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Neuroscience

रूट ganglia न्यूरॉन्स और विभेदित वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल पृष्ठीय: एक Published: February 26, 2015 doi: 10.3791/52543
Automatic Translation
1, 2, 2,3
1Centre for Neuroprosthesis, EPFL | STI | IMT/IBI | LSBI, 2Blond McIndoe Research Laboratories, Institute of Inflammation & Repair, The University of Manchester, 3University Hospital of South Manchester

Summary

पृष्ठीय रूट ganglia (DRG) परिधीय तंत्रिका तंत्र के संवेदी न्यूरॉन्स युक्त संरचनाओं हैं। अलग है, वे चोट स्थल पर vivo वातावरण में नकल उतार, इन विट्रो तंत्रिका उत्थान और myelination अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल उपलब्ध कराने, अनुसूचित जाति-तरह वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एएससी) के साथ सह सुसंस्कृत हो सकता है।

Introduction

परिधीय तंत्रिका चोटों ब्रिटेन में लगभग 9,000 मामलों में एक मुख्य रूप से युवा में हर साल होने वाली है और जनसंख्या एक काम करने के साथ आम हैं। Microsurgical तंत्रिका मरम्मत तकनीकों के बावजूद, समारोह के सामान्य बहाली बिगड़ा हाथ सनसनी, कम मोटर समारोह और अक्सर दर्द और ठंड असहिष्णुता दो जिसके परिणामस्वरूप के साथ अप्राप्य है। ऐसी चोटों एक गहरा और स्थायी मरीज ​​पर प्रभाव और कम से कम 60% 3 काम पर लौटने के साथ, दैनिक जीवन की गतिविधियों प्रदर्शन करने की क्षमता है।

चोट, फेनोटाइप और न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान और श्वान कोशिकाओं अक्षतंतु अंकुरण की अनुमति के लिए एक उपयुक्त माहौल बनाने के क्रम में (अनुसूचित जाति) परिवर्तन के बाद। Transection के मामले में, तंत्रिका प्रॉक्सिमल और बाहर स्टंप में बांटा गया है; पुनर्योजी प्रक्रिया बाहर का स्टंप, जबकि जगह लेता है जहाँ से बात की जा रही समीपस्थ स्टंप अनुसूचित जाति अलग जिस Wallerian अध: पतन से होकर गुजरती हैघायल एक्सोन, डे-अंतर और पैदा करना है। इस माइलिन मलबे को हटाने और तंत्रिका पुनः पीढ़ी 4,5 के लिए बाहर का स्टंप की तैयारी की दिशा में मौलिक है। एक्सोन अंकुरण बाहर का स्टंप पर अनुसूचित जाति द्वारा जारी neurotrophic कारकों और chemokines के उत्पादन के द्वारा समर्थित है, और Wallerian अध: पतन 6,7 निम्नलिखित पीछे छोड़ दिया बेसल लामिना द्वारा निर्देशित है। अनुसूचित जाति Büngner के बैंड के गठन regenerating अक्षतंतु, साथ संरेखित जो सहायता endoneurial ट्यूब के बाहर शाखाओं में बंटी को कम करने के लक्ष्य अंग की ओर अक्षतंतु विकास,। Reinnervation के बाद, अनुसूचित जाति पुनर्जीवित एक्सोन लपेटकर नई माइलिन आवरण रूप है, लेकिन संवेदी और मोटर समारोह केवल आंशिक रूप से 8 बहाल है।

पृष्ठीय रूट ganglia (DRG) संवेदी neuronal कोशिकाओं परिधीय अंगों innervating युक्त स्पाइनल कॉलम की कशेरुकाओं foramina में स्थित संरचनाओं, कर रहे हैं। अलग करते हैं, वे एक उपयुक्त इन विट्रो मॉड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैमाइलिन गठन की जांच सहित 11 - तंत्रिका पुनर्जनन 9 के अध्ययन के लिए एल। विशेष रूप से, वयस्क DRG न्यूरॉन्स इन कोशिकाओं के vivo विशेषताओं की नकल और ऊतक इंजीनियरिंग में परिधीय तंत्रिका मरम्मत के लिए नई रणनीति का अध्ययन करने के लिए एक दुर्जेय उपकरण प्रदान करते हैं।

