Abstract
Комплекс интеграция молекулярных и электрических сигналов необходимо, чтобы превратить покоя матки в сократительной органа в конце беременности. Несмотря на открытие ключевых регуляторов матки, этот процесс до сих пор до конца не изучен. Трансгенные мыши обеспечивают идеальную модель, в которой для изучения родов. Ранее единственным способом для изучения сократимости матки, у мышей был Экс Vivo изометрические записи напряжение, которое субоптимальны по нескольким причинам. Матка должна быть удалена от его физиологической среде, в течение ограниченного времени ход исследования можно, и мышей умерщвляли необходимо. Недавнее развитие радиометрического телеметрии позволило продольных режиме реального времени измерений в естественных условиях давления внутриутробного у мышей. Здесь имплантация внутриутробного Telemeter для измерения изменения давления в матке мыши с середины беременности до родов не описано. По сравнению различий в прессеОЭС между дикого типа и трансгенных мышей, физиологический воздействие интересующего гена может быть выяснена. Этот метод следует ускорить развитие терапевтических, используемых для лечения миометрия беспорядки во время беременности, в том числе преждевременных родов.
Introduction
Преждевременные роды являются ведущей причиной перинатальной заболеваемости и смертности в развитых странах; он несет ответственность за 50% перинатальной заболеваемости и 75% перинатальной 1,2 смертности. Преждевременные роды многогранна и может быть идиопатическим. Хотя много исследований появилась на молекулярном и токопроводов, преобразующих миометрия от покоя ткани в сократительных одного, точнее патофизиологии преждевременных родов остается неуловимым. Болезни эндокринной системы, воспалительные и регуляции генов были все связаны с преждевременными родами 3,4. Тем не менее, этические соображения ограничивают возможность проводить исследования на механизмах преждевременных родов в организме человека.
Учитывая эти ограничения, многие исследователи обратились к мышам в качестве модельной системы, с которой для изучения физиологии родов. Мыши имеют короткие беременностью продолжительностью около трех недель и может быть легко генетически манипулировать. Кроме того, несколько генетические модели мыши имеютразработан для определения сигнальных путей, которые необходимы для труда 5. Несмотря на ключевых различий между мышью и человеческой родов, мыши и люди разделяют многие из тех же механизмов, которые необходимы для труда, в том числе внутриутробного воспаления и инфекции 6. Таким образом, мыши служить бесценным инструментом для изучения маточную активность. На сегодняшний день, золотой стандарт для измерения сократимости матки, у мышей был Экс Vivo изометрические записи напряженности; Однако, это ограничивается одним гестационного момент времени в эксперименте, и требуется удаление матки с его физиологической среде. Другим важным фактором является большое количество животных, необходимых для этих исследований. Наконец, эта методика не позволяет продольных исследований, посвященных индукции родов и преждевременных патофизиологии.
Последние достижения, сделанные в радиометрических устройств телеметрии, используемых для изучения артериальное давление изменяет 7 у мышей и междунарrauterine давление у крыс 8 с чем возникает вопрос, может ли такая же технология была использована для изучения изменений в внутриматочного давления у мышей во время беременности. После первоначального поиска и устранения неисправностей, метод был успешно разработан для измерения труда индукции и прогрессирования у мыши. Это, в естественных условиях подход может измерять переход из состояния низкого давления покоя матки к состоянию высокого давления, указывающий силовых родовых схваток. Этот метод также был в состоянии обнаружить существенные различия давления между трансгенных мышей с ослабленной родов и мышей дикого типа, демонстрируя физиологическую влияние экспрессии генов 9. Этот протокол обеспечивает в реальном масштабе времени, в методе естественных изучать давление мыши матки во время беременности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных в соответствии с руководящими для ухода и использования животных, изложенных Национальными Институтами Здоровья. Все протоколы были одобрены Комитетом животного исследований Вашингтонского университета в Сент-Луисе в.
ПРИМЕЧАНИЕ: Специальные материалы и оборудование для этого протокола перечислены материалы и настольные принадлежности.
1. Временный Разведение самок мышей
- Порода взрослых самок от двух до шести месяцев возраста во временном окне 2 ч с мужчинами. Удельный разведение ч не нужны, если они содержатся в соответствии для полноты эксперимента.
- Подтверждение беременность присутствии совокупительным пробки. Назначить день и час, на котором вилка впервые появилась в день после полового акта 0 (dpc0). Помните определенный час, когда начала записи давления.
- Выполните операции на dpc8-13. Точное DPC будет зависеть от штамма мыши.
