Abstract
En kompleks integrering av molekylære og elektriske signaler som er nødvendig for å transformere en hvile livmoren inn i en kontraktile organ ved slutten av svangerskapet. Til tross for oppdagelsen av viktige regulatorer av uteruskontraktilitet, denne prosessen er fortsatt ikke fullstendig forstått. Gene mus gir en ideell modell for å studere fødsel. Tidligere har den eneste metode for å studere uteruskontraktilitet i mus var ex vivo isometriske strekkopptak, som er suboptimal av flere grunner. Livmoren må fjernes fra dens fysiologisk miljø, er en begrenset tid løpet av undersøkelsen er mulig, og musene må ofres. Den siste utviklingen av radiometrisk telemetri har tillatt for langsgående, sanntidsmålinger av in vivo intrauterin press i mus. Her, i implantering av en intrauterin telemeter måler trykkendringer i mus livmoren fra midten av svangerskapet før levering, er beskrevet. Ved å sammenligne forskjeller i trykktiltak mellom villtype og transgene mus, kan den fysiologiske virkningen av et gen av interesse bli belyst. Denne teknikken bør fremskynde utviklingen av legemiddelselskap som brukes til å behandle myometriske lidelser under svangerskapet, blant annet for tidlig fødsel.
Introduction
Tidlig fødsel er den ledende årsak til perinatal sykelighet og dødelighet i utviklede land; den er ansvarlig for 50% av perinatal sykelighet og 75% av perinatal dødelighet 1,2. Tidlig fødsel er mangefasettert, og kan være idiopatisk. Selv om mye forskning har dukket opp på de molekylære og elektriske baner trans myometriet fra en hvilende vevet inn en kontraktile en, nøyaktig patofysiologien av preterm arbeidskraft forblir unnvikende. Endokrine, inflammatorisk og genregule alle har vært knyttet til for tidlige veer 3,4. Men etiske hensyn begrense muligheten til å forske på mekanismene for tidlig fødsel hos mennesker.
Gitt disse begrensningene, har mange forskere slått til mus som modellsystem som å studere fysiologi av fødsel. Mus har korte gestations varer ca tre uker og kan lett genetisk manipulert. I tillegg flere genetiske musemodeller harblitt utviklet for å bestemme de signalveier som er avgjørende for arbeids 5. Til tross for viktige forskjeller mellom mus og menneske fødsel, mus og mennesker deler mange av de samme mekanismene som er avgjørende for arbeidskraft, herunder intrauterin betennelse og infeksjon 6. Således mus tjener som et uvurderlig verktøy for å undersøke livmoraktivitet. Til dags dato, til gullstandarden måle uteruskontraktilitet i mus har vært ex vivo isometriske spenning opptak; men dette er begrenset til en svangerskaps tidspunkt per eksperiment og krever fjerning av livmoren fra dens fysiologisk miljø. En annen viktig faktor er det store antallet av dyr som kreves for disse undersøkelsene. Til slutt, ikke denne metodikken tillater for longitudinelle studier som undersøker induksjon av fødsel og preterm patofysiologi.
Nylige fremskritt gjort i radiometriske telemetri enheter som brukes til å studere arteriell trykkforandringer 7 i mus og intrauterine trykk i rotter 8 ba spørsmålet om hvorvidt det samme teknologi kan brukes til å studere forandringer i intrauterine trykket hos mus i løpet av graviditet. Etter innledende feilsøking, ble en metode med hell utviklet for å måle arbeidskraft induksjon og progresjon i en mus. Denne in vivo tilnærming kan måle overgangen fra lavtrykkstilstand hvile livmoren til høytrykkstilstand som indikerer kraftige arbeids sammentrekninger. Denne metoden har også vært i stand til å detektere signifikante trykkforskjeller mellom transgene mus med kompromittert fødsel og villtype-mus, noe som demonstrerer den fysiologiske virkningen av genekspresjon 9. Denne protokollen gir en real-time, in vivo metode for å studere mus livmor trykket under svangerskapet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyr prosedyrer holdt retningslinjer for omsorg og bruk av dyr fastsatt av National Institutes of Health. Alle protokoller ble godkjent av Animal Studies utvalget ved Washington University in St. Louis.