सह-संस्कृतियों इन विट्रो में एक विशेष रूप से दो (या अधिक) सेल प्रकार की परस्पर क्रिया में विवो पर्यावरण simulates एक गतिशील प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन सेल सह संस्कृति मॉडल के फायदों में से एक बाह्य वातावरण पर exerted किया जा सकता है कि लचीलापन और उच्च नियंत्रण है। 14 - DRG न्यूरॉन्स परिधीय तंत्रिका तंत्र 10,12 में दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच होती है कि वास्तविक बातचीत की नकल करने के सुप्रीम कोर्ट के साथ सह संस्कृति प्रणालियों में अक्सर इस्तेमाल किया गया है। यह अनुसूचित जाति बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन और उल्लेखनीय सुधार कर सकते हैं कि विकास के कारकों का स्राव कि प्रदर्शन किया गयाDRG न्यूरॉन्स की क्षमता और जीवित रहने के neurites 15,16 अंकुरित करने के लिए। हालांकि, अनुसूचित जाति सेल कल्चर तकनीक के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, यह ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं का एक उपयुक्त संख्या उत्पन्न करने के लिए अभी भी कठिन है, पैदा करने के लिए समय की लंबी अवधि की आवश्यकता होती है और। इसके अलावा, एक स्वस्थ तंत्रिका के बलिदान ऑटोलॉगस अनुसूचित जाति फसल के लिए जरूरी हो जाता है। इसलिए, सोर्सिंग अनुसूचित जाति में अंतर दोनों ऊतक इंजीनियरिंग के लिए और तंत्रिका उत्थान के लिए इन विट्रो परीक्षण में महत्वपूर्ण है। इस दृश्य में, ए एस सी परिधीय तंत्रिका मरम्मत 17,18 के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक ऊतक इंजीनियर निर्माण के विकास के लिए एक मूल्यवान विकल्प पर विचार किया जा सकता है। पिछले काम में इस तरह के एस -100, P75 और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) 19, साथ ही माइलिन प्रोटीन शून्य (P0) के रूप में विशेषता glial-मार्करों, 20 को व्यक्त करने, अनुसूचित जाति-तरह एएससी में अंतर करने के लिए इन कोशिकाओं की क्षमता का प्रदर्शन । ऐसे मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक के रूप में glial वृद्धि कारकों, के स्राव (BDNF), तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) और glial सेल व्युत्पन्न neurotrophic कारक (GDNF) भी 21,22 मनाया गया। 26 - इन विट्रो में दोनों ने प्रदर्शन किया और इन विवो में 23 अध्ययन के रूप में इसलिए, अनुसूचित जाति-जैसे ए एस सी, परिधीय तंत्रिका उत्थान के प्रमोटर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, ए एस सी अन्य स्टेम सेल प्रकार की तुलना में अधिक संख्या में न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रियाओं के माध्यम से काटा जा सकता है; वसा ऊतकों में स्टेम कोशिकाओं की आवृत्ति 100 करने के लिए अस्थि मज्जा 27 की तुलना में अधिक 1,000 गुना है, और वे अनुसूचित जाति और अस्थि मज्जा mesenchymal स्टेम कोशिकाओं की तुलना में एक उच्च प्रसार दर है।

इस काम क्रमशः अलग DRG न्यूरॉन्स और ए एस सी की उच्च कुशल फसल प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल, बाद अनुसूचित जाति-तरह की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा रहा है प्रदान करना है। इन दो प्रकार की कोशिकाओं के सह संस्कृति इसलिए DRG के पूर्वोत्तर की क्षमता पर भविष्य के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक बहुत ही व्यावहारिक प्रणाली प्रदान करेगाurons neurites और तंत्रिका ऊतक इंजीनियरिंग के लिए अलग पाड़ पर माइलिन के गठन के तंत्र अंकुरित करने के लिए।

Protocol

नोट: जानवरों को शामिल सभी प्रयोगों ब्रिटेन पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम, 1986 के अनुसार किए गए।

1. प्रयोगात्मक सेट अप

  1. सभी उपकरण बाँझ कर रहे हैं कि जाँच, ऊतक और सेल फसल शुरू करने से पहले। आवश्यक चाहे, तेज शल्य कैंची, एक बहुत ठीक संदंश और एक ठीक मानक संदंश की एक जोड़ी आटोक्लेव। इसके अलावा यूवी बंध्याकरण, इथेनॉल जोखिम या उचित रूप में भाप नसबंदी का उपयोग करते हुए सेल बोने से पहले प्रत्येक सब्सट्रेट बाँझ।
  2. स्टेम सेल फसल और भेदभाव के लिए मीडिया की तैयारी
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 200 मिमी एल glutamine, और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी एस) के साथ पूरक न्यूनतम आवश्यक मध्यम (α सदस्य) युक्त, स्टेम सेल के विकास मध्यम तैयार करें।
    2. बाँझ डाइमिथाइल sulfoxyde की 2.436 मिलीग्राम में forskolin की 10 मिलीग्राम भंग करके forskolin की एक 10 मिमी स्टॉक समाधान तैयार है। 14 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता में प्रयोग करें। </ ली>
    3. बाँझ डाइमिथाइल sulfoxyde के 1.43 मिलीलीटर में 50 मिलीग्राम भंग करके retinoic एसिड की एक 35 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार है। 350 एनजी / एमएल के अंतिम एकाग्रता में प्रयोग करें।
    4. आसुत बाँझ पानी के 100 μl में lyophilized पाउडर के 10 माइक्रोग्राम प्रति भंग करके प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF) के शेयरों (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) तैयार करें। 5 एनजी / एमएल के अंतिम एकाग्रता में प्रयोग करें।
    5. आसुत बाँझ पानी के 500 μl में lyophilized पाउडर के 50 माइक्रोग्राम प्रति भंग करके बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) के शेयरों (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) तैयार करें। 10 एनजी / एमएल के अंतिम एकाग्रता में प्रयोग करें।
    6. 14 माइक्रोन forskolin, 126 एनजी / एमएल glial वृद्धि कारक-2 (GGF-2), 5 एनजी / एमएल प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF), और 10 एनजी के साथ पूरक स्टेम सेल के विकास मध्यम युक्त, स्टेम सेल भेदभाव मध्यम तैयार / मिलीलीटर बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF)।
  3. न्यूरॉन फसल और हदबंदी के लिए मीडिया और स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. Bottenst तैयार करेंEin और हाम F12 के मध्यम करने के लिए 1% पुनश्च और 1% N2 के पूरक जोड़कर सातो का (बी एस) मध्यम 28। (24 अच्छी तरह से थाली अगर) का उपयोग अच्छी तरह से प्रति 500 ​​μl जरूरत के रूप में अंतिम मात्रा की गणना।
    2. WT / वी 1.25% की एकाग्रता पर हाम F12 के माध्यम में collagenase चतुर्थ शेयरों तैयार करें। 200 μl aliquots के रूप में -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान और दुकान फिल्टर बाँझ।
    3. , 2.5% WT / वी की एकाग्रता पर हाम F12 के माध्यम में गोजातीय अग्नाशय ट्रिप्सिन शेयरों को तैयार 200 μl aliquots के रूप में -20 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर बाँझ और दुकान।
    4. तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) 200 μl के रूप में सी -20 पर एक फिल्टर निष्फल 1 मिलीग्राम F12 के मध्यम और दुकान में / एमएल फैटी एसिड मुक्त गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) समाधान में 5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल की एकाग्रता में स्टॉक समाधान तैयार aliquots। पुनर्गठन के बाद NGF फ़िल्टर न करें।
  4. मामले में कोई सतह संशोधन आरटी पर 15 मिनट के लिए, कोट coverslips / पाली-डी lysine साथ प्लेट (0.1 मिलीग्राम / एमएल प्रदर्शन किया गया है) और / या laminin (37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 2-10 माइक्रोग्राम प्रति / 2 सेमी) के रूप में उपयुक्त न्यूरॉन लगाव और neurite परिणाम समर्थन करने के लिए।
  5. हमेशा प्रयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में मीडिया को गर्म।

