Summary
Den zebrafisk är ett populärt verktyg för att modellera kronisk njursjukdom (CKD). Emellertid gör deras ringa storlek det omöjligt att utvärdera njurfunktion med traditionella metoder. Vi beskriver en fluorescerande färg njure clearance analys 1 som tillåter kvantitativ analys av zebrafisk njurfunktionen hos CKD.
Abstract
Den zebrafisk embryo erbjuder en lätthanterlig modell för att studera organogenesen och modellera människans genetiska sjukdomar. Trots sin relativa enkelhet, utvecklar den zebrafisk njure och funktioner i nästan samma sätt som människor. En stor skillnad i konstruktionen av den humana njuren är närvaron av miljontals nefroner jämfört med zebrafisk som har endast två. Men förenkla sådant komplext system i grundläggande funktionella enheter har hjälpt vår förståelse av hur njuren utvecklar och driver. I zebrafisk, är mittlinjen belägen glomerulus svarar för den första blodfiltrering i två pronephric tubuli som divergerar för att köra bilateralt ned den embryonala axeln innan den fixeras till varandra vid kloaken. De pronephric tubuli är kraftigt befolkas av rörliga cilier som underlättar förflyttning av filtratet längs segmente tubuli, vilket gör utbyte av olika lösta ämnen innan de slutligen lämnar via kloaken 2-4. Många gener som ansvarar för CKD, including de som rör ciliogenesis, har studerats i zebrafisk 5. Men en viktig dra tillbaka har varit svårigheten att utvärdera zebrafisk njurfunktion efter genetisk manipulation. Traditionella analyser för att mäta njurdysfunktion hos människor har visat icke translationell till zebrafisk, främst på grund av deras vattenmiljön och liten storlek. Till exempel är det inte fysiskt möjligt att extrahera blod från embryonala iscensatt fisk för analys av urea och kreatinin innehåll, eftersom de är för små. Dessutom har zebrafisk inte producerar tillräckligt urin för att testa på en enkel proteinuri "mätsticka", som ofta utförs under första patienten undersökningar. Vi beskriver en fluorescerande analys som utnyttjar optiska insyn i zebrafisk att kvantitativt övervaka clearance av en fluorescerande färg, över tiden, från kärl och ut genom njurarna, för att ge en läsning av njurfunktionen 1,6-9.
Introduction
Den mänskliga njure spelar en avgörande roll för att filtrera metaboliska avfall från blodet och återvinna krävs lösta ämnen för att upprätthålla cellulär homeostas. Det finns ett antal av humana genetiska sjukdomar som orsakar njurdysfunktion. Den vanligaste ärvde njursjukdom är autosomalt dominant polycystisk njursjukdom (ADPKD) kännetecknas av utveckling av vätskefyllda blåsor inom nefritiska tubuli; skador som orsakats av cystogenesis är skadligt för njurfunktionen 10. ADPKD har en förekomst av 1: 800 till 1: 1000 och motsvarar 8 - 10% av patienterna i terminal njursvikt (ESRF) 11. Flera gener har varit inblandade för att orsaka ADPKD inklusive polycystin-1 (PKD1) och -2 (PKD2), som står för cirka 85% och 15% av fallen respektive 12,13. Dessutom genprodukter för PKD1 och -2 lokalisera till cilium och är grundläggande för ciliogenesis 14,15. Det finns nu en erkänd familj av genetiska sjukdomar, så kalladede ciliopathies som påverkar flimmerhår funktion och resultera i CKD 16.
Det ökande antalet genetiska sjukdomar som påverkar ciliär utveckling och funktion drar globala intresset för detta en gång betraktades vestigial organell. Den cilium, ett hår-liknande cellulär utstick, är berikad med receptorer och jonkanaler som är nödvändiga för transduktion av viktiga cellsignaleringshändelser. Den cilium består av en mikrotubuli baserad axoneme, vanligen uppdelad i nio radiellt arrangerade mikrotubuli dubletter med eller utan ett centralt par sing mikrotubuli. Den axonemal strukturen definierar typen och läget av ciliär åtgärder. Den 9 + 2 mikrotubuli arrangemang ger motilitet till cilium där den används i rörelsen av vätskor över epitelytor. Den 9 + 0-konfiguration är icke rörliga men tros främst fungerar i cellulära signaleringshändelser 17. Förutom CKD, konsekvenserna av ciliär dysfunktion är en uppsättning av karakteristiskaciliopathy funktioner som inkluderar, fetma, retinal degeneration, polydactyly och kognitiv svikt 16. Dock är CKD bland de mest skadliga för patientens livskvalitet och därför en viktig drivkraft bakom utvecklingen av lämpliga in vivo-modeller för ciliary relaterad CKD.
