Abstract
Cartographie optique se est avérée être une technique utile pour détecter l'activité électrique cardiaque à la fois ex vivo intact cœurs et dans des monocouches de myocytes cultivés. cellules HL-1 ont été largement utilisés comme un modèle cellulaire 2 dimensions pour étudier divers aspects de la physiologie cardiaque. Cependant, il a été un grand défi à la carte optiquement calcium (Ca) transitoires et potentiels d'action simultanément à partir du même champ de vision dans une culture cellulaire HL-1 auriculaire monocouche. Ce est parce que la manipulation spéciale et de soins est nécessaire pour préparer les cellules saines qui peuvent être capturées électriquement et optiquement mappés. Par conséquent, nous avons développé un protocole de travail optimal pour la cartographie optique double canal. Dans ce manuscrit, nous avons décrit en détail comment réaliser l'expérience de cartographie optique double canal. Ce protocole est un outil utile pour améliorer la compréhension de l'action potentielle propagation et la cinétique Ca dans le développement de l'arythmie.
Introduction
Un uniques calcium (Ca) et la tension (V m) technique de cartographie optique double canal 1-5 est en train de devenir un outil efficace pour enregistrer simultanément V m et Ca signaux dans les deux coeurs intacts et des monocouches de cellules cultivées. Cette technique permet d'obtenir des informations puissante concernant la relation entre les transitoires de calcium et potentiels d'action afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents électrophysiologiques d'arythmies cardiaques.
Des monocouches de cellules cultivées se sont avérés être un modèle utile pour étudier cellulaire électrophysiologie cardiaque et le mécanisme sous-jacent d'arythmies. 4,6-8 HL-1 sont des cellules d'une ligne de culture des myocytes auriculaires bien caractérisé. cellules HL-1 maintiennent également un génotype et le phénotype différencié unique qui comprend morphologique, électrophysiologique, et les caractéristiques pharmacologiques de myocytes auriculaires adultes. Ces cellules expriment des gènes et des protéines cardiaques, y compris important canaux ioniques cardiaque (ce est à dire, L et canaux calciques de type T) 9 et matures isoformes de protéines contractiles sarcomériques trouvent normalement dans les myocytes auriculaires adultes que les autres et nous avons indiqué précédemment. 10-13 En outre, HL-1 cellules peuvent être cultivées pour former un 2 dimensions (2-D) myocytes monocouche. Ainsi, les avantages de l'utilisation de culture des monocouches de HL-1 comprennent: 1) coût relativement bas et plus facile à maintenir une ligne de la culture des myocytes que d'isoler et cultiver les myocytes néonataux primaires; 2) une monocouche confluente de cellules réduit la complexité de structure qui résultent de la structure 3-D du coeur; 3) une monocouche cellulaire peut éliminer l'interférence de la fibrose interstitielle qui se produit dans le coeur intact. Ceci peut être utilisé pour disséquer les fonctions électrophysiologiques spécifiques d'un groupe de myocytes sans interférence des fibroblastes et la matrice interstitielle; 4) l'évaluation des conséquences fonctionnelles de la manipulation pharmacologique ou génétique en culmonocouches de cellules turés peuvent être effectivement atteints. Par conséquent, HL-1 cellules sont devenues un modèle cellulaire largement utilisé pour étudier divers aspects de la physiologie myocytes ainsi que les activités électriques anormales induite stimulation. 13-16 Cependant, un traitement spécial et des soins est requis à la culture des monocouches de cellules saines qui répondent à l'extérieur la stimulation électrique pour les études de cartographie optiques. En outre, double procédure colorant fluorescent coloration peut facilement endommager l'intégrité des monocouches de cellules confluentes cultivées. Ainsi, l'exécution V m / CA double canal cartographie optique de culture HL-1 monocouches a été un grand défi.
