie 200ul Lager Tricaine an den entsprechend gekennzeichneten Gericht. Sobald die Injektion bereit, wählen Sie einen individuellen Embryos bei 72 HPF und übertragen in minimal Flüssigkeit auf die Tricaine Gericht. Überwachen Sie die Aktivität des Embryos, testen der Embryo betäubt und durch vorsichtiges Schütteln immobilisiert mit einem abgeschnittenen Microloader Spitze.
- Übertragen Sie die narkotisierten Embryo auf die Spritzgussform und Orientierung des Embryos in einem Agarose-Trog so die linke Seite nach oben zeigt, die Positionierung des Herzens auf der linken Seite des Gesichtsfeldes.
- Um die RD in das Herz injiziert, durchbohren die Herzbeutel mit der Nadel und Injektion 1 nl der RD in die Perikardhöhle des narkotisierten Embryo (2B, rechts). Ziehen Sie die Nadel nach der Injektion. Übertragen Sie die injizierten Embryos in minimal Flüssigkeit auf das "Recovery-Gericht" und Monitor für 1 min. Übertragen Sie die einzelnen Embryo zu einem 24-Well-Platte mit 1 ml frischem Embryo-Medium (das PTU) und kennzeichnen Sie entsprechend.
HINWEIS: Der Herzbeutel ist hart, aber es gibt eine bemerkenswerte Schwachpunkt an der Kreuzung, wo die Herzbeutel entspricht den ventro-kaudal Schlundbögen und dorso-rostral Dottersack (2B Pfeilspitze). Die Nadel sollte auf diese Nut gerichtet werden. Wenn die Nadel an Ort und Stelle, wird ein bestimmtes Klopfen eines Finger auf der Oberseite des Mikromanipulators Eintritt in die Perikardhöhle erleichtern. - Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,6 für mindestens 10 Embryonen pro Versuchsgruppe, legen Sie jeden Fisch in einem eigenen gut und einzigartig labelto Genehmigung einzelnen Versuchs Follow-ups. Inkubation bei 28,5 ° C für 3 Stunden.
4. Imaging Acquisition
- Nach 3 h nach der Injektion (hpi) anästhesiert Embryonen wie oben beschrieben und übertragen, um eine 35 mm Petrischale, enthaltend 3% Methylcellulose. Drücken Sie vorsichtig Embryonen in die Methylcellulose und zu orientieren, so dass die laterale Seite abgebildet werden kann.
- Erwerben eines Bildes des Embryos unter UV, mit einem Filter zur Visualisierung of emittiert Licht bei 570 nm (Abbildung 2C). Nach der Bildaufnahme, damit der Embryo vor dem Austausch in der gut bezeichnet erholen. Erwerben Sie Bilder für alle injizierten Embryonen und bei 28,5 ° C weiter inkubiert.
HINWEIS: In diesem Protokoll verwendeten wir eine Fluoreszenzstereomikroskop mit TXR Filtersatz, einem DFC300FX Kamera und entsprechenden Anwendungssoftware. Notieren Sie sich die exakte Erfassung Einstellungen für nachfolgende Bildaufnahme. - Bei 24 hpi, erwerben eine zweite Runde von Bildern, wie oben beschrieben. Sobald alle Bilder erworben wurden, an beiden 3 hpi und 24 hpi, menschenwürdig zu verfügen der Embryonen oder Nutzung für andere experimentelle Mittel zB Immunhistochemie.
5. Bildverarbeitung
- Quantifizierung der Fluoreszenzintensität der einzelnen injizierten Embryos, bei 3 hpi und 24 hpi, durch die Analyse von Bildern mit NIH ImageJ Software. Um Fluoreszenzintensität zu messen, öffnen Sie ein Bild in ImageJ und geben Sie eine Region of Interest (ROI) bei 100 Pixel 2 (Bearbeiten → Auswahl → angeben).
