Summary
Dorsale rotganglier (DRG) er strukturer som inneholder de sensoriske neuroner i det perifere nervesystem. Når dissosiert, kan de være ko-dyrket med SC-lignende adipose-avledede stamceller (ASC), som gir en verdifull modell for å studere in vitro nerve regenerering og myelinisering, etterligne in vivo miljøet på skadestedet.
Introduction
Perifere nerveskader er vanlig med ca 9.000 tilfeller i Storbritannia forekommer hvert år i en overveiende unge og yrkesaktive befolkningen en. Til tross for mikro nerve reparasjonsteknikker, er normal restaurering av funksjon uoppnåelig med påfølgende svekket hånd følelse, nedsatt motorikk og hyppig smerte og kulde intoleranse to. Slike skader har en dyp og varig innvirkning på pasienten og deres evne til å utføre dagliglivets aktiviteter, med mindre enn 60% tilbake i jobb tre.
Etter skade, fenotype og morfologi av nevroner og Schwannske celler (SC) endring for å skape et egnet miljø for å tillate axon spiring. Ved transeksjon, blir delt inn i nerven proksimale og distale stumper; proksimale stump være det punktet hvor den regenerative prosessen foregår, mens den distale stump gjennomgår Wallerian degenerasjon hvorpå SC løsnefra den skadde axoner, de-differentiate og sprer. Dette er grunnleggende mot fjerning av myelin rusk og forberede distal stubbe for nerve re-generasjon 4,5. Axon spirende støttes av produksjonen av neurotrofe faktorer og chemokiner utgitt av SC på distal stubbe, og ledet av basal lamina etterlatt følgende Wallerian degenerasjon 6,7. SC justere langs regenererende axon danner bånd Büngner, som hjelpemiddel axon vekst mot målet organ, redusere forgrening utenfor endoneurial tube. Etter reinnervation, SC danne ny myelin skjede innpakning regenererte aksoner, men sensorisk og motorisk funksjon er bare delvis restaurert 8.
Ryggmargen (DRG) er strukturer som ligger i mellomvirvelforamina av ryggsøylen, som inneholder de sensoriske nervecellene innervating de perifere organer. Når dissosiert, kan de brukes som en egnet in vitro model for studiet av nerve regenerering 9 - 11, inkludert undersøkelser av myelin dannelse. Spesielt voksen DRG neuroner etterligne in vivo-egenskapene til disse celler, og gir et utmerket verktøy for å studere nye strategier for perifer nervereparasjon i vevsteknologi.
Ko-kulturer representerer et dynamisk system som simulerer in vitro samspillet mellom to (eller flere) celletyper på en bestemt in vivo miljø. En av fordelene med disse celle ko-kulturmodeller er fleksibilitet og høy kontroll som kan utøves på det ekstracellulære miljø. DRG-neuroner har vært brukt hyppigst i ko-kultursystemer med SC for å etterligne de faktiske interaksjoner som forekommer mellom de to celletyper i det perifere nervesystemet 10,12 - 14. Det ble demonstrert at SC utskiller ekstracellulær matriks (ECM) proteiner og vekstfaktorer som kan gi vesentlig bedreevne til DRG nevroner å overleve og spire neuritter 15,16. Imidlertid SC krever lange tidsperioder for å proliferere og, til tross for fremskrittene i cellekultur teknikk, er det fremdeles vanskelig å generere et passende antall celler for vev tekniske anvendelser. I tillegg er offer for en sunn nerve nødvendig å høste autolog SC. Derfor er forskjellen i sourcing SC viktig for både tissue engineering og in vitro testing av nerve regenerering. I dette vis, kan ASC betraktes som en verdifullt alternativ for utvikling av et vev-konstruert konstruksjon som skal brukes for perifer nervereparasjon 17,18. Tidligere arbeid demonstrert evnen til disse cellene til å differensiere til SC-lignende ASC, uttrykker karakteristiske glial-markører, slik som S-100, p75 og glial fibrillært surt protein (GFAP) 19, så vel som myelin protein null (P0) 20 . Utskillelsen av glial vekstfaktorer, slik som hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF), ble også observert nervevekstfaktor (NGF) og glial celleavledet neurotrofisk faktor (GDNF) 21,22. Derfor kan SC-lignende ASC benyttes som promotor av perifere nerve regenerering, som vist ved både in vitro og in vivo studier 23-26. I tillegg kan ASC høstes gjennom minimalt invasive prosedyrer på høyere antall i forhold til andre stammecelletyper; frekvens av stamceller i fettvev er 100- til 1000-ganger høyere enn i benmargen 27, og de har en høyere spredningshastighet i forhold til SC og benmarg mesenchymale stamceller.