L'objectif de cette méthode est de fournir les étapes clés pour effectuer avec succès cartographie optique double canal en culture HL-1 monocouches. Ici, nous avons fourni de nombreux détails sur un protocole optimisé pour une préparation monocouche HL-1 de la cellule, cartographie optique à deux canaux d'une monocouche de cellules cultivées, et le traitement des données de cartographie.
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Protocol
1. Solution Préparation
- Noradrénaline (NP) solution
- Dissoudre 40 mg de NP dans 25 ml de 30 mM d'acide ascorbique (0,1475 g d'acide ascorbique dans 25 ml d'eau Milli-Q (MQ) de l'eau purifiée. Éviter l'exposition lumière directe lors de cette préparation de solution, car la noradrénaline (NP) est sensible à la lumière.
- Filtrer la solution à NP avec un filtre à seringue de 0,22 um. Aliquoter la solution dans 1 ml microtubes stériles et conserver à -20 ° C. Une fois congelés, NP est stable pendant un mois.
- Complété Laver et final Claycomb médias
- Commencez avec 43,5 ml de milieu Claycomb et de compléter avec 5 ml de sérum de veau fœtal (FBS), 0,5 ml de pénicilline / streptomycine, 0,5 ml de NP et 1: 100 diluée L-glutamine pour faire 50 ml de milieu final Claycomb complétée. Éviter l'exposition de la lumière directe pendant cette préparation de la solution parce moyenne Claycomb est sensible à la lumière.
- Préparer le milieu de lavage Claycomb utilisant la même recette que l'supmoyenne complétée Claycomb sauf ajouter 5% de FBS et omettre le NP et les composants de la L-glutamine.
NOTE: Les médias final et Wash Claycomb complété sont bons pour deux semaines lorsqu'il est conservé à 4 ° C sans exposition à la lumière directe.
- Trypsine de soja solution inhibitrice
- Dissoudre 25 mg d'inhibiteur de trypsine de soja dans 100 ml de solution saline tamponnée au phosphate sans Ca et Mg libre de Dulbecco (PBS).
- Filtrer la solution à l'aide d'un filtre à seringue de 0,22 um.
REMARQUE: La solution stérilisée est stable pendant un mois lorsqu'il est conservé à 4 ° C.
- solution de gélatine / fibronectine plat revêtement
- Dissoudre 0,1 g de gélatine dans 500 ml d'eau MQ pour faire 0,02% de gélatine.
- Autoclave, puis diluer 1 ml de fibronectine dans 199 ml de 0,02% de gélatine et mélanger délicatement.
- Aliquote 6 ml de solution de gélatine dans des tubes séparés et conserver à -20 ° C.
- La solution de sel de Hank
- Utiliser un émoiplaque, dissoudre les sels suivants dans l'eau MQ (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5,366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0,4000), MgSO 4 (0,8142), D-Glc (5,051), NaHCO 3 (4,162), HEPES (5,042), CaCl 2 (1,261).
- Calcium colorant sensible (Rhod2) solution
- Diluer 1 mg de poudre sèche Rhod2 dans 400 pi de 20% de Pluronic F-127 dans du DMSO pour faire un Rhod2 colorant solution de stock et conserver à -20 ° C.
- Diluer cette solution de stock 1: 1000 avec la solution de sel de Hanks pour obtenir une solution de travail final avant de commencer l'expérience.
- Tension colorant sensible (Rh237) solution
- Diluer 5 mg de Rh237 avec 2 ml de DMSO pour faire une solution de stock et conserver à -20 ° C. Diluer la solution de stock 1: 1000 avec la solution de sel de Hanks pour obtenir une solution de travail final avant de commencer l'expérience.
& #160; REMARQUE: 04.01 solutions sont basées sur le HL-1 Claycomb protocole de culture cellulaire avec des modifications mineures.
2. Le repiquage et culture des HL-1 auriculaire myocytes sur des lamelles
NOTE: Les cellules HL-1 peuvent être obtenus auprès du Dr. Claycomb (Louisiana State University).