Den zebrafisk är en utmärkt modell för att förstå etiologin av mänsklig genetisk sjukdom. Deras snabba utveckling, produktion av stort antal ägg, transparent vävnad, och ex utero tillväxt gör zebrafisk utvecklingsprocesser som ska visualiseras och biologiska händelser manipuleras med stor lätthet. Gener kan genetiskt ändras med den senaste tidens framgångar genomet redigeringsverktyg (CRISPR 18 och Talens 19), slog ner med hjälp av antisens morfolino teknik 20, eller farmakologiskt regleras genom tillsats av föreningar till deras vattenmiljö. Faktum zebrafisk erbjuda en plattform för att bedriva experiments som inte tillåt i andra djurmodeller. Medan zebrafisk är relativt enkla ryggradsdjur (jämfört med människor) de delar många funktionellt bevarade organ, gener och signalprocesser gemensamt med människor. Till exempel är den zebrafisk njuren påfallande lika i struktur och funktion jämfört med människor 21,22. Men till skillnad från däggdjur njuren som utvecklar genom en rad faser, var och präglas av en mer utvecklad njure (pronephros, mesonephros och metanefros), bara den embryonala zebrafisk utvecklar en pronephros, den mest omogna formen av en njure. Medan miljontals nephrons kan hittas bildar byggstenar däggdjurs njure, bara zebrafisk embryot besitter två. Glomeruli, vilket gör det möjligt för den initiala blod filtratet, smälts vid mittlinjen bara ventrala till aorta. Blod filter genom glomeruli i de pronephric tubuli som kör kaudalt längs axeln, fusing före avsluta via kloaken. Den pronephric tubules är kraftigt cilie med rörliga cilier som är tillåtande för flödet av filtrat mot svans exit 3,4. Denna enkla pronephric struktur bibehåller zebrafisk homeostas genom flera veckors larv tillväxt där de så småningom utvecklas till en mer komplex mesonephros strukturen 21. Dock utvecklar zebrafisk aldrig ett metanefros 21. Trots de zebrafisk egenheter, är zebrafisk nefronet segmenterad med genuttrycksprofilerna lika med den som observerats hos däggdjur och erbjuder därmed en oöverträffad in vivo modell för nephrogenesis 3,22.
Rutinmässigt patienter testas för njurfunktionen genom en serie av blod och urintester. Typiskt blodet analyseras för lösta salter, urea och kreatinin. Höga nivåer av urea, kreatinin och onormala saltkoncentrationer indikerar problem med njurfunktionen. Urinanalys med hjälp av en kolorimetrisk mätsticka upptäcker onormala nivåer av protein, blood, pus, bakterier och socker som finns i urinprover. Sådana tester kräver normalt cirka 30 ml urin eller 5 - 10 ml blod. Det har varit svårt att omsätta dessa typer av analyser för att små in vivo modellorganismer, såsom zebrafisk, främst på grund av det omöjliga natur samla tillräckligt med blod eller urin för att utföra analysen. Här, vi åtgärda bristen på lämpliga zebrafisk njure funktionstester och beskriva en innovativ teknik för sin studie. Genom att injicera ett fluorescerande färgämne i blodet kan vi övervaka och individuellt kvantifiera över tiden filtreringen och utsöndring av fluorescerande aktivitet från blodet via njurarna. Denna metod kan användas för att studera njurskada orsakad av sjukdom, som vi tillhandahåller ett exempel på.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Uttalande: Animal underhåll, djurhållning och förfaranden definieras och kontrolleras av djur (vetenskapliga förfaranden) Act 1986. Alla djurförsök har utförts under licenser som beviljats av inrikesministern (PIL nr 70/7892) i överensstämmelse med biologisk Services Management Group och biologisk Tjänster etiska kommitté, SGUL, London, Storbritannien. Alla ansträngningar gjordes för att minska antalet djur som används och att förfina både rutiner och djurhållning för att minimera lidandet och förbättra välfärden.