एक अनुसूचित जाति Phenotype में 2. वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (एएससी) हार्वेस्ट और भेदभाव

  1. वयस्क पुरुष Sprague-Dawley चूहों की आंत और वंक्षण वसा से ए एस सी फसल
    1. शुरू, हैंक्स 'संतुलित खारा समाधान वसा कटाई तक बर्फ पर पुनश्च समाधान और दुकान का 1% वी / वी के साथ पूरक (HbSS) के 10-15 मिलीलीटर के साथ एक ट्यूब तैयार करने के लिए पहले।
    2. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था और कत्ल के द्वारा चूहे बर्खास्त। आंतरिक अंगों को उजागर करने और खून बह रहा है परहेज, चूहे दाढ़ी और पेट की त्वचा के माध्यम से एक चीरा बनाते हैं। पेट और आंतों (आमतौर पर एक फैटी पीले स्थिरता के द्वारा होती है) और एक वयस्क पुरुष Sprague-Dawley चूहे से अंडकोष के आसपास के वंक्षण वसा encasing आंत वसा निकालें। स्थानांतरण वेंबर्फ पर HBSS युक्त ट्यूब में ई वसा।
    3. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (द्वितीय श्रेणी) में सूक्ष्मता तक पहुँच जाता है कैंची की एक जोड़ी और ठीक स्थिरता जब तक एक बाँझ धार का उपयोग वसा काटना और WT / वी collagenase प्रकार मैं समाधान हौसले से तैयार 0.2% की 15 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में यह हस्तांतरण और दिन पर फिल्टर निष्फल।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ट्यूब स्थानांतरण और सतत आंदोलन के तहत 30 मिनट-एक घंटे के लिए एंजाइम की उपस्थिति में पचाने में वसा ऊतकों को छोड़ दें। बारीकी से पाचन मॉनिटर और ऊतक पूरी तरह से अलग है, इससे पहले कि इस सेल व्यवहार्यता और सेल उपज में सुधार होगा बंद करो। फिल्टर एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से ऊतक theun-अलग।
      नोट: धीरे एक बेज उपस्थिति प्राप्त करने, ट्यूब घूमता जब अच्छा ऊतक पाचन आंखों से दिखाई वसा, के समरूप संगति में परिणाम होगा।
    5. सी और अपकेंद्रित्र 37 डिग्री पर भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त स्टेम सेल के विकास के माध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़कर एंजाइम बेअसरट्यूब के नीचे, स्टेम सेल सहित स्ट्रोमल संवहनी अंश, इकट्ठा करने के क्रम में 10 मिनट के लिए 160 ग्राम पर समाधान।
    6. इस स्तर पर, गोली लाल रक्त कोशिकाओं के एक मिलीलीटर में resuspended किया जा सकता है रक्त कोशिका संदूषण दूर करने के लिए बफर lysis। एक मिनट के लिए मेजबान और pipetting के बाद, 10 मिनट के लिए 160 ग्राम पर ताजा स्टेम सेल के विकास मध्यम और अपकेंद्रित्र के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. ध्यान तल पर जमा सेल गोली की देखभाल, ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला aspirate। स्टेम सेल के विकास के माध्यम के 10 एमएल में कोशिकाओं Resuspend एक 75 सेमी में 2 बोतल उन्हें हस्तांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं। हर 3 दिन मध्यम बदल रहा है, पारित होने के 1-2 तक उप मिला हुआ स्तरों पर कोशिकाओं को बनाए रखने।
  2. एक अनुसूचित जाति phenotype के लिए ए एस सी भेदभाव
    1. पारित होने के 1-2 पर, 75 सेमी 2 कुप्पी से स्टेम सेल के विकास मध्यम हटाने और prepa हौसले 1 मिमी β-mercaptoethanol युक्त ताजा माध्यम के 10 एमएल के साथ बदलेंलाल और दिन पर फिल्टर निष्फल। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं। इस स्तर पर, यह कोशिकाओं भेदभाव शुरू करने से पहले कम घनत्व (30%) में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है।
    2. ध्यान से HBSS, महाप्राण साथ कोशिकाओं को धो लें और 350 एनजी / एमएल retinoic एसिड युक्त मध्यम के 10 एमएल के साथ बदलें। 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं। प्रकाश के लिए सेल के माध्यम से जोखिम को कम करने के लिए प्रयास करें।
    3. (कदम 1.2.6 देखें) तीन दिनों के बाद, HBSS, महाप्राण के साथ सावधानी से कोशिकाओं को धोने और स्टेम सेल भेदभाव माध्यम के 10 एमएल के साथ बदलें। हर 3 दिन मध्यम बदलते, उप मिला हुआ स्तरों पर कोशिकाओं को बनाए रखने।
      नोट: (। Kingham एट अल 5 द्वारा प्रदर्शन के रूप में) ऊष्मायन के 2 हफ्तों के बाद, एएससी उनकी विशेषता फेनोटाइप व्यक्त, अनुसूचित जाति-तरह एएससी में भेदभाव कर रहे हैं। वे तो व्यवहार 29 में ध्यान देने योग्य परिवर्तन के बिना 10 वीं बीतने जब ​​तक इस्तेमाल किया जा सकता है।
<पी वर्ग = "jove_title"> 3। हार्वेस्ट और पृष्ठीय रूट ganglia (DRG) न्यूरॉन्स की हदबंदी

