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Medicine

Telemetria intrauterina misurare mouse contrattile Pressione Published: April 6, 2015 doi: 10.3791/52541

Abstract

È necessaria una complessa integrazione dei segnali molecolari ed elettriche per trasformare un utero quiescente in un organo contrattile alla fine della gravidanza. Nonostante la scoperta dei regolatori chiave della contrattilità uterina, questo processo non è ancora pienamente compreso. Topi transgenici forniscono un modello ideale in cui studiare il parto. In precedenza, l'unico metodo per studiare contrattilità uterina nel topo era ex vivo registrazioni tensione isometrica, che sono non ottimale per diverse ragioni. L'utero deve essere rimossa dal suo ambiente fisiologico, un corso di tempo limitato di indagine è possibile, e topi deve essere sacrificato. Il recente sviluppo di telemetria radiometrica ha permesso longitudinali, misure in tempo reale di in vivo pressione intrauterina nei topi. Qui, l'impianto di un telemetro intrauterina per misurare le variazioni di pressione in utero del mouse da metà della gravidanza fino al parto è descritto. Con differenze confronto a stampaUres tra wild type e topi transgenici, l'impatto fisiologico di un gene di interesse possono essere chiarite. Questa tecnica dovrebbe accelerare lo sviluppo di terapie usati per trattare disturbi miometriale durante la gravidanza, tra cui parto pretermine.

Introduction

Nascita pretermine è la principale causa di morbilità e mortalità nei paesi sviluppati perinatale; è responsabile del 50% di morbilità perinatale e il 75% di 1,2 mortalità perinatale. Parto pretermine è multiforme e può essere idiopatica. Anche se gran parte della ricerca è emerso sui percorsi molecolari ed elettrici trasformando miometrio da un tessuto quiescente in un contrattile una, la fisiopatologia esatto di parto pretermine rimane elusiva. Endocrine, infiammatorie, e regolazione genica sono stati collegati al parto pretermine 3,4. Tuttavia, le preoccupazioni etiche limitano la capacità di condurre una ricerca sui meccanismi di parto pretermine negli esseri umani.

Date queste limitazioni, molti ricercatori si sono rivolti a topi come sistema modello con cui studiare la fisiologia del parto. I topi hanno brevi gestazioni durata circa tre settimane e può essere facilmente manipolato geneticamente. Inoltre, più modelli genetici di topo hannostato sviluppato per determinare le vie di segnalazione che sono essenziali per il lavoro 5. Nonostante le differenze principali tra il mouse e il parto umano, i topi e gli esseri umani condividono molti degli stessi meccanismi che sono essenziali per il lavoro, tra cui l'infiammazione e infezione intrauterina 6. Così, i topi servire come uno strumento prezioso per l'esame dell'attività uterina. Ad oggi, il gold standard per misurare la contrattilità uterina nei topi è stato ex vivo registrazioni tensione isometrica; Tuttavia, questo è limitato ad un punto di tempo gestazionale per esperimento e richiede la rimozione dell'utero dal suo ambiente fisiologico. Un altro fattore importante è il numero di animali necessari per queste indagini. Infine, questa metodologia non consente studi longitudinali che esaminano l'induzione del travaglio pretermine e fisiopatologia.

I recenti progressi compiuti in dispositivi di telemetria radiometriche utilizzate per studiare la pressione arteriosa modifiche 7 nei topi e intpressione rauterine in ratti 8 pregò la questione se la stessa tecnologia potrebbe essere utilizzata per studiare variazioni della pressione intrauterina nei topi durante la gravidanza. Dopo la risoluzione dei problemi iniziali, un metodo è stato sviluppato con successo per misurare l'induzione del lavoro e la progressione in un mouse. Questo approccio in vivo può misurare la transizione dallo stato di bassa pressione dell'utero riposo allo stato di alta pressione indicativo di contrazioni del lavoro forti. Questo metodo è stato anche in grado di rilevare le differenze di pressione significative tra topi transgenici con il parto compromessa e topi wild type, dimostrando l'impatto fisiologico dell'espressione genica 9. Questo protocollo fornisce in tempo reale, in modo vivo per studiare pressione topo uterina durante la gravidanza.