Dette arbeidet tar sikte på å gi en detaljert protokoll for å utføre høyeffektive høsting av dissosiert DRG nevroner og ASC henholdsvis, sistnevnte blir differensiert i SC-lignende celler. Den ko-kultur av disse to celletyper vil derfor gi en meget praktisk system som kan brukes for fremtidige studier på evnen av DRG neurons å spire neuritter og mekanismene for myelin formasjon på forskjellig stillas for nerve tissue engineering.
Protocol
MERK: Alle forsøk med dyr ble utført i samsvar med de britiske Dyr (vitenskapelige prosedyrer) Act, 1986.
1. Eksperimentell Set-up
- Før start vev og celle høst, sjekk at alle verktøyene er sterile. Om nødvendig, autoklav et par skarpe kirurgiske saks, en veldig fin pinsett og en fin standard tang. Også sterilisere hver underlaget før celle seeding bruker UV sterilisering, etanol eksponering eller dampsterilisering som passer.
- Utarbeidelse av media for stamcelle avling og differensiering
- Klargjør stamcellevekstmedium, som inneholder Minimum Essential Medium (α-MEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 200 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin (PS).
- Forberede en 10 mM stamløsning av forskolin ved oppløsning av 10 mg forskolin i 2,436 ml steril dimetyl sulfoxyde. Bruk ved sluttkonsentrasjon på 14 uM. </ Li>
- Forberede en 35 mg / ml stamløsning av retinsyre ved oppløsning av 50 mg i 1,43 ml sterilt dimetyl sulfoxyde. Bruk ved endelig konsentrasjon på 350 ng / ml.
- Forbered blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) lager (100 ug / ml) ved oppløsning av 10 ug av lyofilisert pulver i 100 ul sterilt vann. Bruk ved sluttkonsentrasjon på 5 ng / ml.
- Forbered basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) bestander (100 ug / ml) ved oppløsning av 50 ug av lyofilisert pulver i 500 ul sterilt vann. Bruk ved sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml.
- Klargjør stamcelledifferensiering medium, inneholdende stamcellevekst-medium supplert med 14 uM forskolin, 126 ng / ml glial vekstfaktor-2 (GGF-2), 5 ng / ml blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), og 10 ng / ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF).
- Utarbeidelse av media og lager løsninger for nevron avling og dissosiasjon
- Forberede BottenstEin og Sato (BS) medium 28 ved tilsetning av 1% PS og 1% N2 supplement til Hams F12-medium. Beregne det endelige volum nødvendig så 500 ul per brønn (ved bruk av en 24-brønns plate).
- Forbered kollagenase IV lagre i Hams F12-medium ved en konsentrasjon på 1,25% vekt / volum. Filter-sterilisere løsningen og oppbevares ved -20 ° C som 200 ul porsjoner.
- Forberede storfe bukspyttkjertelen trypsin aksjer i Hams F12 medium ved konsentrasjon på 2,5% vekt / volum, filter-sterilisere og oppbevar ved -20 ° C som 200 ul porsjoner.
- Klargjør nervevekstfaktor (NGF) stamløsning ved en konsentrasjon på 5 pg / ml i et filter-sterilisert 1 mg / ml fettsyre-fri bovint serumalbumin (BSA) løsning i F12-medium og oppbevares ved -20 C mens 200 ul aliquoter. Ikke filtrere NGF etter tilberedning.
- I tilfelle ingen overflatemodifisering har blitt utført, belegge dekkglass / plater med poly-D-lysin (0,1 mg / ml i 15 minutter ved RT) Og / eller laminin (2-10 mikrogram / cm 2 i 2 timer ved 37 ° C) for å støtte neuron feste og neurittutvekst som passer.
- Alltid varme opp mediet i et vannbad ved 37 ° C før bruk.
2. Fett-avledet Stem Cell (ASC) Harvest og Differensiering inn en SC Fenotype
- ASC høste fra visceral og lyske fett av voksen Sprague-Dawley rotter
- Før start, utarbeide en tube med 10-15 ml Hanks 'Balansert Saline Solution (HBSS) supplert med 1% v / v av PS løsning og butikken på is inntil fett høsting.
- Avslutte rotte ved halshugging og halshogging. Barbere rotte og gjør et snitt gjennom abdominal hud, utsette de indre organer og unngå blødninger. Ta av visceralt fett encasing magen og tarmene (vanligvis preget av en fet gul konsistens) og lyske fett rundt testiklene fra en voksen mann Sprague-Dawley rotte. Overførings the fett i rør inneholdende HBSS på is.