1. Beredning av instrument, anestetikum, och fluorescerande färg
- Med hjälp av en mikropipett avdragare och borosilikatglas standard vägg kapillärer (utan trådar) drar nålar av lämplig längd för mikroinjektion (Figur 1A).
- Gör en agaros mögel för orientering av embryon för enkel injektion i hjärtsäcken (Figur 1B). Lim cirka tio glas mikroskop slides tillsammans för att bilda en "trappa" av offset diabilder. För bästa resultat, använd en droppe snabb set epoxiharts lim i mitten av varje bild.
- Klipp ut en sektion av ca 78 mm i längd halvvägs genom två 10 ml plastpipetter med en bunsenbrännare uppvärmd skalpell, ta bort pipett slutar så är lämpligt. Fäst och lim (epoxiharts) pipett sektioner till de staplade glasskivor för att ge stabilitet för att tillåta formen att doppa i en 90 mm petriskål. Gör allt för att säkerställa glid hörn anpassa vinkelrätt mot petriskål golvet. Låt limmet tid att ställa in.
- Kasta formen i en 2% -ig lösning gjord i fisk vatten (erhållen från akvariet). Häll agaros i en 90 mm petriskål och placera formen ovanpå den öppna petriskål, som möjliggör den staplade glidkanterna att dränka i en vinkel under agaros ytan. Låt ställa på labbänken under 30 min.
- Ta bort glid gjutna och täcka slide-märkta agaros med färsk fisk vatteninnehållande Tricaine bedövningsmedel (se steg 1.9) vid förhållandet 1:25.
- Gör lösningar av Rhodamine dextran (RD) färgämne. Resuspendera rodamin B 10000 MW märkt dextran i autoklaverat ultrarent vatten till en stamkoncentration av 50 mg / ml. För mikroinjektion, ytterligare späda lager till en slutlig koncentration av 5 mg / ml i autoklaveras ultrarent vatten.
OBS: pigmenterade celler börjar differentiera i zebrafisk från 24 timmar efter befruktning (HPF); dessa kan skymma fluorescerande markörer under bildtagning. - Hämmar melanocyt bildning genom att använda N -Phenylthiourea (PTU), som blockerar melanogenes genom hämning av tyrosinas. Gör en 0,003% stamlösning av PTU genom upplösning PTU pulver i akvarievatten, värme lösning vid 60 ° C för att fullständigt solubilisera.
- Inkubera zebrafisk embryon i lösning av metylenblått, en mild fungicid, för att förhindra svamp blommar och öka överlevnaden. Tillsätt 2 ml av metylenblått förrådslösning, innehållande 0,1% metylenblått i ultrapure vatten, till 1 liter akvarievatten och användning som en standard embryo medium.
- Gör upp en 15 mM lager koncentration av Tricaine / etyl 3-aminobensoat metansulfonatsalt enligt instruktionerna i "The Zebrafish bok" 23. Söva embryona och därmed immobiliserade dem att utföra mikroinjektion proceduren.
- Efter anesthetizing embryona, orientera dem, för avbildning med hjälp av giftfria och viskösa egenskaper metylcellulosa. För att göra en 200 ml beredning av 3% metylcellulosa, chill 130 ml vatten vid -20 ° C under 30 min och placera på is. Värm 70 ml vatten till 80 ° C i en glasbägare, tillsätt 6 g metylcellulosa, och skaka med en glasstav tills alla partiklar är vätta och jämnt dispergerat. Lägg till iskallt vatten, blanda och låt preparatet svalna vid 4 ° C i 30 min innan alikvotering i 50 ml tuber.
OBS: Sänkning av temperaturen tillåter metylcellulosa att bli lösliga. Lösningen blir tjockaresom pulver hydrater. 3% metylcellulosa kan lagras utan bakterietillväxt under korta perioder av en vecka vid 4 ° C eller längre vid -20 ° C. Se till att metylcellulosa nått RT före användning. - För att utföra injektioner av fluorescerande färgämne i zebrafisk använda en vanlig mikroinjektion set-up (Figur 1C). Denna består av en luftkompressor ansluten till en tryckregulator system som matar in i en rak pipett hållare för användning med 1,0 kapillärer yttre diameter. Pipetten Innehavaren bör hållas inom en MM33 kompakt 3-axlig styrning mikromanipulator fäst vid en stålbottenplatta med en magnetisk monter. Embryon kan visualiseras, manipuleras och injiceras med hjälp av en stereo dissekera mikroskop.
