Abstract
En kompleks integration af molekylære og elektriske signaler er nødvendig for at omdanne en hvilende livmoder i en kontraktile orgel i slutningen af graviditeten. Trods opdagelsen af vigtige regulatorer af uterin kontraktilitet, denne proces er stadig ikke helt forstået. Transgene mus giver en ideel model til at studere fødslen. Tidligere er den eneste metode til at studere uterin kontraktilitet i mus var ex vivo isometriske spænding optagelser, som er suboptimal af flere grunde. Livmoderen skal fjernes fra dets fysiologisk miljø, et begrænset tidsforløb for undersøgelse er mulig, og musene skal ofres. Den seneste udvikling i radiometrisk telemetri har tilladt for langsgående, tidstro målinger af in vivo intrauterine tryk hos mus. Her til implantation af en intrauterin telemeter måler trykændringer i mus uterus fra midten graviditet indtil levering er beskrevet. Ved sammenligning forskelle i trykninger mellem vildtype og transgene mus, kan den fysiologiske virkning af et gen af interesse blive belyst. Denne teknik bør fremskynde udviklingen af terapeutiske midler, der anvendes til behandling af myometriske lidelser under graviditet, herunder for tidlig fødsel.
Introduction
Tidlig fødsel er den førende årsag til perinatal sygelighed og dødelighed i de udviklede lande; den er ansvarlig for 50% af perinatal sygelighed og 75% af perinatal dødelighed 1,2. Tidlig fødsel er mangesidet og kan være idiopatisk. Selvom megen forskning er opstået på det molekylære og elektriske veje omdanne myometrium fra en hvilende væv i en kontraktile én, den nøjagtige patofysiologien af tidlig fødsel er fortsat undvigende. Endokrine, inflammatorisk, og genregulering er alle blevet forbundet med tidlig fødsel 3,4. Imidlertid begrænser de etiske problemer evnen til at udføre forskning på mekanismerne for tidlig fødsel hos mennesker.
I betragtning af disse begrænsninger har mange forskere slået til mus som modelsystem med at studere fysiologi kælvning. Mus har korte svangerskaber varig cirka tre uger, og kan nemt genetisk manipuleret. Derudover flere genetiske musemodeller harblevet udviklet til at bestemme de signalveje, der er afgørende for arbejdskraft 5. Trods vigtige forskelle mellem mus og menneske fødsel, mus og mennesker deler mange af de samme mekanismer, der er afgørende for arbejdskraft, herunder intrauterin betændelse og infektion 6. Således mus tjene som et uvurderligt værktøj til at undersøge uterin aktivitet. Til dato, til guldstandarden måle uterin kontraktilitet i mus har været ex vivo isometriske spænding optagelser; Dette er imidlertid begrænset til et gestational tidspunkt per eksperiment og kræver fjernelse af livmoderen fra dens fysiologisk miljø. En anden vigtig faktor er det store antal af dyr, der er nødvendige for disse undersøgelser. Endelig er denne metode ikke mulighed for longitudinelle studier undersøger induktion af arbejdskraft og præmature patofysiologi.
Nylige fremskridt foretaget i radiometriske telemetri, der anvendes til at studere arterielle trykændringer 7 i mus og intrauterine tryk i rotter 8 bad spørgsmålet om, hvorvidt den samme teknologi kan anvendes til at studere ændringer i det intrauterine tryk i mus under graviditet. Efter første fejlfinding blev en metode med succes udviklet til at måle arbejdskraft induktion og progression i en mus. Denne in vivo fremgangsmåde kan måle overgangen fra lavtryks-tilstand hvilende livmoderen til højtryks-tilstand indikerer kraftfulde arbejdskraft sammentrækninger. Denne metode har også været i stand til at detektere betydelige trykforskelle mellem transgene mus med kompromitteret fødsel og vildtypemus, hvilket viser den fysiologiske virkning af genekspression 9. Denne protokol giver en real-time, in vivo metode til at studere mus uterin tryk under graviditet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyreforsøg overholdt retningslinjer for pasning og anvendelse af dyr, der er fastsat af National Institutes of Health. Alle protokoller blev godkendt af Animal Studies udvalget på Washington University i St. Louis.
