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Biology

संवर्धित एच एल -1 अलिंद myocyte monolayer के वोल्ट और कैल्शियम दोहरी चैनल ऑप्टिकल मानचित्रण

Published: March 23, 2015 doi: 10.3791/52542
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1
1Department of Cell and Molecular Physiology, Loyola University Chicago, 2Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Bioengineering, Clemson University
* These authors contributed equally

Abstract

ऑप्टिकल मानचित्रण दिलों विवो पूर्व दोनों अक्षुण्ण पर और सुसंस्कृत myocyte monolayers में हृदय की विद्युतीय गतिविधि का पता लगाने के लिए एक मूल्यवान तकनीक साबित हो गया है। एच एल -1 कोशिकाओं को व्यापक रूप से हृदय शरीर क्रिया विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक 2-आयामी सेलुलर मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, यह एक सुसंस्कृत एच एल -1 आलिंद सेल monolayer में देखने का एक ही क्षेत्र से एक साथ ऑप्टिकली नक्शा कैल्शियम (सीए) यात्रियों और कार्रवाई क्षमता के लिए एक बड़ी चुनौती रही है। विशेष हैंडलिंग और देखभाल विद्युत कब्जा कर लिया और ऑप्टिकली मैप किया जा सकता है कि स्वस्थ कोशिकाओं को तैयार करने के लिए आवश्यक है क्योंकि यह है। इसलिए, हम दोहरी चैनल ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए एक इष्टतम काम प्रोटोकॉल विकसित किया है। इस पांडुलिपि में, हम दोहरी चैनल ऑप्टिकल मानचित्रण प्रयोग करने के लिए कैसे विस्तार से वर्णन किया है। इस प्रोटोकॉल अतालता विकास में कार्रवाई संभावित प्रसार और सीए कैनेटीक्स की समझ को बढ़ाने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।

Introduction

एक अनूठी कैल्शियम (सीए) और वोल्टेज (वी एम) दोहरी चैनल ऑप्टिकल मानचित्रण तकनीक 1-5 एक साथ बरकरार दिल और सुसंस्कृत सेल monolayers दोनों में वी एम और सीए संकेतों को दर्ज करने के लिए एक कुशल उपकरण के रूप में उभर रहा है। इस तकनीक के लिए यह संभव बेहतर कार्डियक arrhythmias की अंतर्निहित electrophysiological तंत्र को समझने के लिए कैल्शियम यात्रियों और कार्रवाई क्षमता के बीच संबंध के बारे में शक्तिशाली जानकारी प्राप्त करने के लिए बनाता है।