2. Zebrafish Husbandry och Pre-injektion Treatment
- Bibehåll zebrafisk som tidigare beskrivits 23. Använd ett akvarium set-up som ger recirkulerande vatten tillförs vid en konstant temperatur av 28,5 ° C, Rade till pH 6,8-7,2 och konduktivitet 450-550 iS med natriumbikarbonat och direkt Ocean havssalt, respektive. Använd vildtyp eller transgena zebrafisk linjer som är lämpligt för experimentet, upprätthålla en beläggningsgrad på 15 hanar till 15 honor per 8 L tank. Ställ fisken anläggningen photocycle till 14 timmar av dagsljus mellan 09:00 till 11:00.
- Zebrafisk leken börjar i början av photocycle, när ljuset slås på på morgonen. För att säkerställa maximal ägg kan samlas utan att störa fisken, dränka avelstankar (innehållande mesh skär, tillgängliga från zebrafisk specialister) till vildtyp lagertankar kvällen före samlingen.
- På dagen för insamling, tillåter 30-40 minuter för fisken att leka, varefter samla in och skölj ägg med en tesil och färskt akvarievatten. Deponera de rengjorda ägg i en 90 mm petriskål med embryo medium och inkubera vid 28,5 ° C.
- Behandla embryona med PTU att inhibera Melanogenesis. Vid 8 HPF, överföra livskraftiga embryon i minimal vätska till färska petriskålar innehållande 1: 100 PTU till embryo medium och ytterligare inkubera vid 28,5 ° C tills 72 HPF.
OBS: PTU kan orsaka utvecklingsdefekter om den används i tidigare led så bör begränsas för att posta 8 HPF stadier, men kan behandlas så sent som 24 HPF. Sen tillägg av PTU inte helt blockerar ögonpigmente men är i allmänhet framgångsrik och hämma bålen melanocyt bildning.
3. Mikroinjektion
OBS: perikardium encases hjärtat men separeras för skydd och enkel hjärt rörelse genom vätskan i perikardiell kaviteten. Syftet med detta förfarande är att injicera RD i perikardiell hålighet, detta möjliggör snabbt upptag av färgämnet till kärlsystemet.
- Last nålar med 6 l - utspädd RD, med hjälp av microtips och säkra in nålen innehavaren av mikromanipulator. Bryt slutet av nålen med fin tipped pincett (Figur 1A). Flytta RD lösning på nålspetsen genom att maximera pulslängd till minutinställningen, växla tillbaka till msek gång komplett.
- Använd en mikrometern, tryckregulatorn och förfiningar till nålspetsen längd (med pincett) för att justera storleken på den utvisade droppen till 100 nm i diameter, motsvarar detta en 0,5 nl volym (Figur 2A).
OBS! När bryta nålen, vara noga med att inte bryta för mycket off annars kommer att göra kalibrera injektionsvolym svårt. Om så är nödvändigt, ytterligare bryta nålspetsen för att öka droppstorleken dock upprätthålla en nål tjocklek som medger inträde i perikardium utan överdriven böjning eller skada på vävnaden. - Före injektion, söva embryona i embryo medium innehållande Tricaine. Ställ in 2 x 35 mm petriskålar innehållande 5 ml embryo medium, etikett ens Tricaine "och den andra" Recovery ".
- Lägg 200l av lager Tricaine till korrekt märkta skålen. När redo att injicera, välja en enskild embryo vid 72 HPF och överföra i minimal vätska till Tricaine skålen. Övervaka aktiviteten hos embryot, testar embryot bedövas och immobiliseras genom försiktig omrörning med hjälp av en stympad microloader spets.
- Överför sövd embryot till injektion mögel och orientera embryot inom ett agaros tråg så den vänstra sidan är vänd uppåt, placera hjärtat till vänster om synfältet.
