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Medicine

Télémétrie intra-utérine mesurer souris contractile pression doi: 10.3791/52541 Published: April 6, 2015

Abstract

Une intégration complexe des signaux moléculaires et électriques est nécessaire pour transformer une matrice de repos dans un organe contractile à la fin de la grossesse. Malgré la découverte de régulateurs clés de la contractilité utérine, ce processus ne est pas encore entièrement compris. Les souris transgéniques offrent un modèle idéal pour étudier la parturition. Auparavant, la seule méthode pour étudier la contractilité utérine chez la souris était ex vivo des enregistrements de tension isométrique, qui sont sous-optimaux pour plusieurs raisons. L'utérus doit être retiré de son environnement physiologique, un cours d'une durée limitée de l'enquête est possible, et les souris doit être sacrifié. Le développement récent de la télémétrie radiométrique a permis longitudinales, mesures en temps réel de la pression intra-utérin in vivo chez la souris. Ici, l'implantation intra-utérine d'un télémètre pour mesurer les changements de pression dans l'utérus de la souris à partir de la mi-gestation jusqu'à la livraison est décrite. En comparant les différences dans la pressemesu- entre le type sauvage et des souris transgéniques, l'impact physiologique d'un gène d'intérêt peuvent être élucidés. Cette technique devrait accélérer le développement de produits thérapeutiques utilisés pour traiter les troubles myométriales pendant la grossesse, y compris le travail prématuré.

Introduction

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La prématurité est la principale cause de morbidité et de mortalité dans les pays développés périnatale; il est responsable de 50% de la morbidité périnatale et 75% des 1,2 de mortalité périnatale. Le travail prématuré est multiforme et peut être idiopathique. Bien que beaucoup de recherches ont vu le jour sur les voies moléculaires et électriques transformant le myomètre partir d'un tissu de repos dans un contractile une, la physiopathologie exacte du travail prématuré reste insaisissable. Endocriniennes, inflammatoires, et la régulation des gènes ont tous été liés à travail prématuré 3,4. Toutefois, les préoccupations éthiques limitent la capacité de mener des recherches sur les mécanismes de travail prématuré chez les humains.

Compte tenu de ces limitations, de nombreux chercheurs se sont tournés vers des souris en tant que système modèle pour l'étude de la physiologie de la parturition. Les souris ont gestations courtes durée d'environ trois semaines et peuvent être facilement manipulées génétiquement. En outre, des modèles de souris génétiques multiples ontété développé pour déterminer les voies de signalisation qui sont essentiels pour le travail 5. Malgré les différences clés entre la souris et la parturition humaine, les souris et les humains partagent bon nombre des mêmes mécanismes qui sont essentiels pour le travail, y compris l'inflammation et l'infection intra-utérine de six. Ainsi, les souris servent un outil précieux pour examiner l'activité utérine. À ce jour, l'étalon-or pour mesurer la contractilité utérine chez la souris a été ex vivo enregistrements de tension isométrique; cependant, ce est limité à un point de temps gestationnel par expérience et nécessite ablation de l'utérus de son environnement physiologique. Un autre facteur important est le grand nombre d'animaux requis pour ces enquêtes. Enfin, cette méthode ne permet pas d'études longitudinales sur l'induction du travail et physiopathologie prématuré.

Les récents progrès réalisés dans les dispositifs de télémétrie radiométriques utilisées pour étudier la pression artérielle de modification se 7 chez la souris et intrauterine pression chez les rats 8 pria la question de savoir si la même technologie pourrait être utilisée pour étudier les changements dans la pression intra-utérine chez la souris pendant la grossesse. Après dépannage initial, une méthode a été développée avec succès pour mesurer l'induction du travail et la progression dans une souris. Cette approche in vivo peut mesurer la transition de l'état de l'utérus à l'état de repos indicative des contractions du travail énergiques haute pression basse pression. Cette méthode a également été en mesure de détecter des différences de pression significatives entre les souris transgéniques avec parturition compromise et souris de type sauvage, ce qui démontre l'effet physiologique de l'expression du gène 9. Ce protocole fournit en temps réel, dans la méthode in vivo pour étudier la pression de l'utérus de la souris pendant la grossesse.