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Protocol

NOTA: Tutte le procedure sugli animali rispettato le linee guida per la cura e l'uso di animali previsti dal National Institutes of Health. Tutti i protocolli sono stati approvati dal comitato di Animal Studies presso la Washington University di St. Louis.
NOTA: i materiali specifici e attrezzature per questo protocollo sono elencati materiali e attrezzature tavola.

1. Allevamento temporizzata di topi di sesso femminile

  1. Razza femmine adulte tra due e sei mesi di età in una finestra di tempo di 2 ore con i maschi. Specific hr allevamento non sono necessari, purché siano tenuti coerente per l'intero esperimento.
  2. Confermare la gravidanza dalla presenza di un tappo di copula. Designare il giorno e ora in cui la spina è la prima volta come il giorno post-coito 0 (dpc0). Ricorda l'ora specifica in cui iniziare la registrazione di pressione.
  3. Eseguire interventi chirurgici su dpc8-13. L'esatta DPC dipenderà dal ceppo di topi.
  4. Per determinare se un mouse è incinta prima dell'intervento chirurgico, perform ecografia dell'addome con una sonda 40 MHz array lineare accoppiato ad un sistema di imaging prima di somministrare l'anestesia. Questo permetterà la visualizzazione di sacche gestazionali. Se un sistema ad ultrasuoni non è disponibile, utilizzare il peso del mouse.
    NOTA: Un aumento di peso di almeno 2 g tra dpc0 e dpc8 e distensione dell'addome è un buon indicatore di gravidanza.

2. telemetria Chirurgia Prep

  1. Utilizzare autoclave per sterilizzare gli strumenti, garze, tamponi di cotone, teli chirurgici, e punte per pipette entro 24 ore prima dell'intervento chirurgico.
  2. Superficie chirurgia Pulire con il 70% di etanolo.
  3. Accendere rilievo di riscaldamento (specializzato per roditori) e tallone sterilizzatrice.