- Att injicera RD in i hjärtat, hål i hjärtsäcken med nålen och injicera 1 nl av RD i hjärt håligheten i nedsövd embryot (Figur 2B, högra panelen). Dra ut nålen efter injektionen. Överför den injicerade embryot i minimal vätska till "återhämtnings skålen" och övervaka under 1 min. Överför individuella embryot till en 24-brunnar innehåller 1 ml färskt embryo medium (innehållande PTU) och märk lämpligt.
OBSERVERA: Den hjärtsäcken är tufft, men det finns en anmärkningsvärd svag punkt i korsningen där hjärtsäcken möter ventro-caudal svalg valv och dorso-rostral gulesäcken (Figur 2B pilspets). Nålen ska riktas till detta spår. När nålen är på plats, kommer en fast kran av ett finger på toppen av mikromanipulator lätta inträde i perikardiell hålrum. - Upprepa steg 3,2-3,6 i minst 10 embryon per experimentgrupp, placera varje fisk i en separat väl och unikt labelto tillstånds individuella experimentella uppföljningar. Inkubera vid 28,5 ° C under 3 h.
4. Imaging Acquisition
- Vid 3 timmar efter injektion (HPI) söva embryon som tidigare beskrivits och överför till en 35 mm petriskål med 3% metylcellulosa. Tryck försiktigt embryon i metylcellulosa och orientera så den laterala sidan kan avbildas.
- Förvärva en bild av embryot i UV, med hjälp av ett filter för visualisering of emitterat ljus vid 570 nm (Figur 2C). Efter bild förvärv, låta embryot att återhämta sig innan du byter in den utsedda väl. Hämta bilder för alla injicerade embryon och ytterligare inkubera vid 28,5 ° C.
OBS: I detta protokoll använde vi en fluorescerande stereomikroskop med en TXR filteruppsättning, en DFC300FX kamera och respektive programvara. Anteckna de exakta förvärvsinställningar för efterföljande bild förvärv. - Vid 24 HPI, skaffa en andra omgång av bilderna som beskrivs ovan. När alla bilder har förvärvats, både 3 HPI och 24 HPI, humant avyttra embryon eller användning för andra experimentella metoder, t.ex., immunohistokemi.
5. Bildbehandling
- Kvantifiera fluorescerande intensitet varje injicerade embryo, vid 3 HPI och 24 HPI, genom att analysera bilder med NIH: s ImageJ programvara. För att mäta fluorescerande intensitet, öppna en bild i ImageJ och ange ett område av intresse (ROI) på 100 px 2 (Redigera → val → specificera).
- Placera hjärta i mitten av roi (figur 2C), ställ mätningar för att inkludera genomsnittliga gråskala och området (Analyze → set mätningar), utför mätningen (Analysera → åtgärd). Slutför för varje uppsättning bilder, vid 3 HPI och 24 HPI, per embryo och överföra genomsnittliga grå skalvärden till ett kalkylblad för vidare bearbetning.
OBS: Vi valde en fast roi storlek på 100 px 2 eftersom detta omfattar enskilda hjärtan mellan embryon. Hjärtat valdes att utföra mätningar på grund av sin storlek som gör ett mycket bra läge för att mäta fluorescerande innehållet i blodet före in i njuren. - Utför statistisk analys med hjälp av lämplig statistisk programvara. Jämför grupper för statistisk signifikans med hjälp av en T-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bardet-Biedl syndrom (BBS) är en sällsynt heterogen ciliopathy som drabbar ungefär 1: 160.000 människor världen 16. Patienter som före med ett antal tillhörande problem inklusive polycystiska njurar, därefter patienter behöver ofta njur dialys eller transplantation 24. ESRF är den vanligaste dödsorsaken i BBS, med cirka 30% av patienterna utvecklar CKD 16. För närvarande har 20 icke-relaterade gener varit inblandad i BBS utan publicerade genotyp-fenotyp association. BBS proteinerna har gemensamma proteinlokaliseringsdomäner inom cilium och basala organ som, tillsammans med patienternas karakteristiska drag, sluta sig till ciliopathy diagnos. BBS9 kodar Parathyoid Hormone-responsiv B1 (PTHB1) protein som tillsammans med andra BBS (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) -proteiner utgör kärnan BBSome komplexet ansvarigt för bildningen av den primära cilium 24. Mutationer i BBS9 står för 6% av BBS cALL 24. Vidare har PTH varit inblandad i njur cystbildning genom främjande av njur epitelcellproliferation, vilket tyder på att förlusten av bbs9 funktion i zebrafisk kan visa njurskador 25. Tidigare rapporter med ett bbs9 knockdown zebrafisk