BEMÆRK: Specifikke materialer og udstyr til denne protokol er opført Materialer og udstyr bord.
1. Tidsindstillet Opdræt af hunmus
- Race voksne hunner mellem to og seks måneder i en 2 hr tidsvindue med mænd. Specifik avl HR er ikke nødvendigt, så længe de forbliver konsistente for hele forsøget.
- Bekræft graviditet ved tilstedeværelsen af en kopulative stik. Udpeg dagen og HR, hvor stikket er første gang set som dag efter coitus 0 (dpc0). Husk den specifikke time, når du starter tryk optagelse.
- Udfør operationer på dpc8-13. Den nøjagtige DPC vil afhænge af musestamme.
- At afgøre, om en mus er gravid før operation, perform ultralydsscanning af maven med en 40 MHz lineært array probe koblet til et billedbehandlingssystem før administration anæstesi. Dette vil tillade visualisering af svangerskabsuge sække. Hvis en ultralyd-system ikke er tilgængeligt, skal du bruge vægten af musen.
BEMÆRK: En vægtforøgelse på mindst 2 g mellem dpc0 og dpc8 og udspiling af maven er en god indikator for graviditet.
2. Telemetry Surgery Prep
- Brug en autoklave til at sterilisere instrumenter, gaze, vatpinde, kirurgiske forhæng, og pipettespidser indenfor 24 timer før operation.
- Ren kirurgi overflade med 70% ethanol.
- Tænd varmepude (specialiseret til gnavere) og perle sterilisator.
3. Telemetry Surgery
- For anæstesi bruge 4-5% isofluran med en oxygen strømningshastighed på 1-2 l / min.
- Vent, indtil musen viser tegn på bedøvelse og derefter injicere subkutant med buprenorphin (smertestillende: 0,1 ml pr 20 g).
- Barber maven af musen fra bunden af ribberne ned til blæren.
- Bring musen til operationen tabellen på forvarmet varmepude, og dække musens øjne med oftalmisk salve for at forhindre udtørring.
- Begynd steril teknik. Tag sterile handsker og holde indpakningen som en steril overflade at placere jod og ethanol scrubs.
- Fjern telemeter fra pakken eller saltvand, og brug steril pincet til at placere den på steril gaze.
- Brug sprøjten (leveres af telemeter leverandør) at fylde kateterspidsen med gel. Forsigtigt presse kateteret skabe nok undertryk til at trække gelen ind i kateteret.
- Placer en steril spids på pipetten. Pipetter 2 ul af kirurgisk lim og sæt pipetten på en steril overflade.
- For at rense det kirurgiske sted, svaber området med jod og derefter med 70% ethanol.
- Skær et hul i kirurgiske afdækningsstykke lige stor nokfor området behov for snittet og sted over musen.
- Udfør en fod knivspids (pedal respons) for at sikre, at musen er helt bedøvet før et snit.
- Lav en lille lodret midtlinjeincision. Dernæst skal en tilsvarende snit gennem den underliggende kropsvæg muskel.
- Træk forsigtigt livmoderen ud af kroppen hulrum og find livmoderhorn indeholder de fleste hvalpe, der er levedygtige.
- Valgfrit - For tilsætning af miRNA, injicere viral vektor i muskel lag af livmoderen før indsættelse af telemeter.
- Lav et lille snit på spidsen af uterushornet med 3 mm forkant foråret saks.
- Tråd kateteret, uden at klemme mellem livmodervæggen og føtale sække. Sæt kateteret forbi flere sække til at reducere sin utilsigtet fjernelse. Sørg for, at føtale sække ikke forstyrres af indsættelsen.
