Summary
El pez cebra es una herramienta popular para modelar la enfermedad renal crónica (ERC). Sin embargo, su pequeño tamaño hace que sea imposible para evaluar la función renal utilizando métodos tradicionales. Se describe un ensayo de aclaramiento renal tinte fluorescente 1 que permite el análisis cuantitativo de la función renal pez cebra en la ERC.
Abstract
El embrión de pez cebra ofrece un modelo manejable para estudiar la organogénesis y modelar enfermedades genéticas humanas. A pesar de su relativa simplicidad, el riñón pez cebra se desarrolla y funciona casi de la misma forma que los humanos. Una diferencia importante en la construcción del riñón humano es la presencia de millones de nefronas en comparación con el pez cebra que tiene sólo dos. Sin embargo, la simplificación de un sistema tan complejo en unidades funcionales básicos ha ayudado a nuestra comprensión de cómo se desarrolla el riñón y opera. En el pez cebra, la línea media situada glomérulo es el responsable de la filtración de la sangre inicial en dos túbulos pronéfricos que divergen para funcionar bilateralmente por el eje embrionario antes de fundirse entre sí en la cloaca. Los túbulos pronéfricos están densamente poblados por cilios móviles que facilitan el movimiento de filtrado a lo largo del túbulo segmentada, lo que permite el intercambio de varios solutos antes de finalmente salir a través de la cloaca 2-4. Muchos de los genes responsables de la enfermedad renal crónica, incLuding los relacionados con ciliogenesis, han sido estudiados en el pez cebra 5. Sin embargo, un gran inconveniente ha sido la dificultad para evaluar la función renal pez cebra después de la manipulación genética. Ensayos tradicionales para medir la disfunción renal en humanos han demostrado no traslacional para el pez cebra, debido principalmente a su medio acuático y pequeño tamaño. Por ejemplo, no es físicamente posible extraer la sangre de embriones en escena de pescado para el análisis de urea y creatinina contenido, ya que son demasiado pequeñas. Además, el pez cebra no producen suficiente orina para la prueba en un simple proteinuria 'varilla', que a menudo se lleva a cabo durante los exámenes iniciales de los pacientes. Se describe un ensayo fluorescente que utiliza la transparencia óptica del pez cebra para controlar cuantitativamente la liquidación de un colorante fluorescente, con el tiempo, a partir de la vasculatura y hacia fuera a través del riñón, para dar una lectura de la función renal 1,6-9.
Introduction
El riñón humano juega un papel crucial en el filtrado de los desechos metabólicos de la sangre y la recuperación de solutos necesarios para mantener la homeostasis celular. Hay un número de enfermedades genéticas humanas que causan disfunción renal. La enfermedad renal hereditaria más común es la enfermedad renal poliquística autosómica dominante (PQRAD) caracterizada por el desarrollo de los sacos llenos de líquido dentro de túbulos nefríticos; el daño causado por la quistogénesis es perjudicial para la función renal 10. PQRAD tiene una ocurrencia de 1: 800 - 1: 1000 y representa el 8 - 10% de los pacientes en insuficiencia renal terminal (IRT) 11. Varios genes han sido implicados para causar PQRAD incluyendo policistina-1 (PKD1) y -2 (PKD2), que representa aproximadamente el 85% y el 15% de los casos, respectivamente 12,13. Además, los productos génicos para PKD1 y -2 se localizan en el cilio y son fundamentales para ciliogenesis 14,15. Existe ahora una familia reconocida de trastornos genéticos humanos, conocidos comolos ciliopatías, que afectan a la función de los cilios y dan lugar a ERC 16.
