Summary
Il pesce zebra è uno strumento popolare per modellare la malattia renale cronica (CKD). Tuttavia, la loro piccola dimensione rende impossibile valutare la funzione renale con metodi tradizionali. Descriviamo un colorante fluorescente rene liquidazione test 1 che permette l'analisi quantitativa della funzione renale zebrafish in CKD.
Abstract
L'embrione zebrafish offre un modello per lo studio trattabili organogenesi e modello di malattia genetica umana. Nonostante la sua relativa semplicità, il rene zebrafish sviluppa e funzioni quasi nello stesso modo come gli esseri umani. Una differenza importante nella costruzione del rene umano è la presenza di milioni di nefroni rispetto al zebrafish che ha solo due. Tuttavia, semplificando un sistema così complesso in unità funzionali di base ha aiutato la nostra comprensione di come si sviluppa il rene e gestisce. In zebrafish, la linea mediana trova glomerulo è responsabile per la filtrazione del sangue iniziale in due tubuli pronephric che divergono per eseguire bilateralmente lungo l'asse embrionale prima di fondersi tra loro a cloaca. I tubuli pronephric sono fortemente popolate da cilia motili che facilitano il movimento di filtrato lungo il tubulo segmentato, permettendo lo scambio di vari soluti prima infine di uscire attraverso la cloaca 2-4. Molti geni responsabili di CKD, incLuding quelli relativi alla ciliogenesis, sono stati studiati in zebrafish 5. Tuttavia, un grande inconveniente è stata la difficoltà di valutare la funzione renale zebrafish dopo manipolazione genetica. Saggi tradizionali per misurare disfunzioni renali nell'uomo hanno dimostrato non traslazionale per zebrafish, dovuto principalmente al loro ambiente acquatico e le dimensioni ridotte. Ad esempio, non è materialmente possibile estrarre sangue da embrionale scena pesci per l'analisi del contenuto di urea e creatinina, in quanto sono troppo piccole. Inoltre, zebrafish non produce abbastanza urine per il test su un semplice proteinuria 'astina', che viene spesso eseguita durante gli esami iniziali paziente. Descriviamo un test di fluorescenza che utilizza la trasparenza ottica della zebrafish per monitorare quantitativamente il passaggio di un colorante fluorescente, nel tempo, dal sistema vascolare e fuori attraverso il rene, per dare una lettura fuori della funzione renale 1,6-9.
Introduction
Il rene umano gioca un ruolo cruciale nel filtraggio rifiuti metabolici dal sangue e il recupero soluti necessarie per sostenere l'omeostasi cellulare. Ci sono un certo numero di malattie genetiche umane che causano disfunzioni renali. La malattia renale ereditaria più comune è autosomica dominante malattia del rene policistico (ADPKD) caratterizzato dallo sviluppo di fluidi riempita sacs all'interno tubuli pochechnykh; i danni provocati da cystogenesis è dannoso per la funzione renale 10. ADPKD ha una occorrenza di 1: 800 - 1: 1.000 e rappresenta il 8-10% dei pazienti con insufficienza renale allo stadio terminale (ESRF) 11. Diversi geni sono stati implicati a causare ADPKD compreso policistina-1 (PKD1) e -2 (PKD2), che rappresentano circa l'85% e, rispettivamente, 12,13 15% dei casi. Inoltre, i prodotti genici per PKD1 e -2 localizzano al ciglio e sono fondamentali per ciliogenesis 14,15. Vi è ora una famiglia riconosciuta di malattie genetiche umane, dettile ciliopatie, che influenzano la funzione delle ciglia e si traducono in CKD 16.