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Protocol

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NOTE: Toutes les procédures d'animaux conformes aux lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux énoncées par les National Institutes of Health. Tous les protocoles ont été approuvés par le Comité des études animales de l'Université Washington à St. Louis.
REMARQUE: matériaux et équipements spécifiques pour ce protocole sont répertoriés Matériaux et table Équipement.

1. Elevage Timed de souris femelles

  1. Race femelles adultes entre deux et six mois dans une fenêtre de temps de deux heures avec les hommes. H de reproduction spécifiques ne sont pas nécessaires dans la mesure où ils sont maintenus uniforme pour la totalité de l'expérience.
  2. Confirmer la grossesse par la présence d'un bouchon de copulation. Désigner la journée et h sur laquelle le bouchon est d'abord considéré comme jour post-coït 0 (dpc0). Rappelez-vous l'heure spécifique lors du démarrage de l'enregistrement de pression.
  3. Effectuer des chirurgies sur dpc8-13. Le DPC exact dépendra de la souche de souris.
  4. Pour déterminer si une souris est enceinte avant la chirurgie, perform imagerie par ultrasons de l'abdomen avec une sonde à réseau linéaire 40 MHz couplé à un système de formation d'image avant d'administrer l'anesthésie. Cela permettra la visualisation de sacs gestationnel. Si un système à ultrasons ne est pas disponible, utiliser le poids de la souris.
    REMARQUE: Un gain de poids d'au moins 2 g entre dpc0 et dpc8 et une distension de l'abdomen est un bon indicateur de la grossesse.

2. télémétrie chirurgie Prep

  1. Utilisez un autoclave pour stériliser les instruments, de la gaze, des cotons-tiges, champs opératoires, et des embouts de pipette dans les 24 heures avant la chirurgie.
  2. Surface de la chirurgie propre avec 70% d'éthanol.
  3. Allumez coussin chauffant (spécialisée pour les rongeurs) et stérilisateur à billes.

3. Chirurgie télémétrie

  1. Pour l'anesthésie, 4-5% d'isoflurane utiliser avec un débit d'oxygène de 1 à 2 L / min.
  2. Attendez jusqu'à ce que la souris montre des signes d'anesthésie puis injecter sous-cutanée avec la buprénorphine (analgésique: 0,1 ml par 20 g).
  3. Raser l'abdomen de la souris à partir du fond des nervures vers le bas de la vessie.
  4. Apportez la souris à la table de chirurgie sur coussin chauffant préchauffé, et couvrir les yeux de la souris avec une pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement.
  5. Commencez technique stérile. Mettez des gants stériles et de garder l'emballage comme une surface stérile sur lequel placer les iode et de l'éthanol gommages.
  6. Retirer le télémètre de l'emballage ou de solution saline et d'utiliser des pinces stériles pour le placer sur une gaze stérile.
    1. Utilisez la seringue (fourni par le fournisseur de télémètre) pour remplir l'extrémité du cathéter avec du gel. Pressez doucement le cathéter créer assez de pression négative pour attirer le gel dans le cathéter.
  7. Placez une pointe stérile sur la pipette. Pipette 2 pi de colle chirurgicale et mettre la pipette sur une surface stérile.
  8. Pour nettoyer le site chirurgical, nettoyer la surface avec de l'iode, puis avec 70% d'éthanol.
  9. Découper un trou dans le drap chirurgical juste assez grandpour la zone nécessaire pour l'incision et la placer sur la souris.
  10. Effectuer une pincée de pied (réponse de la pédale) pour assurer la souris est complètement anesthésié avant de faire une incision.
  11. Faire une petite incision verticale médiane. Ensuite, faire une incision similaires à travers le muscle de la paroi du corps sous-jacent.
  12. Tirez doucement l'utérus hors de la cavité du corps et de localiser la corne utérine contenant le plus de chiots qui sont viables.
    1. Facultatif - Pour plus de miARN, injecter vecteur viral dans la couche musculaire de l'utérus avant l'insertion de télémètre.
  13. Faire une petite incision à la pointe de la corne utérine avec 3 mm avant-gardistes ciseaux à ressort.
  14. Enfiler le cathéter, sans serrer, entre la paroi utérine et sacs fœtales. Insérez le cathéter passé plusieurs sacs de réduire son retrait accidentel. Assurez-vous que les sacs fœtales ne sont pas perturbés par l'insertion.
  15. Pipeter la colle chirurgicale à l'emplacement d'insertion télémétrique pour faire adhérer le cathéter à l'ucorne terine et empêcher le cathéter de glisser hors de la corne de l'utérus. Attendez quelques secondes pour que la colle à devenir rigide, puis placer soigneusement l'utérus à l'intérieur de la cavité corporelle.
  16. Placez le télémètre dans la cavité du corps de l'autre côté du site d'insertion du cathéter.
  17. Suturer la cavité du corps fermée avec 6,0 sutures absorbables. Tout d'abord, faire un point de la bourse, puis de trois à quatre points individuels.
  18. Suturer la peau en utilisant la même technique, mais avec 6-0 suture non absorbable.
  19. Swab dibucaïne (analgésique topique) pommade sur le site de l'incision.
  20. Injecter 0,3 à 0,4 ml de solution saline stérile voie sous-cutanée pour aider à réhydrater l'animal.
  21. Surveiller l'animal après la chirurgie jusqu'à ce qu'il soit complètement réveillé. Ne placez pas la souris dans sa cage jusqu'à ce qu'il soit en mesure de tenir librement la tête hors de la table, comme certains types de litière peuvent suffoquer une souris lourdement anesthésié. Pour une souris qui a été anesthésiés pendant 30-45 min, on devrait se attendre ee souris pour être pleinement éveillé par 1 h et 15 min.
  22. Si vous effectuez des interventions chirurgicales supplémentaires, essuyez instruments avec 70% d'éthanol et perles stériliser avant de les réutiliser.