संवर्धित सेल monolayers हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और arrhythmias के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी सेलुलर मॉडल साबित किया है। 4,6-8 एच एल -1 कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से विशेषता आलिंद myocyte संस्कृति लाइन कर रहे हैं। एच एल -1 कोशिकाओं को भी शब्द के भागों, electrophysiologic, और वयस्क आलिंद myocytes की pharmacologic विशेषताओं में शामिल है कि एक विशिष्ट भेदभाव जीनोटाइप और phenotype बनाए रखें। इन कोशिकाओं को importa सहित हृदय जीन और प्रोटीन, व्यक्तNT हृदय आयन चैनल (यानी, एल और टी प्रकार कैल्शियम चैनल) 9 और sarcomeric सिकुड़ा प्रोटीन की परिपक्व isoforms के सामान्य रूप से दूसरों के रूप में वयस्क आलिंद myocytes में पाया जाता है और हम पहले से सूचित किया है। 10-13 इसके अलावा, एच एल -1 कोशिकाओं किया जा सकता है एक दो आयामी (2 डी) myocyte monolayer के लिए फार्म का सुसंस्कृत। इस प्रकार, सुसंस्कृत एच एल -1 monolayers के प्रयोग के लाभ में शामिल हैं: 1) अपेक्षाकृत कम लागत और आसान अलग और प्राथमिक नवजात myocytes संवर्धन की तुलना में एक myocyte संस्कृति लाइन बनाए रखने के लिए; 2) कोशिकाओं का एक मिला हुआ monolayer के दिल के 3-डी संरचना से परिणाम है कि संरचनात्मक जटिलताओं को कम कर देता है; 3) एक सेल monolayer बरकरार दिल में होता है कि मध्य फाइब्रोसिस के हस्तक्षेप को समाप्त कर सकते हैं। इस fibroblasts और मध्य मैट्रिक्स के हस्तक्षेप के बिना myocytes के एक समूह के विशिष्ट electrophysiological कार्यों काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; संस्कृति में औषधीय या आनुवंशिक हेरफेर से कार्यात्मक परिणामों की 4) मूल्यांकनखंडित सेल monolayers को प्रभावी ढंग से हासिल किया जा सकता है। इसलिए, एच एल -1 कोशिकाओं myocyte शरीर क्रिया विज्ञान के विविध पहलुओं के साथ-साथ पेसिंग प्रेरित असामान्य विद्युत गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल सेलुलर मॉडल बन गए हैं। बाह्य का जवाब है कि 13-16 हालांकि, विशेष हैंडलिंग और देखभाल संस्कृति के लिए आवश्यक है स्वस्थ सेल monolayers ऑप्टिकल मानचित्रण पढ़ाई के लिए बिजली पेसिंग। इसके अलावा, दोहरी फ्लोरोसेंट डाई धुंधला प्रक्रिया आसानी से सुसंस्कृत मिला हुआ सेल monolayers की अखंडता को नुकसान हो सकता है। इस प्रकार, सुसंस्कृत एच एल -1 monolayers में प्रदर्शन कर वी एम / सीए दोहरी चैनल ऑप्टिकल मानचित्रण एक बड़ी चुनौती रही है।

इस विधि के लक्ष्य को सफलतापूर्वक सुसंस्कृत एच एल -1 monolayers में दोहरी चैनल ऑप्टिकल मानचित्रण प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण कदम प्रदान करना है। यहाँ हम एच एल -1 सेल monolayer तैयारी, एक सुसंस्कृत सेल monolayer की दोहरी चैनल ऑप्टिकल मानचित्रण, और मानचित्रण डेटा प्रसंस्करण के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल पर व्यापक जानकारी प्रदान की है।