Il crescente numero di malattie genetiche umane che influenzano lo sviluppo e la funzione ciliare sta disegnando interesse globale in questo organello vestigial tempo considerato. Il cilium, una sporgenza cellulare a ciglia, è arricchito con recettori e canali necessari per la trasduzione di eventi di segnalazione cellulare chiave ioni. Il cilium consiste di un axoneme basata microtubuli, tipicamente strutturato in nove doppietti microtubuli disposte radialmente con o senza una coppia centrale di microtubuli singoletto. La struttura axonemal definisce il tipo e la modalità di azione ciliare. La disposizione 9 + 2 microtubuli conferisce alla motilità cilium dove viene utilizzato nel movimento dei fluidi attraverso superfici epiteliali. La configurazione 9 + 0 non è mobili, ma si crede che soprattutto in funzione di eventi di segnalazione cellulare 17. Oltre CKD, le conseguenze della disfunzione ciliare sono un insieme di caratteristichecaratteristiche ciliopathy che comprendono, l'obesità, la degenerazione della retina, polidattilia, e deterioramento cognitivo 16. Tuttavia, CKD è tra i più dannosi per la qualità della vita del paziente e quindi una forza trainante dietro lo sviluppo di adeguati modelli in vivo per ciliare correlati CKD.
Il pesce zebra è un ottimo modello per comprendere l'eziologia della malattia genetica umana. Il loro rapido sviluppo, la produzione di un gran numero di uova, il tessuto trasparente, e la crescita ex utero permette processi di sviluppo di zebrafish per essere visualizzati e gli eventi biologici manipolati con notevole facilità. I geni possono essere geneticamente modificati con il recente successo di strumenti di editing genoma (CRISPR 18 e Talens 19), abbattuto con antisenso tecnologia morfolino 20, o farmacologicamente regolati con l'aggiunta di composti al loro ambiente acquatico. Infatti, zebrafish offrire una piattaforma di intraprendere experiments che non sono permissive in altri modelli animali. Mentre zebrafish sono vertebrati relativamente semplici (rispetto per gli esseri umani) hanno in comune molti organi funzionalmente conservati, geni e processi di segnalazione in comune con gli esseri umani. Ad esempio, il rene zebrafish è notevolmente simile in struttura e funzione rispetto agli esseri umani 21,22. Tuttavia, a differenza del rene mammiferi che si sviluppa attraverso una serie di fasi, ciascuna contrassegnata da un rene più sviluppata (Pronefro, mesonefro e metanefro), il pesce zebra embrionale si sviluppa solo pronephros, la forma più immatura di un rene. Mentre milioni di nefroni si trovano formare i mattoni del rene mammiferi, l'embrione zebrafish solo possiede due. Il glomeruli, che consentono il filtrato del sangue iniziale, si fondono sulla linea mediana appena ventrale all'aorta. I filtri di sangue attraverso il glomeruli nei tubuli pronephric che corrono caudalmente lungo l'asse, fusione prima di uscire attraverso la cloaca. Il pronephric tubules sono fortemente ciliato con cilia motilità che sono permissive al flusso del filtrato verso l'uscita caudale 3,4. Questa struttura semplice pronephric mantiene l'omeostasi zebrafish attraverso diverse settimane di crescita delle larve dove alla fine si sviluppano in una più complessa struttura mesonefro 21. Tuttavia, il pesce zebra non sviluppa una metanefro 21. Nonostante le idiosincrasie zebrafish, nefrone zebrafish è segmentato con profili di espressione genica pari a quello osservato nei mammiferi e offre così un impareggiabile nel modello in vivo per nefrogenesi 3,22.