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था और कत्ल के द्वारा चूहे बर्खास्त। चूहे दाढ़ी और स्पाइनल कॉलम को बेनकाब करने के लिए त्वचा उठा। तेज कैंची का प्रयोग, सीमित अंगों और रक्त वाहिकाओं के अतिरिक्त ध्यान रखने स्पाइनल कॉलम excide। एक पेट्री डिश का उपयोग कर एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (द्वितीय श्रेणी) में स्पाइनल कॉलम स्थानांतरण और किसी भी पृष्ठीय भाग को हटा दें।
  2. गर्भनाल ऊतक को बेनकाब करने के लिए बाँझ और तेज शल्य कैंची का उपयोग अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ आधे में स्पाइनल कॉलम फूट डालो। इस बिंदु पर, यह आसान DRG न्यूरॉन फसल के दौरान संभाल करने के लिए बनाने के लिए, रिब पिंजरे के स्तर के नीचे दो छोटे खंडों में स्पाइनल कॉलम में कटौती करने के लिए उपयोगी है। ठीक संदंश का प्रयोग, धीरे खींच और DRG के जड़ों को दूर नहीं करने के लिए ध्यान का भुगतान, सभी की हड्डी के ऊतकों को हटा दें। DRG और जड़ों वर्टिब्रल नहरों के भीतर उजागर किया जाएगा इस तरह, अभी भी कॉलम में encased। सफेद तंतु comi रूप DRG का निरीक्षणनहरों से सीधे बाहर एनजी।
  3. गैन्ग्लिया की जड़ों को नुकसान नहीं ध्यान, बहुत ठीक संदंश का उपयोग वर्टिब्रल नहरों में गहरी जा रहा है और भुगतान करके वर्टिब्रल नहरों से पूरे DRG के रूट (न सिर्फ DRG) बाहर खींचो। 1% पी एस के साथ पूरक है हाम F12 के माध्यम के 3-4 मिलीलीटर युक्त एक छोटा सा पेट्री डिश (60 मिमी 2) में DRG के स्थानांतरण। विभिन्न जानवरों का उपयोग अगर, अलग व्यंजन का उपयोग करें।
  4. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, glial सेल प्रदूषण को कम करने के लिए बाँझ संदंश और एक स्केलपेल का उपयोग गैन्ग्लिया आसपास के तंत्रिका जड़ों की किसी भी अधिक की DRG साफ। ताजा F12 के माध्यम के 1.8 मिलीलीटर के साथ एक छोटा सा पेट्री डिश (35 मिमी 2) में DRG के स्थानांतरण।
  5. 1.25% WT / वी collagenase प्रकार चतुर्थ शेयर समाधान (0.125% की अंतिम एकाग्रता) के 200 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में DRG सेते हैं। ध्यान से महाप्राण या DRG नुकसान नहीं ध्यान दे, एक गिलास विंदुक के साथ मध्यम aspirate। ताजा F12 मध्यम कोमल जोड़ेंपहले से वर्णित के रूप में 0.125% WT / वी collagenase प्रकार चतुर्थ एंजाइम के साथ mented और 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  6. मध्यम Aspirate और धीरे F12 के माध्यम से DRG धो लें। F12 के माध्यम की तो 1.8 मिलीग्राम और trypsin के 200 μl जोड़ें (अंतिम एकाग्रता 0.25% की WT / वी) और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
  7. ट्रिप्सिन निकालें और enzymatic प्रतिक्रिया की गिरफ्तारी के लिए FBS की 500 μl के साथ पूरक F12 के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें। मध्यम Aspirate और धीरे सीरम के निशान को दूर करने के लिए तीन बार के लिए F12 के माध्यम से DRG धो लें।
  8. ताजा F12 के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें और ध्यान से एक गिलास पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में मध्यम से DRG के हस्तांतरण। धीरे (प्लास्टिक सुझावों विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है) कांच विंदुक के साथ नीचे (लगभग 8-10 बार) ऊपर pipetting और से DRG न्यूरॉन्स अलग कर देना।
  9. गोली ट्यूब के नीचे बसा है और एक नया ट्यूब में मध्यम इकट्ठा करने की अनुमति दें। गोली युक्त ट्यूब के लिए ताजा F12 के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें और एम दोहरानेकांच विंदुक के साथ echanical हदबंदी। निलंबन सजातीय (लगभग 3-4 बार) हो जाता है जब तक इस चरण को दोहराएँ और नया ट्यूब में सभी अलग DRG के इकट्ठा। इस विधि यांत्रिक हदबंदी से पाने तनाव कम होता है और न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता को बेहतर बनाता है।
  10. संयुक्त राष्ट्र-अलग न्यूरॉन्स और अन्य मलबे को हटाने के लिए एक 100 माइक्रोन सेल झरनी का उपयोग कर एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप homogenized निलंबन फ़िल्टर। इस स्तर पर, यह पहली बार एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन फ़िल्टर और फिर एक गिलास पिपेट का उपयोग छोटे ट्यूब में समाधान के लिए स्थानांतरण करने के लिए सुविधाजनक हो सकता है। 5 मिनट के लिए 110 ग्राम पर निलंबन अपकेंद्रित्र।
  11. F12 के माध्यम के 500 μl करने के लिए एक 30% BSA समाधान के 500 μl जोड़कर एक 15% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) तैयार करें। धीरे-धीरे एक क्रमिक प्रोटीन राह बनाने के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब की दीवार के नीचे समाधान विंदुक। इस स्तर पर, यह संख्या पर प्रयोग बीएसए एक 45 डिग्री के कोण पर ट्यूब पकड़ और धीरे धीरे जारी करने के लिए उपयोगी हैके गठन "ट्रैक" के लिए एक संदर्भ के रूप में फाल्कन ट्यूब।
  12. ट्यूब के नीचे 500 μl छोड़ने कदम 3.10 से सतह पर तैरनेवाला Aspirate और एक ही माध्यम में सेल गोली resuspend। धीरे-धीरे पहले से 5 मिनट के लिए 500 ग्राम पर कदम 3.11 (एक संदर्भ के रूप में ट्यूब पर नंबरों का उपयोग) और अपकेंद्रित्र में तैयार प्रोटीन निशान के साथ निलंबन विंदुक।
  13. कदम 4.5 में नीचे वर्णित के रूप में, सतह पर तैरनेवाला Aspirate और संशोधित बी एस मध्यम (या अनुसूचित जाति की तरह ए एस सी / DRG के सह संस्कृति के लिए एक मिश्रित माध्यम के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend।
    नोट: DRG न्यूरॉन्स फिर से निलंबित करने के लिए खंड वरीयता प्राप्त किया जा करने के लिए वांछित अंतिम सेल एकाग्रता और नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है, आवश्यक वास्तविक मात्रा अप करने के लिए बनाया जा सकता है। एक जानवर एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रयोग के लिए पर्याप्त कोशिकाओं प्रदान करेगा।
  14. सेल लगाव अनुमति देने के लिए दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर वरीयता प्राप्त नमूने सेते हैं और अंत में तंत्रिका वृद्धि पिता में से 50 एनजी / एमएल के साथ पूरक ताजा बी एस मध्यम जोड़नेctor (NGF)।