4. Publier chirurgie Recovery

  1. Surveiller les progrès quotidienne post-chirurgicale dans un journal. Catalogue gain de poids et la perte et de regarder pour la léthargie, des saignements ou une fermeture incomplète de l'incision chirurgicale.
    1. Nourrir le chow de la souris adoucie de la souris (~ la consistance de compote de pommes) ou spécialisée régime alimentaire de récupération.
    2. Examiner les sutures et se assurer qu'ils ne sont pas retirés, mais essayez de ne pas manipuler la souris trop.

5. télémétrie Enregistrement

  1. Le jour d'intérêt (au moins deux à trois jours après que la souris a récupéré de la chirurgie), placez un aimant près de la souris pour tourner sur le télémètre. Mettez la cage de la souris sur le récepteur. La lumière sur le récepteur devrait se allumer si le télémètre est activée.
  2. Calibrer Teleme nouvelle marque TER avec étalonnages spécifiques du fabricant fournies. Réutilisés télémètre spécifications d'étalonnage seront conservées dans le logiciel.
  3. Dans le logiciel, démarrer l'enregistrement en un clic droit sur "animal" et cliquez sur "commencer l'échantillonnage, continue», ce qui permet un échantillonnage à des débits allant jusqu'à 500 Hz. Assurez-vous que le logiciel est réglé pour enregistrer et retracer.
    REMARQUE: Lorsque l'icône de la souris d'échantillonnage se allume en vert, les pressions sont enregistrées. Troubler la souris pendant l'accouchement peut interrompre ou modifier le travail, afin d'observer avec prudence.
  4. Après l'accouchement ou période de temps d'intérêt, arrêtez l'enregistrement en cliquant droit sur "animal" et en sélectionnant "arrêter les enregistrements, tous". Utilisez un aimant pour éteindre télémètre pour sauver la vie de la batterie, que la batterie du télémètre sera généralement ne dure 1,5 mois d'enregistrement continu.
  5. Euthanasier la souris en CO 2 surdosage et de récupérer le télémètre. Les chiots sont euthanasiés par décapitation.
TLE "> 6. Telemeter Stérilisation