Ordinariamente i pazienti sono testati per la funzione renale, attraverso una serie di esami del sangue e delle vie urinarie. Tipicamente il sangue viene analizzato per disciolto sali, urea e creatinina. Alti livelli di urea, creatinina e concentrazioni saline anomale sono indicativi di problemi con la funzione renale. L'analisi delle urine utilizzando un asta colorimetrico rileva i livelli anormali di proteine, Blood, pus, batteri e zucchero in campioni di urina presente. Tali prove normalmente richiedono circa 30 ml di urina o di 5-10 ml di sangue. È stato difficile tradurre questi tipi di saggi di piccole organismi modello in vivo, come il pesce zebra, dovuta principalmente alla natura impossibile della raccolta di sangue o di urina sufficiente per eseguire il test. Qui, ci rivolgiamo la mancanza di adeguati test di funzionalità renale zebrafish e descriviamo una tecnica innovativa per il suo studio. Iniettando un colorante fluorescente nel flusso sanguigno siamo in grado di monitorare e quantificare singolarmente nel tempo la filtrazione e l'escrezione di attività fluorescente dal sangue attraverso i reni. Questo metodo può essere usato per studiare il danno renale causato da malattia, cui forniamo un esempio di.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etica Dichiarazione: animali di manutenzione, allevamento, e le procedure sono definiti e controllati dagli Animali (procedure scientifiche) Act 1986. Tutti sperimentazione animale è stata effettuata sotto licenze concesse dallo Home Secretary (PIL No. 70/7892) in conformità con Biologica Servizi Management Group e il Comitato Etico Servizi biologica, SGUL, Londra, UK. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre il numero di animali utilizzati e di affinare sia le procedure e allevamento, al fine di ridurre al minimo le sofferenze e migliorare il benessere.
1. Preparazione degli strumenti, anestetici, e fluorescente Dye
- Utilizzando un estrattore micropipetta e capillari standard di borosilicato parete (senza fili) tirare aghi di lunghezza appropriata per microiniezione (Figura 1A).
- Fare uno stampo agarosio per l'orientamento di embrioni per l'iniezione facile nel pericardio (Figura 1B). Colla circa dieci vetro microscopio slidi insieme per formare una 'scala' di diapositive offset. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare una goccia di rapida messa resina epossidica colla nel centro di ciascuna diapositiva.
- Tagliare una sezione di circa 78 mm di lunghezza a metà due pipette 10 ml in plastica con un becco Bunsen bisturi riscaldata, rimuovere pipetta finisce a seconda dei casi. Attaccare e sezioni colla (resina epossidica) pipette ai vetrini impilati per fornire stabilità per consentire lo stampo di immergere in una capsula di Petri 90 mm. Fare ogni sforzo per garantire angoli di scorrimento allineano perpendicolare al pavimento piatto Petri. Lasciare il tempo colla per impostare.
- Cast lo stampo in una soluzione di agarosio 2% made in acqua pesci (ottenuto dall'acquario). Versare agarosio in un piatto 90 millimetri Petri e posizionare lo stampo sulla parte superiore del piatto Petri aperta, permettendo la diapositiva impilati bordi per immergere un angolo sotto la superficie agarosio. Lasciare impostata sul banco di laboratorio per 30 min.
- Rimuovere il cast vetrino e coprire il agarosio slide-impresso con acqua il pesce frescocontenente Tricaine anestetico (vedi punto 1.9) con un rapporto di 01:25.
- Fare soluzioni di rodamina destrano (RD) dye. Risospendere rodamina B 10.000 MW etichettato destrano in acqua ultrapura autoclavato a fare una scorta di concentrazione di 50 mg / ml. Per microiniezione, diluire ulteriormente il titolo ad una concentrazione finale di 5 mg / ml in acqua ultrapura autoclave.
NOTA: Pigmento cellule iniziano a differenziarsi in zebrafish da 24 ore dopo la fecondazione (HPF); questi possono oscurare marcatori fluorescenti durante l'acquisizione dell'immagine. - Inibire la formazione melanocita utilizzando N -Phenylthiourea (PTU), che blocca la melanogenesi attraverso l'inibizione della tirosinasi. Fare una soluzione madre 0,003% di PTU sciogliendo polvere PTU in acquario, soluzione di calore a 60 ° C per solubilizzare completamente.
- Incubare embrioni di zebrafish in soluzione di blu di metilene, un fungicida lieve, per evitare fioriture fungine e aumentare la sopravvivenza. Aggiungere 2 ml di blu di metilene soluzione madre, contenente 0,1% blu di metilene in uacqua ltrapure, a 1 l di acqua e l'uso come mezzo embrione standard.