- Cultivez HL-1 cellules dans des flacons T25 et nourrir avec 5 ml d'complétée Claycomb moyenne quotidienne. Passage des cellules en flacons T25 tous les cinq jours selon la Claycomb HL-1 protocole de culture cellulaire (décrite ci-dessous) 10.
- La place des lamelles rondes (diamètre 20 mm) en culture à 12 puits des plaques de 24 heures avant que les cellules dans le flacon T25 sont entièrement confluentes et prêtes à être repiquées, puis couvrir les lamelles avec de la gélatine / de la fibronectine pendant une nuit à 37 ° C.
- Le lendemain, aspirer et jeter la gélatine / fibronectine des plaques de culture et le remplacer par 1,5 ml de milieu supplémenté final Claycomb dans chaque puits.
- Fractionner les cellules d'une cultur T25e flacon après avoir atteint pleine confluence au jour 5. Aspirer le milieu du flacon T25 contenant la culture de confluence et rincer la culture rapidement avec du PBS à 37 ° C.
- Aspirer le PBS et ajouter 3 ml de 0,05% de trypsine / EDTA à 37 ° C en pipetant la trypsine / EDTA dans le fond du flacon T25 pour éviter le contact direct avec les cellules. Incuber à 37 ° C pendant 1 min.
- Retirer la trypsine / EDTA par aspiration et ajouter un autre 1,3 ml de trypsine / EDTA par flacon T25. Incuber à température ambiante pendant 1 min. Examiner sous un microscope et si les cellules sont encore attachés au ballon, appuyez sur pour déloger entièrement cellules restantes.
- Ajouter 1,3 ml d'inhibiteur de trypsine de soja pour les cellules et les cellules de transfert à partir de la fiole dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Rincer la fiole vide avec 5 ml de milieu de lavage Claycomb. Ajouter le liquide de rinçage pour les cellules dans le tube de 15 ml de la centrifugeuse. Centrifuger à 500 g pendant 5 min.
- Après centrifugation, aspirer le surnageant et remettre en suspension doucement le culot cellulairedans 6 ml de milieu supplémenté final Claycomb.
- Ensemencer chaque puits d'une plaque à 12 puits avec 0,5 ml de suspension de cellules à partir de passages de cellule. Nourrir les cellules avec un milieu frais complété final Claycomb quotidienne.
REMARQUE: Surveiller de près la croissance des cellules, généralement les monocouches de cellules confluentes atteindre le statut le jour 4 et les activités spontanées restent visibles. Ensuite, la culture monocouche sera prêt pour la cartographie optique sur 4-5 jours.
3. Chargement de calcium et de tension colorants sensibles aux cellules
- Pour les études de cartographie optique, retirez délicatement la lamelle de la plaque de culture cellulaire de 12 puits et rincer avec la solution de sel de Hanks.
- Pour colorer les cellules avec le colorant sensible Ca Rhod2, incuber la monocouche de cellules sur la lamelle couvre-objet avec 3 ml de la oxygénée (barbotage avec 5% de CO2 / 95% d'O 2 gazeux) de la solution de travail Rhod2 à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 30 min .
- Pour colorer les cellules avec V m colorant sensibleRh237, immerger la monocouche cellulaire Rhod2 chargé dans 3 ml de solution de travail Rh237 oxygénée à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 15 min.
Cartographie 4. Double canal optique
- Placer la monocouche cellulaire, qui est coloré avec du double-V m colorants et Ca, dans une chambre de circulation sur un microscope à fluorescence inversé. Utiliser un système de circulation chauffé pour maintenir la température de la chambre de cellule à 35 ± 1 ° C. Contrôler soigneusement la température du liquide de perfusion en réglant la vitesse du flux circulant à travers la chambre afin d'éviter un gradient de plus de 0,3 ° C à travers la chambre.