modell utesluter en beskrivning av njuren, presentera möjlighet att visa den beskrivna njurfunktion analys 26. Knockdown av bbs9 funktionen uppnåddes i zebrafisk genom att injicera, vid 1- till 4-cellstadiet, en antisens morfolino att blockera genspecifik bbs9 översättning och parallellt en vanlig negativ kontroll morpholino mot en intronisk mutation i humant beta-globin (4 ng bbs9 MO, sekvens: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA och 4 ng kontroll MO, sekvens: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). Vi fann att förlusten av bbs9 funktion resulterade i 40% av embryon visar pronephric cystor med 5 dpf, tyder detta var en lämplig modell för att analyseranjurfunktion när rodamin dextran analysbesked. Vi observerade att morphant fiskar har en betydande minskning av deras förmåga att rensa fluorescerande färg efter 24 hpi jämfört med kontroller (Figur 3) - con: 14,8 ± 1,2 SEM, n = 9; bbs9 MO: 61,0 ± 10,3 SEM, n = 10 ; oparat t-test P-värde: 0,002). För att utesluta möjligheten att minskad clearance kan bero på minskad blodcirkulation, var embryon utvärderades för hjärtslag och recirkulerande blodkroppar, både kontroll och morphant fisken hade jämförbar hjärtfrekvens och blodflöde. Dessa data tyder på att njurfunktionen är nedsatt i bbs9 morphants. Faktum bbs9 morphant embryon utvecklar cystisk pronephric tubuli samtidiga med den som observerats hos BBS patienter.
Figur förberedelse 1. Utrustningoch set-up. (A) borosilikatglas kapillärer bör dras för mikroinjektion med hjälp av en lämplig nål avdragare. Nålen kräver att bryta med pincett (streckad linje) för att tillåta RD att avsluta nålen, bör man inte bryta nålen för mycket gör en nål som inte kan kalibreras. Skala bar:. 200 nm (B) En agaros mögel för embryomanipulation och orientering kan formas genom limning tillsammans glas och plastpipetter (C) Standardmikroinjektion set-up.. Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Figur 2. Mikroinjektion av Rhodamine dextran i hjärtsäcken. (A) Kalibrera droppstorleken till 10 increments (100 nm) på en 1 mm skede hårkors. (B) Korrekt positionering av nålen (svarta pilar) i crevasse märkning korsningen mellan den bakre svalgbågen, gulesäcken och hjärta kommer att underlätta piercing vävnaden (pilspets). Skala bar:. 200 pm (C) Rodamin dextran kan ses snabbt tas upp av hela kärl (vita pilar). 100 px 2 regioner intresse täcker en centraliserad hjärta (gul fyrkant) bör användas för att göra mätningar av medelvärdet gråvärdet och därmed pixel / fluorescerande intensitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Knockdown av bbs9 orsakar defekt njure function i zebrafisk. (A) Embryon injiceras i hjärtsäcken med Rhodamine dextran vid 3 HPI och 24 HPI, topp- och botten två paneler respektive i antingen kontroll eller bbs9 morphant embryon. Pilspetsar indikerar hjärtat; pilen indikerar bildandet av en pronephric cysta. (B) Procent fluorescensintensitet som återstår efter 24 hpi i kontroll kontra bbs9 MO embryon. Felstaplar visar standardfelet för medelvärdet (SEM), ** P ≤ 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk erbjuda ett värdefullt verktyg för att modellera människans genetiska sjukdomar, har deras användning som ett vetenskapligt instrument för in vivo forskning möjlig detaljerade studier av den genetiska nedbrytning av många biologiska system, inklusive njuren. Mycket är nu förstås om hur zebrafisk njuren utvecklar och funktioner. De slående likheter med människans nephrogenesis och homologi med sjukdoms orsakar gener 21 har illustrerat hur zebrafisk har blivit grundläggande för att förstå hur fel i geners funktion leder till patologin av njursjukdom. I själva verket kan genmanipulation vara enkelt uppnås zebrafisk använder antisens morfolino knockdown teknik eller mer avancerade riktade genomredigeringsverktyg såsom Talens eller CRISPR. Skapa knockdown eller muterade modeller för misstänkt njursjukdom orsakar gener är det första steget i att förstå deras inblandning i sjukdomen manifestationen. För att göra detta en tillförlitlig analys för njurfunktion söksatt indikera huruvida en kandidatgen är sannolikt ansvarig för patologin observerats hos patienter.