- Portare a 15 mM concentrazione magazzino di Tricaine sale methanesulfonate / etil-3 amminobenzoato come indicato in 'The Zebrafish libro' 23. Anestetizzare gli embrioni e di conseguenza li immobilizzato per eseguire la procedura di microiniezione.
- Dopo anestetizzante gli embrioni, orientarli, per l'imaging utilizzando le proprietà non-tossici e viscosi di metilcellulosa. Per fare un 200 ml preparazione di 3% metilcellulosa, chill 130 ml di acqua a -20 ° C per 30 min e posto su ghiaccio. Riscaldare 70 ml di acqua a 80 ° C in un bicchiere di vetro, aggiungere 6 g di metilcellulosa, ed agitare con una bacchetta di vetro fino a che tutte le particelle sono bagnate ed uniformemente dispersi. Aggiungere l'acqua ghiacciata, mescolare, e consentire la preparazione raffreddare a 4 ° C per 30 minuti prima di aliquotando in 50 ml provette.
NOTA: L'abbassamento della temperatura permette la metilcellulosa di diventare solubile. La soluzione diventerà più spessacome gli idrati polvere. 3% di metilcellulosa può essere conservato senza crescita batterica per brevi periodi di una settimana a 4 ° C o più a -20 ° C. Assicurarsi che la metilcellulosa ha raggiunto RT prima dell'uso. - Per eseguire iniezioni di colorante fluorescente nel zebrafish utilizzare un microiniezione set-up standard (Figura 1C). Questo consiste in un compressore d'aria collegato ad un sistema regolatore di pressione che alimenta un supporto pipetta diritta per l'uso con 1.0 capillari diametro esterno. Il titolare pipetta deve essere ricavato da un compatto micromanipolatore di controllo a 3 assi MM33 fissato ad una piastra di base in acciaio da un supporto magnetico. Gli embrioni possono essere visualizzati, manipolato e iniettato utilizzando un microscopio da dissezione stereo.
2. Zebrafish Husbandry e trattamento pre-iniezione
- Mantenere zebrafish come descritto in precedenza 23. Utilizzare un acquario set-up che fornisce l'acqua di ricircolo fornita ad una temperatura costante di 28,5 ° C, Condizionati a pH 6,8-7,2 e conducibilità 450-550 mS con bicarbonato di sodio e Instant Ocean Sea Salt, rispettivamente. Utilizzare tipo selvatico o linee di zebrafish transgenici come appropriato per l'esperimento, il mantenimento di una densità di 15 maschi 15 femmine per 8 L serbatoio. Impostare il fotociclo impianto pesce a 14 ore di luce del giorno tra le 09:00-23:00.
- Deposizione Zebrafish comincia all'inizio della fotociclo, quando le luci accendono al mattino. Per garantire il massimo delle uova possono essere raccolti senza disturbare il pesce, immergere (inserti in rete contenenti, disponibili da specialisti zebrafish) vasche di allevamento in magazzino serbatoi di tipo selvatico la sera prima della raccolta.
- Il giorno della raccolta, permette 30 - 40 minuti per i pesci a deporre le uova, dopo di che raccogliere e lavare le uova con un colino da tè e acqua dell'acquario fresca. Depositare le uova pulite in un terreno contenente embrione 90 millimetri piastra di Petri e incubare a 28,5 ° C.
- Trattare gli embrioni con PTU inibisce melanogenesi. Alle 8 HPF, trasferire embrioni vitali in liquido minimo per piatti freschi Petri contenenti 1: 100 PTU medio embrione e l'ulteriore incubare a 28,5 ° C fino 72 HPF.