3. telemetria Chirurgia

  1. Per l'anestesia, usare 4-5% isoflurano con un tasso di flusso di ossigeno di 1-2 l / min.
  2. Attendere fino a quando il mouse mostra segni di anestesia e poi iniettare per via sottocutanea con buprenorfina (analgesico: 0,1 ml per 20 g).
  3. Radere l'addome del mouse dal fondo delle nervature alla vescica.
  4. Portare il mouse sul tavolo operatorio in rilievo di riscaldamento pre-riscaldato, e coprire gli occhi del topo con pomata oftalmica per evitare l'essiccazione.
  5. Inizia tecnica sterile. Indossare guanti sterili e mantenere l'involucro come una superficie sterile su cui collocare le iodio e etanolo scrub.
  6. Rimuovere la telemetrica dalla confezione o soluzione salina e utilizzare pinze sterili per metterlo su garza sterile.
    1. Usare la siringa (fornita dal fornitore telemetro) per riempire la punta del catetere con il gel. Premere delicatamente il catetere creare abbastanza pressione negativa per attirare il gel nel catetere.
  7. Mettere una punta sterile sulla pipetta. Pipettare 2 ml di colla chirurgica e impostare la pipetta su una superficie sterile.
  8. Per pulire il sito chirurgico, tamponare la zona con iodio e poi con etanolo al 70%.
  9. Tagliare un foro nella pellicola chirurgica appena sufficienteper l'area necessaria per l'incisione e posizionare sopra il mouse.
  10. Eseguire un pizzico piede (risposta del pedale) per assicurare il mouse è completamente anestetizzato prima di fare un'incisione.
  11. Fai una piccola incisione verticale mediana. Avanti, fare un'incisione simile attraverso il muscolo parete del corpo di fondo.
  12. Estrarre delicatamente l'utero fuori della cavità del corpo e individuare il corno uterino che contiene la maggior parte dei cuccioli che sono vitali.
    1. Opzionale - Per l'aggiunta di miRNA, iniettare vettore virale in strato muscolare dell'utero prima dell'inserimento del telemetro.
  13. Fai una piccola incisione sulla punta del corno uterino 3 mm taglio forbici primavera bordo.
  14. Infilare il catetere, senza stringere, tra la parete uterina e sacche fetali. Inserire il catetere passato diverse sacche di ridurre la sua rimozione accidentale. Assicurarsi che le sacche fetali non sono disturbati con l'inserimento.
  15. Pipettare la colla chirurgica al sito di inserimento telemetro per aderire il catetere alla ucorno terine e prevenire il catetere di scivolare fuori del corno uterino. Attendere qualche secondo per la colla a diventare rigido, e quindi posizionare con cura l'utero indietro all'interno della cavità del corpo.
  16. Posizionare il telemetro nella cavità del corpo sul lato opposto del sito di inserimento del catetere.
  17. Suturare la cavità del corpo chiuso con 6,0 punti di sutura riassorbibili. In primo luogo, fare un punto borsa e poi 3-4 singoli punti.
  18. Suturare la pelle utilizzando la stessa tecnica, ma con 6-0 sutura non assorbibile.
  19. Tampone dibucaina (analgesico topico) pomata sul sito di incisione.
  20. Iniettare ,3-0,4 ml di soluzione fisiologica sterile per via sottocutanea per aiutare reidratare l'animale.
  21. Monitorare l'animale dopo l'intervento fino a quando non è completamente sveglio. Non posizionare il mouse di nuovo nella sua gabbia fino a quando è in grado di tenere libera la testa sopra il tavolo, come alcuni tipi di biancheria da letto possono soffocare un mouse molto anestetizzato. Per un mouse che è stato anestetizzato per 30-45 minuti, ci si dovrebbe aspettare the il mouse per essere completamente sveglio da 1 ora e 15 min.
  22. Se si esegue ulteriori interventi chirurgici, pulire gli strumenti con il 70% di etanolo e tallone sterilizzare prima di riutilizzarli.

4. Post-chirurgia Recovery

  1. Monitorare quotidianamente i progressi post-chirurgico in un registro. Catalogo aumento di peso e la perdita e guardare per letargia, sanguinamento, o la chiusura incompleta della incisione chirurgica.
    1. Feed the Mouse ammorbidito del mouse chow (~ la consistenza di mele) o cibo specializzato dieta di recupero.
    2. Esaminare le suture e assicurarsi che non sono tirati fuori, ma cercate di non gestire il mouse eccessivamente.

5. telemetria Recording

  1. Il giorno di interesse (almeno due o tre giorni dopo il mouse ha recuperato da un intervento chirurgico), posizionare un magnete vicino al mouse per accendere il telemetro. Posizionare la gabbia del mouse sul ricevitore. La luce sul ricevitore dovrebbe accendersi se è attivata la telemetrica.
  2. Calibrare nuovo di zecca Teleme TERS con tarature specifiche produttore forniti. Specifiche calibrazione telemetro riutilizzati saranno tenuti in software.
  3. All'interno del software, avviare la registrazione facendo clic destro su "animale" e fare clic su "avviare il campionamento, continua," che permette il campionamento a velocità fino a 500 Hz. Assicurarsi che il software sia impostato per salvare e risalire.
    NOTA: Quando l'icona del mouse campionamento diventa verde, le pressioni vengono registrate. Inquietante il mouse durante la consegna può interrompere o alterare il lavoro, in modo da osservare con cautela.
  4. Dopo la consegna o il tempo periodo di interesse, interrompere la registrazione facendo clic destro su "animale" e selezionando "fermare le registrazioni, tutto". Utilizzare un magnete per disattivare telemetro per salvare la vita della batteria, in quanto la batteria telemetro in genere dura solo per 1,5 mesi di registrazione continua.
  5. Euthanize il mouse da CO 2 overdose e recuperare telemetro. Pups sono sacrificati per decapitazione.
tle "> 6. Telemeter Sterilizzazione