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Protocol

1. समाधान तैयारी

  1. Norepinephrine (एनपी) समाधान
    1. । शुद्ध मिल्ली क्यू (MQ) पानी की 25 मिलीलीटर में 30 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड (0.1475 जी एस्कॉर्बिक एसिड के 25 एमएल में एनपी की 40 मिलीग्राम भंग नोरेपिनेफ्रिने (एनपी) प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, क्योंकि इस समाधान की तैयारी के दौरान प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम से बचें।
    2. 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ एनपी समाधान फ़िल्टर। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर बाँझ microtubes में समाधान और दुकान विभाज्य। जमे हुए एक बार, एनपी एक महीने के लिए स्थिर है।
  2. पूरक वॉश और अंतिम Claycomb मीडिया
    1. Claycomb माध्यम के 43.5 मिलीलीटर के साथ आरंभ और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 5 मिलीलीटर, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 0.5 मिलीलीटर, एनपी के 0.5 मिलीलीटर और एक साथ पूरक: अंतिम पूरक Claycomb माध्यम के 50 मिलीलीटर बनाने के लिए एल Glutamine पतला 100। Claycomb मध्यम प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, क्योंकि इस समाधान की तैयारी के दौरान प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम से बचें।
    2. समर्थन के रूप में एक ही नुस्खा का उपयोग कर धो Claycomb मध्यम तैयारसिवाय plemented Claycomb मध्यम 5% FBS के जोड़ और एनपी और एल Glutamine घटकों न आना।
      नोट: प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम के बिना चार डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब पूरक अंतिम और धो Claycomb मीडिया दो सप्ताह के लिए अच्छा कर रहे हैं।
  3. सोयाबीन trypsin निरोधात्मक समाधान
    1. सीए-मुक्त और मिलीग्राम से मुक्त है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा की 100 मिलीलीटर (पीबीएस) में सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला के 25 मिलीग्राम भंग।
    2. 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर।
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब निष्फल समाधान एक महीने के लिए स्थिर है।
  4. जिलेटिन / फ़ाइब्रोनेक्टिन पकवान कोटिंग समाधान
    1. 0.02% जिलेटिन बनाने के लिए MQ के पानी की 500 मिलीलीटर में जिलेटिन की 0.1 ग्राम भंग।
    2. आटोक्लेव, तो 0.02% जिलेटिन की 199 मिलीलीटर में फ़ाइब्रोनेक्टिन के 1 मिलीलीटर पतला और धीरे मिश्रण।
    3. विभाज्य -20 डिग्री सेल्सियस पर जिलेटिन अलग ट्यूबों में हल और दुकान के 6 मिलीलीटर।
  5. हैंक्स 'नमक समाधान
    1. एक हलचल का प्रयोगथाली, सोडियम क्लोराइड (136.9), KCl (5.366), के.एच. 2 पीओ 4 (0.4409), नाह 2 पीओ 4 (0.4000), MgSO 4 (0.8142), डी-GLC MQ के पानी (mmol / एल) में निम्न लवण भंग (5.051), 3 NaHCO (4.162), HEPES (5.042), 2 CaCl (1.261)।
  6. कैल्शियम संवेदनशील डाई (Rhod2) समाधान
    1. एक Rhod2 -20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर समाधान और दुकान डाई बनाने के लिए DMSO में 20% Pluronic एफ-127 के 400 μl में Rhod2 शुष्क पाउडर की एक मिलीग्राम पतला।
    2. प्रयोग शुरू करने से पहले एक अंतिम काम कर समाधान बनाने के लिए 1000 हैंक्स 'नमक समाधान के साथ: इस शेयर समाधान एक पतला।
  7. वोल्टेज संवेदनशील डाई (Rh237) समाधान
    1. -20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर समाधान और दुकान बनाने के लिए DMSO के 2 मिलीलीटर के साथ Rh237 की 5 मिलीग्राम पतला। प्रयोग शुरू करने से पहले एक अंतिम काम कर समाधान बनाने के लिए 1000 हैंक्स 'नमक समाधान के साथ: शेयर समाधान एक पतला।

& #160; नोट: 1-4 समाधान मामूली संशोधन के साथ Claycomb एच एल -1 सेल संस्कृति प्रोटोकॉल पर आधारित हैं।

2. Passaging और संवर्धन एच एल -1 अलिंद myocytes coverslips पर

नोट: एच एल -1 कोशिकाओं डॉ Claycomb (लुइसियाना राज्य विश्वविद्यालय) से प्राप्त किया जा सकता है।

  1. T25 बोतल में एच एल -1 कोशिकाओं के विकास और दैनिक पूरक Claycomb माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ खाते हैं। पैसेज T25 में कोशिकाओं Claycomb एच एल -1 सेल संस्कृति प्रोटोकॉल (नीचे वर्णित) 10 के अनुसार हर पांच दिनों बोतल।
  2. 24 घंटा T25 फ्लास्क में कोशिकाओं से पहले 12 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में जगह दौर coverslips (20 मिमी व्यास) passaged, और फिर रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर जिलेटिन / फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ coverslips को कवर किया जाना पूरी तरह से मिला हुआ है और तैयार कर रहे हैं।
  3. अगले दिन, महाप्राण और संस्कृति प्लेटों से जिलेटिन / फ़ाइब्रोनेक्टिन त्यागने और अच्छी तरह से प्रत्येक में पूरक अंतिम Claycomb माध्यम की 1.5 एमएल के साथ बदलें।
  4. एक T25 संस्कृतियों से स्प्लिट कोशिकाओंमहाप्राण मिला हुआ संस्कृति युक्त T25 कुप्पी से मध्यम और 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के साथ संक्षिप्त संस्कृति कुल्ला दिन 5. पर पूर्ण संगम तक पहुंचने के बाद ई कुप्पी।
  5. महाप्राण पीबीएस और कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क से बचने के लिए T25 कुप्पी के तल पर / trypsin EDTA pipetting द्वारा 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिलीलीटर 0.05 की% / trypsin EDTA जोड़ें। 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. आकांक्षा से / trypsin EDTA निकालें और T25 फ्लास्क प्रति एक और trypsin के 1.3 मिलीग्राम / EDTA जोड़ें। एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। एक खुर्दबीन के नीचे की जांच करने और कोशिकाओं को अभी भी कुप्पी से जुड़े होते हैं, तो पूरी तरह से शेष कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए नल।
  7. एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में कुप्पी से कोशिकाओं और हस्तांतरण कोशिकाओं को सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला के 1.3 मिलीलीटर जोड़ें। धो Claycomb मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ खाली फ्लास्क कुल्ला। 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं को कुल्ला जोड़ें। 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र।
  8. , धीरे सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और centrifuging के बाद सेल गोली फिर से निलंबितपूरक अंतिम Claycomb माध्यम के 6 मिलीलीटर में।
  9. सेल passaging से सेल निलंबन के 0.5 मिलीलीटर के साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह बीज। दैनिक ताजा पूरक अंतिम Claycomb मध्यम के साथ कोशिकाओं फ़ीड।
    नोट: बारीकी से कोशिकाओं के विकास पर नजर रखने, आम तौर पर सेल monolayers 4 दिन पर मिला हुआ स्थिति तक पहुँचने और सहज गतिविधियों दिखाई रहेगा। फिर, सुसंस्कृत monolayer के दिन 4-5 पर ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए तैयार हो जाएगा।