NOTA: PTU può causare difetti di sviluppo, se utilizzato nelle fasi precedenti così dovrebbe essere limitato a postare 8 tappe HPF, ma può essere trattata più tardi 24 HPF. Tardo aggiunta di PTU non blocca completamente la pigmentazione degli occhi, ma è generalmente efficace e inibendo la formazione del tronco melanociti.
3. Microiniezione
NOTA: Il pericardio avvolge il cuore, ma è separato per la protezione e la facilità di movimento cardiaco fluido nella cavità pericardico. Lo scopo di questa procedura è di iniettare RD nella cavità pericardio, questo permette un rapido assorbimento del colorante al sistema vascolare.
- Aghi di carico con 6 ml - diluito RD, con punte microloader e sicuro nel supporto ago della micromanipolatore. Rompere la fine dell'ago utilizzando tipp benepinza Ed (Figura 1A). Spostare la soluzione RD alla punta dell'ago massimizzando durata dell'impulso per l'impostazione dei minuti, tornare alla msec una volta completato.
- Utilizzare un micrometro, il regolatore di pressione, ed i parametri di lunghezza della punta dell'ago (usando pinze) per regolare la dimensione della gocciolina espulsa a 100 micron di diametro, ciò equivale a un volume di 0,5 nl (Figura 2A).
NOTA: Quando si spezza l'ago, fare attenzione a non rompere troppo fuori altrimenti farà calibrare il volume di iniezione difficile. Se necessario, rompere ulteriormente la punta dell'ago per aumentare la dimensione della goccia tuttavia mantenere uno spessore ago che permette l'ingresso nel pericardio senza eccessiva flessione o danni al tessuto. - Prima dell'iniezione anestetizzare gli embrioni in media embrione contenente Tricaine. Impostare 2 x 35 millimetri piastre Petri contenenti 5 ml di mezzo embrione, un'etichetta di 'Tricaine' e l'altro 'Recovery'.
- Aggiungere 200ml di magazzino Tricaine al piatto adeguatamente etichettati. Una volta pronto per iniettare, selezionare un singolo embrione a 72 HPF e trasferire in un liquido minimo al piatto Tricaine. Monitorare l'attività dell'embrione, testare l'embrione è anestetizzato e immobilizzato da agitazione con una punta microloader troncato.
- Trasferire l'embrione anestetizzato allo stampo di iniezione e orientare l'embrione in un trogolo agarosio modo che il lato sinistro è rivolto verso l'alto, posizionando il cuore a sinistra del campo di vista.
- Per iniettare il RD nel cuore, perforare il pericardio con l'ago e iniettare 1 nl del RD nella cavità pericardico dell'embrione anestetizzato (Figura 2B, pannello di destra). Estrarre l'ago dopo l'iniezione. Trasferire l'embrione iniettato nel liquido minimo per il 'piatto Recovery' e monitor per 1 min. Trasferire l'embrione individuo a un 24-pozzetti contenenti 1 ml di mezzo embrione fresco (contenente PTU) e l'etichetta in modo appropriato.
NOTA: Il pericardio è dura, tuttavia c'è un notevole punto debole all'incrocio dove il pericardio incontra gli archi faringei ventro-caudale e dorso-rostrale sacco vitellino (Figura 2B freccia). L'ago deve essere diretto a questo solco. Quando l'ago è in posizione, un rubinetto di un dito ferma sulla sommità del micromanipolatore faciliterà ingresso nella cavità pericardico. - Ripetere i passaggi 3,2-3,6 per almeno 10 embrioni per gruppo sperimentale, mettere ogni pesce in un pozzo separato ed unicamente labelto permesso singoli esperimenti di follow-up. Incubare a 28.5 ° C per 3 ore.
4. Imaging Acquisition
- A 3 ore dopo l'iniezione (HPI) anestetizzare gli embrioni come precedentemente descritto e versare in un piatto 35 millimetri Petri contenente 3% metilcellulosa. Spingere delicatamente embrioni in metilcellulosa e orientare così la parte laterale può essere ripreso.