अनुसूचित जाति की तरह ए एस सी और DRG न्यूरॉन्स की 4. प्रत्यक्ष सह-संस्कृति

  1. कदम 2.2.3 में वर्णित के रूप में उप मिला हुआ स्तरों पर संस्कृति में अनुसूचित जाति-तरह एएससी बनाए रखें। DRG के फसल के लिए पहले चौबीस घंटा, स्टेम सेल भेदभाव मध्यम महाप्राण और HBSS के साथ कोशिकाओं को धो लें। महाप्राण और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में trypsin के 3 मिलीलीटर में सेते हैं।
  2. सभी कोशिकाओं कुप्पी से अलग कर दिया है कि एक प्रकाश खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें। धीरे टुकड़ी मदद करने के लिए कुप्पी नल। , ट्रिप्सिन प्रतिक्रिया को रोकने के 5 मिनट के लिए 110 ग्राम पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सेल निलंबन इकट्ठा करने के लिए माध्यम की 7 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और स्टेम सेल भेदभाव मध्यम के 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और आवश्यक अंतिम एकाग्रता के अनुसार सेल निलंबन पतला। आदर्श रूप में, 20,000 अनुसूचित जाति-तरह एएससी बोने / 2 सेमी कोशिकाओं का एक मिला हुआ परत की गारंटी होगी।
  4. अनुसूचित जाति-तरह बीजऔर सब्सट्रेट पर एएससी सेल लगाव अनुमति देने के लिए 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
  5. 24 घंटा ऊष्मायन के बाद, मध्यम महाप्राण और कदम 3.14 और 3.15 के रूप में वर्णित कोशिकाओं के शीर्ष पर DRG न्यूरॉन्स जोड़ें। स्टेम सेल भेदभाव माध्यम के 50% और बी एस माध्यम के 50% से युक्त एक मिश्रित मध्यम करने के लिए मध्यम बदलें। इसके अलावा, अंतिम मिश्रित माध्यम में 1-2.5% के लिए FBS के एकाग्रता को कम करने DRG हदबंदी से व्युत्पन्न उपग्रह कोशिकाओं contaminating के प्रसार से बचने में मदद करता है।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में सह सुसंस्कृत नमूने सेते हैं और भविष्य परीक्षण के लिए आवश्यक समय के लिए संस्कृति में बनाए रखने के लिए।