- Avant d'enregistrer V m / signaux Ca, laver la monocouche cellulaire avec une solution fraîche Hanks pendant environ 5 min pour éliminer le colorant reste des étapes de coloration précédentes.
- Pace monocouches de cellules en bonne santé en utilisant une électrode bipolaire composée d'une pipette en verre rempli d'une solution saline de Hanks et un silver fil enroulé autour de la pointe de la pipette comme décrit précédemment 12,17.
- Pace monocouches de cellules saines à une longueur de cycle de 200-500 ms et de largeur d'impulsion de 2 ms, attendent un seuil de stimulation à environ 1 mV.
NOTE: Pour chaque lot de monocouches de culture, au moins deux monocouches non traitées doivent être utilisés pour tester l'état de la charge de la cellule. Monocouches témoins en bonne santé devraient être en mesure d'être capturé par la stimulation électrique à la durée du cycle de 200-500 ms. Si les monocouches de contrôle ne parviennent pas à être électriquement rythme, cela suggère que l'ensemble du lot de cellules peut ne pas convenir pour des expériences de cartographie optique. - Pour exciter à la fois m et V Ca colorants sensibles, utiliser une source de lumière à LED (520 nm de longueur d'onde) couplé à un filtre d'excitation (510 nm / 40) et un miroir dichroïque (561 nm).
- Recueillir les signaux fluorescents émis par les cellules par l'intermédiaire d'un objectif 40X et divisée avec un miroir dichroïque (594 nm) dans un composant de m V et d'un composant de Ca.On filtre la lumière émise dans le canal de m V avec un filtre passe longue (700 nm) et la lumière émise dans le canal de Ca avec un filtre passe-bande (585/40 nm).
- Collecter la lumière fluorescente filtrés en utilisant deux caméras CCD (80 x 80 pixels, 1000 fps; redshirt imagerie).
- Pour éviter colorant photoblanchiment, faire des enregistrements pour les moins de 2 s sur chaque champ de vue de limiter le temps d'exposition à la lumière. Ici, l'image généralement quatre domaines différents pour chaque monocouche.
5. Traitement des données de V m ou Ca Recordings
- Pour les deux V m et signaux Ca (80 x 80 pixels), la moyenne des valeurs d'intensité de vingt-cinq (5 x 5) pixels voisins dans une valeur d'intensité à différents points de temps d'enregistrement pour réduire le bruit de fond.
NOTE: Après le calcul de la moyenne de données, chaque point de la durée d'enregistrement d'un potentiel d'action individuelle ou transitoire Ca donne une matrice de données contenant 16 x 16 valeurs d'intensité moyenne (moyennedes canaux de données) avec une résolution spatiale de 50 um. - Définir temps d'activation (AT) des signaux enregistrés Ca m V ou.
- Pour définir un temps d'activation (AT) d'un potentiel d'action individuel ou Ca transitoire, déterminer le temps de 50% de l'amplitude de crête des signaux de Ca en utilisant un algorithme basé sur MATLAB sur mesure m V ou comme décrit précédemment. 12
- Manuellement relire l'AT analysé pour éliminer les erreurs qui peuvent survenir lors de l'analyse du programme.
- Stocker les AT matrice définie (16 x 16 en moyenne canaux de données) de potentiel d'action enregistrée et transitoire de calcium, respectivement, dans le logiciel utilisé.
- Calculer potentiel d'action ou de calcium transitoires vitesse de conduction (CV) des vecteurs de la matrice à l'aide de la méthode d'analyse du champ de vecteur tel que décrit précédemment avec des modifications mineures 12,18.
- Calculer le vecteur de CV d'un canal de données par rapport à son environnement à des points de données (5 ×; 5 voisine moyenne canaux de données) pour simuler une surface polynomiale lisse du temps d'activation (à la surface) en utilisant un algorithme des moindres carrés dans le programme MATLAB 12,18.