- Acquisire un'immagine dell'embrione sotto UV, utilizzando un filtro per la visualizzazione of emessa luce a 570 nm (Figura 2C). Dopo l'acquisizione delle immagini, permettono l'embrione di recuperare prima di sostituire ben designato. Acquisire le immagini per tutti gli embrioni iniettati e in seguito incubare a 28,5 ° C.
NOTA: In questo protocollo abbiamo utilizzato uno stereomicroscopio a fluorescenza con un set di filtri TXR, una macchina fotografica DFC300FX e relativo software applicativo. Annotare le impostazioni di acquisizione esatte per la successiva acquisizione delle immagini. - Al 24 hpi, acquisire una seconda tornata di immagini, come descritto sopra. Una volta che tutte le immagini sono state acquisite, sia a 3 e 24 HPI HPI, umanamente disporre degli embrioni o utilizzare altri mezzi sperimentali per esempio, immunoistochimica.
Elaborazione 5. Immagine
- Quantificare intensità fluorescenza di ogni embrione iniettato, a 3 e 24 HPI HPI, analizzando le immagini utilizzando il software ImageJ del NIH. Per misurare l'intensità fluorescente, aprire un'immagine in ImageJ e specificare una regione di interesse (ROI) a 100 px 2 (Modifica → selezione → specificare).
- Posizionare il cuore nel centro del roi (Figura 2C), impostare misure di includere media scala dei grigi e la zona (Analizza → misure set), eseguire la misurazione (Analyze → misura). Completare per ogni set di immagini, alle 3 e 24 HPI HPI, per embrioni e trasferire valori medi scala di grigi di un foglio di calcolo per ulteriori elaborazioni.
NOTA: Abbiamo scelto una dimensione roi fisso pari a 100 px 2 come questo comprende cuori individuali tra embrioni. Il cuore è stato selezionato per effettuare misurazioni a causa delle dimensioni che consente una posizione comoda per misurare il contenuto di fluorescenza del sangue prima di entrare nel rene. - Eseguire l'analisi statistica utilizzando appropriati software statistico. Confronta i gruppi per la significatività statistica con t-test di uno studente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sindrome di Bardet-Biedl (BBS) è una ciliopathy eterogeneo rara che colpisce circa 1: 160.000 persone in tutto il mondo 16. I pazienti presentano una serie di problemi connessi compresi reni policistici, successivamente i pazienti spesso richiedono dialisi o il trapianto 24. ESRF è la causa più comune di morte in BBS, con circa il 30% dei pazienti che sviluppano CKD 16. Attualmente, 20 geni non correlati sono stati implicati in BBS senza pubblicato associazione genotipo-fenotipo. Le proteine BBS condividono domini localizzazione proteica comuni in seno agli organi Ciglio e basali che, insieme con i tratti caratteristici dei pazienti, deducono una diagnosi ciliopathy. BBS9 codifica B1 Parathyoid Hormone-reattiva (PTHB1) proteina che insieme ad altri BBS (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) proteine formano il nucleo BBSome complesso responsabile della formazione del ciglio primario 24. Mutazioni in conto BBS9 per il 6% dei BBS cAses 24. Inoltre, PTH è stato implicato in formazione di cisti renali attraverso la promozione di renale proliferazione delle cellule epiteliali, suggerendo che la perdita di funzione bbs9 in zebrafish potrebbero mostrare difetti renali 25. I rapporti precedenti con un bbs9 atterramento modello di zebrafish escludono una descrizione del rene, che presenta la possibilità di dimostrare il rene descritto funzione test 26. Knockdown della funzione bbs9 è stato raggiunto in zebrafish iniettando, nella fase 1 a 4 celle, un morfolino antisenso per bloccare gene traduzione bbs9 specifico e in parallelo un morfolino controllo negativo normale contro una mutazione in intronico umana beta-globina (4 ng bbs9 MO, sequenza: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA e controllo 4 ng MO, sequenza: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). Abbiamo scoperto che la perdita della funzione bbs9 portato nel 40% degli embrioni che mostrano cisti pronephric da 5 dpf, suggerendo che questo era un modello adeguato per analizzarela funzione renale utilizzando il test rodamina destrano gioco. Abbiamo osservato che i pesci morphant hanno una significativa riduzione della loro capacità di eliminare il colorante fluorescente dopo 24 hpi rispetto ai controlli (Figura 3) - con: 14.8 ± 1.2 SEM, n = 9; MO bbs9: 61,0 ± 10,3 SEM, n = 10 ; spaiato valore P t-test: 0.002). Per escludere la possibilità che ha ridotto la clearance potrebbe essere a causa della ridotta circolazione del sangue, gli embrioni sono stati valutati per le cellule del battito cardiaco e del sangue di ricircolo, sia il controllo e pesce morphant avevano frequenza cardiaca comparabili e il flusso di sangue. Questi dati indicano che la funzione renale è compromessa in morphants bbs9. In effetti, gli embrioni bbs9 morphant sviluppano tubuli pronephric cistica in concomitanza con quello osservato in pazienti BBS.