- Pipette kirurgisk lim til stedet for telemeter insertion at klæbe kateteret til uterine horn og forhindre kateteret i at glide ud af uterine horn. Vent et par sekunder for limen at blive stive, og derefter forsigtigt placere livmoderen tilbage inde i kroppen hulrum.
- Placer telemeter i kroppen hulrum på den modsatte side af kateteret insertion site.
- Suturere legemshulrum lukket med 6,0 absorberbare suturer. Først gør en pung søm og derefter 3-4 individuelle sting.
- Suturere huden ved anvendelse af den samme teknik, men med 6-0 ikke-absorberbar sutur.
- Swab dibucain (aktuel smertestillende) salve over incisionssted.
- Injicer 0,3-0,4 ml sterilt saltvand subkutant at hjælpe rehydrere dyret.
- Overvåg dyret efter operationen, indtil det er helt vågen. Placer ikke musen tilbage i sit bur, indtil den er i stand til frit at holde hovedet over bordet som visse typer strøelse kan kvæle et stærkt bedøvede mus. For en mus, der er blevet bedøvet i 30-45 min, bør man forvente the musen for at være helt vågen ved 1 time og 15 min.
- Hvis der udføres yderligere indgreb, tørre instrumenter med 70% ethanol og perle sterilisere før genbrug.
4. Post-kirurgi Recovery
- Overvåg daglig post-kirurgi fremskridt i en log. Butik vægtøgning og tab og se til sløvhed, blødning eller ufuldstændig lukning af det kirurgiske snit.
- Før musen blødgjort musefoder (~ sammenhæng i æblemos) eller specialiserede opsving kost mad.
- Undersøg suturer og sørg for at de ikke trukket ud, men prøv ikke at håndtere musen for meget.
5. Telemetri Optagelse
- På dagen for renter (mindst en to til tre dage efter, at musen har genvundet fra kirurgi), placere en magnet i nærheden af musen til at tænde for telemeter. Sæt musebur på modtageren. Lyset på modtageren skal tænde, hvis telemeter er aktiveret.
- Kalibrer splinterny Teleme TERS med fabrikantens specifikke kalibreringer forudsat. Genbruges Telemeter kalibrering specifikationer vil blive holdt i software.
- Inden for software, starter optagelsen ved at højreklikke på "dyr", og klik på "start prøveudtagning, kontinuerlig", som giver mulighed for prøveudtagning på hastigheder på op til 500 Hz. Sørg for, at softwaren er indstillet til at gemme og spore.
BEMÆRK: Når ikonet prøvetagning mus bliver grønt, er presset bliver optaget. Foruroligende musen under fødslen kan afbryde eller ændre arbejdskraft, så observere forsigtigt. - Efter levering eller tidsperiode af interesse, stoppe optagelsen ved at højreklikke på "dyr" og vælge "stop optagelser, alle". Brug en magnet til at slukke telemeter at spare på batteriet, da telemeter batteri typisk kun vare i 1,5 måneder af kontinuerlig optagelse.
- Aflive musen ved CO 2 overdosis og inddrive telemeter. Hvalpe bliver aflivet ved halshugning.
- Placer telemeter i en opløsning af 1% enzym detergent i deioniseret vand natten over ved stuetemperatur.
- Skyl telemeter i deioniseret vand og fjern alt væv og lim, og pas på ikke at presse kateteret.
- Inkubér telemeter i 2% glutaraldehyd i 24 timer ved stuetemperatur for at sterilisere.