MERK: Spesifikke materialer og utstyr for denne protokollen er oppført Materialer og utstyr tabellen.
1. Tidsbestemt Avl av hunnmus
- Avle voksne kvinner mellom to og seks måneders alder i en 2 timers tidsvinduet med menn. Spesifikk avl t er ikke nødvendig så lenge som de holdes konsekvent gjennom hele forsøket.
- Bekrefte graviditeten ved tilstedeværelse av en copulatory plugg. Utpeke den dag og time der pluggen er først sett på som dagen etter samleie 0 (dpc0). Husk den spesifikke time når du starter press opptak.
- Utføre operasjoner på dpc8-13. Den nøyaktige DPC vil avhenge av musestamme.
- For å avgjøre om en mus er gravid før kirurgi, perform ultralydavbildning av buken med en 40 MHz lineær oppstilling sonde koblet til et avbildningssystem før administrering av anestesi. Dette vil tillate visualisering av svangerskaps sekker. Hvis et ultralydsystem er ikke tilgjengelig, bruker vekten av musen.
MERK: En vektøkning på minst 2 g mellom dpc0 og dpc8 og oppblåsthet av magen er en god indikator på graviditet.
2. Telemetri Surgery Prep
- Bruk en autoklav å sterilisere instrumenter, gasbind, bomullspinner, kirurgiske gardiner, og pipette tips innen 24 timer før operasjonen.
- Rent kirurgi overflaten med 70% etanol.
- Slå på varmepute (spesialisert for gnagere) og perle sterilisator.
3. Telemetri Surgery
- For anestesi, bruke 4-5% isofluran med en oksygenstrømningshastighet på 1-2 l / min.
- Vent til mus viser tegn til anesthetization og deretter injisere subkutant med buprenorfin (smertestillende: 0,1 ml per 20 g).
- Barbere buken hos mus fra bunnen av ribbene ned i blæren.
- Bringe musen til kirurgi tabellen på forvarmet varmepute, og dekke musens øyne med oftalmisk salve for å hindre uttørking.
- Begynn steril teknikk. Ta på sterile hansker og holde wrapper som en steril overflate som du kan plassere jod og etanolskrubb.
- Ta av telemeter fra pakken eller saltvann og bruke steril pinsett til å plassere den på steril kompress.
- Bruk sprøyte (gitt av telemeter leverandør) for å fylle kateterspissen med gel. Klem forsiktig på kateteret skape nok undertrykk til å trekke gelen inn i kateteret.
- Plasser en steril spissen på pipetten. Pipetter 2 ul av kirurgisk lim og sette pipetten på en steril overflate.
- Å rengjøre operasjonsstedet, pensle med jod og deretter med 70% etanol.
- Skjær et hull i operasjonslakenet akkurat stor nokfor det området som er nødvendig for snittet og sted over musen.
- Utføre en fot klype (pedal respons) for å sikre at musen er helt bedøvet før du gjør et snitt.
- Lag en liten vertikal midtlinjesnitt. Deretter lage en lignende snitt gjennom den underliggende kroppsveggen muskler.
- Trekk forsiktig livmoren ut av kroppens hulrom og finn livmor horn som inneholder flest unger som er levedyktig.
- Valgfritt - For tillegg av miRNA, injisere viral vektor inn i muskelen laget av livmoren før innsetting av telemeter.
- Lage et lite snitt på tuppen av livmor horn med 3 mm cutting edge våren saks.
- Træ kateteret, uten å klemme, mellom fosterblærer livmorveggen og. Sett kateteret forbi flere sekker for å redusere utilsiktet fjerning. Pass på at fosterblærer ikke blir forstyrret av innsettingen.