Figura preparazione 1. apparecchiaturee set-up. Capillari (A) borosilicato dovrebbero essere tirato per la microiniezione utilizzando un apposito estrattore ago. L'ago, occorre eliminare con una pinza (linea tratteggiata) per consentire la RD per uscire l'ago, si deve prestare attenzione a non rompere l'ago troppo rendering di un ago che non può essere calibrato. Scala bar:. 200 micron (B) uno stampo agarosio per la manipolazione degli embrioni e l'orientamento può essere modellato incollando insieme vetrini e pipette di plastica (C) La norma microiniezione set-up.. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura .
Figura 2. Microiniezione di rodamina destrano nel sacco pericardico. (A) Calibrare la dimensione della goccia di 10 increments (100 micron), su un reticolo stadio 1 mm. (B) Il corretto posizionamento dell'ago (frecce nere) nella marcatura l'intersezione tra la caudale arco faringeo, sacco vitellino e cuore faciliterà penetrante del tessuto (freccia) crepaccio. Scala bar:. 200 micron (C) rodamina destrano può essere visto rapidamente ripreso da tutta la vascolarizzazione (frecce bianche). 100 px 2 regioni d'interesse, che coprono un cuore centrale (quadrato giallo) deve essere utilizzato per prendere le misure del valore di grigio medio e di conseguenza l'intensità pixel / fluorescenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Knockdown di bbs9 provoca func rene difettosozione in zebrafish. (A) Gli embrioni iniettato pericardio con rodamina destrano alle 3 e 24 HPI HPI, superiore e inferiore di due pannelli, rispettivamente, sia il controllo o embrioni bbs9 morphant. Frecce indicano il cuore; freccia indica la formazione di una cisti pronephric. intensità fluorescente (B) Percentuale rimanente dopo 24 hpi controllo rispetto embrioni bbs9 MO. Le barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM), ** P ≤ 0,01. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafish offrire un prezioso strumento per modellare malattia genetica umana, il loro impiego come strumento scientifico per la ricerca in vivo hanno consentito studi dettagliati sulla composizione genetica di molti sistemi biologici, tra cui il rene. Ora molto è capito su come si sviluppa il rene zebrafish e funzioni. Le somiglianze sorprendenti per nefrogenesi umana e omologia con i geni che causano malattie 21 ha illustrato come zebrafish sono diventati fondamentali per capire come difetti di funzione del gene portano alla patologia della malattia renale. In effetti, la manipolazione genetica può essere raggiunto senza sforzo in zebrafish utilizzando antisenso morfolino tecnologia atterramento o più avanzati genoma mirati strumenti di editing, come TALENS o CRISPR. Creazione di modelli atterramento o mutanti per sospetta malattia renale geni che causano è il primo passo per capire il loro coinvolgimento nella manifestazione della malattia. Per fare questo è richiesto un test affidabile per la funzione renaleper indicare se un gene candidato è probabilmente responsabile per la patologia osservata nei pazienti.