- Чтобы определить, если мышь беременна до операции, ЧПrform ультразвуковой визуализации органов брюшной полости с 40 МГц линейный массив зонда, соединенного с системой формирования изображения перед введением анестезии. Это позволит визуализировать гестационного мешков. Если ультразвуковая система не доступна, воспользуйтесь вес мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: увеличение веса, по крайней мере 2 г между dpc0 и dpc8 и вздутие живота является хорошим показателем беременности.
2. Телеметрия хирургии Prep
- Используйте автоклав для стерилизации инструментов, марля, ватные тампоны, хирургические простыни, и наконечники в течение 24 ч до операции.
- Чистый хирургии поверхность с 70% -ным этанолом.
- Включите грелку (специализированный для грызунов) и бортовой стерилизатор.
3. Телеметрия хирургии
- Для обезболивания, используйте 4-5% изофлуран с частотой кислорода потока 1-2 л / мин.
- Подождите, пока мышь не показывает признаков анестезии, а затем вводят подкожно бупренорфин (анальгетик: 0,1 мл на 20 г),
- Бритье брюшко мыши из нижней части ребра вниз в мочевой пузырь.
- Навести мышку на хирургический стол на подогретым грелку, и охватывают глаза мыши с глазной мази, чтобы предотвратить высыхание.
- Начните стерильной техники. Положите на стерильные перчатки и сохранит оболочку в виде стерильного поверхности, на которой можно разместить йода и этанол скрабы.
- Удалить дальномер из пакета или физиологическим раствором и использовать стерильного пинцета поместить его на стерильную марлю.
- Используйте шприц (предоставляется поставщиком телеметрической), чтобы заполнить кончик катетера с гелем. Слегка сожмите катетер, создавая достаточно отрицательное давление, чтобы привлечь гель в катетер.
- Поместите стерильную наконечник на пипетки. Пипетка 2 мкл хирургического клея и установить пипетки на стерильной поверхности.
- Чтобы очистить места операции, тампоном область йодом, а затем 70% -ным этанолом.
- Вырезать отверстие в хирургической салфетке достаточно большойдля области, необходимой для разреза и место над мышью.
- Выполните ног щепотку (ответ педаль), чтобы гарантировать мыши полностью под наркозом, прежде чем сделать надрез.
- Сделайте небольшой вертикальный срединный разрез. Далее, сделать подобный разрез через подлежащей мышцы стенки тела.
- Осторожно потяните матку из полости тела и найдите рог матки, содержащий самую щенков, которые жизнеспособны.
- Дополнительно - Для добавления микроРНК, вводят вирусного вектора в мышечный слой матки до введения Telemeter.
- Сделать небольшой надрез на кончике рога матки с 3 мм передний край пружинные ножницы.
- Автор катетер, не сдавливая между стенкой матки и плода мешочков. Вставьте катетер последние несколько мешков, чтобы уменьшить ее случайное удаление. Убедитесь, что у плода мешочки не нарушается путем включения.
- Внесите хирургического клея к месту вставки телеметрической придерживаться катетер в Uterine рог и предотвратить катетер от скольжения из рога матки. Подождите несколько секунд для клея, чтобы стать жесткой, а затем аккуратно установите матку обратно в полость тела.
- Поместите Telemeter в полости тела на противоположной стороне участка ввода катетера.
- Шовный в полость тела, прикрытый 6,0 рассасывающиеся швы. Во-первых, сделать кошелек стежка, а затем 3:57 отдельных швов.
- Шовный кожу, используя ту же технику, но с 6-0 нерассасывающегося шва.
- Тампон дибукаин (местное болеутоляющее) мазь на месте разреза.
- Вводят 0,3-0,4 мл стерильного физиологического раствора подкожно, чтобы помочь увлажняет животное.
- Монитор животное после операции, пока не полностью проснулся. Не устанавливайте мышь обратно в клетку до тех пор, пока не сможет свободно держать голову над столом, как некоторые виды постельных принадлежностей может задохнуться тяжело наркозом мыши. Для мыши, которые были под наркозом в течение 30-45 мин, следует ожидать йе мышь, чтобы полностью проснуться к 1 ч и 15 мин.
- При выполнении дополнительных операций, протрите инструменты с 70% этанола и бортом стерилизации перед повторным использованием.
4. Послеоперационный Recovery
- Монитор ежедневный прогресс после операции в журнале. Каталог веса и потеря и следить за вялость, кровотечение или неполным закрытием хирургического разреза.
- Поток мыши смягчил мыши чау (~ консистенции яблочное пюре) или специализированного питания оздоровительная диета.