El creciente número de enfermedades genéticas humanas que afectan el desarrollo y la función ciliar está atrayendo el interés mundial en este orgánulo vestigial una vez considerado. El cilio, un saliente celular-cabello como, está enriquecida con los receptores y canales iónicos necesarios para la transducción de eventos de señalización celular clave. El cilio consiste en un axonema a base de microtúbulos, típicamente estructurado en nueve dobletes de microtúbulos dispuestos radialmente con o sin un par central de microtúbulos singlete. La estructura axonemal define el tipo y modo de acción ciliar. La disposición de los microtúbulos 9 + 2 confiere a la motilidad del cilio donde se utiliza en el movimiento de los fluidos a través de las superficies epiteliales. La configuración 9 + 0 es no móviles, pero se cree que es principalmente función en eventos de señalización celular 17. Aparte de ERC, las consecuencias de la disfunción ciliar son un conjunto de característicascaracterísticas ciliopatía que incluyen, la obesidad, la degeneración de la retina, polidactilia, y el deterioro cognitivo 16. Sin embargo, la ERC es una de las más perjudiciales para la calidad de vida del paciente y, por tanto, una importante fuerza impulsora detrás del desarrollo de su caso en modelos in vivo para ciliar relacionada con la ERC.
El pez cebra es un excelente modelo para comprender la etiología de la enfermedad genética humana. Su desarrollo rápido, la producción de un gran número de huevos, tejido transparente, y el crecimiento ex utero permite procesos de desarrollo de pez cebra a ser visualizados y eventos biológicos manipulados con facilidad considerable. Los genes pueden ser alterados genéticamente utilizando el reciente éxito de herramientas de edición genoma (CRISPR 18 y TALENS 19), derribados usando tecnología antisentido de morfolino 20, o farmacológicamente regulados por la adición de compuestos a su medio ambiente acuático. De hecho, el pez cebra ofrece una plataforma para llevar a cabo experimentos que no son permisivos en otros modelos animales. Mientras que el pez cebra son vertebrados relativamente simples (en comparación con los seres humanos) que comparten muchos órganos funcionalmente conservados, los genes y los procesos de señalización en común con los seres humanos. Por ejemplo, el riñón pez cebra es notablemente similar en estructura y función en comparación con los seres humanos 21,22. Sin embargo, a diferencia del riñón de mamífero que se desarrolla a través de una sucesión de fases, cada una marcada por un riñón más desarrollada (pronefros, mesonefros y metanefros), el pez cebra embrionarias sólo se desarrolla una pronefros, la forma más inmadura de un riñón. Mientras millones de nefronas se encuentran formando los bloques de construcción del riñón de los mamíferos, el embrión de pez cebra sólo poseen dos. Los glomérulos, que permiten el filtrado de sangre inicial, se fusionan en la línea media ventral sólo a la aorta. Filtros de sangre a través de los glomérulos en los túbulos pronéfricos que se ejecutan en sentido caudal a lo largo del eje, la fusión antes de salir a través de la cloaca. El pronephric tubules están fuertemente ciliadas con cilios móviles que son permisivas para el flujo de filtrado hacia la salida caudal 3,4. Esta estructura pronephric sencillo mantiene la homeostasis pez cebra a través de varias semanas de crecimiento de las larvas en el que el tiempo se convierten en una estructura más compleja mesonefros 21. Sin embargo, el pez cebra nunca desarrolla un metanefros 21. A pesar de las idiosincrasias de pez cebra, la nefrona pez cebra se segmenta con perfiles de expresión génica igual a la observada en los mamíferos y por lo tanto ofrece una incomparable modelo in vivo para la nefrogénesis 3,22.