कोशिकाओं के लिए 3. लोड हो रहा है कैल्शियम और वोल्टेज संवेदनशील रंजक

  1. ऑप्टिकल मानचित्रण अध्ययन के लिए, धीरे 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली से coverslip को हटाने और हैंक्स 'नमक के घोल से कुल्ला।
  2. सीए संवेदनशील डाई Rhod2 के साथ कोशिकाओं दाग करने के लिए, के 3 मिलीलीटर के साथ coverslip पर सेल monolayer सेते oxygenated 30 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर Rhod2 काम कर समाधान (5% सीओ 2/95% ओ 2 गैस के साथ बुदबुदाती) ।
  3. वी एम संवेदनशील डाई के साथ कोशिकाओं दागRh237, एक और 15 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर ऑक्सीजन Rh237 काम कर समाधान के 3 मिलीलीटर में Rhod2 लोड सेल monolayer विसर्जित कर दिया।

4. दोहरी चैनल ऑप्टिकल मानचित्रण

  1. एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर एक परिसंचरण चेंबर में, वी एम और सीए रंगों के साथ डबल दाग है जो सेल monolayer, रखें। 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर सेल चैम्बर के तापमान को रखने के लिए एक गर्म परिसंचरण तंत्र का प्रयोग करें। ध्यान से चैम्बर भर में अधिक से अधिक 0.3 डिग्री सेल्सियस के एक ढाल से बचने के लिए कक्ष के माध्यम से घूम प्रवाह की गति का समायोजन करके perfusate के तापमान को नियंत्रित।
    1. वी एम / सीए संकेतों रिकॉर्डिंग से पहले, पिछले धुंधला कदम से शेष डाई दूर करने के लिए लगभग 5 मिनट के लिए ताजा हैंक्स समाधान के साथ सेल monolayer धो लें।
  2. हैंक्स 'नमक समाधान और एक SILV से भरा एक गिलास पिपेट से बना एक द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हुए पेस स्वस्थ सेल monolayersएर पहले से ही विंदुक टिप के आसपास coiled तार 12,17 का वर्णन किया।
  3. लगभग एक एम वी एक पेसिंग दहलीज उम्मीद 2 मिसे के 200-500 मिसे और पल्स चौड़ाई का एक चक्र की लंबाई में पेस स्वस्थ सेल monolayers,।
    नोट: सुसंस्कृत monolayers के प्रत्येक बैच के लिए, कम से कम दो गैर इलाज monolayers के सेल बैच की हालत परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। स्वस्थ नियंत्रण monolayers के 200-500 मिसे के चक्र लंबाई में बिजली पेसिंग द्वारा कब्जा किया जा करने में सक्षम होना चाहिए। नियंत्रण monolayers के विद्युत पुस्तक जा करने में विफल रहते हैं, इस पूरे सेल बैच ऑप्टिकल मानचित्रण प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है कि पता चलता है।
  4. वी एम और सीए संवेदनशील रंगों दोनों उत्तेजित करने के लिए, एक उत्तेजना फिल्टर (510 एनएम / 40) और एक dichroic दर्पण (561 एनएम) के साथ मिलकर एक एलईडी प्रकाश स्रोत (520 एनएम तरंगदैर्ध्य) का उपयोग करें।
    1. एक वी एम घटक में एक dichroic दर्पण (594 एनएम) और एक सीए घटक के साथ एक 40x उद्देश्य और विभाजन के माध्यम से कोशिकाओं द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट संकेतों लीजिए।एक बैंड पास फिल्टर के साथ सीए चैनल में एक लंबे पास फिल्टर (700 एनएम) और उत्सर्जित प्रकाश के साथ वी एम चैनल में उत्सर्जित प्रकाश फिल्टर (585/40 एनएम)।