- I et biologisk sikkerhetskabinett (klasse II) Finhakk fett ved hjelp av en saks og en steril barberblad inntil fin konsistens er nådd, og overføre den til et rør som inneholder 15 ml 0,2% vekt / volum kollagenase type I løsning tilberedes og filtersterilisert på dagen.
- Overfør røret i et vannbad ved 37 ° C og forlater fettvev å fordøye i nærvær av enzymet i 30 min-1 time under kontinuerlig agitering. Overvåke fordøyelsen tett og stoppe før vevet er fullt dissosiert, vil dette forbedre celle levedyktighet og celle yield. Filter Theun-dissosiert vev gjennom en 100 mikrometer celle sil.
MERK: God vevsfordøyelse vil resultere i homogen konsistens av fettet, synlig med øyet når forsiktig virvlende røret, anskaffe en beige utseende. - Nøytraliser enzymet ved å tilsette 15 ml av stamcellevekst medium inneholdende føtalt bovint serum ved 37 ° C og sentrifugeroppløsning ved 160 g i 10 minutter for å samle det stromale vaskulær fraksjon, inkludert stamceller, ved bunnen av røret.
- På dette stadium kan pelleten blir resuspendert i 1 ml av røde blodceller lysebuffer for å fjerne blodceller forurensning. Etter resuspensjon og pipettering i 1 min, tilsett 10 ml av frisk stamceller vekstmedium og sentrifuger ved 160 g i 10 min.
- Aspirere nøye supernatanten fra røret, å ta vare på det avsatte cellepelleten på bunnen. Resuspender cellene i 10 ml stamcellevekstmedium, overføre dem i en 75 cm to kolber og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2. Vedlikeholde cellene ved sub-konfluent nivåer inntil passasje 1-2, endre medium hver 3 dager.
- ASC differensiering til en SC fenotype
- Ved passasje 1-2, fjerner stamcellevekstmedium fra 75 cm2 kolbe og erstatte det med 10 ml friskt medium inneholdende 1 mM β-merkaptoetanol ferskt behandling anleggrødt og filtersterilisert på dagen. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i 24 timer. På dette trinn er det viktig at cellene sådd ut ved lav tetthet (30%) før differensiering.
- Vask cellene nøye med HBSS, aspirer og erstatte den med 10 ml medium som inneholder 350 ng / ml retinsyre. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i 72 timer. Prøv å minimere eksponering av celle medium for lys.
- Etter 3 dager, vaske cellene nøye med HBSS, aspirer og erstatte den med 10 ml av stamcelle differensiering medium (se trinn 1.2.6). Opprettholde cellene ved sub-konfluent nivåer, endre medium hver 3 dager.
MERK: Etter to uker med inkubasjon, er ASC differensiert i SC-lignende ASC, uttrykke sin karakteristiske fenotype (som demonstrert av Kingham et al. 5). De kan da bli brukt opp før den 10. passasje uten merkbare endringer i atferd 29.
- Avslutte rotte ved halshugging og halshogging. Barbere rotte og løfte huden å eksponere ryggsøylen. Ved hjelp av skarp saks, excide ryggsøylen ta ekstra vare på de trange organer og blodårer. Overfør ryggsøylen i en biologisk sikkerhetskabinett (klasse II) under anvendelse av en petriskål, og fjerne eventuelle ryggdelen.
- Fordel ryggsøylen i to langs den langsgående aksen ved hjelp av sterile og skarpe kirurgiske sakser for å eksponere ledningen vev. På dette punkt er det nyttig å kutte ryggsøylen i to mindre segmenter under nivået av brystkassen, for å gjøre det lettere å håndtere under DRG-nevroner innhøsting. Ved hjelp av fine tang, forsiktig fjerne all ledningen vev, betaler oppmerksomhet til ikke trekke og fjerne DRG røtter. På denne måten DRG og røtter vil bli eksponert i løpet av de vertebrale kanalene, fremdeles inne i kolonnen. Observere DRG som hvite filamenter coming ut direkte fra kanalene.
- Trekk ut hele DRG root (ikke bare DRG) fra ryggvirvel kanalene ved hjelp av svært fin pinsett, går dypt inn i ryggvirvel kanalene og betaler oppmerksomhet for ikke å skade røttene av ganglier. Overfør DRG i en liten petriskål (60 mm 2) inneholdende 3-4 ml av Hams F12-medium supplert med 1% PS. Hvis du bruker forskjellige dyr, bruker separate retter.
- Under en disseksjonsmikroskop, rengjør DRG av eventuelle overskytende av nerverøtter rundt ganglia ved hjelp av sterile pinsett og en skalpell for å redusere gliacelle forurensning. Overfør DRG i en liten petriskål (35 mm 2) med 1,8 ml friskt F12 medium.