- Pipetter kirurgisk lim til stedet for telemeter innsetting å følge kateteret til uterine horn og hindre at kateteret glir ut av livmor horn. Vent noen sekunder for limet å bli stiv, og deretter forsiktig plassere livmoren tilbake inne i kroppens hulrom.
- Plasser telemeter i kroppens hulrom på motsatt side av kateterinnføringsstedet.
- Sutur kroppens hulrom lukket med 6,0 absorberbare suturer. Først gjøre en veske sting og deretter 03:57 individuelle sting.
- Suturer huden ved hjelp av samme teknikk, men med 6-0 ikke-absorberbare sutur.
- Pinne dibukain (aktuell smertestillende) salve over snittet området.
- Injisere 0,3-0,4 ml sterilt saltvann subkutant å rehydrere dyret.
- Overvåke dyret etter operasjonen før det er helt våken. Ikke plasser musen tilbake i buret før den er i stand til fritt å holde hodet over bordet som visse typer sengetøy kan kvele et tungt bedøvet mus. For en mus som har blitt bedøvd for 30-45 min, bør man forvente the musen til å være helt våken etter 1 time og 15 min.
- Hvis du utfører flere operasjoner, tørk instrumenter med 70% etanol og perle sterilisere før gjenbruk.
4. Post-kirurgi Recovery
- Overvåke daglig etter operasjonen fremgang i en logg. Katalog vektøkning og tap og se for apati, blødning, eller ufullstendig lukking av kirurgiske innsnitt.
- Mate musa myknet mus chow (~ konsistensen av eplemos) eller spesialisert utvinning diett mat.
- Undersøke sting og sørge for at de ikke trukket ut, men prøv ikke å håndtere musen overdrevet.
5. Telemetri Recording
- På dagen for interesse (minst et to til tre dager etter at musa har kommet seg fra kirurgi), plassere en magnet i nærheten av musen for å slå på telemeter. Sett museburet på mottakeren. Lyset på mottakeren skal slå seg på hvis telemeter er aktivert.
- Kalibrere helt ny teleme meterne med produsentens spesifikke kalibreringer gitt. Gjenbrukes telemeter spesifikasjoner kalibrerings vil bli holdt i programvare.
- I programvaren, starte opptak ved å høyreklikke på "dyr" og klikk "start prøvetaking, kontinuerlig", som gjør det mulig for prøvetaking ved hastigheter på opp til 500 Hz. Kontroller at programvaren er satt til å lagre og spore.
MERK: Når prøvetaking museikonet blir grønt, blir presset blir tatt opp. Forstyrre mus under levering kan avbryte eller endre arbeidskraft, så observere forsiktig. - Etter levering eller tidsperiode av interesse, stoppe opptaket ved å høyreklikke på "dyr" og velge "stoppe opptak, alle". Bruk en magnet for å slå av telemeter for å spare batterilevetid, som telemeter batteriet vil vanligvis bare vare i 1,5 måneder med kontinuerlig opptak.
- Avlive musen ved CO 2 overdose og gjenopprette telemeter. Valper avlives ved halshogging.
- Plasser telemeter i en oppløsning av 1% enzym vaskemiddel i avionisert vann over natten ved romtemperatur.
- Skyll telemeter i avionisert vann og fjern alle vev og lim, være forsiktig med å presse kateteret.
- Inkuber telemeter i 2% glutaraldehyd i 24 timer ved romtemperatur for å sterilisere.