  1. Placez le télémètre à une solution de 1% de détergent enzymatique dans de l'eau désionisée pendant une nuit à température ambiante.
  2. Rincer le télémètre dans de l'eau déminéralisée et enlever tous les tissus et de la colle, en faisant attention de ne pas presser le cathéter.
  3. Incuber le télémètre à 2% de glutaraldéhyde pendant 24 heures à la température ambiante à stériliser.
  4. Rincer le télémètre avec une solution saline stérile et stocker dans une solution saline stérile jusqu'à la prochaine implantation ou être renvoyé au fabricant à être rénové. Télémètres devraient être remis à neuf si le tissu est situé à l'intérieur du cathéter après stérilisation. Typiquement télémètres peuvent être utilisés 4-5 fois avant de devoir être rénové.

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Representative Results

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En temps réel des pressions intra-utérins vivo peut être enregistrée en utilisant un système d'acquisition télémétrique. échantillonnage de pression associé à l'enregistrement simultané de la vidéo de la souris a été utilisé pour capturer l'heure exacte de la prestation de chaque chiot et corréler délai de livraison à la pression intra-utérine de la mère. Tous les points de données peuvent ensuite être tracées tout au long de l'enregistrement afin de générer une pression en fonction du temps plot (figure 1A). Ce graphique montre les points pendant la gestation, lorsque les variations de pression intra-utérine, ainsi que la différence de pression entre les cycles sombres et claires. En outre, une moyenne mobile de la pression intra-utérine peut être tracée (figure 1B). Ce est utile pour visualiser plus facilement les augmentations soutenues dans intra-utérine caractéristique de pression des contractions associées au processus du travail (enregistrements obtenus pendant l'accouchement ont été publiés antérieurement 9).

Les données peuvent être analysées en outre par l'exportation de points de données d'un logiciel d'analyse et la moyenne des données sur la période de temps d'intérêt. Lorsque l'on compare différentes conditions expérimentales, telles que le type sauvage contre des souris transgéniques, quotidiens ou des pressions horaires de souris différents peuvent être en moyenne pour examiner les tendances contractiles dépendantes sur le gène d'intérêt. En outre, la signification statistique de toute différence peut être déterminée. Pressions intra-utérins peuvent être examinées lors de l'accouchement, ou une étude longitudinale peuvent être effectuées pour examiner l'ensemble de la période de gestation dans des conditions différentes.

Télémétrie intra-utérine peut être utilisé pour tester des réponses in vivo à des agents pharmacologiques pendant la grossesse. Plus précisément, cette méthode permet de tester précoce de médicaments avant les essais cliniques. Les différences de réponse à des agents spécifiques peuvent être testés chez des souris transgéniques, ainsi que chez les souris non enceintes ou enceintes. Un agent pharmacologique spécifique connu pour augmenter l'utérusne contraction, l'ocytocine, peut être expédié sous-cutanée comme décrit précédemment dans un modèle de rat 10. Le télémètre peut être implanté à la fois comme une micro-pompe osmotique pour fournir un débit constant de l'ocytocine. Les différences dans les enregistrements entre non-enceinte (figure 2A) et enceinte (figure 2B) souris avec l'administration de l'ocytocine peuvent aussi être examinées.

Une autre application potentielle de la télémétrie intra-utérine se penche sur les contractions utérines après miRNA / shRNA silence des protéines. Des modèles de souris ne sont pas disponibles pour tous les gènes qui sont essentiels pour la parturition. Ainsi, l'inactivation de gène en combinaison avec des mesures de pression intra-utérine peut être utilisé pour étudier des protéines d'intérêt. Par l'injection de miARN vecteurs lentiviraux exprimant dans le myomètre lors de l'implantation du télémètre, knockdown spécifique de l'utérus d'un gène d'intérêt peut être appréciée, comme on le voit sur ​​la figure 3A. Une récente étude montreun exemple concret qui démontre que le canal Kir7.1 a un rôle important dans la quiescence utérine après l'utilisation de deux miARN et de télémétrie pour examiner les changements à pression intra-utérine pendant la gestation 11. Tracés représentatifs de miARN brouillés (figure 3A) ou Kir7.1 miARN (figure 3B) montrent que abattre expression du canal potassique Kir7.1 causé pression intra-utérine à augmenter. Ces tracés représentatifs sont similaires à ce qui est vu dans les modèles de souris transgéniques comme décrit précédemment neuf.