- Проверьте швы и убедитесь, что они не вытащил, но стараюсь не обращаться мышь чрезмерно.
5. телеметрии записи
- В день интерес (по крайней мере в два-три дня после того, как мыши оправился от операции), поместите магнит рядом с мышью, чтобы включить дальномер. Поставьте клетку мыши на ресивере. Индикатор на приемнике должен включаться, если дальномер активизируется.
- Калибровка новый teleme Ослабляет с производителем конкретных калибровок предусмотрено. Бывшие в употреблении Технические характеристики калибровки телеметрических будут храниться в программном обеспечении.
- В программном обеспечении, начните запись, нажав правой кнопкой мыши на "животного" и нажмите "начать отбор проб, непрерывный", который позволяет отбор проб со скоростью до 500 Гц. Убедитесь, что программное обеспечение настроено для сохранения и следа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда значок выборки мышь зеленеет, давление записывается. Нарушение мыши во время родов может прервать или изменить труда, так наблюдать осторожно. - После поставки или периода времени интерес, или остановить запись, щелкнув правой кнопкой мыши на "животного" и выбрав "остановить запись, все". Используйте магнит, чтобы выключить дальномер для экономии заряда аккумулятора, как дальномер батареи, как правило, длятся всего 1,5 месяцев непрерывной записи.
- Эвтаназии мыши, CO 2 передозировки и восстановить дальномер. Щенки эвтаназии путем обезглавливания.
- Поместите Telemeter в растворе 1% фермента детергента в деионизированной воды в течение ночи при комнатной температуре.
- Промыть дальномер в деионизированной воде и удалить все ткани и клей, стараясь не выжать катетер.
- Инкубируйте Telemeter в 2% глутарового альдегида в течение 24 ч при комнатной температуре, чтобы стерилизовать.
- Промыть дальномер стерильным физиологическим раствором и не храните его в стерильном физиологическом растворе до следующего имплантации или быть отправлены обратно к производителю, чтобы быть отремонтированы. Telemeters должны быть отремонтированы, если ткань находится внутри катетера после стерилизации. Обычно telemeters может быть использован в 4-5 раз до необходимости быть отремонтированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В режиме реального времени в естественных условиях давления внутриматочных могут быть записаны с помощью телеметрической системы сбора. Отбор проб давления в паре с одновременной записью видео мыши была использована, чтобы захватить точное время доставки каждого щенка и соотнести времени доставки в внутриматочного давления матери. Все точки данных могут быть нанесены в течение записи для генерации давления в сравнении с временем-участок (фиг.1А). Этот график показывает, очки во время беременности, когда внутриматочные изменения давления, а также разница в давлении между темными и светлыми циклов. Кроме того, скользящая средняя внутриматочного давления может быть построена (рис 1B). Это полезно для более легко визуализировать устойчивый рост внутриутробного характеристики давления сокращений, связанных с процессом труда (записи, полученные во время родов были опубликованы ранее 9).
Данные могут быть дополнительно проанализированы с помощью экспорта точек данных с программным обеспечением для анализа и усреднение данных по времени период интерес. При сравнении различных экспериментальных условиях, таких как дикого типа по сравнению с трансгенными мышами, посуточно или почасово давления со стороны различных мышей могут быть усреднены для изучения сократительной модели, зависящие от интересующего гена. Кроме того, статистическая значимость каких-либо различий может быть определена. Внутриматочные давление может быть рассмотрен во время родов или продольное исследование может быть проведено, чтобы исследовать весь гестационный период в различных условиях.
Внутриутробного телеметрии могут быть использованы для проверки в естественных ответов на фармакологических агентов во время беременности. В частности, этот метод позволяет для раннего тестирования на наркотики до клинических испытаний. Различия в ответ на конкретные агенты могут быть проверены в трансгенных мышей, а также у небеременных или беременных мышей. Один специфический фармакологический агент, как известно, увеличивают маткиNE сжатие, окситоцин, могут быть доставлены подкожно, как описано выше в крысиной модели 10. Телеметрическая могут быть имплантированы в то же время, как микро-осмотического насоса, чтобы доставить постоянной скоростью окситоцина. Различия в записях между небеременных (рис 2а) и беременных (рис 2В) мышей с администрацией окситоцина также могут быть рассмотрены.