- Skyll telemeter med sterilt saltvann og lagre den i sterilt saltvann før neste implantasjon eller å bli sendt tilbake til produsenten for å bli fornyet. Telemeters bør være renovert hvis vev er plassert inne i kateteret etter sterilisering. Vanligvis telemeters kan brukes 4-5 ganger før du trenger å bli fornyet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Real-time in vivo intrauterine press kan registreres ved hjelp av en telemetrisk innsamlingssystem. Trykk prøvetaking sammen med samtidig videoopptak av musen ble brukt til å fange det eksakte tidspunktet for hver valp levering og korrelere leveringstid til intrauterin trykk av moren. Alle datapunktene kan deretter bli opptegnet i løpet av opptaket for å generere et trykk som funksjon av tid plottet (figur 1A). Denne tomten viser punkter under svangerskapet når de intrauterin trykkendringer samt trykkforskjellen mellom de mørke og lyse sykluser. I tillegg kan en glidende gjennomsnitt av de intrauterine trykket bli plottet (figur 1B). Dette er nyttig å lettere visualisere vedvarende økning i intrauterin press karakteristikk av sammentrekninger i forbindelse med arbeidsprosessen (registreringer oppnådd under fødselen har vært publisert tidligere 9).
Data kan bli ytterligere analysert ved å eksportere datapunkter til analyse programvare og snitt data over tidsperioden av interesse. Når man sammenligner ulike eksperimentelle forhold, for eksempel villtype versus transgene mus, daglig eller time press fra forskjellige mus kan i gjennomsnitt å undersøke kontraktile mønstre avhengig av genet av interesse. I tillegg kan den statistiske signifikans av forskjeller bestemmes. Intrauterine press kan undersøkes under fødselen, eller en longitudinell studie kan gjennomføres for å undersøke hele svangerskapsperioden under forskjellige forhold.
Intrauterin telemetrisystem kan brukes til å teste in vivo responser på farmakologiske midler under graviditet. Spesifikt, gir denne metoden for tidlig narkotika testing før kliniske studier. Forskjeller i respons til spesifikke midler kan testes i transgene mus, så vel som i ikke-gravide eller gravide mus. En spesifikk farmakologisk middel som er kjent for å øke uterine sammentrekning, oksytocin, kan bli levert subkutant som tidligere beskrevet i en rottemodell 10. Den telemeter kan implanteres på samme tid som en mikro-osmotisk pumpe for å levere en jevn rate av oksytocin. Forskjeller i opptak mellom ikke-gravid (Figur 2A) og gravid (figur 2B) mus med administrasjon av oksytocin kan også bli undersøkt.
En annen potensiell anvendelse av intrauterin telemetri er å se på livmor sammentrekninger etter miRNA / shRNA stanse av proteiner. Musemodeller er ikke tilgjengelige for alle gener som er avgjørende for fødsel. Således kan genet Slå sammen med intrauterine trykkmålinger brukes til å undersøke proteiner av interesse. Ved å injisere miRNA-uttrykk lentivirale vektorer inn i myometrium under implantering av telemeter, kan uterin-spesifikke knockdown av et gen av interesse undersøkes, som vist i figur 3A. En fersk studie viseret spesifikt eksempel som viser at Kir7.1 kanal har en viktig rolle i uterus etter bruk både miRNA og telemetri for å undersøke endringene i intrauterin trykk gjennom drektighets 11. Representative tracings av egge miRNA (figur 3A) eller Kir7.1 miRNA (Figur 3B) viser at å slå ned uttrykk for kalium kanal Kir7.1 forårsaket intrauterin press for å øke. Disse representative tracings er lik det som er sett i transgene musemodeller som tidligere beskrevet ni.