Representative Results

अलग DRG न्यूरॉन्स की संस्कृतियों तंत्रिका उत्थान के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उपयुक्त प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, अनुपचारित substrates के DRG के लगाव और neurites के विस्तार के लिए एक उपयुक्त वातावरण प्रदान नहीं करते हैं। अनुसूचित जाति-तरह एएससी वे मध्यम संस्कृति में जारी किया जाता है जब neurites के अंकुर DRG न्यूरॉन्स की क्षमता में सुधार कर सकते हैं जो वृद्धि कारकों और chemokines 19 का उत्पादन करने में सक्षम हैं। संस्कृति प्रणाली में अनुसूचित जाति की तरह ए एस सी की मौजूदगी इसलिए DRG के कार्यों को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1) neuronal कोशिकाओं को पहले वरीयता प्राप्त अनुसूचित जाति-तरह एएससी के साथ सीधे संपर्क में मिलता है, जिसके दौरान अनुसूचित जाति की तरह ए एस सी और DRG न्यूरॉन्स, का एक सीधा सह संस्कृति प्रदर्शन करने की प्रक्रिया को दिखाता है। इस प्रक्रिया के साथ जुड़े मुख्य कठिनाई विभिन्न जानवरों से काटा DRG न्यूरॉन्स की संख्या के उच्च परिवर्तनशीलता है। इस कारण, परिणाम compar करने के लिए कभी कभी मुश्किल हो सकता हैई और एक विशेष ध्यान हमेशा के लिए एक प्रयोग में एक तुलनीय सेल घनत्व को प्राप्त करने के क्रम में बोने की प्रक्रिया के दौरान भुगतान किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल बीएसए ढाल (कदम 3.11) का उपयोग DRG न्यूरॉन हदबंदी से शेष उपग्रह कोशिकाओं के कम से कम संख्या को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया है। Kingham एट अल। 11 द्वारा वर्णित के रूप में इसके अलावा, साइटोसिन-arabinose (ए आर ए सी) के पूरक, आगे उपग्रह सेल की आबादी को कम करने के क्रम में बी एस माध्यम से जोड़ा जा सकता है। हालांकि, इलाज के समय का चुनाव भी संस्कृति के माध्यम में आरा-सी पूरक की उपस्थिति से प्रभावित DRG और अनुसूचित जाति-तरह एएससी जीवन शक्ति, के साथ सावधानी से संतुलित करने की जरूरत है। इसलिए, यह एक उपग्रह सेल मुक्त प्रणाली को पूरा करने के लिए बहुत मुश्किल है।

Substrates के रूप में caprolactone (पीसीएल) फिल्मों - चित्रा 2 अनुपचारित और रासायनिक संशोधित पाली का उपयोग कर एक सह संस्कृति मॉडल में अंकुरण DRG neurite के लिए SC-तरह एएससी के महत्व को दर्शाता है। DRG न्यूरॉन्स थे माईकदम 4.5 में वर्णित के रूप में, बी एस माध्यम के 50% और स्टेम सेल भेदभाव माध्यम के 50% से युक्त एक मिश्रित समाधान का उपयोग, उपस्थिति या अनुसूचित जाति-तरह एएससी के अभाव में तीन दिनों के लिए संस्कृति में ntained। इस अवधि के बाद, कोशिकाओं 4% paraformaldehyde में तय किया गया और β ट्यूबिलिन तृतीय (DRG न्यूरॉन्स) और S100 है (अनुसूचित जाति-तरह एएससी) सेल आकृति विज्ञान की जांच के लिए और neurites बहर करने DRG न्यूरॉन्स की क्षमता का अध्ययन करने के साथ दाग। Neurites के गठन के लिए स्पष्ट रूप से सह संस्कृति प्रणाली (चित्रा -2) में सुधार किया गया है whilst कोई neurites, अनुसूचित जाति-जैसे ए एस सी (2A चित्रा) के अभाव में इलाज सतहों पर मनाया गया। औसत पर, सेल शरीर प्रति neurites की संख्या में काफी स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति में 0-3 की वृद्धि हुई। इन परिणामों की पुष्टि भी 3 चित्र में दिखाया इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) विश्लेषण, स्कैनिंग द्वारा दिया गया था। विशेष रूप से, SEM छवियों के neurites अंकुर DRG न्यूरॉन्स की क्षमता संयोजन के रूप में अधिमान्यतया तब होती है जब पता चलता है किअनुसूचित जाति-तरह एएससी के साथ, के रूप में चित्रा -3 सी में पीले तीर द्वारा संकेत दिया।

यह neurite गठन और विस्तार पर उल्लेखनीय प्रभाव होने, DRG न्यूरॉन्स युक्त संस्कृति प्रणालियों में (laminin के व्युत्पन्न पेप्टाइड्स सहित) laminin के संशोधित substrates के उपयोग अक्सर neuronal सेल संस्कृति के लिए एक उपयुक्त शर्त के रूप में परिभाषित किया गया है कि बाहर बताया जाना चाहिए 30-32 । हालांकि, चित्रा 2 डी और चित्रा 3 डी में दिखाया परिणामों रासायनिक और जैविक संकेतों के संयोजन आगे DRG न्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया में वृद्धि कर सकते हैं कि यह दर्शाता है।

चित्र 1
प्रत्यक्ष DRG के अनुसूचित जाति-तरह एएससी सह संस्कृति प्रणाली चित्रा 1. तैयारी। DRG न्यूरॉन्स और एएससी स्पाइनल कॉलम और वयस्क मल की आंत और वंक्षण वसा से क्रमशः प्राप्त कर रहे हैंई Sprague-Dawley चूहों। एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का एक झरना के माध्यम से वसा ऊतकों के पाचन के बाद, ए एस सी अनुसूचित जाति-तरह की कोशिकाओं में भेदभाव कर रहे हैं और जब तक जरूरत उप मिला हुआ परिस्थितियों में बनाए रखा। अनुसूचित जाति-तरह एएससी DRG फसल से पहले प्रत्येक सब्सट्रेट 24 घंटा पर पूर्व वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। दिन, DRG न्यूरॉन्स निकाले जाते हैं और एंजाइमी और यांत्रिक कार्रवाई की एक श्रृंखला के माध्यम से अलग। न्यूरॉन्स तो पहले से वरीयता प्राप्त अनुसूचित जाति-जैसे ए एस सी के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त और assayed जब तक संस्कृति में रखा जाता है (मिश्रित मध्यम: स्टेम सेल भेदभाव माध्यम के 50% और संशोधित बी एस माध्यम के 50% से युक्त)। कृपया यहाँ क्लिक करें एक बड़ा देखने के लिए इस आंकड़े के संस्करण।