- Calculer vecteur de conduction en utilisant les formules ci-dessous
Formule 1:
Formule 2:
θ = arctan [(dy / dt) / (dx / dt)]
REMARQUE: Ve est un vecteur de CV projeté à x et y axes; dx / dt est la projection du vecteur de CV en abscisse; dy / dt est la projection du vecteur de CV dans l'axe y. T est la surface AT; x, y désignent les coordonnées de la 2-D; T x = ∂T / ∂x est la dérivée partielle de T par rapport à x; T y = ∂T / ∂y est la dérivée partielle de T par rapport à y; θ est la direction finale d'un vecteur de CV. - Groupe tous les vecteurs de la matrice AT dans 36 voies, dont chacun couvre un secteur de dix degrés sur la boussole. </ Li>
- Sélectionnez la voie contenant la plus grande population des vecteurs CV parmi les 36 voies de conduction. Calculer le CV moyen de cette voie pour représenter le CV de la monocouche.
6. Visualisation de la Propagation front d'onde
- Normaliser l'intensité du signal d'un potentiel d'action individuelle ou Ca transitoire à différents points par rapport à sa valeur maximale en utilisant un logiciel MATLAB de temps d'enregistrement.
- Stocker temporairement les données d'intensité normalisées de tous les points de temps enregistrée dans une matrice de 16 x 16 intensité dans le logiciel MATLAB utilisé.
- Construire une carte à code couleur intensité de la matrice d'intensité stockées de chaque point de temps d'enregistrement en utilisant la fonction de surf.m.
NOTE: Dans la carte d'intensité, rouge représente haute intensité des signaux Ca m V ou, et bleu reflète faible intensité des signaux de fluorescence. - Créer un fichier .avi en utilisant la fonction de avifile.m.
- Conservez toutes les icartes ntensity à différents points de temps d'enregistrement du potentiel d'action ou Ca transitoire en utilisant la fonction de addframe.m.
NOTE: A ce stade, deux fichiers avi séparés de V m et Ca propagation seront générés.
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Representative Results
Une monocouche confluente culture présente un rythme intrinsèque régulière comme l'a démontré dans Movie 1. Nous avons ensuite effectué V m / Ca cartographie optique double canal dans un cadre entièrement confluentes HL-1 monocouche. Figure 1A montre des exemples de traces de V m et signaux Ca à partir d'une seule enregistrée battre. Cartes isochrones propagée uniformément représentatifs de m V et des signaux de Ca en utilisant le système de cartographie optique double canal sont représentés sur les figures 1B et 1C. Images chronologiques représentatifs de potentiels d'action uniforme propagées et transitoires Ca ont été obtenus de la même HL-1 la culture monocouche. Enfin, Films 2 et 3 donnent des exemples d'animation d'un potentiel d'action propagé uniforme (Vidéo 2) et transitoire de calcium (Movie 3) dans la HL-1 confluentes monocouche.
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Figure 1: (A) Exemples de traces V m (bleu) et Ca (rouge) à partir d'un battement stimulé électriquement à une longueur de cycle (CL) de 500 msec. (B) Une image de notre système de cartographie optique pour HL-1 monocouches. (C) une carte isochrone potentiel d'action de propagation à partir du même battement stimulé tout au long de l'ensemble du champ de vision. (D) Une carte isochrone de Ca propagation transitoire de la même battement rythmé tout le champ de vision. Dans les deux cartes isochrones, laps de temps est représenté avec des couleurs, à commencer par bleu foncé que l'initiation et rouge foncé à 50 ms. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2: (A) Une série de cartes de la répartition de V m à 60, 80, 140, et 200 ms après le début de l'enregistrement. (B) Cartes de répartition Ca à 60, 80, 140, et 200 ms après le début de l'enregistrement.
Film 1: Un film d'un mandataire inscrit confluentes HL-1 monocouche à la culture de cinq jours, sous un microscope optique avec un objectif 40X.