    2. दो सीसीडी कैमरों (; redshirt इमेजिंग 80 x 80 पिक्सल, 1000 एफपीएस) का उपयोग कर फ़िल्टर फ्लोरोसेंट प्रकाश लीजिए।
    3. डाई photobleaching से बचने के लिए, प्रकाश जोखिम के समय को सीमित करने के दृश्य के प्रत्येक क्षेत्र पर कम से कम 2 सेकंड के लिए रिकॉर्डिंग कर। इधर, आम तौर पर छवि प्रत्येक monolayer के लिए चार अलग-अलग क्षेत्रों में।

वी एम या सीए रिकॉर्डिंग का 5. डाटा प्रोसेसिंग

  1. दोनों वी एम और सीए संकेतों (80 x 80 पिक्सल) के लिए, पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए अलग-अलग रिकॉर्डिंग समय बिंदुओं पर एक तीव्रता मूल्य में तीव्रता पच्चीस (एक्स 5 5) के मूल्यों पड़ोसी पिक्सल औसत।
    नोट: डेटा औसत के बाद, एक व्यक्ति संभावित कार्रवाई या सीए क्षणिक के प्रत्येक रिकॉर्डिंग समय बिंदु औसतन एक्स 16 16 तीव्रता मूल्यों का औसत युक्त एक डाटा मैट्रिक्स (पैदावार50 माइक्रोन का एक स्थानिक संकल्प के साथ डेटा चैनल)।
  2. दर्ज वी मीटर या सीए संकेतों के सक्रियण समय (एटी) को परिभाषित करें।
    1. पहले से वर्णित के रूप में एक व्यक्ति के संभावित कार्रवाई या सीए क्षणिक की एक सक्रियण समय (एटी) को परिभाषित करने के लिए, वी एम या एक कस्टम निर्मित MATLAB आधारित कलन विधि का उपयोग सीए संकेतों के शिखर आयाम के 50% के समय निर्धारित करते हैं। 12
    2. कार्यक्रम मैन्युअल विश्लेषण के दौरान हो सकता है कि किसी भी त्रुटि को खत्म करने के लिए विश्लेषण एटीएस ठीक करना।
    3. मैट्रिक्स में परिभाषित दुकान इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर में, क्रमशः दर्ज की संभावित कार्रवाई और कैल्शियम क्षणिक, (16 X 16 डेटा चैनलों का औसत)।
  3. पहले से मामूली संशोधनों 12,18 के साथ वर्णित के रूप में वेक्टर क्षेत्र विश्लेषण विधि का उपयोग करने में मैट्रिक्स पर कार्रवाई संभावित या कैल्शियम क्षणिक चालन वेग (सीवी) वैक्टर की गणना।
    1. (5 × अपने डेटा बिंदुओं पर आसपास के एक डेटा चैनल रिश्तेदार के CV सदिश की गणना; 5 पड़ोसी MATLAB कार्यक्रम 12,18 के भीतर कम से कम एक वर्ग कलन विधि का उपयोग) सतह पर सक्रियण बार (के एक चिकनी बहुपद सतह अनुकरण करने के लिए) के आंकड़ों चैनलों औसत।
    2. नीचे दिए गए फार्मूले का उपयोग कर चालन सदिश की गणना
      फॉर्मूला 1:
      1 समीकरण
      फॉर्मूला 2:
      θ = arctan [(वि / डीटी) / (DX / डीटी)]
      नोट: Ve एक्स और वाई कुल्हाड़ियों में पेश एक CV वेक्टर है; DX / डीटी एक्स-अक्ष में सीवी वेक्टर का प्रक्षेपण होता है; वि / डीटी Y अक्ष में सीवी वेक्टर का प्रक्षेपण है। टी में सतह है; एक्स, वाई निर्देशांक 2-डी को देखें; टी एक्स = ∂T / ∂x एक्स के लिए सम्मान के साथ टी के आंशिक व्युत्पन्न है; टी Y = ∂T / ∂y Y के लिए सम्मान के साथ टी के आंशिक व्युत्पन्न है; θ एक CV वेक्टर के अंतिम दिशा है।
    3. कम्पास पर एक दस डिग्री क्षेत्र को शामिल किया गया, जिनमें से प्रत्येक 36 रास्ते में एटी मैट्रिक्स के समूह के सभी वैक्टर। </ ली>
    4. 36 चालन रास्ते के बीच में सीवी वैक्टर की सबसे बड़ी आबादी युक्त मार्ग का चयन करें। Monolayer के सीवी का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस मार्ग का औसत सीवी की गणना।

