Abstract
Det behövs en komplex integration av molekylära och elektriska signaler för att transformera en vilande livmodern i en kontraktil orgel vid slutet av graviditeten. Trots upptäckten av viktiga regulatorer av uteruskontraktion denna process är fortfarande inte helt klarlagt. Transgena möss ger en idealisk modell där för att studera förlossning. Tidigare den enda metoden för att studera uterin kontraktilitet i mus var ex vivo isometrisk spänning inspelningar som suboptimalt av flera skäl. Livmodern måste avlägsnas från dess fysiologiska miljö är en begränsad tid under utredning möjlig, och mössen måste offras. Den senaste utvecklingen av radiometriska telemetri har tillåtit för longitudinella, realtidsmätningar av in vivo intrauterint tryck hos möss. Här, till implantation av en intrauterin telemeter mäter tryckförändringar i musen livmodern från mitten av graviditeten fram till förlossningen beskrivs. Genom att jämföra skillnader i tryckderna mellan vildtyp och transgena möss, kan den fysiologiska effekten av en gen av intresse att belysas. Denna teknik bör påskynda utvecklingen av läkemedel för behandling av myometrial sjukdomar under graviditeten, inklusive tidig förlossning.
Introduction
Tidig födsel är den vanligaste orsaken till perinatal sjuklighet och dödlighet i de utvecklade länderna; den är ansvarig för 50% av perinatal sjuklighet och 75% av perinatal dödlighet 1,2. Tidig förlossning är mångfacetterat och kan vara idiopatisk. Även om mycket forskning har vuxit fram på de molekylära och elektriska vägar omvandla myometrium från en vilande vävnad i en sammandragande en, den exakta patofysiologi tidig förlossning är fortfarande instabil. Endokrina, inflammatoriska och genreglering har alla varit kopplade till tidig förlossning 3,4. Men etiska betänkligheter begränsa möjligheten att bedriva forskning om mekanismerna bakom tidig förlossning hos människor.
Med tanke på dessa begränsningar, har många forskare vänt sig till möss som modellsystem med att studera fysiologi förlossning. Möss har korta börd varar cirka tre veckor och kan enkelt genetiskt manipulerade. Dessutom flera genetiska musmodeller harutvecklats för att bestämma de signalvägar som är väsentliga för arbetskraft 5. Trots viktiga skillnader mellan mus och människa förlossning, möss och människor delar många av samma mekanismer som är väsentliga för arbetskraft, inklusive intrauterin inflammation och infektion 6. Således möss fungerar som ett ovärderligt verktyg för att undersöka livmoderaktivitet. Hittills till guldmyntfot mäta livmoder kontraktilitet hos möss har varit ex vivo isometrisk spänning inspelningar; Men, detta är begränsat till en graviditets tidpunkt per experiment och kräver avlägsnande av livmodern från dess fysiologiska miljön. En annan viktig faktor är det stora antalet djur som krävs för dessa undersökningar. Slutligen, denna metod inte tillåter longitudinella studier som undersökt induktion av arbetskraft och för tidig patofysiologi.
Nya framsteg som gjorts i radiometriska telemetriutrustning används för att studera artärtryckförändringar 7 i möss och intrauterine trycket hos råttor 8 bönföll frågan om huruvida samma teknik kan användas för att studera förändringar i intrauterint tryck hos möss under graviditeten. Efter inledande felsökning, var en metod framgångsrikt utvecklat för att mäta förlossningsinduktion och progression i en mus. Detta in vivo-metod kan mäta övergången från lågtryckstillstånd den passiva livmodern till högtryckstillstånd indikerar kraftfulla arbete sammandragningar. Denna metod har också kunnat påvisa signifikanta tryckskillnader mellan transgena möss med nedsatt nedkomst och vildtypsmöss, visar den fysiologiska effekten av genuttryck 9. Protokollet ger en realtids, in vivo-metod för att studera musen livmodertrycket under graviditeten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djurförsök överensstämde med riktlinjer för vård och användning av djur som anges av National Institutes of Health. Samtliga protokoll godkändes av Animal Studies kommittén vid Washington University i St Louis.