Film 2 : Un film représentant d'un potentiel d'action propagé à partir d'un battement rythmé à une CL de 500 ms.
Film 3 : Un film représentant d'un Ca transitoire propagé à partir d'un paced battu à une CL de 500 ms.
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Discussion
Cet article décrit les aspects clés de la cartographie optique dans une culture HL-1 auriculaire myocytes monocouche colorées avec calcium et de tension colorants fluorescents sensibles. Il comprend la culture d'un HL-1 monocouche cellulaire optimale, la configuration de l'équipement de la cartographie, la cartographie d'une monocouche de culture, et l'analyse des données.
Pour cartographier avec succès des cellules en culture, l'essentiel est de préparer une monocouche de cellules uniformément répartie. Lorsque l'ensemencement des cellules sur des lamelles, être sûr de se disperser uniformément les cellules. Toujours carte monocouches de cellules cultivées entièrement et complètement confluentes, car ceux-ci mieux répondre à une stimulation électrique. Il est également important de garder les cellules oxygénées pendant le chargement des colorants, mais les bulles d'oxygène ne doit pas entrer en contact direct avec les cellules car cela pourrait tuer ou de les déloger de la lamelle. L'abaissement de la concentration de colorant et de réduction de l'intensité de la lumière diminue l'amplitude du signal et de réduire le rapport signal sur bruit, tout en augmentant concentrations d tinctorialeset en améliorant l'intensité de la lumière va augmenter l'amplitude du signal, mais aussi augmenter le bruit. Par conséquent, un équilibre optimal entre la concentration de colorant fluorescent et la force de lumière d'excitation doit être déterminée pour améliorer le rapport signal sur bruit des signaux d'enregistrement. En outre, pendant l'enregistrement de cartographie optique, assurez-vous de ne pas exposer la monocouche cellulaire à de longues expositions de lumière concentrée car cela peut causer des dommages aux cellules photodynamique dans la zone de lumière exposée. Enfin, un système de cartographie optique qui offre une résolution spatiale et temporelle des signaux d'enregistrement est nécessaire pour obtenir des données de haute qualité.
Bien cartographie optique double canal dans les cœurs intacts a un grand potentiel pour l'étude de l'électrophysiologie cardiaque en raison de sa capacité à signaux de tension et de calcium virés simultanées, une limitation est que cette technique recueille de l'information à partir d'une surface 3-D comme une projection carte 2-D. 2-D obtenus données de coeurs intacts avec des informations ignorées de 3-D Curvature du cœur peut entraîner des erreurs dans l'analyse des données, en particulier dans l'analyse de la vitesse de conduction. Avec les avantages d'utiliser un HL-1 modèle de culture 2-D cellulaire, nous sommes en mesure de visualiser des rythmes réguliers et irréguliers, d'évaluer Ca transitoire et d'action cinétique potentiels, déterminer la vitesse de conduction et de caractériser Ca et les modes de propagation des potentiels d'action (uniforme ou non propagation uniforme) sans interférence de la structure 3-D d'un cœur intact. Par conséquent, la cartographie avec succès deux transitoires de calcium et potentiels d'action dans une culture HL-1 auriculaire myocytes monocouche comme une approche complémentaire peut grandement améliorer la compréhension des propriétés électrophysiologiques des myocytes auriculaires et les mécanismes sous-jacents de arythmogénèse auriculaire.
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Claycomb pour fournir des cellules HL-1 et le protocole d'entretien détaillé. Nous tenons également à remercier Mme Elena Carrillo et le Dr Seth Robia pour leur aide à générer le film cellulaire et M. Pete Caron pour son aide à la rédaction des accessoires pour notre double système de cartographie optique canal.
Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 à XA), National Institutes of Health (HL113640 à XA), et le Fonds de l'Université Loyola de recherches pour le développement (à XA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPEs | Sigma | H3375 |
References
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