Другое потенциальное применение внутриматочных телеметрии, глядя на маточных сокращений после микроРНК / shRNA молчания белков. Мышиные модели доступны не для всех генов, которые необходимы для родов. Таким образом, молчание генов в сочетании с измерениями внутриматочного давления может быть использован для исследования белков, представляющих интерес. Вводя микроРНК-выражения лентивирусов векторов в миометрии при имплантации Telemeter, матки конкретных нокдаун интересующего гена могут быть рассмотрены, как показано на фиг.3А. А недавно исследование показываетКонкретный пример демонстрирует, что Kir7.1 канал играет важную роль в матки покоя после использования как микроРНК и телеметрии для изучения изменений в внутриматочного давления во время беременности 11. Представительства обводка яичницы микроРНК (рис 3А) или Kir7.1 микроРНК (рис 3b) показывают, что сбить выражение калиевого канала Kir7.1 вызвало внутриматочного давления, чтобы увеличить. Эти представительные обводка похожи на то, что видели в трансгенных мышах, как описано выше 9.
Рисунок 1: представитель записи непрерывная внутриматочного давления (A) в режиме реального времени данные о давлении внутриутробного записанные в естественных условиях непрерывно в течение четырех дней (15-19 ЦОД).. (B) Перемещение среднечасовой данных в (А). БелыйITE и черные полосы в верхней части записей указывают 12 ч светлых и темных циклов, соответственно. (C) увеличено следа мыши в естественных условиях отдельных сокращений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: внутриматочных давление в ответ на окситоцин Типичные обводка внутриматочного давления от небеременных (NP) миометрия (А) и в конце беременности (18 DPC) миометрий (В) подвергаются 5 единиц / день окситоцина в течение 24 ч шоу увеличивается. давления в конце беременности по сравнению с мышами НП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Измерение внутриматочного давления после молчания канала калия микроРНК / shRNA () Схема размещения дальномер и сайтов впрыска микроРНК, экспрессирующих лентивирусы.. Недавние исследования показали, представительные прорисовки внутриматочного давления от миометрия трансдуцированную (B) поднялся Мирна или (С) Kir7.1 Мирна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследования миометрия сократительной полагались на бывших естественных условиях измерений напряжения мышц. Эта методика может быть полезна для ранней стадии испытаний вновь разработанных утеротонических препаратов, которые не могут быть введены в живых животных. Тем не менее, подходы в естественных условиях необходимо, чтобы понять, в продольном направлении прогрессирование труда. Измерения в естественных условиях служат нескольким целям. Во-первых, они позволяют захват полной картины изменений в маточной сократительной узором в течение срока беременности. Во-вторых, они устраняют смещение Экс Vivo записей, которые требуют ткань матки должен быть установлен вертикально или горизонтально, ограничивая наше понимание полного роли круговой и продольной мышечного слоя матки. В-третьих, они позволяют запись давлением матки в эндогенной гормональной среде, таким образом, делая возможным более точно исследовать роды на мышах. Наконец, они позволяют более трanslational исследования между моделями мыши и человека как матки телеметрии больше напоминает измерений, у беременных женщин с внутриутробной катетеров давления.
Методы мыши матки телеметрии легко узнать, но трудно овладеть. Следователи, имеющие опыт хирургии мыши может добиться успеха быстрее, но это не должно удерживать лаборатории с помощью этого ценного технику. Оригинальные исследования с использованием мыши матки телеметрии были сделаны новичка с большим успехом после нескольких попыток, так лаборатории должны быть готовы к первой паре операций, чтобы привести плотину, чтобы потерять все зародыши. Вот несколько советов, чтобы держать в уме. Как и при любой операции, короткий продолжительность лучше для животного. Быстрый операция будет ограничивать обезвоживание и потребность в дополнительных доз анестезии. Если исследователь трудное время завершения процедуры перед мышь просыпается, ИФ может быть использован, чтобы сохранить anesthetiz мыширед дольше. Мы также обнаружили, что использование изофлуран увеличивает количество жизнеспособных детенышей и предпочтительнее, чем кетамин. Маленький надрез можно, просто, чем тело Telemeter немного больше, будет уменьшить шанс раны зияющего позже, уменьшить время, необходимое для шва, а также улучшить восстановление мыши. С небольшой разрез брюшной стенки, потянув матки вне полости тела позволит для лучшей видимости во время введения катетера. При повторном в телеметрических, фактор в предыдущем кривой катетера при заправке его вниз рог матки. Разрешение хирургическое клей затвердеет полностью до размещения рог матки обратно в полость тела поможет сохранить катетер на месте и предотвратить клей от прилипания к кишечника. Тело дальномер может привести к повреждению печени, если установлен слишком высокий, и живот мышки способен расширяться экстенсивно, так что не стесняйтесь размещать дальномер ниже в организме. Эти методы должны быть настроены тО соответствовать потребностям различных лабораториях и различных мышиных моделях, но преимущества матки телеметрии намного перевешивают препятствия.