OBS: Särskilda material och utrustning för detta protokoll listas Material och utrustning bord.
1. Begränsad Uppfödning av honmöss
- Ras vuxna honor mellan två och sex månaders ålder i en 2 tim tidsfönster med hanar. Specifik avel hr behövs inte så länge som de förblir förenliga för helheten av experimentet.
- Bekräfta graviditet genom närvaron av en parnings plugg. Utse dagen och hr då kontakten är först ses som dagen efter samlag 0 (dpc0). Minns den specifika timmen vid start tryckmätning.
- Utför operationer på dpc8-13. Den exakta DPC kommer att bero på musstammen.
- För att avgöra om en mus är gravid innan operationen, peR formultraljudsundersökningar av buken med en 40 MHz linjär array sond kopplad till ett bildsystem före administrering anestesi. Detta kommer att möjliggöra visualisering av graviditets säckar. Om ett ultraljudssystem inte är tillgänglig, använd vikten på musen.
OBS: En viktökning på minst 2 g mellan dpc0 och dpc8 och utspänd buk är en bra indikator på graviditet.
2. Telemetri Kirurgi Prep
- Använd en autoklav för att sterilisera instrument, gasväv, bomullspinnar, operationsdukar och pipettspetsar inom 24 timmar före operationen.
- Rengör kirurgi ytan med 70% etanol.
- Slå på värmedyna (specialiserad för gnagare) och pärla autoklav.
3. Telemetri Kirurgi
- För anestesi, använder 4-5% isofluran med en syreflödeshastighet av 1-2 l / min.
- Vänta tills musen visar tecken på anesthetization och sedan injicera subkutant med buprenorfin (smärtstillande: 0,1 ml per 20 g).
- Raka buken av musen från botten av revbenen ner till urinblåsan.
- Ta musen till operation tabellen på förvärmda värmedyna, och täcker musens ögonen med ögon salva för att förhindra uttorkning.
- Begin steril teknik. Sätt på sterila handskar och hålla omslaget som en steril yta att placera jod och etanolskrubb.
- Avlägsna telemeter från förpackningen eller saltlösning och använda steril pincett för att placera den på steril gasväv.
- Använd sprutan (tillhandahålls av telemeter leverantören) för att fylla kateterspetsen med gel. Tryck försiktigt katetern skapa tillräckligt undertryck för att dra gelen in i katetern.
- Placera en steril spets på pipetten. Pipettera 2 pl kirurgiskt lim och ställa pipetten på en steril yta.
- För att rengöra det kirurgiska stället, kompress området med jod och därefter med 70% etanol.
- Skär ett hål i den operationsduk bara tillräckligt storaför det område som behövs för snittet och plats över musen.
- Utför en fot nypa (pedal svar) för att se till att musen är helt sövd innan göra ett snitt.
- Gör en liten vertikal mittlinjeincision. Nästa, göra en liknande snitt genom den underliggande kroppen väggen muskler.
- Dra försiktigt livmodern ut ur kroppen hålighet och leta livmoderhornet innehåller flest valpar som är livskraftiga.
- Tillval - För tillsättning av miRNA, injicera virusvektor i en muskel skikt av livmodern före insättning av telemeter.
- Gör ett litet snitt vid spetsen av livmoderhornet med 3 mm banbrytande våren sax.
- Trä katetern, utan att klämma, mellan livmoderväggen och fostersäckar. Sätt katetern förbi flera säckar för att minska sin oavsiktlig borttagning. Se till de fetala säckar inte störs genom insättningen.