Figur 1: Representant kontinuerlig intrauterin press opptak (A) Sanntids intrauterin trykkdata registrert i vivo kontinuerlig i fire dager (15-19 DPS).. (B) Flytting timesgjennomsnitt for data i (A). WhITE og svarte striper på toppen av opptakene viser 12 timers lys og mørke sykluser, henholdsvis. (C) En zoomet inn spor av mus in vivo individuelle sammentrekninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Intrauterine presset i respons på oxytocin Representative tracings av intrauterin press fra ikke-gravid (NP) myometrium (A) og sen gravid (18 DPC) myometrium (B) som utsettes for 5 enheter / dag av oxytocin for 24-timers viser øker. i press i slutten gravid versus NP mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Måling av intrauterin press etter å kneble av en kalium kanal av miRNA / shRNA (A) Skjematisk av plassering av telemeter og områder av injeksjon av miRNA-uttrykker lentiviruses.. Nyere studier har vist de representative tracings av intrauterin press fra myometriet transdusert med (B) egge miRNA eller (C) Kir7.1 miRNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøkelser av myometriets kontraktilitet har stolt på ex vivo målinger av muskelspenninger. Denne metoden kan være nyttig for tidlig stadium testing av nyutviklede preparates uterotoniske medikamenter som ikke kan administreres til levende dyr. Imidlertid, in vivo metoder er nødvendige for å forstå langs progresjon av arbeidskraft. De in vivo-målinger tjene flere formål. Først aktiverer de fangst av et komplett bilde av endringer i livmor kontraktile mønster over varigheten av svangerskapet. Sekund, de eliminerer skjevhet av ex vivo-opptak som krever livmorvev kan monteres enten vertikalt eller horisontalt, noe som begrenser vår forståelse av den komplette rolle sirkulære og langsgående muskellaget i livmoren. For det tredje, de tillater opptak av livmortrykk i den endogene hormonelle miljø, og dermed gjør det mulig for mer nøyaktig å studere fødsel i musemodeller. Til slutt, de gir mulighet for mer translational undersøkelser mellom musemodeller og mennesker som livmor telemetri ligner målinger tatt hos gravide kvinner med intrauterin trykk katetre nærmere.
Metodene for mus livmor telemetri er lett å lære, men vanskelig å mestre. Etterforskere med tidligere mus kirurgi erfaring kan oppnå suksess raskere, men dette bør ikke avskrekke labs fra å bruke denne verdifulle teknikk. De opprinnelige studier med mus livmor telemetri ble gjort av en nybegynner med stor suksess etter et par forsøk, så laboratorier bør være forberedt for de første par operasjoner for å føre dammen for å miste alle fostre. Her er noen tips for å huske på. Som med alle kirurgi, er den korteste varigheten best for dyret. En rask operasjon vil begrense dehydrering og behovet for ytterligere doser av anestesi. Dersom forskeren er å ha en vanskelig tid etterbehandling prosedyren før musen våkner, kan isofluran brukes til å holde muse anesthetized lenger. Man har også funnet at bruken av isofluran øker antallet levedyktige unger og foretrekkes fremfor ketamin. Den minste innsnitt mulig, bare litt større enn kroppen av telemeter, vil redusere sjansen for såret gapende senere, redusere tiden det tar å sutur, og forbedre mus utvinning. Med en liten abdominal innsnitt, vil trekke livmoren utenfor kroppshulrommet tillate bedre synlighet under kateterinnføring. Ved gjenbruk av en telemeter, faktor i det foregående kurve av kateteret mens tråden den ned i livmorhorn. Slik at den kirurgiske limet til å herde fullstendig før plassering av livmorhorn tilbake inne i kroppshulen vil bidra til å holde kateteret på plass og forhindre at lim fester seg til tarmene. Den telemeter kroppen kan skade leveren hvis plassert for høyt, og musens magen er i stand til å utvide mye, så ikke nøl med å plassere telemeter lavere i kroppen. Disse metodene vil måtte tilpasses to passe behovene til ulike laboratorier og ulike musemodeller, men fordelene med livmor telemetri langt oppveier hindringer.