Rutinariamente a los pacientes se prueban para la función renal a través de una serie de pruebas de sangre y orina. Típicamente, la sangre se analiza para disuelto sales, urea y creatinina. Los altos niveles de urea, creatinina y concentraciones anormales de sal son indicativos de problemas con la función renal. Análisis de orina utilizando una tira reactiva colorimétrica detecta niveles anormales de proteína, blood, pus, bacterias y azúcar presente en muestras de orina. Estas pruebas normalmente requieren aproximadamente 30 ml de orina o de 5-10 ml de sangre. Ha sido difícil traducir estos tipos de ensayos a pequeña en organismos modelo in vivo, tales como el pez cebra, debido principalmente a la naturaleza imposible de recogida de sangre u orina suficiente para realizar el ensayo. Aquí, nos dirigimos a la falta de pruebas de función renal pez cebra apropiadas y describimos una técnica innovadora para su estudio. Mediante la inyección de un tinte fluorescente en la corriente sanguínea que son capaces de controlar y cuantificar de forma individual en el tiempo de la filtración y la excreción de la actividad fluorescente de la sangre a través del riñón. Este método puede ser utilizado para estudiar el daño renal causada por la enfermedad, que proporcionan un ejemplo de.
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Protocol
Declaración de Ética: Animal de mantenimiento, la cría y los procedimientos están definidos y controlados por la Ley de 1986. Todos los experimentos con animales se ha llevado a cabo bajo licencias otorgadas por el Ministro del Interior (PIL Nº 70/7892) en cumplimiento con Biológica Animales (Procedimientos Científicos) Grupo de Servicios de Gestión y el Comité de Ética de Servicios Biológica, SGUL, Londres, Reino Unido. Se hicieron todos los esfuerzos para reducir el número de animales utilizados y para perfeccionar los procedimientos y la cría con el fin de minimizar el sufrimiento y mejorar el bienestar.
1. Elaboración de Instrumentos, Anestésico, y colorante fluorescente
- El uso de un extractor de micropipeta y los capilares de borosilicato de pared estándar (sin filamentos) Tire agujas de longitud adecuada para la microinyección (Figura 1A).
- Hacer un molde de agarosa para la orientación de los embriones para inyección fácil en el pericardio (Figura 1B). Pegamento aproximadamente diez vidrio microscopio slides juntos para formar una 'escalera' de diapositivas offset. Para obtener los mejores resultados, utilice una gota de pegamento rápido resina epoxi conjunto en el centro de cada diapositiva.
- Corte un tramo de aproximadamente 78 mm de longitud a medio camino a través de dos pipetas de plástico de 10 ml utilizando un bisturí Mechero Bunsen climatizada, retire la pipeta termina en su caso. Adjuntar y secciones pegamento (resina epoxi) de pipeta a las diapositivas de cristal apilados para proporcionar estabilidad para permitir que el molde para que moje en una placa de Petri de 90 mm. Haga todo lo posible para asegurar las esquinas de diapositivas alinean perpendicular al suelo placa de Petri. Dé tiempo pegamento se seque.
- Reparto de molde en una solución de agarosa al 2% en agua hecha de pescado (obtenido de la acuario). Verter de agarosa en una placa de Petri de 90 mm y colocar el molde en la parte superior de la placa de Petri abierta, permitiendo la diapositiva apilados bordes para sumergirse en un ángulo bajo la superficie de agarosa. Deja para establecer en el banco de laboratorio durante 30 minutos.
- Retire el molde deslizante y cubra la agarosa deslizable impresa con peces de agua dulceque contiene tricaína anestésico (ver paso 1,9) a una proporción de 1:25.
- Haga soluciones de dextrano rodamina (RD) tinte. Resuspender rodamina B 10.000 MW dextrano marcado en agua ultrapura esterilizada en autoclave para hacer una concentración de solución madre de 50 mg / ml. Para la microinyección, diluir aún más la acción a una concentración final de 5 mg / ml en agua ultrapura tratada en autoclave.
NOTA: pigmentada células comienzan a diferenciarse en el pez cebra de 24 h después de la fecundación (HPF); estos pueden oscurecer marcadores fluorescentes durante la adquisición de imagen. - Inhibir la formación de melanocitos mediante el uso de N -Phenylthiourea (PTU), que bloquea la melanogénesis través de la inhibición de la tirosinasa. Hacer una solución madre de 0,003% de PTU disolviendo polvo de PTU en el agua del acuario, la solución se calienta a 60 ° C para solubilizar completamente.