Есть некоторые ограничения, которые следует учитывать при реализации этой методологии. Одним из основных проблем, которые должны быть преодолены является степень потери плода после имплантации передатчика. В внутриматочная телеметрии первоначального доклада 9, все трансгенные SK3 T / T и дикого типа мышей, получили некоторую степень потери плода в одной или обеих маточных рогов независимо от того, как этот рог был выбран для размещения телеметрической. Оптимизация выбора дня во время беременности, когда дальномер хирургическим путем вставляется улучшили нашу скорость успешных срока беременности, но полный комплект щенков никогда не был получен. Примечательно, что оптимальным день операции для SK3 T / T мышей отличалось от дикого типа, с лучшими репродуктивной отметил на dpc12-13 для мышей SK3 T / T по сравнению с dpc8-9 для WT мышей, suggeжало, что протокол операция может потребоваться изменить для каждой модели мыши интересов. Наши данные показывают, что число щенков рожден не коррелирует с общей внутриматочного давления. Плода результаты действительно улучшилось с улучшенными хирургических навыков экспериментатор, и другие, которые осуществили эту методику в своей лаборатории отметили, что результаты плода улучшена с использованием ИФ вместо кетамина. Ожидается, что в более лаборатории используют эту методологию, технология передатчик и программное обеспечение внутриутробного анализ станут более изощренными. Это, несомненно, заранее полезность этой технологии в исследованиях механизмов, которые способствуют труда.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Glue | 3M Vetbond | 1469SB | Tissue Adhesive--stored in Drierite |
| Absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | J212H | Vicryl |
| Non-absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | 8706H | Prolene |
| Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymer | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | Specialized for rodents |
| Bead sterilizer | Keller | Z378577 | Steri 250 Sterilizer |
| Disecting Microscope | Nikon | SMZ754 | Fibre optic gooseneck external light source |
| Sterile Surgical Gloves--Latex | Cardinal Health Triflex | 2D7253 | |
| PhysioTel PA-C10 Pressure Transmitter | Data Sciences International | 270-0135-001 | TA11PA-C10 |
| Telemeter Reciever | Data Sciences International | 272-6001-001 | RPC-1 |
| Dataquest ART 4.3.2 Analysis Platinum | Data Sciences International | 271-0147-141 | Analysis software |
| Diet Recovery Gel | Clear H2O | 72-01-5022 | Purified Soft Diet for Rodents |
| Tergazyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme detergent |
References
- Slattery, M. M., Morrison, J. J. Preterm delivery. Lancet. 360, 1489-1497 (2002).
- Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371, 75-84 (2008).
- Keelan, J. A. Pharmacological inhibition of inflammatory pathways for the prevention of preterm birth. Journal Of Reproductive Immunology. 88, 176-184 (2011).
- Voltolini, C., et al. Understanding spontaneous preterm birth: from underlying mechanisms to predictive and preventive interventions. Reproductive Sciences. 20, 1274-1292 (2013).
- Ratajczak, C. K., Muglia, L. J. Insights into parturition biology from genetically altered mice. Pediatric research. 64, 581-589 (2008).
- Rajakumar, A., et al. Placental HIF-1 alpha, HIF-2 alpha, membrane and soluble VEGF receptor-1 proteins are not increased in normotensive pregnancies complicated by late-onset intrauterine growth restriction. American Journal Of Physiology. Regulatory, Integrative And Comparative Physiology. 293, (2007).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American journal of physiology. Heart And Circulatory Physiology. 286, H2408-H2415 (2004).
- Mackay, L. B., Shi, L. B., Maul, H. ., Maner, W. L., Garfield, R. E. The effect of bilateral pelvic neurectomy on cervical ripening in pregnant rats. Journal Of Perinatal Medicine. 37, 263-269 (2009).
- Pierce, S. L., Kutschke, W., Cabeza, R., England, S. K. In vivo measurement of intrauterine pressure by telemetry: a new approach for studying parturition in mouse models. Physiol Genomics. 42, 310-316 (2010).
- Imamura, T., Luedke, C. E., Vogt, S. K., Muglia, L. J. Oxytocin modulates the onset of murine parturition by competing ovarian and uterine effects. American Journal Of Physiology. Regulatory, Integrative And Comparative Physiology. 279, R1061-R1067 (2000).
- McCloskey, C., et al. The inwardly rectifying K+ channel KIR7.1 controls uterine excitability throughout pregnancy. EMBO Mol Med. 6 (9), 1161-1174 (2014).