Figure 1
Figure 1: enregistrement de la pression intra-utérine continue Représentant (A) les données en temps réel de la pression intra-utérine enregistrées in vivo en continu pendant quatre jours (15-19 DPC).. (B) Déménagement moyenne horaire de données dans (A). White barres noires en haut et d'enregistrements indiquent 12 h lumière et sombres cycles, respectivement. (C) Un zoom avant trace de souris dans contractions individuelles in vivo. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: pressions intra-utérins en réponse à l'ocytocine tracés représentatifs de la pression intra-utérine de non-enceinte (NP) myomètre (A) et en fin de gestation (18 DPC) myomètre (B) exposée à 5 unités / jour d'ocytocine pendant 24 heures montrent des augmentations. de la pression à la fin du rapport enceinte souris NP. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Mesure de la pression intra-utérine après silençage d'un canal de potassium par miARN / shRNA (A) Représentation schématique de la mise en place du télémètre et les sites d'injection des lentivirus exprimant miARN.. Des études récentes ont montré les tracés représentatifs de la pression intra-utérine myomètre transduites avec (B) brouillés miRNA ou (C) Kir7.1 miARN. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Les enquêtes sur la contractilité du myomètre se sont appuyés sur des mesures ex vivo de la tension musculaire. Cette méthodologie peut être utile pour tester un stade précoce des utérotoniques nouvellement développés qui ne peuvent pas être administrés aux animaux vivants. Cependant, les approches in vivo sont nécessaires pour comprendre longitudinalement la progression du travail. Les mesures in vivo ont plusieurs buts. D'abord, ils permettent la capture d'une image complète des changements dans le profil de contraction de l'utérus au cours de la durée de la grossesse. Deuxièmement, ils éliminent le biais des anciens enregistrements vivo qui nécessitent tissu utérin à être monté verticalement ou horizontalement, ce qui limite notre compréhension du rôle complète de la couche musculaire circulaire et longitudinale de l'utérus. En troisième lieu, ils permettent l'enregistrement de la pression de l'utérus dans l'environnement hormonal endogène, ce qui permet d'étudier de façon plus précise la parturition chez des modèles de souris. Enfin, ils permettent pour plus trenquêtes anslational entre les modèles de souris et les humains que utérine télémétrie ressemble de plus près les mesures prises chez les femmes enceintes avec des cathéters de pression intra-utérins.

Les méthodes de l'utérus de la souris télémétrie sont faciles à apprendre, mais difficile à maîtriser. Les enquêteurs précédente expérience de la chirurgie de la souris peuvent réussir plus vite, mais cela ne devrait pas dissuader les laboratoires de l'utilisation de cette technique précieuse. Les études originales en utilisant l'utérus de la souris télémétrie ont été faites par un novice avec beaucoup de succès après quelques essais, donc les laboratoires doivent être préparés pour le premier couple de chirurgies pour provoquer le barrage de perdre tous les fœtus. Voici quelques conseils à garder à l'esprit. Comme pour toute chirurgie, la durée la plus courte est la meilleure pour l'animal. Une chirurgie rapide va limiter la déshydratation et le besoin de doses supplémentaires de l'anesthésie. Si le chercheur est d'avoir un moment difficile de terminer la procédure devant la souris se réveille, l'isoflurane peut être utilisé pour maintenir la anesthetiz de la sourised plus. Nous avons également trouvé que l'utilisation de l'isoflurane augmente le nombre de petits viables et est préférée à la kétamine. La plus petite incision possible, juste un peu plus grand que le corps du télémètre, permettra de réduire les chances de la plaie béante plus tard, de réduire le temps nécessaire à la suture, et améliorer la récupération de la souris. Avec une petite incision abdominale, tirant l'utérus à l'extérieur de la cavité corporelle permettra une meilleure visibilité lors de l'insertion du cathéter. Lorsque la réutilisation d'un télémètre, facteur dans la courbe précédente du cathéter lors de l'enfilage vers le bas la corne utérine. Permettre la colle chirurgicale pour durcir complètement avant de la corne utérine à l'intérieur de la cavité corporelle aidera à garder le cathéter en place et d'empêcher la colle de coller aux intestins. Le corps du télémètre peut endommager le foie se il est placé trop haut, et l'abdomen de la souris est capable de se étendre longuement, alors ne hésitez pas à placer le télémètre inférieure dans le corps. Ces méthodes devront être personnalisés to répondre aux besoins des différents laboratoires et différents modèles de souris, mais les avantages de l'utérus télémétrie emportent de loin sur les obstacles.