- Skyl telemeter med sterilt saltvand og gemme det i sterilt saltvand til næste implantation eller sendes tilbage til producenten for at blive renoveret. Afstandsmålere skal være renoveret, hvis væv er placeret inde i kateteret efter sterilisering. Typisk afstandsmålere kan bruges 4-5 gange, før det skal renoveret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Real-tid in vivo intrauterine tryk kan registreres ved hjælp af en telemetrisk erhvervelse system. Pres prøveudtagning parret med samtidig videooptagelse af musen blev brugt til at fange det nøjagtige tidspunkt for hver hvalp leverance og korrelere leveringstid til den intrauterine tryk af moderen. Alle datapunkter kan derefter plottes hele optagelsen til at generere et tryk-versus-tid plot (figur 1A). Dette plot viser de punkter i drægtighedsperioden når intrauterine tryk ændringer samt forskellen i trykket mellem mørke og lyse cyklusser. Derudover kan et glidende gennemsnit af den intrauterine tryk plottes (figur 1B). Dette er nyttigt til lettere visualisere vedvarende stigninger i intrauterine tryk karakteristisk for sammentrækninger forbundet med arbejdsprocessen (optagelser opnået under fødslen er blevet offentliggjort tidligere 9).
Data kan analyseres yderligere ved at eksportere datapunkter til analysesoftware og gennemsnit af data over det tidsrum af interesse. Når man sammenligner forskellige eksperimentelle betingelser, såsom vildtype versus transgene mus, hver dag eller time pres fra forskellige mus kan gennemsnit at undersøge kontraktile mønstre afhængig af genet af interesse. Derudover kan den statistiske signifikans af eventuelle forskelle bestemmes. Intrauterine tryk kan undersøges under fødslen, eller kan udføres en langsgående undersøgelse for at undersøge hele gestational periode under forskellige betingelser.
Intrauterin telemetri kan anvendes til at teste in vivo respons på farmakologiske midler under graviditet. Konkret denne metode giver mulighed for tidlig test stof før kliniske forsøg. Forskelle i reaktion på specifikke midler kan testes i transgene mus, såvel som i ikke-gravide eller drægtige mus. En specifik farmakologisk middel kendt for at øge uterine sammentrækning, oxytocin, kan leveres subkutant som tidligere beskrevet i en rottemodel 10. Den telemeter kan implanteres på samme tid som en mikro-osmotisk pumpe til at levere en konstant hastighed af oxytocin. Forskelle i optagelser mellem ikke-gravid (figur 2A) og gravid (figur 2B) mus med administration af oxytocin kan også undersøges.
En anden potentiel anvendelse af intrauterin telemetri ser på uteruskontraktioner efter miRNA / shRNA nedregulering af proteiner. Musemodeller er ikke tilgængelige for alle gener, der er afgørende for fødslen. Således kan gendæmpning i kombination med intrauterine tryk målinger anvendes til at undersøge proteiner af interesse. Ved at indsprøjte miRNA-udtrykkende lentivirale vektorer i myometrium under implantation af telemeter kan uterin-specifik knockdown af et gen af interesse undersøges, som det ses i figur 3A. En nylig undersøgelse viseret konkret eksempel viser, at det Kir7.1 kanal har en vigtig rolle i inaktiv uterus efter brug både miRNA og telemetri til at undersøge ændringer i intrauterine tryk i hele drægtighedsperioden 11. Repræsentative kurver scrambled miRNA (figur 3A) eller Kir7.1 miRNA (figur 3B) viser, at vælte ekspression af kaliumkanalen Kir7.1 forårsaget intrauterine tryk til at stige. Disse repræsentative kurver svarer til, hvad der ses i transgene musemodeller som tidligere beskrevet 9.