लहर सामने प्रचार 6. दृश्य

  1. MATLAB के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अपने चरम मूल्य के सापेक्ष विभिन्न रिकॉर्डिंग समय बिंदुओं पर एक व्यक्ति के संभावित कार्रवाई या सीए क्षणिक के संकेत तीव्रता मानक के अनुसार।
  2. अस्थायी रूप से इस्तेमाल किया MATLAB के सॉफ्टवेयर में एक 16 x 16 तीव्रता मैट्रिक्स में हर दर्ज की गई समय बिंदु की सामान्यीकृत तीव्रता डेटा की दुकान।
  3. Surf.m समारोह का उपयोग कर प्रत्येक रिकॉर्डिंग समय बिंदु से संग्रहीत तीव्रता मैट्रिक्स से एक रंग कोडित तीव्रता मानचित्र का निर्माण।
    नोट: तीव्रता मानचित्र में, लाल वी मीटर या सीए संकेतों के उच्च तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, और नीले रंग प्रतिदीप्ति संकेतों के कम तीव्रता को दर्शाता है।
  4. Avifile.m समारोह का उपयोग कर एक .avi फ़ाइल बनाएँ।
  5. सब मुझे बचाने के लिएaddframe.m समारोह का उपयोग कर कार्रवाई संभावित या सीए क्षणिक के विभिन्न रिकॉर्डिंग समय बिंदुओं पर ntensity नक्शे।
    नोट: इस बिंदु पर, वी एम और सीए प्रचार की दो अलग-अलग AVI फ़ाइलें उत्पन्न हो जाएगा।

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Representative Results

मूवी 1 में प्रदर्शन के रूप में एक सुसंस्कृत मिला हुआ monolayer के एक नियमित रूप से आंतरिक लय दर्शाती है। हम तो एक पूरी तरह से मिला हुआ एच एल -1 monolayer में वी एम / सीए दोहरी चैनल ऑप्टिकल मानचित्रण प्रदर्शन किया। चित्रा 1 ए एक रिकॉर्ड एकल से वी एम और सीए संकेतों के उदाहरण के निशान से पता चलता है मरुंगा। समान रूप से प्रचारित वी एम और दोहरी चैनल ऑप्टिकल मैपिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए सीए संकेतों के प्रतिनिधि isochronal नक्शे आंकड़े 1B और 1C में दिखाए जाते हैं। समान रूप से प्रचारित कार्रवाई क्षमता और सीए यात्रियों के प्रतिनिधि कालानुक्रमिक छवियों को एक ही एच एल -1 संस्कृति monolayer से प्राप्त किया गया। अंत में, सिनेमा 2 और 3 एच एल -1 मिला हुआ monolayer में एक समान रूप से प्रचारित संभावित कार्रवाई (मूवी 2) और कैल्शियम क्षणिक (मूवी 3) के एनीमेशन उदाहरण देते हैं।