Njurfunktion tester är enkla och relativt billiga att utföra på människor, i allmänhet tittar på nivåer av lösta ämnen som är närvarande i blod eller urin. Men dessa metoder är tillämpliga i zebrafisk på grund av sin ringa storlek och akvatiska habitat. Den rodamin dextran analysen som beskrivs här utnyttjar förmågan hos pronephric tubuli för att filtrera lågmolekylära beståndsdelar från blodet. De podocyter positionerad i Bowmans kapsel av njuren, att kuvert kapillärerna i glomerulus, tillåta fri passage av små molekyler, såsom vatten, joniska salter och glukos genom en slits membran 27. Filtrerings slitsar fungera ytterligare för att förhindra förlust av makro proteiner från blodet. Filtrering är begränsad för molekyler över 5 kDa och nästan helt blockerade på storleken på serumalbumin 28 (cirka0; 65 kDa). Genom att injicera ett fluorescerande dextran färgämne med approximativt 10 kDa, vid en känd koncentration i det perikardiell kaviteten, har vi möjlighet att mäta fluorescensintensitet av blodet över tid. Under normala betingelser cirka 85% av initial fluorescens förloras från blodet, under en 24 h period via sekretion via njurarna. Man bör notera att injektion i perikardiell rymden är bara möjligt med låg MW dextran som passerar fritt in i kärlsystemet. Således denna analys ger bara en avläsning för graden av clearance för lågmolekylära beståndsdelar och inte ger någon information om effekten av glomerulär filtrering. Det senare kan bedömas mer direkt med hög molekylvikt färgämnen över 70 kDa, som kräver injektion i kärlsystemet och inte in i perikardiell rymden. I själva verket kan dextraner av olika MWs användas för att ytterligare dissekera njurfunktion 28.
De zebrafisk pronephric tubuli är mycket cilie med mokakel cilier som underlättar förflyttning av filtratet mot kloaken 3,4. Defekter i ciliär maskiner har varit inblandade i njursjukdom. BBS är en genetiskt heterogen, autosomalt recessiv sjukdom som kännetecknas av barndomen debut näthinnedegeneration, tidig debut fetma, kognitiv nedsättning, polydactyly och njur missbildning 24. Hittills har 20 BBS gener (BBS1-20) identifierats. Störningar av BBS leder till renal cystbildning och defekt pronephric funktion i zebrafisk 9. BBS9 interagerar med andra BBS proteiner bildar BBSome ansvarig för lämplig ciliogenesis, mutationer som står för 6% av BBS fallen 24. Medan en zebrafisk bbs9 knockdown modell har rapporterats, var en beskrivning av njur fenotyp som saknar 26. Genom att knacka ner bbs9 i zebrafisk, med hjälp av morpholino tillvägagångssätt visar vi användning av njuranalys clearance som en metod för att bestämmanjurfunktionen hos en njursjukdom modell. Här visar vi att bbs9 morphant embryon visar hindras fluorescerande clearance från blodet, vilket indikerar att njuren inte ta bort låga MW lösta ämnen. Således, på grund av inblandning av bbs9 i ciliogenesis, och den roll som pronephric cilier underlätta filtrat rörelse, kommer sannolikt att bero på avvikande cilier funktionen den observerade njur clearance hos morphants. Denna metod utgör ett värdefullt verktyg för att bedöma njurfunktionen hos zebrafisk sjukdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Acknowledgments
Tekniskt stöd från Jaipreet Bharj. Detta arbete har finansierats med bidrag från EU-FP7 (SYSCILIA -241.955) och The Dutch Kidney Foundation (CP11.18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , Academic Press. (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