  1. Posizionare il telemetro in una soluzione di 1% di detergente enzimatico in una notte acqua deionizzata a temperatura ambiente.
  2. Sciacquare il telemetro in acqua deionizzata e rimuovere il tessuto e colla, facendo attenzione a non comprimere il catetere.
  3. Incubare telemetro a 2% glutaraldeide per 24 ore a temperatura ambiente per sterilizzare.
  4. Sciacquare il telemetro con soluzione salina sterile e conservarla in soluzione fisiologica sterile fino al prossimo impianto o da inviare al costruttore di essere ristrutturato. Telemetri dovrebbero essere rinnovate, se il tessuto si trova all'interno del catetere dopo la sterilizzazione. Tipicamente telemetri può essere utilizzato 4-5 volte prima di dover essere rinnovato.

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Representative Results

Tempo reale pressioni intrauterini vivo può essere registrato utilizzando un sistema di acquisizione telemetrico. Campionamento di pressione in coppia con registrazione video simultanea del mouse è stato usato per catturare il tempo della consegna esatto di ogni cucciolo e correlare i tempi di consegna per la pressione intrauterina della madre. Tutti i punti di dati possono essere tracciati durante la registrazione per generare una pressione-versus-plot tempo (Figura 1A). Questo grafico mostra i punti durante la gestazione quando la pressione intrauterini nonché la differenza di pressione tra i cicli chiari e scuri. Inoltre, una media mobile della pressione intrauterina può essere tracciata (Figura 1B). Ciò è utile per visualizzare più facilmente aumenti sostenuti in caratteristica pressione intrauterina delle contrazioni associati al processo di lavoro (registrazioni ottenuti durante la consegna sono stati pubblicati in precedenza 9).

I dati possono essere ulteriormente analizzati esportando punti dati al software di analisi e la media dei dati nel periodo di tempo di interesse. Quando si confrontano diverse condizioni sperimentali, come il tipo selvaggio contro topi transgenici, quotidiani o pressioni orari di diversi topi possono essere media per esaminare i modelli contrattili dipendenti dal gene di interesse. Inoltre, la significatività statistica delle differenze può essere determinato. Pressioni intrauterini possono essere esaminati durante la consegna, o uno studio longitudinale possono essere condotte per esaminare l'intero periodo gestazionale in condizioni diverse.

Telemetria intrauterina può essere utilizzato per testare in vivo risposte agli agenti farmacologici durante la gravidanza. In particolare, questo metodo consente di primi test di droga prima di sperimentazioni cliniche. Le differenze nella risposta ad agenti specifici possono essere testati in topi transgenici, così come nei topi non gravide o gravidanza. Un agente farmacologico specifico noto per aumentare uterine contrazione, ossitocina, può essere fornito per via sottocutanea come precedentemente descritto in un modello di ratto 10. Il telemetro può essere impiantato allo stesso tempo come una pompa micro-osmotica per fornire un tasso costante di ossitocina. Le differenze di registrazioni tra non-gravidanza (Figura 2A) e in stato di gravidanza (Figura 2B) topi con la somministrazione di ossitocina può anche essere esaminate.

Un'altra potenziale applicazione della telemetria intrauterina sta guardando le contrazioni uterine dopo miRNA / shRNA silenziamento di proteine. Modelli murini non sono disponibili per tutti i geni che sono essenziali per il parto. Così, silenziamento genico in combinazione con misure di pressione intrauterini può essere usato per studiare le proteine ​​di interesse. Iniettando miRNA-esprimono vettori lentivirali nel miometrio durante l'impianto del telemetro, knockdown specifico uterina di un gene di interesse può essere esaminato, come si vede nella Figura 3A. Un recente studio mostraun esempio specifico dimostrare che il canale Kir7.1 ha un ruolo importante in quiescenza uterina dopo utilizzando sia miRNA e telemetria per esaminare modifiche pressione intrauterina durante la gestazione 11. Tracciati rappresentativi di scrambled miRNA (Figura 3A) o Kir7.1 miRNA (Figura 3B) dimostrano che abbattere l'espressione del canale del potassio Kir7.1 causato pressione intrauterina ad aumentare. Questi tracciati rappresentativi sono simili a quanto visto in modelli di topi transgenici come precedentemente descritto 9.