- Pipet den kirurgiskt lim till stället för telemeterhuvud för att vidhäfta katetern till uterine horn och förhindra att katetern glider ut ur livmoderhornet. Vänta några sekunder för limmet att bli stel, och sedan försiktigt placera livmodern tillbaka inuti kroppen hålighet.
- Placera telemeter i kroppskaviteten på den motsatta sidan av kateterinsättningsstället.
- Sutur kroppshålan stängs med 6.0 absorberbara suturer. Först gör en handväska stygn och sedan 03:57 enskilda stygn.
- Sutur huden genom att använda samma teknik, men med 6-0 icke-resorberbara suturer.
- Svabb dibukain (lokalsmärtstillande) salva över snittet webbplatsen.
- Injicera 0,3 till 0,4 ml steril koksaltlösning subkutant för att hjälpa rehydrera djuret.
- Övervaka djuret efter operationen tills den är helt vaken. Placera inte musen tillbaka i sin bur tills den kan fritt hålla huvudet ovanför bordet som vissa typer av sängkläder kan kväva ett tungt sövd mus. För en mus som har sövd under 30-45 min, bör man förvänta the musen för att vara fullt vaken av 1 tim och 15 min.
- Om du utför ytterligare operationer, torka instrument med 70% etanol och pärla sterilisera före återanvändning.
4. Post-kirurgi Återhämtning
- Övervaka dagligen efter operationen framsteg i en logg. Katalog viktökning och förlust och titta på letargi, blödning, eller ofullständig stängning av kirurgiska snittet.
- Mata musen mjuknat musfoder (~ konsistensen av äppelmos) eller specialiserade återvinnings dietmat.
- Undersök suturer och se till att de inte dras ut, men försök att inte hantera musen drivet.
5. Telemetri Inspelning
- På dagen av intresse (åtminstone två till tre dagar efter det att musen har återhämtat sig från operationen), placera en magnet nära musen för att slå på telemeter. Placera musen buren på mottagaren. Lampan på mottagaren ska tändas om telemeter är aktiverad.
- Kalibrera splitternya teleme gor med tillverkarspecifika kalibreringar tillhandahålls. Återanvända telemeter kalibrerings specifikationer kommer att hållas i mjukvara.
- Inom programmet, starta inspelningen genom att högerklicka på "djur" och klicka på "start provtagning, kontinuerlig", som möjliggör provtagning i hastigheter på upp till 500 Hz. Se till att programvaran är inställd för att spara och spåra.
OBS: När ikonen samplings musen blir grön, är trycket registreras. Störande musen under förlossningen kan avbryta eller förändra arbetskraft, så iaktta försiktighet. - Efter leverans eller tidsperiod av intresse, stoppa inspelningen genom att högerklicka på "djur" och välja "stopp inspelningar, allt". Använd en magnet för att stänga av telemeter för att spara på batteriet, eftersom telemeter batteriet normalt bara varar i 1,5 månader av kontinuerlig inspelning.
- Euthanize musen genom CO2 överdos och återvinna telemeter. Valpar avlivas genom halshuggning.
- Placera telemeter i en lösning av 1% enzym tvättmedel i avjoniserat vatten över natten vid rumstemperatur.
- Skölj telemeter i avjoniserat vatten och ta bort alla vävnader och lim, försiktigt så att inte pressa katetern.
- Inkubera telemeter i 2% glutaraldehyd under 24 h vid rumstemperatur för att sterilisera.