- Positionieren Sie das Herz in der Mitte des roi (2C), stellen Messungen mittleren Graustufen und Umgebung sind (Analyse → Set-Messungen), Messung durchführen (Analysieren → Maßnahme). Füllen Sie für jeden Satz von Bildern, bei 3 hpi und 24 hpi, pro Embryo und übertragen durchschnittliche Grauwerte in eine Tabellenkalkulation zur weiteren Verarbeitung.
HINWEIS: Wir haben uns für eine feste roi Größe von 100 Pixel 2, da dies umfasst individuelle Herzen von Embryonen. Das Herz wurde ausgewählt, um Messungen durchzuführen aufgrund seiner Größe, die eine günstige Lage ermöglicht, Fluoreszenzgehalt des Blutes vor dem Eintritt in die Niere zu messen. - Führen Sie eine statistische Analyse unter Verwendung geeigneter statistischer Software. Gruppen auf statistische Signifikanz mit ein Student t-Test vergleichen.
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Representative Results
Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) ist eine seltene, heterogene Ziliopathie, die ca. 1 betrifft: 160.000 Menschen weltweit 16. Patienten mit einer Reihe von damit verbundenen Problemen wie polyzystischen Nieren vorhanden, anschließend Patienten benötigen häufig Dialyse oder Transplantation 24. ESRF ist die häufigste Todesursache in den BBS, mit rund 30% der Patienten entwickeln CKD 16. Derzeit haben 20 nicht verwandten Genen in BBS ohne veröffentlicht Genotyp-Phänotyp-Verein in Verbindung gebracht. Die BBS-Proteine gemeinsame Proteinlokalisierung Domänen innerhalb der Zilien und basalen Körper, die, zusammen mit den Patienten charakteristischen Züge, schließen eine Ziliopathie Diagnose. BBS9 kodiert Parathyoid Hormone ansprechenden B1 (PTHB1) Protein, das zusammen mit anderen BBS (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) Proteine bilden den Kern für die Bildung des primären cilium 24 BBSome Komplexes verantwortlich. Mutationen in BBS9 entfallen 6% der BBS cases 24. Darüber hinaus hat PTH in Nierenzystenbildung durch die Förderung des renalen epithelialen Zellproliferation in Verbindung gebracht, was darauf hindeutet, dass der Verlust von bbs9 Funktion im Zebrafisch könnte Nierendefekte 25 anzuzeigen. In früheren Berichten mit einem Knockdown bbs9 Zebrafisch-Modell schließen eine Beschreibung der Niere, präsentiert die Möglichkeit, die beschriebenen Nierenfunktion Test 26 zu demonstrieren. Knockdown bbs9 Funktion wurde im Zebrafisch durch Injektion erreicht, in der 1- bis 4-Zell-Stadium, ein Antisense-Morpholino zur genspezifischen bbs9 Übersetzung parallel ein Standard-Negativkontrolle Morpholino gegen eine Intron-Mutation im menschlichen beta-Globin Block (4 ng bbs9 MO, Reihenfolge: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA und 4 ng Steuer MO, Reihenfolge: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). Wir fanden, dass der Verlust der Funktion bbs9 Folge 40% der Embryonen Anzeige pronephric Zysten von 5 dpf, was dies ist ein geeignetes Modell zur AnalyseNierenfunktion mit dem Rhodamin-Dextran-Clearance-Test. Wir beobachteten, dass morphanten Fisch hat eine deutliche Verringerung ihrer Fähigkeit, den Fluoreszenzfarbstoff klar nach 24 hpi Vergleich zu den Kontrollen (Figur 3) - con: 14,8 ± 1,2 SEM, n = 9; bbs9 MO: 61,0 ± 10,3 SEM, n = 10 ; ungepaarter t-Test P-Wert: 0,002). Um auszuschließen, die Möglichkeit, die Clearance verringert konnte aufgrund der geringeren Durchblutung zu können, wurden Embryonen für Herzschlag und Umlauf Blutkörperchen ausgewertet, sowohl Steuerung und morphanten Fische hatten vergleichbare Herzfrequenz und den Blutfluss. Diese Daten zeigen, dass die Nierenfunktion in bbs9 morphants beeinträchtigt. Tatsächlich entwickeln bbs9 morphanten Embryonen zystische pronephric Tubuli gleichzeitig mit, dass in der BBS-Patienten beobachtet.