- Incubar embriones de pez cebra en solución de azul de metileno, un fungicida suave, para evitar las floraciones de hongos y aumentar la supervivencia. Añadir 2 ml de solución de azul de metileno, que contiene 0,1% de azul de metileno en uagua ltrapure, a 1 l de agua del acuario y su uso como medio de embrión estándar.
- Invente una concentración stock de 15 mM de sal metanosulfonato / acetato de 3-aminobenzoato tricaína como se indica en 'El libro de pez cebra' 23. Anestesiar a los embriones y por consiguiente ellos inmovilizada para realizar el procedimiento de microinyección.
- Después de anestesiar a los embriones, orientarlo, para obtener imágenes mediante el uso de las propiedades no tóxicas y viscosas de metilcelulosa. Para hacer una preparación de 200 ml de 3% de metilcelulosa, chill 130 ml de agua a -20 ° C durante 30 min y el lugar en hielo. Calentar 70 ml de agua a 80 ° C en un vaso de precipitados de vidrio, añadir 6 g de metilcelulosa, y agitar con una varilla de vidrio hasta que todas las partículas se humedecen y uniformemente dispersos. Agregue el agua helada, mezcle y deje que la preparación se enfríe a 4 ° C durante 30 minutos antes de alícuotas en tubos de 50 ml.
NOTA: La reducción de la temperatura permite la metilcelulosa se vuelva soluble. La solución se vuelva más gruesocomo los hidratos de polvo. 3% de metilcelulosa se puede almacenar sin crecimiento bacteriano durante cortos períodos de una semana a 4 ° C o más a -20 ° C. Asegúrese de que la metilcelulosa ha llegado a RT antes de su uso. - Para llevar a cabo inyecciones de tinte fluorescente en el pez cebra utilizar una microinyección configuración estándar (Figura 1C). Este consta de un compresor de aire conectado a un sistema regulador de presión que se alimenta en un soporte de pipetas recta para su uso con 1,0 capilares de diámetro exterior. El titular de la pipeta debe ser alojado dentro de un compacto micromanipulador de control 3-MM33 eje fijado a una placa base de acero por un soporte magnético. Los embriones pueden ser visualizados, manipulado y se inyectaron usando un microscopio de disección estéreo.
2. El pez cebra Cría y Tratamiento Pre-inyección
- Mantener el pez cebra como se describió anteriormente 23. Utilice un acuario configuración que proporciona agua de recirculación suministrado a una temperatura constante de 28,5 ° C, Condicionado a pH 6.8 a 7.2 y la conductividad de 450 a 550 mS con bicarbonato de sodio y la sal del mar Océano instantánea, respectivamente. Utilice tipo salvaje o líneas de pez cebra transgénico según sea apropiado para el experimento, el mantenimiento de una densidad de población de 15 machos y 15 hembras por 8 tanque L. Ajuste el fotociclo instalación pescado a 14 horas de luz del día entre las 09 a.m.-11 p.m..
- Desove pez cebra comienza a principios de la fotociclo, cuando las luces se encienden en la mañana. Para asegurar huevos máximas pueden recogerse sin molestar a los peces, sumerja los tanques de cría (que contienen inserciones de malla, disponible de especialistas de pez cebra) en los tanques de almacenamiento de tipo salvaje de la noche antes de la recolección.
- En el día de la recolección, permite 30 - 40 min para los peces para desovar, después de lo cual recoger y enjuagar los huevos usando un colador de té y agua del acuario fresco. Deposita los huevos limpios en un medio que contiene el embrión de 90 mm placa de Petri y se incuba a 28,5 ° C.
- Tratar a los embriones con PTU para inhibir melanogénesis. A las 8 de HPF, transferir embriones viables en el líquido mínimo en placas de Petri que contienen frescos 1: 100 PTU a medio embrión y se incuba adicionalmente a 28,5 ° C hasta 72 HPF.