Test di funzionalità renale sono semplici e relativamente poco costoso per eseguire sugli esseri umani, in genere guardando i livelli di soluti presenti nel sangue o nelle urine. Tuttavia, questi metodi sono applicabili in zebrafish grazie alle sue piccole dimensioni e l'habitat acquatico. Il dosaggio destrano rodamina qui descritto utilizza la capacità di tubuli pronephric filtrare componenti a basso peso molecolare dal sangue. I podociti posizionati all'interno della capsula di Bowman del rene, che avvolge i capillari del glomerulo, consentono il passaggio libero di piccole molecole come l'acqua, sali ionici e glucosio attraverso un diaframma a fessura 27. Le fessure di filtrazione funzionano ulteriormente per prevenire la perdita di proteine macro dal sangue. Filtrazione è limitato per le molecole di cui sopra 5 kDa e quasi completamente bloccato la dimensione di albumina sierica 28 (circa0; 65 kDa). Iniettando un colorante fluorescente destrano di circa 10 kDa, ad una concentrazione nota nella cavità pericardio, siamo in grado di misurare l'intensità fluorescente del sangue nel tempo. In condizioni normali di circa l'85% della fluorescenza iniziale è persa dal sangue, in un periodo di 24 ore, attraverso la secrezione via renale. Si deve notare che l'iniezione nello spazio pericardico è possibile solo con destrano basso MW che passa liberamente nel sistema vascolare. Così, questo saggio dà solo una lettura-out per il tasso di passaggio per i componenti a basso peso molecolare e non fornisce alcuna informazione circa l'efficacia di filtrazione glomerulare. Quest'ultima può essere valutata più direttamente usando alti coloranti peso molecolare oltre 70 kDa, richiedendo iniezione nel sistema vascolare e non nello spazio pericardico. Infatti, destrani di varie MW possono essere utilizzati per sezionare ulteriormente la funzione renale 28.
I tubuli pronephric zebrafish sono altamente ciliato con mocilia piastrelle che facilitano il movimento del filtrato verso la cloaca 3,4. Difetti di macchinari ciliare sono stati implicati in malattie renali. BBS è un geneticamente eterogenea, autosomica recessiva malattia caratterizzata da degenerazione retinica ad esordio infantile, obesità precoce insorgenza, deficit cognitivo, polidattilia e malformazione renale 24. Ad oggi, sono stati identificati 20 geni BBS (BBS1-20). Turbativa di bbs porta alla formazione di cisti renale e la funzione pronephric difettoso in zebrafish 9. BBS9 interagisce con altre proteine BBS per formare il BBSome responsabile del caso ciliogenesis, mutazioni di cui rappresentano il 6% dei casi BBS 24. Mentre un modello bbs9 atterramento zebrafish è stato segnalato, una descrizione del fenotipo renale era carente 26. Abbattendo bbs9 in zebrafish, utilizzando l'approccio morfolino, dimostriamo l'uso del saggio clearance renale come metodo per determinarefunzione renale in un modello di malattia renale. Qui, dimostriamo che gli embrioni bbs9 morphant visualizzare spazio fluorescente ostacolato dal flusso sanguigno, che indica che il rene non è riuscito a rimuovere soluti a basso MW. Così, a causa del coinvolgimento di bbs9 in ciliogenesis, e il ruolo delle ciglia pronephric nel facilitare il movimento filtrato, la clearance renale osservato in morphants è probabilmente dovuto alla funzione di cilia aberrante. Questo metodo rappresenta un valido strumento per la valutazione della funzione renale in modelli di malattia di zebrafish.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
L'assistenza tecnica fornita da Jaipreet Bharj. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal EU-FP7 (SYSCILIA -241.955) e The Kidney Foundation olandese (CP11.18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , Academic Press. (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