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चित्र 1: (ए) 500 मिसे का एक चक्र की लंबाई (सीएल) में एक विद्युत पुस्तक हरा से वी एम (नीला) और CA (लाल) का उदाहरण निशान। (बी) एच एल -1 monolayers के लिए हमारे ऑप्टिकल मानचित्रण प्रणाली की एक छवि। (सी) पूरी दृष्टि क्षेत्र भर में एक ही पुस्तक हरा से कार्रवाई संभावित प्रसार का एक isochronal नक्शा। (डी) दृष्टि क्षेत्र भर में एक ही पुस्तक हरा से सीए क्षणिक प्रचार का एक isochronal नक्शा। दोनों isochronal नक्शे में, समय व्यतीत हो जाने के 50 मिसे में दीक्षा और गहरे लाल रंग के रूप में गहरे नीले रंग की शुरुआत के साथ, रंगों के साथ प्रतिनिधित्व किया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्र 2: (ए) एक 60 में वी एम वितरण के नक्शे की श्रृंखला, 80, 140, और रिकॉर्डिंग की शुरुआत के बाद 200 मिसे। (बी) के 60 में सीए वितरण के मानचित्र, 80, 140, और रिकॉर्डिंग की शुरुआत के बाद 200 मिसे।

मूवी 1: एक 40x उद्देश्य के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के अंतर्गत, संस्कृति पांच दिन में एक मिला हुआ एच एल -1 monolayer से दर्ज एक प्रतिनिधि फिल्म।

फिल्म 2 : 500 मिसे के एक सीएल पर एक पुस्तक हरा से प्रचारित कार्रवाई की क्षमता का एक प्रतिनिधि फिल्म।

मूवी 3 : पीएसी से प्रचारित सीए क्षणिक का एक प्रतिनिधि फिल्मएड 500 मिसे के एक सीएल में हराया।

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Discussion

यह लेख कैल्शियम और वोल्टेज संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों के साथ दाग एक सुसंस्कृत एच एल -1 आलिंद myocyte monolayer में ऑप्टिकल मानचित्रण के महत्वपूर्ण पहलुओं का वर्णन है। यह एक इष्टतम एच एल -1 सेल monolayer, मानचित्रण उपकरण का सेटअप संवर्धन एक सुसंस्कृत monolayer मानचित्रण, और डेटा विश्लेषण भी शामिल है।

सफलतापूर्वक संवर्धित कोशिकाओं को मैप करने के लिए, कुंजी एक समान रूप से वितरित सेल monolayer को तैयार है। Coverslips के लिए कोशिकाओं पर बोने करते हैं, तो समान रूप से कोशिकाओं को फैलाने के लिए सुनिश्चित हो। इन सबसे अच्छा विद्युत पेसिंग का जवाब देंगे हमेशा की तरह, पूरी तरह से वृद्धि हुई है और पूरी तरह से मिला हुआ सेल monolayers नक्शा। यह रंगों लोड करने के दौरान ऑक्सीजन कोशिकाओं को रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है, लेकिन ऑक्सीजन बुलबुले इस मारने या coverslip से उन्हें बेदखल कर सकते हैं के रूप में कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क में नहीं आना चाहिए। डाई concentrati बढ़ती जा रही है, जबकि डाई एकाग्रता कम करने और संकेत परिमाण कम होती है और शोर अनुपात करने के लिए संकेत कम हो जाएगा प्रकाश की तीव्रता को कम करनेपर और संकेत परिमाण में वृद्धि, लेकिन यह भी शोर में वृद्धि होगी रोशनी की तीव्रता में वृद्धि। इसलिए, फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता और उत्तेजना प्रकाश ताकत का एक इष्टतम संतुलन रिकॉर्डिंग संकेतों के शोर अनुपात करने के लिए संकेत बढ़ाने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। इस प्रकाश उजागर क्षेत्र के भीतर photodynamic सेल नुकसान का कारण बन सकता है इसके अलावा, ऑप्टिकल मानचित्रण रिकॉर्डिंग के दौरान, केंद्रित प्रकाश के लंबे निवेश के लिए सेल monolayer उजागर बचने के लिए सुनिश्चित हो। अंत में, रिकॉर्डिंग संकेतों के उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्रदान करता है कि एक ऑप्टिकल मानचित्रण प्रणाली उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।