- Skölj telemeter med steril koksaltlösning och förvara den i steril koksaltlösning tills nästa implantation eller för att skickas tillbaka till tillverkaren för att vara renoverade. Avståndsmätare ska renoveras om vävnad ligger inne i katetern efter sterilisering. Normalt avståndsmätare kan användas 4-5 gånger innan det måste renoveras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Realtids in vivo intrauterina trycket kan spelas in med hjälp av ett telemetriska förvärvssystem. Tryck provtagning parat med samtidig videoinspelning av musen användes för att fånga den exakta tidpunkten för varje valp leverans och korrelerar leveranstid till intrauterint tryck hos modern. Alla datapunkter kan sedan ritas hela inspelningen för att alstra en tryck-kontra-tid-kurva (Figur 1A). Denna kurva visar de punkter under dräktigheten när intrauterina tryckförändringar såväl som skillnaden i tryck mellan de mörka och ljusa cykler. Dessutom kan ett glidande medelvärde av intrauterint tryck ritas (Figur 1B). Detta är användbart för att lättare visualisera ihållande ökningar i intrauterin tryck karakteristisk för sammandragningar i samband med arbetsprocessen (inspelningar som erhållits i samband med förlossningen har tidigare publicerats 9).
Data kan analyseras ytterligare genom att exportera datapunkter till analysprogram och medelvärdes data över tidsperioden av intresse. När man jämför olika experimentella förhållanden, såsom vildtyp kontra transgena möss, dag eller timme påtryckningar från olika möss kan medelvärdes att undersöka kontraktila mönster beroende på genen av intresse. Dessutom kan den statistiska signifikansen av alla skillnader fastställas. Intrauterina trycket kan undersökas under förlossningen, eller en longitudinell studie kan genomföras för att undersöka hela graviditetsperioden under olika förhållanden.
Intrauterin telemetri kan användas för att testa in vivo svar på farmakologiska medel under graviditeten. Specifikt ger denna metod för tidig drogtester före kliniska prövningar. Skillnader i svar på specifika medel kan testas i transgena möss, såväl som i icke-dräktiga eller gravida möss. Ett specifikt farmakologiskt medel kända för att öka uterine kontraktion, oxitocin, kan levereras subkutant såsom tidigare beskrivits i en råttmodell 10. Telemetern kan implanteras samtidigt som en mikro osmotisk pump för att leverera en jämn hastighet av oxytocin. Skillnader i inspelningar mellan icke-gravida (Figur 2A) och gravid (Figur 2B) möss med administration av oxytocin kan också undersökas.
En annan potentiell tillämpning av intrauterin telemetri är att titta på uteruskontraktioner efter miRNA / shRNA tysta proteiner. Musmodeller är inte tillgängliga för alla gener som är viktiga för nedkomst. Således kan gentystande i kombination med intrauterina tryckmätningar användas för att undersöka proteiner av intresse. Genom att injicera miRNA-uttryck lentivirusvektorer in i myometrium under implantation av telemeter, kan livmoderspecifik knockdown av en gen av intresse undersökas, vilket kan ses i figur 3A. En färsk undersökning visarett specifikt exempel som visar att Kir7.1 kanalen har en viktig roll i inaktivitet i livmodern efter att ha använt både miRNA och telemetri för att undersöka förändringar intrauterint tryck i hela dräktigheten 11. Representativa kurvor av oordning miRNA (figur 3A) eller Kir7.1 miRNA (figur 3B) visar att knacka ner expression av kaliumkanalen Kir7.1 orsakade intrauterint tryck att öka. Dessa representativa kurvor liknar vad som ses i transgena musmodeller som tidigare beskrivits 9.