NOTA: PTU puede causar defectos de desarrollo si se usa en las primeras etapas de modo debe limitarse a publicar 8 etapas HPF, pero puede ser tratada tan tarde como 24 HPF. Además tardía de PTU no bloquea completamente la pigmentación del ojo, pero generalmente es exitoso y la inhibición de la formación de los melanocitos tronco.
3. La microinyección
NOTA: El pericardio encierra al corazón, pero se separa para la protección y facilidad de movimiento cardiaco por el fluido dentro de la cavidad pericárdica. El objetivo de este procedimiento es inyectar RD en la cavidad pericárdica, esto permite la rápida captación del colorante al sistema de vasculatura.
- Agujas de carga con 6 l - diluyen RD, utilizando puntas Microloader y segura en el soporte de la aguja del micromanipulador. Romper el extremo de la aguja usando bien tippfórceps ed (Figura 1A). Mover la solución RD a la punta de la aguja mediante la maximización de la duración del pulso a la configuración minutos, volver a mseg una vez completa.
- Utilice un micrómetro de platina, el regulador de presión, y refinamientos a la longitud de punta de la aguja (utilizando pinzas) para ajustar el tamaño de la gotita expulsada a 100 micras de diámetro, esto equivale a un volumen de 0,5 nl (Figura 2A).
NOTA: Al romper la aguja, tenga cuidado de no romper demasiado fuera de lo contrario hará que calibrar el volumen de inyección difícil. Si es necesario, romper aún más la punta de la aguja para aumentar el tamaño de la gota sin embargo, mantener un espesor de la aguja que permite la entrada en el pericardio sin flexión excesiva o daños en el tejido. - Antes de la inyección, anestesiar a los embriones en medio de embrión que contienen tricaína. Configure 2 x 35 mm placas de Petri que contenían 5 ml de medio de embriones, una etiqueta 'tricaína' y la otra 'recuperación'.
- Añadir 200l de stock tricaína al plato debidamente etiquetado. Una vez listo para inyectar, seleccionar un embrión individual en 72 HPF y transferir en líquido mínimo para el plato tricaína. Supervisar la actividad del embrión, pruebe el embrión se anestesia y se inmoviliza mediante agitación suave con una punta de microloader truncado.
- Transferir el embrión anestesiado para el molde de inyección y orientar el embrión dentro de una cubeta de agarosa de manera que el lado izquierdo está mirando hacia arriba, el posicionamiento del corazón a la izquierda del campo de vista.
- Para inyectar la RD en el corazón, el pericardio perforar con la aguja e inyectar 1 nl de RD en la cavidad pericárdica del embrión anestesiado (Figura 2B, panel derecho). Retire la aguja después de la inyección. Transferir el embrión inyectado en el líquido mínimo para el 'plato recuperación' y vigilar durante 1 min. Transferir el embrión individual a una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de medio de embriones frescos (que contiene PTU) y la etiqueta de manera apropiada.
NOTA: El pericardio es difícil, sin embargo hay un punto débil notable en la intersección donde el pericardio cumple con los arcos faríngeos ventro-caudal y saco vitelino dorso-rostral (Figura 2B punta de flecha). La aguja debe dirigirse a esta ranura. Cuando la aguja está en su lugar, un grifo firma de un dedo en la parte superior de la micromanipulador facilitará la entrada en la cavidad pericárdica. - Repita los pasos 3.2 a 3.6 por lo menos 10 embriones por grupo experimental, coloque cada pez en un pozo independiente y única labelto permiso individuales experimentales de seguimiento. Se incuba a 28,5 ° C durante 3 horas.
4. Imaging Acquisition
- A las 3 h después de la inyección (hpi) anestesiar a los embriones como se describió anteriormente y transferir a un plato de Petri de 35 mm que contiene 3% de metilcelulosa. Presione suavemente los embriones en la metilcelulosa y orientar para que el lado lateral se pueden obtener imágenes.