Det er noen begrensninger som bør vurderes når implementere denne metodikken. En av hovedutfordringene som må overvinnes er graden av føtalt tap etter implantasjon av senderen. I den intrauterine telemetri første rapport 9, hadde alle transgene SK3 T / T og villtype mus viss grad av føtalt tap i den ene eller begge uterine horn uansett om det hornet ble valgt for telemeter plassering. Optimalisering av valget av dagen under svangerskapet når telemeter ble kirurgisk satt forbedret vår rente vellykkede sikt svangerskap, men et omfattende tilbud av valpene ble aldri oppnådd. Spesielt, den optimale operasjonsdagen for SK3 T / T mus skilte seg fra den i vill type, med bedre reproduktive utfall bemerket på dpc12-13 for SK3 T / T mus versus dpc8-9 for WT mus, Suggebrodd at kirurgi protokollen må kanskje endres for hver mus modell av interesse. Våre data indikerer at antall unger birthed ikke korrelerer med generelle intrauterin press. Føtale utfallet ble bedre med bedre kirurgiske ferdigheter ved eksperimentator, og andre som har implementert denne metodikken i sitt laboratorium har registrert at fosterets utfall forbedret med bruk av isofluran i stedet for ketamin. Det er forventet at etter hvert som flere laboratorier bruke denne metoden, vil senderen teknologi og intrauterin analyseprogramvare blir mer raffinert. Dette vil utvilsomt fremme nytten av denne teknologien i studier av mekanismer som bidrar til arbeidskraft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Glue | 3M Vetbond | 1469SB | Tissue Adhesive--stored in Drierite |
| Absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | J212H | Vicryl |
| Non-absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | 8706H | Prolene |
| Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymer | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | Specialized for rodents |
| Bead sterilizer | Keller | Z378577 | Steri 250 Sterilizer |
| Disecting Microscope | Nikon | SMZ754 | Fibre optic gooseneck external light source |
| Sterile Surgical Gloves--Latex | Cardinal Health Triflex | 2D7253 | |
| PhysioTel PA-C10 Pressure Transmitter | Data Sciences International | 270-0135-001 | TA11PA-C10 |
| Telemeter Reciever | Data Sciences International | 272-6001-001 | RPC-1 |
| Dataquest ART 4.3.2 Analysis Platinum | Data Sciences International | 271-0147-141 | Analysis software |
| Diet Recovery Gel | Clear H2O | 72-01-5022 | Purified Soft Diet for Rodents |
| Tergazyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme detergent |
References
- Slattery, M. M., Morrison, J. J. Preterm delivery. Lancet. 360, 1489-1497 (2002).
- Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371, 75-84 (2008).
- Keelan, J. A. Pharmacological inhibition of inflammatory pathways for the prevention of preterm birth. Journal Of Reproductive Immunology. 88, 176-184 (2011).
- Voltolini, C., et al. Understanding spontaneous preterm birth: from underlying mechanisms to predictive and preventive interventions. Reproductive Sciences. 20, 1274-1292 (2013).
- Ratajczak, C. K., Muglia, L. J. Insights into parturition biology from genetically altered mice. Pediatric research. 64, 581-589 (2008).
- Rajakumar, A., et al. Placental HIF-1 alpha, HIF-2 alpha, membrane and soluble VEGF receptor-1 proteins are not increased in normotensive pregnancies complicated by late-onset intrauterine growth restriction. American Journal Of Physiology. Regulatory, Integrative And Comparative Physiology. 293, (2007).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American journal of physiology. Heart And Circulatory Physiology. 286, H2408-H2415 (2004).
- Mackay, L. B., Shi, L. B., Maul, H. ., Maner, W. L., Garfield, R. E. The effect of bilateral pelvic neurectomy on cervical ripening in pregnant rats. Journal Of Perinatal Medicine. 37, 263-269 (2009).
- Pierce, S. L., Kutschke, W., Cabeza, R., England, S. K. In vivo measurement of intrauterine pressure by telemetry: a new approach for studying parturition in mouse models. Physiol Genomics. 42, 310-316 (2010).
- Imamura, T., Luedke, C. E., Vogt, S. K., Muglia, L. J. Oxytocin modulates the onset of murine parturition by competing ovarian and uterine effects. American Journal Of Physiology. Regulatory, Integrative And Comparative Physiology. 279, R1061-R1067 (2000).
- McCloskey, C., et al. The inwardly rectifying K+ channel KIR7.1 controls uterine excitability throughout pregnancy. EMBO Mol Med. 6 (9), 1161-1174 (2014).