Figur 1: Representant kontinuerlig intrauterint tryck inspelning (A) Realtids intrauterin tryckdata som spelats in vivo kontinuerligt under fyra dagar (15-19 DPC).. (B) Moving timmedelvärde av data i (A). WhITE och svarta ränder ovanpå inspelningar visar 12 tim ljusa och mörka cykler, respektive. (C) En zoomas in spår av mus in vivo enskilda sammandragningar. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Intrauterina tryck som svar på oxytocin Representativa tracings av intrauterint tryck från icke-gravida (NP) myometrium (A) och sen gravid (18 DPC) myometrium (B) utsätts för 5 enheter / dag av oxytocin för 24 tim visar ökningar. i tryck i slutet gravida kontra NP möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mätning av intrauterin tryck efter tysta av en kaliumkanal av miRNA / shRNA (A) Schematisk bild av placeringen av telemeter och platserna för injektion av miRNA-uttryck lentivirus.. Nya studier har visat de representativa kurvor av intrauterint tryck från myometrium transducerad med (B) förvrängd miRNA eller (C) Kir7.1 miRNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersökningar av myometrial kontraktilitet har förlitat sig på ex vivo mätningar av muskelspänningar. Denna metod kan vara användbart för tidigt stadium testning av nyutvecklade uterotona läkemedel som inte kan administreras på levande djur. Men in vivo metoder är nödvändiga för att i längdled förstå utvecklingen av arbetskraft. De in vivo mätningar tjänar flera syften. Först de möjliggör infångning av en fullständig bild av förändringar i livmoder kontraktila mönster över under graviditeten. För det andra, eliminera de bias av ex vivo inspelningar som kräver livmodervävnad kan monteras antingen vertikalt eller horisontellt, vilket begränsar vår förståelse av hela rollen av den cirkulära och longitudinella muskellagret i livmodern. För det tredje, de tillåter inspelning av livmodertrycket i den endogena hormonella miljön, vilket gör det möjligt att mer exakt studera nedkomst i musmodeller. Slutligen de möjliggör mer translational undersökningar mellan musmodeller och människor som livmoder telemetri mer liknar mätningar hos gravida kvinnor med intrauterin tryckkatetrar.
Metoderna för musen livmoder telemetri är lätt att lära sig, men svårt att bemästra. Utredare med tidigare mus kirurgi erfarenhet kan nå framgång snabbare, men detta bör inte avskräcka labb från att använda denna värdefulla teknik. De ursprungliga studier med mus livmoder telemetri gjordes av en nybörjare med stor framgång efter några försök, så labb bör vara redo för den första par operationer för att orsaka dammen att förlora alla foster. Här är några tips att tänka på. Som med all kirurgi, är den kortaste varaktig bäst för djuret. En snabb operation kommer att begränsa uttorkning och behovet av ytterligare doser av anestesi. Om forskaren har en svår tid efterbehandling förfarandet vid musen vaknar, kan isofluran användas för att hålla musen anesthetized längre. Vi har också funnit att användningen av isofluran ökar antalet livsdugliga valpar och är att föredra framför ketamin. Den minsta snittet möjligt, bara något större än kroppen av telemeter, kommer att minska risken för att såret gapande senare, minskar tiden som behövs för att sutur, och förbättra återvinningen musen. Med ett litet buksnitt, kommer att dra livmodern utanför kroppen hålighet möjliggöra bättre synlighet vid kateterinläggning. Vid återanvändning en telemeter, faktor i den tidigare kurvan av katetern när du trär ner livmoderhornet. Att låta den kirurgiska limmet härda helt innan du lägger livmoderhornet tillbaka inuti kroppen hålighet kommer att hålla katetern på plats och hindrar limmet fastnar tarmarna. Telemetern kroppen kan skada levern om de placeras för högt, och musen buk kan expandera i stor utsträckning, så tveka inte att placera telemeter lägre i kroppen. Dessa metoder måste anpassas to passa behoven hos olika laborationer och olika musmodeller, men fördelarna med livmoder telemetri uppväger hindren.