Figura 1
Figura 1: registrazione della pressione intrauterina continua Rappresentante (A) in tempo reale i dati di pressione intrauterino registrati in vivo ininterrottamente per quattro giorni (15-19 DPC).. (B) Moving media oraria di dati in (A). Whbarre ITE e nere in cima registrazioni indicano 12 cicli di luce hr e scure, rispettivamente. (C) A ingrandita traccia di topo in vivo singoli contrazioni. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: pressioni intrauterini in risposta ad ossitocina tracciati rappresentativi di pressione intrauterino da non gravide (NP) miometrio (A) e tardiva di gravidanza (18 DPC) miometrio (B) esposta a 5 unità / giorno di ossitocina per 24 hr spettacolo aumenta. in pressione nel tardo gravidanza contro topi NP. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: La misurazione della pressione intrauterina dopo silenziamento di un canale del potassio da miRNA / shRNA (A) Schema del collocamento di telemetro e siti di iniezione di lentivirus miRNA-esprimono.. Recenti studi hanno dimostrato i tracciati rappresentativi della pressione intrauterina da myometrium trasdotte con (B) strapazzate o miRNA (C) Kir7.1 miRNA. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Le indagini della contrattilità miometriale hanno invocato ex vivo misurazioni di tensione muscolare. Questa metodologia può essere utile per i test in fase precoce di farmaci uterotonico nuovo sviluppo che non possono essere somministrati agli animali vivi. Tuttavia, gli approcci in vivo sono necessari per comprendere longitudinalmente la progressione del lavoro. Le misurazioni in vivo servono diversi scopi. In primo luogo, essi consentono cattura di un quadro completo delle variazioni uterina contrattile modello sulla durata della gravidanza. In secondo luogo, eliminano il bias di ex registrazioni vivo che richiedono tessuto uterino per essere montato sia in verticale che in orizzontale, limitando la nostra comprensione del ruolo completa dello strato muscolare circolare e longitudinale dell'utero. In terzo luogo, essi consentono la registrazione della pressione uterina nell'ambiente ormonale endogena, rendendo così possibile studiare più accuratamente parto in modelli murini. Infine, essi consentono più trindagini anslational tra modelli di topo e nell'uomo come uterino telemetria assomiglia più da vicino le misure adottate in donne in gravidanza con cateteri a pressione intrauterina.

I metodi per il mouse uterina telemetria sono facili da imparare, ma difficile da padroneggiare. Gli investigatori, con precedenti esperienze di chirurgia del mouse possono raggiungere il successo più veloce, ma questo non deve scoraggiare i laboratori di utilizzare questa tecnica preziosa. Gli studi originali utilizzando il mouse uterina telemetria sono stati fatti da un debuttante con grande successo, dopo alcuni tentativi, così i laboratori dovrebbero essere preparati per il primo paio di interventi chirurgici per causare la diga di perdere tutti i feti. Qui ci sono alcune indicazioni da tenere a mente. Come con qualsiasi intervento chirurgico, la durata più breve è la migliore per l'animale. Un intervento chirurgico rapido limiterà la disidratazione e la necessità di ulteriori dosi di anestesia. Se il ricercatore sta avendo un momento difficile finire il procedimento dinanzi il mouse si sveglia, isoflurano può essere utilizzato per mantenere il anesthetiz del mousecato più. Abbiamo anche scoperto che l'uso di isoflurano aumenta il numero di cuccioli vitali ed è preferito rispetto ketamina. L'incisione più piccolo possibile, solo leggermente più grande rispetto al corpo del telemetro, ridurrà la probabilità della ferita in seguito, diminuire il tempo necessario per sutura, e migliorare il recupero del mouse. Con una piccola incisione addominale, tirando l'utero di fuori della cavità del corpo consentirà una migliore visibilità durante l'inserimento del catetere. Quando riutilizzare un telemetro, fattore di curva precedente del catetere quando si infila giù corno uterino. Permettere la colla chirurgica per indurire completamente prima di mettere il corno uterino indietro all'interno della cavità del corpo contribuirà a mantenere il catetere in posizione e impedire che la colla si attacchi agli intestini. Il corpo del telemetro può danneggiare il fegato se posizionato troppo in alto, e l'addome del mouse è in grado di espandere ampiamente, quindi non esitate a mettere il telemetro inferiore nel corpo. Questi metodi dovranno essere personalizzato to soddisfare le esigenze dei diversi laboratori e diversi modelli di mouse, ma i vantaggi di uterina telemetria superano di gran lunga gli ostacoli.