चित्र 2
विविध संस्कृति की स्थिति में DRG न्यूरॉन्स की चित्रा 2. प्रतिदीप्ति छवियों।(ए) अनुपचारित PCL फिल्मों, (बी) RGD संशोधित PCL फिल्मों, (ग) के सह-सुसंस्कृत अनुसूचित जाति-तरह अनुपचारित PCL फिल्मों पर एएससी के साथ, (घ) के सह-सुसंस्कृत RGD संशोधित PCL फिल्मों पर अनुसूचित जाति-तरह एएससी के साथ। प्रकोष्ठों संशोधित बी एस माध्यम के 50% और स्टेम सेल भेदभाव माध्यम के 50% से युक्त एक मिश्रित समाधान का उपयोग कर 3 दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा गया। इस समय के बाद, सेल, 4% paraformaldehyde में तय किया गया एक ट्राइटन एक्स समाधान में permeabilized, और गैर विशिष्ट बाध्यकारी साइटों 1% BSA के साथ अवरुद्ध किया गया। और S-100 के खिलाफ अनुसूचित जाति-जैसे ए एस सी (AlexaFluor568, लाल) एंटीबॉडी; neuronal कोशिकाओं तो β ट्यूबिलिन तृतीय (हरी FITC) के खिलाफ दाग रहे थे। अंत में नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग रहे थे। छवियाँ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (ओलिंप BX60, जापान) का उपयोग कर हासिल किया गया। से अनुमति के साथ (फिर से प्रिंट डी लुका एट अल। 30। एक बड़ा vers देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के आयन।

चित्र तीन
विविध संस्कृति की स्थिति में DRG न्यूरॉन्स की चित्रा 3. SEM छवियों (ए) अनुपचारित PCL फिल्मों (बी) RGD संशोधित PCL फिल्मों;। (सी) के सह-सुसंस्कृत अनुपचारित PCL फिल्मों पर अनुसूचित जाति-तरह एएससी के साथ, (घ) के सह-सुसंस्कृत RGD संशोधित PCL फिल्मों पर अनुसूचित जाति-तरह एएससी के साथ। पीले तीर सह संस्कृति प्रणाली में उनकी सीधी बातचीत की पुष्टि, अनुसूचित जाति-जैसे ए एस सी और DRG के बीच संपर्क अंक संकेत मिलता है। कोशिकाओं 3 दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा है और 2.5% glutaraldehyde में तय किया गया। वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला (50%, 70%, 90%, 100%) में निर्जलीकरण के बाद, कोशिकाओं अंत में hexamethyldisilazane में rinsed थे और SEM विश्लेषण के लिए sputtering स्टब्स और सोने पर बढ़ते से पहले सूख गया। छवियाँ एक त्वरक वॉल्यूम के साथ एक SEM (जीस EVO60, ब्रिटेन) का उपयोग कर हासिल किया गया10kV की Tage। (डी लुका एट अल। 30 से अनुमति के साथ फिर से प्रिंट। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्राथमिक संस्कृति विवो में axotomy के बाद न्यूरॉन्स के उत्थान का अध्ययन करने के लिए DRG न्यूरॉन्स अक्सर neuronal कोशिकाओं के बीच किया जाता है। यहाँ वयस्क चूहों से DRG के फसल के लिए एक सटीक प्रोटोकॉल न्यूरोनल अस्तित्व समझौता किए बिना आसपास के वातावरण में उपग्रह कोशिकाओं की आबादी को कम करने के उद्देश्य से, प्रस्तुत किया है। एक अनुसूचित जाति की तरह फेनोटाइप में भेदभाव ए एस सी के रूप में सेल उपचार के लिए अनुसूचित जाति के लिए एक वैध विकल्प हैं, एक अनुसूचित जाति की तरह ए एस सी / DRG के सह संस्कृति प्रणाली को भी विस्तार से वर्णन किया गया है।

33 - यह व्यापक रूप से laminin (या laminin के व्युत्पन्न पेप्टाइड दृश्यों) न्यूरॉन अस्तित्व और neurite गठन 31 पर एक लाभदायक प्रभाव है कि जाना जाता है। DRG न्यूरॉन संस्कृतियों जब प्रदर्शन कर यह इसलिए neuronal कोशिकाओं की कार्यक्षमता के किसी भी नुकसान से बचने के क्रम में पहले से कोट करने के लिए laminin के साथ प्रत्येक सब्सट्रेट की सलाह दी है। laminin कोटिंग्स की अवधारणा भी की डिजाइन के लिए biomaterial substrates के लिए लागू होता हैऐसे पाली के रूप में ऊतक इंजीनियरिंग निर्माणों, - caprolactone (पीसीएल) अक्सर तंत्रिका conduits के 30 के निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है। इसके अलावा, पिछले काम आतंच matrices के तीन आयाम 11 में neuronal संस्कृतियों के लिए उपयुक्त सामग्री रहे हैं कि प्रदर्शन किया।