Figur 1: Repræsentant kontinuerlig intrauterine tryk optagelse (A) i realtid intrauterine tryk registreret i vivo uafbrudt i fire dage (15-19 DPC).. (B) Flytning i (A) gennemsnit af data hver time. WhITE og sorte bjælker øverst optagelser angiver 12 timers lys og mørke cyklus, hhv. (C) en indzoomet spor af mus in vivo individuelle sammentrækninger. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2: intrauterin tryk som reaktion på oxytocin Repræsentative kurver af intrauterine tryk fra ikke-gravid (NP) myometrium (A) og sen gravid (18 DPC) myometrium (B) udsættes for 5 enheder / dag af oxytocin i 24 timer viser stigninger. i tryk i slutningen af gravide versus NP-mus. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: Måling af det intrauterine tryk efter silencing af en kaliumkanal af miRNA / shRNA (A) Skematisk af placeringen af telemeter og injektionsstederne af miRNA-udtrykkende lentivirus.. Nylige undersøgelser har vist de repræsentative tracings af intrauterine tryk fra myometrium transduceret med (B) krypteret miRNA eller (C) Kir7.1 miRNA. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelser af myometrielle kontraktilitet har påberåbt sig ex vivo målinger af muskelspændinger. Denne metode kan være nyttigt for den tidlige fase af nyudviklede uterotoniske stoffer, der ikke kan administreres til levende dyr. Der er imidlertid behov in vivo metoder til længderetningen forstå progressionen af arbejdskraft. In vivo målinger tjener flere formål. Først de muliggør opsamling af et fuldstændigt billede af ændringer i uterus kontraktile mønster over varigheden af graviditeten. For det andet eliminerer forspændingen af ex vivo optagelser, der kræver uterusvæv skal monteres enten lodret eller vandret, begrænser vores forståelse af den komplette rolle cirkulære og langsgående muskel lag af livmoderen. Tredje, de tillader registrering af uterin trykket i den endogene hormonale miljø, hvilket gør det muligt mere præcist at studere fødslen i musemodeller. Endelig de giver mulighed for mere translational undersøgelser mellem musemodeller og mennesker som uterin telemetri mere ligner målinger i gravide kvinder med intrauterine tryk katetre.
Metoderne til mus uterin telemetri er nemme at lære, men svært at mestre. Efterforskere med tidligere mus kirurgi erfaring kan opnå succes hurtigere, men dette bør ikke afskrække labs fra at bruge denne værdifulde teknik. De oprindelige undersøgelser med anvendelse af mus uterin telemetri blev udført af en novice med stor succes efter et par forsøg, så labs bør være forberedt på de første par operationer til at forårsage dæmningen til at miste alle fostre. Her er et par pointers at huske på. Som med enhver operation, den korteste varighed er det bedste for dyret. En hurtig operation vil begrænse dehydrering og behovet for yderligere doser af anæstesi. Hvis forskeren har en vanskelig tid efterbehandling retsforhandlingerne musen vågner, kan isofluran bruges til at holde musen anesthetized længere. Vi har også fundet, at anvendelsen af isofluran øger antallet af levedygtige hvalpe og foretrækkes frem ketamin. Den mindst mulige indsnit blot lidt større end selve telemeter vil mindske risikoen for såret gabende senere, mindske nødvendige tid til sutur og forbedre mus genopretning. Med en lille abdominal incision, vil trække livmoderen uden for kroppen hulrum muliggøre bedre synlighed under kateteret. Når genbruge en afstandsmåler, faktor i den foregående kurve af katetret, når skrue den ned uterine horn. Tillade den kirurgiske lim til at hærde fuldstændigt før placere uterushornet tilbage inde i kroppen hulrum vil hjælpe med at holde kateteret på plads og forhindre limen i at klæbe til tarmene. Det telemeter krop kan skade leveren hvis de placeres for højt, og musens mave er i stand til at udvide meget, så tøv ikke med at placere telemeter lavere i kroppen. Disse fremgangsmåder skal tilpasses to passer til behovene i forskellige laboratorier og forskellige musemodeller, men fordelene ved uterin telemetri langt opvejer forhindringer.