Abbildung 1: Gerätevorbereitungund Set-up. (A) Borosilikatglas Kapillaren sollte für die Mikroinjektion mit einem geeigneten Nadelzieher herausziehen. Die Nadel ist mit einer Pinzette (gestrichelte Linie) zu brechen, um die RD ermöglichen, um die Nadel zu beenden, sollte darauf geachtet werden, dass die Nadel brechen zu viel machen eine Nadel, die nicht kalibriert werden können. Maßstab:. 200 & mgr; m (B) Eine Agarose-Form für Embryomanipulation und Orientierung kann durch Verkleben Glasobjektträger und Kunststoffpipetten gestaltet werden (C) Das Standard-Mikroinjektion Set-up.. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen .
Abbildung 2. Mikroinjektion von Rhodamin-Dextran in den Herzbeutel. (A) Kalibrieren Sie den Tropfengröße bis 10 incforderungen (100 um) auf einer 1 mm Bühne Fadenkreuz. (B) Die korrekte Positionierung der Nadel (schwarze Pfeile) in die Spalte markiert den Schnittpunkt zwischen der Schwanz Pharyngealbogen, Dottersack und Herz Stechen des Gewebes (Pfeilspitze) zu erleichtern. Maßstab:. 200 & mgr; m (C) Rhodamin Dextran ersichtlich schnell von der gesamten Gefäßsystem (weiße Pfeile) entnommen werden. 100 px-2-Regionen der Interessen abdeckt eine zentrale Herz (gelbes Quadrat) sollte verwendet werden, um Messungen des mittleren Grauwert und damit Pixel / Fluoreszenzintensität zu nehmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: Knockdown von bbs9 verursacht defekten Niere function im Zebrafisch. (A) Die Embryonen injiziert in den Herzbeutel mit Rhodamin-Dextran in 3 hpi und 24 hpi, oben und unten zwei Platten jeweils entweder Kontroll- oder bbs9 morphanten Embryonen. Pfeilspitzen zeigen das Herz; Pfeil zeigt die Bildung eines pronephric Zyste. (B) Prozentsatz der Fluoreszenzintensität nach 24 hpi Kontrolle gegen bbs9 MO Embryonen verbleiben. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung des Mittelwertes (SEM), ** p ≤ 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Zebrafische bieten ein wertvolles Werkzeug für die menschliche genetische Krankheitsmodell, ihre Verwendung als ein wissenschaftliches Instrument zur in vivo Erforschung detaillierte Studien der genetischen Abbau von vielen biologischen Systemen, einschließlich der Niere aktiviert. Viel ist nun, wie die Zebrafisch-Niere entwickelt und Funktionen zu verstehen. Die auffallende Parallelen zum menschlichen Nephrogenese und Homologie mit krankheitsverursachenden Gene 21 hat sich das Verständnis veranschaulicht, wie Zebrafisch haben sich fundamental, wie Mängel in der Genfunktion führen zu der Pathologie der Nierenerkrankung. Tatsächlich Genmanipulation mühelos im Zebrafisch mit Antisense-Morpholino Knockdown Technologie oder erweiterte Ziel-Genom-Editing-Tools wie TALENS oder CRISPR erreicht werden. Erstellen Zuschlags oder Mutanten-Modelle für Verdacht auf Nierenerkrankungen verursachende Gene ist der erste Schritt zum Verständnis ihrer Beteiligung an der Krankheitsmanifestation. Um dies ein zuverlässiger Test für die Nierenfunktion angestrebt tunum anzuzeigen, ob ein Kandidatengen ist wahrscheinlich, für die bei Patienten beobachtet Pathologie verantwortlich.