- Adquirir una imagen del embrión bajo UV, utilizando un filtro para la visualización of emite luz a 570 nm (Figura 2C). Después de la adquisición de imágenes, permite que el embrión se recupere antes de reemplazar en el bien designado. Adquirir imágenes de todos los embriones inyectados e incubar mayor a 28,5 ° C.
NOTA: En este protocolo se utilizó un microscopio estereoscópico fluorescente con un conjunto de filtros TXR, una cámara DFC300FX y software de aplicación respectiva. Tome nota de los ajustes de adquisición exactos para la adquisición de la imagen posterior. - A las 24 hpi, adquirir una segunda ronda de imágenes como se describe anteriormente. Una vez que todas las imágenes han sido adquiridas, tanto a los 3 hpi y 24 hpi, humanamente disponer de los embriones o el uso para otros medios experimentales, por ejemplo, la inmunohistoquímica.
Procesamiento 5. Imagen
- Cuantificar la intensidad de fluorescencia de cada embrión inyectado, a las 3 hpi y 24 hpi, mediante el análisis de imágenes utilizando el software ImageJ de NIH. Para medir la intensidad de fluorescencia, abrir una imagen en ImageJ y especificar una región de interés (ROI) a 100 px 2 (Editar → Selección → especificar).
- Coloque el corazón en el centro de la roi (Figura 2C), establezca medidas para incluir la escala de gris medio y el área (Analizar → medidas de ajuste), lleve a cabo la medición (Analizar → medida). Completar para cada conjunto de imágenes, a las 3 hpi y 24 hpi, por embrión y transferir valores promedio en escala de grises a una hoja de cálculo para su posterior procesamiento.
NOTA: Seleccionamos un tamaño roi fijo de 100 px 2 ya que esto abarca corazones individuales entre embriones. El corazón fue seleccionado para realizar mediciones debido a su gran tamaño que permite una ubicación conveniente para medir el contenido fluorescente de la sangre antes de entrar en el riñón. - Realizar análisis estadístico utilizando el software estadístico apropiado. Comparar grupos de significación estadística utilizando la prueba t de estudiante.
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Representative Results
Síndrome de Bardet-Biedl (BBS) es una rara ciliopatía heterogénea que afecta aproximadamente a 1: 160.000 personas en todo el mundo 16. Los pacientes presentan una serie de problemas asociados incluyendo riñones poliquísticos, posteriormente los pacientes con frecuencia requieren diálisis o trasplante 24. ESRF es la causa más común de muerte en BBS, con alrededor del 30% de los pacientes que desarrollan ERC 16. En la actualidad, 20 genes no relacionados han sido implicados en BBS sin asociación genotipo-fenotipo publicado. Las proteínas BBS comparten dominios de localización de proteínas comunes dentro de los cuerpos cilio y basal que, junto con los rasgos característicos de los pacientes, infieren un diagnóstico ciliopatía. BBS9 codifica B1 Parathyoid sensibles a la hormona de proteína (PTHB1) que, junto con otra BBS (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) proteínas forman el núcleo BBSome complejo responsable de la formación del cilio primario 24. Las mutaciones en cuenta BBS9 para el 6% de BBS c24 ases. Además, la PTH ha sido implicado en la formación de quistes riñón a través de la promoción de la proliferación de las células epiteliales renales, lo que sugiere que la pérdida de la función bbs9 en el pez cebra podría mostrar defectos renales 25. En informes anteriores utilizando un modelo de pez cebra bbs9 desmontables excluyen una descripción del riñón, presentando la oportunidad de demostrar la función renal ensayo descrito 26. Desmontables de función bbs9 se logró en el pez cebra mediante la inyección, en la etapa de 1 a 4 de las células, un morfolino antisentido para bloquear la traducción bbs9 específico del gen y en paralelo un morfolino control negativo estándar contra una mutación intrónica en beta-globina humana (4 ng bbs9 MO, secuencia: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA y MO de control 4 ng, secuencia: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). Se encontró que la pérdida de función bbs9 resultó en 40% de los embriones que presentan quistes pronéfricos por 5 dpf, sugiriendo que era un modelo adecuado para analizarla función renal mediante el ensayo de aclaramiento rodamina dextrano. Hemos observado que los peces morphant tienen una reducción significativa en su capacidad para eliminar el colorante fluorescente después de 24 hpi en comparación con los controles (Figura 3) - con: 14,8 ± 1,2 SEM, n = 9; MO bbs9: 61,0 ± 10,3 SEM, n = 10 ; desapareado valor de p t-test: 0.002). Para descartar la posibilidad de que la reducción de espacio libre podría ser debido a la reducción de la circulación sanguínea, los embriones fueron evaluados para latidos del corazón y la sangre de recirculación de las células, tanto de control como de pescado morphant tenían frecuencia cardiaca comparable y el flujo sanguíneo. Estos datos indican que la función renal está alterada en morphants bbs9. De hecho, los embriones morphant bbs9 desarrollan túbulos pronéfricos quísticas concurrentes con la observada en pacientes BBS.