Der er nogle begrænsninger, der bør overvejes i forbindelse med gennemførelsen af denne metode. En af de største udfordringer, der skal overvindes, er graden af fostertab efter implantation af senderen. I intrauterine telemetri oprindelige rapport 9, havde alle transgene SK3 T / T og vildtypemus vis grad af fostertab i den ene eller begge uterine horn uanset om at horn blev valgt til telemeter placering. Optimering af valget af dagen under graviditeten, hvor telemeter blev kirurgisk indsat forbedret vores sats af succesfulde sigt graviditeter, men en komplet supplement af unger blev aldrig opnået. Især den optimale operationsdagen for SK3 T / T-mus adskilte sig fra i vildtype, med bedre reproduktive resultater noteret på dpc12-13 for SK3 T / T-mus versus dpc8-9 for WT mus, suggebrod, at kirurgi kan protokollen skal ændres for hver musemodel af interesse. Vores data viste, at antallet af unger født ikke korrelerer med samlet intrauterine tryk. Føtal resultater blev bedre med forbedrede kirurgiske færdigheder ved forsøgslederen, og andre, der har implementeret denne metode i deres laboratorium har bemærket, at føtale resultater forbedret med brugen af isofluran stedet for ketamin. Det forventes, at efterhånden som flere laboratorier anvender denne metode, vil senderen teknologi og intrauterin analyse software bliver mere raffineret. Det vil uden tvivl fremme nytten af denne teknologi i studier af de mekanismer, der bidrager til arbejdskraft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Glue | 3M Vetbond | 1469SB | Tissue Adhesive--stored in Drierite |
| Absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | J212H | Vicryl |
| Non-absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | 8706H | Prolene |
| Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymer | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | Specialized for rodents |
| Bead sterilizer | Keller | Z378577 | Steri 250 Sterilizer |
| Disecting Microscope | Nikon | SMZ754 | Fibre optic gooseneck external light source |
| Sterile Surgical Gloves--Latex | Cardinal Health Triflex | 2D7253 | |
| PhysioTel PA-C10 Pressure Transmitter | Data Sciences International | 270-0135-001 | TA11PA-C10 |
| Telemeter Reciever | Data Sciences International | 272-6001-001 | RPC-1 |
| Dataquest ART 4.3.2 Analysis Platinum | Data Sciences International | 271-0147-141 | Analysis software |
| Diet Recovery Gel | Clear H2O | 72-01-5022 | Purified Soft Diet for Rodents |
| Tergazyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme detergent |
References
- Slattery, M. M., Morrison, J. J. Preterm delivery. Lancet. 360, 1489-1497 (2002).
- Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371, 75-84 (2008).
- Keelan, J. A. Pharmacological inhibition of inflammatory pathways for the prevention of preterm birth. Journal Of Reproductive Immunology. 88, 176-184 (2011).
- Voltolini, C., et al. Understanding spontaneous preterm birth: from underlying mechanisms to predictive and preventive interventions. Reproductive Sciences. 20, 1274-1292 (2013).
- Ratajczak, C. K., Muglia, L. J. Insights into parturition biology from genetically altered mice. Pediatric research. 64, 581-589 (2008).
- Rajakumar, A., et al. Placental HIF-1 alpha, HIF-2 alpha, membrane and soluble VEGF receptor-1 proteins are not increased in normotensive pregnancies complicated by late-onset intrauterine growth restriction. American Journal Of Physiology. Regulatory, Integrative And Comparative Physiology. 293, (2007).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American journal of physiology. Heart And Circulatory Physiology. 286, H2408-H2415 (2004).
- Mackay, L. B., Shi, L. B., Maul, H. ., Maner, W. L., Garfield, R. E. The effect of bilateral pelvic neurectomy on cervical ripening in pregnant rats. Journal Of Perinatal Medicine. 37, 263-269 (2009).
- Pierce, S. L., Kutschke, W., Cabeza, R., England, S. K. In vivo measurement of intrauterine pressure by telemetry: a new approach for studying parturition in mouse models. Physiol Genomics. 42, 310-316 (2010).
- Imamura, T., Luedke, C. E., Vogt, S. K., Muglia, L. J. Oxytocin modulates the onset of murine parturition by competing ovarian and uterine effects. American Journal Of Physiology. Regulatory, Integrative And Comparative Physiology. 279, R1061-R1067 (2000).
- McCloskey, C., et al. The inwardly rectifying K+ channel KIR7.1 controls uterine excitability throughout pregnancy. EMBO Mol Med. 6 (9), 1161-1174 (2014).