प्रोटीन कोटिंग के अलावा, सह संस्कृति मॉडल DRG न्यूरॉन अस्तित्व और चोट के बाद परिधीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स और अनुसूचित जाति के बीच होती है कि बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त वातावरण के लिए बहुमूल्य शर्तों प्रदान करते हैं। कोशिकाओं को भी चोट स्थल पर ऑटोलॉगस कोशिकाओं की भर्ती के समय कम करने के क्रम में तंत्रिका उपकरणों का उपयोग करके विवो में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। यह सेल वार्धक्य / मृत्यु और मांसपेशियों शोष को जन्म दे सकता है जो गंभीर चोटों, में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। अनुसूचित जाति परिधीय तंत्रिका उत्थान और myelination, अपने सीमित उपलब्धता और उनके धीमी गति से प्रसार दर की प्रक्रिया में शामिल सबसे महत्वपूर्ण glial कोशिकाओं हालांकि उन्हें अनुपयुक्त बनाता हैऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के 34 के लिए। ए एस सी की वजह से उनकी बहुतायत और अनुसूचित जाति फेनोटाइप में अंतर करने की क्षमता, विशिष्ट glial मार्करों व्यक्त और देशी अनुसूचित जाति के लिए 19 कार्यात्मक समानता दिखाने के लिए एक वैध विकल्प हैं। ए एस सी भी एक सह संस्कृति प्रणाली में DRG न्यूरॉन्स द्वारा गठन और neurites की विस्तार करने के लिए फायदेमंद हो सकता है कि प्रोटीन और वृद्धि कारकों 5 का उत्पादन करने में सक्षम हैं। हालांकि, दो अलग अलग सह संस्कृति प्रणालियों प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के समारोह के रूप में स्थापित किया जा सकता है। इस पत्र में प्रस्तावित विधि हमारी प्रयोगशाला में 11 में एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण है और यह दूसरा सेल प्रकार (DRG न्यूरॉन्स) वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, जिसमें दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच सीधा संपर्क (प्रत्यक्ष सह संस्कृति), शामिल है दूसरों (अनुसूचित जाति-तरह एएससी) के शीर्ष पर। यह दृष्टिकोण neuronal संस्कृतियों 35 बोने जब ​​सब्सट्रेट पर एक glial सेल परत की उपस्थिति के महत्व को दिखा दिया कि पिछले निष्कर्ष पर आधारित है 37। इस आशय की स्टेम कोशिका की सतह पर ए एस सी और अन्य संकेतों से जमा DRG integrins के माध्यम से सेल सेल बातचीत और ईसीएम अणुओं की वजह से होने की संभावना है। यह भी माध्यम में प्रोटीन सीरम की कमी एएससी कार्यों को प्रभावित किए बिना, DRG न्यूरॉन्स की हदबंदी से प्राप्त कर सकते हैं कि उपग्रह कोशिकाओं contaminating के प्रसार को कम किया है कि मनाया गया। हालांकि, अनुसूचित जाति की एक छोटी सी आबादी सहित उपग्रह कोशिकाओं, पूरी तरह से भी सह संस्कृति प्रणाली में उपस्थित रहेंगे DRG न्यूरॉन्स और कुछ शेष कोशिकाओं की संस्कृतियों से खत्म करने के लिए मेहनत कर रहे हैं। यह इन छोटे उप आबादी भी चोट के बाद विवो में मौजूद हैं कि ऑटोलॉगस कोशिकाओं को वापस बुलाने, इन विट्रो अध्ययन के दौरान myelination प्रक्रियाओं को शामिल कर सकते हैं कि नोट करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। दूसरा दृष्टिकोण (यहाँ प्रस्तुत नहीं) दो अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं के बीच सीधा संपर्क (अप्रत्यक्ष सह संस्कृति) से परहेज, सेल संस्कृति आवेषण का इस्तेमाल शामिल है। Howevएर, यह तंत्रिका पुनर्जनन (लंबी neurites विकसित करने के लिए neuronal कोशिकाओं की कम क्षमता) के दौरान इन विवो शर्तों के प्रतिनिधि नहीं है, लेकिन यह अन्य 38 पर एक निश्चित सेल की आबादी से मध्यम में जारी प्रसारण कारकों के प्रभाव की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm cell strainer BD Biosciences 352360 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative
15 ml plastic tubes Sarstedt 62.554.002
50 ml plastic tubes Sarstedt 62.547.004
75 cm2 flasks Corning BC301
Retinoic Acid >98% HPLC Sigma R2625
ARA-C supplement Sigma C6645
Recombinant Human FGF-basic (154 aa) Peprotech 100-18B
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9205
Collagenase type I Gibco 17100-017 Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion
Collagenase type IV Worthington Biochemical LS004188 Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants
Foetal Bovine Serum (FBS) Biosera FB-1001
Forskolin  Sigma F3917
Glass pipettes Fisher Scientific FB50253 Sharp material to be disposed accordingly
Glial Growth Factor-2 (GGF-2) Acorda Therapeutics GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200 ng/ml
Nutrient Mix F12 HAM Sigma N6658 Warm at 37 °C in a water bath unless specified
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma H9394 Warm at 37 °C in a water bath unless specified
N-2 supplement (100x) Invitrogen 17502
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands  (NGF) Millipore NC011
Penicillin-Streptomycin (PS) Sigma P0781
Name Company Catalog Number Comments
Petri dishes Corning 430165
Recombinant Human PDGF-AA Peprotech 100-13A
Trypsin  Invitrogen 25200-056 Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks
Trypsin (2x bovine pancreatic) Worthington Biochemical LS003703 This is used for DRG dissociation
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Sigma M8042 Warm at 37 °C in a water bath unless specified
2-mercaptoethanol Sigma M3148 Prepare the solution in the biological cabinet

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References

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रूट ganglia न्यूरॉन्स और विभेदित वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल पृष्ठीय: एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; सह संस्कृति मॉडल परिधीय तंत्रिका पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए
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de Luca, A. C., Faroni, A., Reid, A. J. Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration. J. Vis. Exp. (96), e52543, doi:10.3791/52543 (2015).

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