Ci sono alcune limitazioni che dovrebbero essere considerati in sede di attuazione di questa metodologia. Uno dei principali problemi che devono essere superati è il grado di perdita fetale dopo l'impianto del trasmettitore. Nella relazione iniziale telemetria intrauterina 9, tutti SK3 T / T e wild type topi transgenici hanno avuto un certo grado di perdita fetale in una o entrambe le corna uterine, indipendentemente se quel corno è stato scelto per il posizionamento del telemetro. Ottimizzazione della scelta del giorno durante la gravidanza, quando il telemetro è stato inserito chirurgicamente migliorato il nostro tasso di gravidanze riuscite termine, ma una serie completa di cuccioli è stato mai ottenuto. In particolare, il giorno ottimale di un intervento chirurgico per SK3 T / T topi diverso da quello in wild type, con migliori esiti riproduttivi notato a dpc12-13 per topi SK3 T / T contro dpc8-9 per WT topi, suggepungiglione che il protocollo chirurgico potrebbe essere necessario modificare per ogni modello murino di interesse. I nostri dati indicano che il numero di cuccioli birthed non correlava con la pressione intrauterina generale. Esiti fetali hanno migliorato con miglioramento delle competenze chirurgiche da parte dello sperimentatore, e altri che hanno attuato questa metodologia nel loro laboratorio hanno notato che gli esiti fetali migliorata con l'uso di isoflurano invece di ketamina. Si prevede che, come più laboratori utilizzano questa metodologia, la tecnologia trasmettitore e software di analisi intrauterina diventeranno più raffinata. Questo senza dubbio avanzare l'utilità di questa tecnologia in studi dei meccanismi che contribuiscono al lavoro.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Glue 3M Vetbond 1469SB Tissue Adhesive--stored in Drierite
Absorbable 6-0 Sutures Ethicon J212H Vicryl
Non-absorbable 6-0 Sutures Ethicon 8706H Prolene
Water Jacket Blanket + Heating Pad Gaymer T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC Specialized for rodents
Bead sterilizer Keller Z378577 Steri 250 Sterilizer
Disecting Microscope Nikon SMZ754 Fibre optic gooseneck external light source
Sterile Surgical Gloves--Latex  Cardinal Health Triflex 2D7253
PhysioTel PA-C10 Pressure Transmitter  Data Sciences International 270-0135-001 TA11PA-C10
Telemeter Reciever  Data Sciences International 272-6001-001 RPC-1
Dataquest ART 4.3.2 Analysis Platinum  Data Sciences International 271-0147-141 Analysis software
Diet Recovery Gel Clear H2O 72-01-5022 Purified Soft Diet for Rodents
Tergazyme Sigma-Aldrich Z273287 Enzyme detergent

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References

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Medicina pressione intrauterina la telemetria la gravidanza il mouse utero, parto pretermine riproduttiva
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Rada, C. C., Pierce, S. L.,More

Rada, C. C., Pierce, S. L., Grotegut, C. A., England, S. K. Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo. J. Vis. Exp. (98), e52541, doi:10.3791/52541 (2015).

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