बरकरार दिलों में दोहरी चैनल ऑप्टिकल मानचित्रण के कारण एक साथ इकट्ठा वोल्टेज और कैल्शियम संकेतों के लिए अपनी क्षमता को हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए काफी संभावना है, वहीं एक सीमा इस तकनीक का एक 2-डी प्रोजेक्शन नक्शे के रूप में एक 3 डी सतह से जानकारी एकत्र करती है। 3-डी curvat का ध्यान नहीं दिया जानकारी के साथ बरकरार दिल से 2-डी प्राप्त डेटाडेटा विशेष रूप से चालन वेग विश्लेषण में, विश्लेषण में दिल की ure त्रुटियों में परिणाम सकता है। एक सुसंस्कृत 2-डी एच एल -1 सेलुलर मॉडल का उपयोग कर के लाभ के साथ, हम (वर्दी या गैर, नियमित और अनियमित लय कल्पना सीए क्षणिक और संभावित कार्रवाई कैनेटीक्स का आकलन, चालन वेग का निर्धारण और सीए और कार्रवाई संभावित प्रसार पैटर्न विशेषताएँ करने में सक्षम हैं एक अक्षुण्ण दिल के 3-डी संरचना से हस्तक्षेप किए बिना वर्दी प्रसार)। इसलिए, सफलतापूर्वक एक मानार्थ दृष्टिकोण के रूप में एक सुसंस्कृत एच एल -1 आलिंद myocyte monolayer में कैल्शियम यात्रियों और कार्रवाई क्षमता दोनों मानचित्रण बहुत आलिंद myocytes के electrophysiologic गुण और आलिंद arrhythmogenesis की अंतर्निहित तंत्र की समझ बढ़ा सकते हैं।

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Acknowledgments

हम एच एल -1 कोशिकाओं और विस्तृत रखरखाव प्रोटोकॉल उपलब्ध कराने के लिए डॉ Claycomb को धन्यवाद देना चाहूंगा। हम भी अपने दोहरी चैनल ऑप्टिकल मानचित्रण प्रणाली के लिए कुछ सामान बनाने के साथ उसकी सहायता के लिए सेल फिल्म और श्री पीट Caron पैदा करने के साथ उनकी सहायता के लिए सुश्री ऐलेना Carrillo और डॉ सेठ Robia को धन्यवाद देना चाहूंगा।

यह काम (XA के लिए 10GRNT3770030 और 12GRNT12050478) अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (XA के लिए HL113640), और (XA के लिए) लोयोला विश्वविद्यालय के अनुसंधान विकास कोष द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhod2 dry powder AAT Bioquest 21062
pluronic AAT Bioquest 20050
DMSO Sigma 276855
Rh237 Invitrogen S-1109
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P3911
KH2PO4 Sigma P0662
NaH2PO4 Sigma S9638
MgSO4 Sigma M7506
D-Glucose Sigma G8270
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
HEPEs Sigma H3375

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 97 सेलुलर ऑप्टिकल मानचित्रण सुसंस्कृत आलिंद monolayer संभावित कार्रवाई कैल्शियम क्षणिक वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई कैल्शियम डाई
संवर्धित एच एल -1 अलिंद myocyte monolayer के वोल्ट और कैल्शियम दोहरी चैनल ऑप्टिकल मानचित्रण
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Yan, J., Thomson, J. K., Zhao, W.,… More

Yan, J., Thomson, J. K., Zhao, W., Fast, V. G., Ye, T., Ai, X. Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer. J. Vis. Exp. (97), e52542, doi:10.3791/52542 (2015).

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