Det finns vissa begränsningar som bör beaktas vid genomförandet av denna metod. En av de viktigaste utmaningarna som måste övervinnas är graden av missfall efter implantation av sändaren. I den intrauterina telemetri ursprungliga rapporten 9, hade alla transgena SK3 T / T och möss av vildtyp någon grad av missfall hos en eller båda livmoderhornen oavsett om det hornet valdes för telemeter placering. Optimering av valet av dag under graviditeten då telemeter var inopererad förbättrat vår hastighet av framgångsrika sikt graviditeter, men en full uppsättning av valparna var aldrig erhållits. Noterbart är den optimala operationsdagen för SK3 T / T-möss skilde sig från den i vildtyp, med bättre reproduktiva utfall noterades vid dpc12-13 för SK3 T / T-möss kontra dpc8-9 för WT möss, suggesting att operationen protokollet kan behöva ändras för varje musmodell av intresse. Våra data visade att antalet kutar birthed inte korrelerar med övergripande intrauterint tryck. Fostrets utfall förbättrades med förbättrade kirurgiska färdigheter genom försöks, och andra som har genomfört denna metod i sitt laboratorium har noterat att fetala utfall förbättras med hjälp av isofluran istället för ketamin. Det förväntas att eftersom fler laboratorier använder denna metod, kommer tekniken sändare och intrauterin analysprogram blivit mer raffinerad. Detta kommer utan tvekan att föra nyttan av denna teknik i studier av de mekanismer som bidrar till arbetskraft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Glue | 3M Vetbond | 1469SB | Tissue Adhesive--stored in Drierite |
| Absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | J212H | Vicryl |
| Non-absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | 8706H | Prolene |
| Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymer | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | Specialized for rodents |
| Bead sterilizer | Keller | Z378577 | Steri 250 Sterilizer |
| Disecting Microscope | Nikon | SMZ754 | Fibre optic gooseneck external light source |
| Sterile Surgical Gloves--Latex | Cardinal Health Triflex | 2D7253 | |
| PhysioTel PA-C10 Pressure Transmitter | Data Sciences International | 270-0135-001 | TA11PA-C10 |
| Telemeter Reciever | Data Sciences International | 272-6001-001 | RPC-1 |
| Dataquest ART 4.3.2 Analysis Platinum | Data Sciences International | 271-0147-141 | Analysis software |
| Diet Recovery Gel | Clear H2O | 72-01-5022 | Purified Soft Diet for Rodents |
| Tergazyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme detergent |
References
- Slattery, M. M., Morrison, J. J. Preterm delivery. Lancet. 360, 1489-1497 (2002).
- Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371, 75-84 (2008).
- Keelan, J. A. Pharmacological inhibition of inflammatory pathways for the prevention of preterm birth. Journal Of Reproductive Immunology. 88, 176-184 (2011).
- Voltolini, C., et al. Understanding spontaneous preterm birth: from underlying mechanisms to predictive and preventive interventions. Reproductive Sciences. 20, 1274-1292 (2013).
- Ratajczak, C. K., Muglia, L. J. Insights into parturition biology from genetically altered mice. Pediatric research. 64, 581-589 (2008).
- Rajakumar, A., et al. Placental HIF-1 alpha, HIF-2 alpha, membrane and soluble VEGF receptor-1 proteins are not increased in normotensive pregnancies complicated by late-onset intrauterine growth restriction. American Journal Of Physiology. Regulatory, Integrative And Comparative Physiology. 293, (2007).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American journal of physiology. Heart And Circulatory Physiology. 286, H2408-H2415 (2004).
- Mackay, L. B., Shi, L. B., Maul, H. ., Maner, W. L., Garfield, R. E. The effect of bilateral pelvic neurectomy on cervical ripening in pregnant rats. Journal Of Perinatal Medicine. 37, 263-269 (2009).
- Pierce, S. L., Kutschke, W., Cabeza, R., England, S. K. In vivo measurement of intrauterine pressure by telemetry: a new approach for studying parturition in mouse models. Physiol Genomics. 42, 310-316 (2010).
- Imamura, T., Luedke, C. E., Vogt, S. K., Muglia, L. J. Oxytocin modulates the onset of murine parturition by competing ovarian and uterine effects. American Journal Of Physiology. Regulatory, Integrative And Comparative Physiology. 279, R1061-R1067 (2000).
- McCloskey, C., et al. The inwardly rectifying K+ channel KIR7.1 controls uterine excitability throughout pregnancy. EMBO Mol Med. 6 (9), 1161-1174 (2014).