Il ya quelques limitations qui devraient être considérés lors de l'application de cette méthodologie. L'un des principaux défis qui doivent être surmontés est le degré de perte fœtale après l'implantation de l'émetteur. Dans la télémétrie intra-utérine rapport initial 9, toutes les souris SK3 T / T et de type sauvage transgéniques avaient un certain degré de perte fœtale dans un ou les deux cornes utérines, peu importe si cette corne a été choisi pour le placement de télémètre. Optimisation du choix du jour pendant la grossesse lorsque le télémètre a été inséré chirurgicalement amélioré notre taux de grossesses à terme avec succès, mais une gamme complète de petits n'a jamais été obtenu. Notamment, le jour de la chirurgie optimale pour les souris SK3 T / T différait de celle de type sauvage, avec de meilleurs résultats en matière de reproduction a noté au dpc12-13 pour les souris SK3 T / T contre dpc8-9 pour WT souris, suggeaiguillon que le protocole de la chirurgie peut être nécessaire d'être modifié pour chaque modèle de souris d'intérêt. Nos données indiquent que le nombre de petits mis bas ne était pas corrélée avec la pression intra-utérine globale. Résultats pour le fœtus ne se améliorent avec des compétences chirurgicales améliorées par l'expérimentateur, et d'autres qui ont mis en œuvre cette méthodologie dans leur laboratoire ont indiqué que les résultats foetaux améliorés avec l'utilisation de l'isoflurane à la place de la kétamine. Il est prévu que plusieurs laboratoires utilisent cette méthodologie, la technologie de l'émetteur et des logiciels d'analyse intra-utérine deviendront plus raffinée. Ce sera sans aucun doute avancer l'utilité de cette technologie dans les études des mécanismes qui contribuent au travail.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Glue 3M Vetbond 1469SB Tissue Adhesive--stored in Drierite
Absorbable 6-0 Sutures Ethicon J212H Vicryl
Non-absorbable 6-0 Sutures Ethicon 8706H Prolene
Water Jacket Blanket + Heating Pad Gaymer T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC Specialized for rodents
Bead sterilizer Keller Z378577 Steri 250 Sterilizer
Disecting Microscope Nikon SMZ754 Fibre optic gooseneck external light source
Sterile Surgical Gloves--Latex  Cardinal Health Triflex 2D7253
PhysioTel PA-C10 Pressure Transmitter  Data Sciences International 270-0135-001 TA11PA-C10
Telemeter Reciever  Data Sciences International 272-6001-001 RPC-1
Dataquest ART 4.3.2 Analysis Platinum  Data Sciences International 271-0147-141 Analysis software
Diet Recovery Gel Clear H2O 72-01-5022 Purified Soft Diet for Rodents
Tergazyme Sigma-Aldrich Z273287 Enzyme detergent

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References

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Télémétrie intra-utérine mesurer souris contractile pression<em&gt; In Vivo</em
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Cite this Article

Rada, C. C., Pierce, S. L., Grotegut, C. A., England, S. K. Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo. J. Vis. Exp. (98), e52541, doi:10.3791/52541 (2015).More

Rada, C. C., Pierce, S. L., Grotegut, C. A., England, S. K. Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo. J. Vis. Exp. (98), e52541, doi:10.3791/52541 (2015).

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