Nierenfunktionstests sind einfach und relativ billig auf den Menschen durchzuführen, in der Regel Blick auf Ebenen im Blut oder Urin gelöste Stoffe. Allerdings sind diese Methoden nicht anwendbar im Zebrafisch aufgrund ihrer geringen Größe und der aquatischen Lebensraum. Die hier beschriebene Rhodamin Dextran Assay nutzt die Fähigkeit von pronephric Tubuli zu Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht aus dem Blut zu filtern. Die Podozyten in der Bowman-Kapsel der Niere positioniert, dass Umschläge die Kapillaren des Glomerulus, ermöglichen die freie Weitergabe von kleinen Molekülen wie Wasser, ionische Salze und Glucose durch eine Schlitzblende 27. Die Filtrationsschlitze funktionieren weiterhin den Verlust von Makro Proteine aus dem Blut zu verhindern. Filtration ist für Moleküle über 5 kDa und fast vollständig auf die Größe von Serumalbumin 28 blockiert beschränkt (ca.0; 65 kDa). Durch Injizieren eines fluoreszierenden Farbstoffes Dextran von etwa 10 kDa, mit einer bekannten Konzentration in die Perikardhöhle, sind wir in der Lage, die Fluoreszenzintensität des Blutes über die Zeit zu messen. Unter normalen Bedingungen etwa 85% der anfänglichen Fluoreszenz aus dem Blut durch die Sekretion über die Nieren verloren, die über einen Zeitraum von 24 Std. Man sollte beachten, dass die Injektion in Perikardhöhle ist nur mit geringen MW Dextran, die sich frei in das Gefäßsystem durchläuft möglich. Damit dieser Test liefert nur ein Auslesen für die Clearance-Rate für Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht und keine Informationen über die Wirksamkeit der glomerulären Filtrations nicht geben. Letzteres kann beurteilt werden mehr direkt mit Gewichts Farbstoffe mit hohem Molekular über 70 kDa, erfordern Injektion in das Gefäßsystem und nicht in die Perikardhöhle. Tatsächlich können Dextrane verschiedener MWs zur weiteren sezieren Nierenfunktion 28 sein.
Die Zebrafisch pronephric Tubuli sind sehr zufrieden mit mo bewimpertFliese Zilien, die die Bewegung des Filtrats zu der Kloake 3,4 erleichtern. Defekte im ciliary Maschinen haben in Nierenerkrankungen in Verbindung gebracht. BBS ist eine genetisch heterogene, autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung, die durch Kindheit einsetzende Degeneration der Netzhaut, früh beginnende Fettleibigkeit, kognitiven Störungen, Polydaktylie und Nierenfehlbildung 24. Bisher wurden 20 BBS Gene (BBS1-20) identifiziert worden. Störung der bbs führt zu Nierenzystenbildung und defekte pronephric Funktion im Zebrafisch 9. BBS9 interagiert mit anderen Proteinen der BBS BBSome verantwortlich für entsprechende ciliogenesis zu bilden, Mutationen davon entfallen 6% der BBS 24 Fällen. Während ein Zebrafisch bbs9 Zuschlagsmodell berichtet wurde, wurde eine Beschreibung des Nieren Phänotyp fehlt 26. Mit dem Zuschlag bbs9 im Zebrafisch, mit dem Morpholino Ansatz zeigen wir die Verwendung der renalen Clearance-Test als eine Methode, um festzustellenNierenfunktion bei einem Nierenerkrankungen. Hier zeigen wir, dass bbs9 morphanten Embryonen anzuzeigen erschwerten fluoreszierende Clearance aus dem Blutkreislauf, was darauf hinweist, dass die Niere konnte mit niedrigem MW gelöste Stoffe zu entfernen. Weil also der Einbindung der bbs9 in ciliogenesis, und die Rolle pronephric Zilien erleichtern Filtrat Bewegung ist die beobachtete Nierenclearance in morphants wahrscheinlich aufgrund aberrante Zilien Funktion sein. Dieses Verfahren stellt ein wertvolles Werkzeug zur Bewertung der Nierenfunktion bei Zebrafisch Krankheitsmodellen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Technische Unterstützung durch Jaipreet Bharj vorgesehen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus EU-FP7 (SYSCILIA -241.955) und der niederländischen Kidney Foundation (CP11.18) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
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