Figura 1. Preparación de Equiposy puesta en marcha. Capilares (A) de borosilicato se deben sacar para la microinyección con un extractor de aguja adecuada. La aguja requiere romper con el fórceps (línea de trazos) para permitir que el RD para salir de la aguja, se debe tener cuidado de no romper la aguja demasiado prestación de una aguja que no puede ser calibrado. Barra de escala:. 200 m (B) Un molde de agarosa para la manipulación y la orientación del embrión se puede formar pegando láminas de vidrio y pipetas de plástico (C) El estándar de microinyección configuración.. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
Figura 2. La microinyección de dextrano rodamina en el saco pericárdico. (A) Calibre el tamaño de gota de 10 increqui- (100 micras) en una retícula etapa 1 mm. (B) La colocación correcta de la aguja (flechas negras) en la marca de la intersección entre el arco faríngeo caudal, saco vitelino y el corazón facilitará la perforación del tejido (punta de flecha) grieta. Barra de escala:. 200 micras (C) rodamina dextrano se puede ver rápidamente absorbido por todo el sistema vascular (flechas blancas). 100 px 2 regiones de interés, que cubren un corazón centralizado (cuadrado amarillo) se debe utilizar para tomar mediciones del valor de gris medio y por lo tanto de píxeles / intensidad de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Derribo de bbs9 causa func riñón defectuosoción en el pez cebra. (A) Los embriones se inyecta en el pericardio con rodamina dextrano a las 3 hpi y 24 hpi, la parte superior y dos paneles inferiores, respectivamente, en el control o embriones morphant bbs9. Las puntas de flecha indican el corazón; flecha indica la formación de un quiste pronephric. (B) Porcentaje intensidad fluorescente que queda después de 24 hpi en control versus embriones MO bbs9. Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM), ** P ≤ 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El pez cebra ofrece una valiosa herramienta para modelar la enfermedad genética humana, su utilización como instrumento científico para la investigación in vivo han permitido estudios detallados de la descomposición genética de muchos sistemas biológicos, incluido el riñón. Mucho ahora se entiende acerca de cómo se desarrolla y funciona el riñón pez cebra. Las similitudes con nefrogénesis humana y la homología con los genes causantes de enfermedades 21 ha ilustrado cómo el pez cebra se han convertido en fundamental en la comprensión de cómo los defectos en la función gen conducen a la patología de la enfermedad renal. De hecho, la manipulación genética se puede lograr sin esfuerzo en el pez cebra utilizando morfolino antisentido tecnología desmontables o más avanzadas herramientas de edición del genoma específico como TALENS o CRISPR. La creación de modelos desmontables o mutantes de los genes que causan la enfermedad renal se sospecha es el primer paso en la comprensión de su participación en la manifestación de la enfermedad. Para ello se busca un ensayo fiable de la función renalpara indicar si un gen candidato es probable responsable de la patología observada en los pacientes.
Pruebas de función renal son sencillos y relativamente barato para llevar a cabo en los seres humanos, en general mirando a los niveles de los solutos presentes en la sangre o en la orina. Sin embargo, estos métodos no son aplicables en el pez cebra, debido a su pequeño tamaño y hábitat acuático. El ensayo rodamina dextrano descrito aquí utiliza la capacidad de los túbulos pronéfricos para filtrar componentes de bajo peso molecular a partir de la sangre. Los podocitos posicionados dentro de la cápsula de Bowman del riñón, que envuelve los capilares del glomérulo, permiten el paso libre de pequeñas moléculas como el agua, las sales iónicas y glucosa a través de un diafragma de ranura 27. Las hendiduras de filtración función adicional para prevenir la pérdida de proteínas macro de la sangre. Filtración está restringido para las moléculas superiores a 5 kDa y casi completamente bloqueados por el tamaño de la albúmina de suero 28 (aproximadamente0; 65 kDa). Mediante la inyección de un tinte fluorescente dextrano de aproximadamente 10 kDa, a una concentración conocida dentro de la cavidad pericárdica, somos capaces de medir la intensidad fluorescente de la sangre con el tiempo. En condiciones normales aproximadamente 85% de la fluorescencia inicial se pierde de la sangre, durante un período de 24 horas, a través de la secreción a través del riñón. Hay que señalar que la inyección en el espacio pericárdico sólo es posible con una baja de dextrano de PM que pasa libremente en el sistema vascular. Por lo tanto, este ensayo sólo da una lectura de salida para la tasa de aclaramiento para los componentes de bajo peso molecular y no da ninguna información acerca de la eficacia de la filtración glomerular. Este último se puede evaluar usando más directamente colorantes de alto peso molecular de más de 70 kDa, que requiere la inyección en la vasculatura y no en el espacio pericárdico. De hecho, los dextranos de varios MW se pueden utilizar para diseccionar la función renal 28.
Los túbulos pronéfricos pez cebra son muy ciliadas con mocilios baldosas que facilitan el movimiento de filtrado hacia la cloaca 3,4. Los defectos en la maquinaria ciliar se han implicado en la enfermedad renal. BBS es un trastorno autosómico recesivo genéticamente heterogénea, caracterizada por la degeneración de inicio infantil de la retina, la obesidad de aparición temprana, el deterioro cognitivo, polidactilia y malformación renal 24. Hasta la fecha, se han identificado 20 genes BBS (BBS1-20). La interrupción de bbs conduce a la formación de quistes renales y la función pronephric defectuoso en el pez cebra 9. BBS9 interactúa con otras proteínas BBS para formar el BBSome responsable de ciliogenesis apropiado, mutaciones de los cuales representan el 6% de los casos BBS 24. Mientras que un modelo de caída bbs9 pez cebra se ha informado, una descripción del fenotipo renal era deficiente 26. Por derribando bbs9 en el pez cebra, utilizando el enfoque de morfolino, se demuestra el uso del ensayo de aclaramiento renal como un método para determinarla función renal en un modelo de enfermedad renal. Aquí, mostramos que los embriones morphant bbs9 muestran holgura fluorescente impedido desde el torrente sanguíneo, lo que indica que el riñón no logró eliminar solutos de bajo PM. Por lo tanto, debido a la participación de bbs9 en ciliogenesis, y el papel de los cilios pronephric en facilitar el movimiento filtrado, el aclaramiento renal observada en morphants es probable que sea debido a la función de los cilios aberrante. Este método representa una herramienta valiosa para evaluar la función renal en modelos de enfermedad de pez cebra.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La asistencia técnica proporcionada por Jaipreet Bharj. Este trabajo fue apoyado por becas de la UE-FP7 (SYSCILIA -241.955) y El Riñón Fundación holandesa (CP11.18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
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