- Tilsett 200 ul av 1,25% vekt / volum kollagenase type IV stamløsning (sluttkonsentrasjon på 0,125%) og inkuber DRG ved 37 ° C, 5% CO2 i 1 time. Aspirere nøye mediet med et glass pipette, betaler oppmerksomhet ikke til å suge eller skade DRG. Legg fersk F12 medium smidigmentert med 0,125% vekt / volum kollagenase type IV enzymet og inkuberes i 1 time som tidligere beskrevet.
- Aspirer medium og vask forsiktig DRG med F12 medium. Legg deretter 1,8 ml F12-medium og 200 pl trypsin (endelig konsentrasjon på 0,25% vekt / vol) og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 30 minutter.
- Fjern trypsin og tilsett 1 ml F12-medium supplert med 500 ul av FBS for å stanse enzymreaksjonen. Aspirere mediet og vaskes forsiktig DRG med F12 medium for tre ganger for å fjerne spor av serum.
- Tilsett 2 ml friskt F12 medium og nøye overføre DRG med mediet inn i et 15 ml rør ved hjelp av en glass-pipette. Forsiktig dissosiere DRG neuroner ved å pipettere opp og ned (omtrent 8-10 ganger) med glasset pipette (plast tips kan brukes som alternativ).
- Tillat pelleten til å slå seg ned på bunnen av røret, og samle mediet i et nytt rør. Tilsett 2 ml friskt F12 medium til røret inneholdende pellets og gjenta mechanical dissosiasjon med glasset pipette. Gjenta dette trinnet til suspensjon blir homogene (ca 3-4 ganger) og samle alle dissosiert DRG i det nye røret. Denne fremgangsmåten reduserer stress som stammer fra den mekaniske dissosiasjon og forbedrer levedyktigheten til neuronene.
- Filtrere den resulterende homogenisert suspensjon inn i en ny 15 ml tube ved hjelp av en 100 mikrometer celle sil for å fjerne un-dissosiert nevroner og annet rusk. På dette trinn, kan det være fordelaktig først å filtrere cellesuspensjonen i et 50 ml rør og deretter overføre oppløsningen inn i mindre rør ved hjelp av en glass-pipette. Sentrifuger suspensjonen ved 110 g i 5 min.
- Fremstille en 15% bovint serumalbumin (BSA) ved å tilsette 500 ul av en 30% BSA-oppløsning i 500 ul av F12 medium. Sakte pipettere løsningen ned veggen i et 15 ml rør for å skape en gradvis protein sti. På dette stadiet, er det nyttig å holde røret i 45 ° vinkel og sakte slipper BSA bruker tallene påfalken tube som en referanse for å danne "spor".
- Aspirere supernatanten fra trinn 3.10 forlater 500 ul på bunnen av røret, og cellepelleten suspenderes i det samme medium. Sakte pipette suspensjon langs protein sti tidligere utarbeidet i trinn 3.11 (bruke tallene på røret som referanse) og sentrifuger ved 500 g for 5 min.
- Aspirere supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml modifisert BS medium (eller et blandet medium for SC-lignende ASC / DRG ko-kultur, som beskrevet nedenfor i trinn 4.5.
MERK: Volum å resuspendere DRG neuroner kan gjøres opp til det faktiske volum som er nødvendig, avhengig av den endelige cellekonsentrasjon ønsket og antallet prøver som skal podes. Ett dyr vil gi nok celler til en 24-brønners plate eksperiment. - Inkuber seeded prøvene ved 37 ° C, 5% CO2 i 2 timer for å tillate cellebinding og til slutt legge BS friskt medium supplert med 50 ng / ml nervevekst factor (NGF).
4. Direkte Co-kulturen i SC-lignende ASC og DRG nevroner
- Oppretthold SC-lignende ASC i kultur ved sub-konfluent nivåer som beskrevet i trinn 2.2.3. Tjuefire timers før DRG innhøstingen, aspirer stamcelle differensiering medium og vaske cellene med HBSS. Aspirer og inkuber i 3 ml trypsin ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 min.
- Sjekk under et lysmikroskop at alle cellene har løsnet fra kolben. Banke forsiktig på flasken for å hjelpe avløsning. Legg 7 ml medium for å stoppe trypsin-reaksjonen, samle cellesuspensjonen i et 15 ml rør og sentrifuger ved 110 g i 5 min.
- Aspirere supernatanten og cellepelleten suspenderes i 5 ml stamcelledifferensiering medium. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og fortynn cellesuspensjonen i henhold til den endelige konsentrasjonen som kreves. Ideelt seeding 20.000 SC-lignende ASC / cm 2 ville garantere en konfluent lag av celler.
- Seed SC-lignendeASC på substratet og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i 24 timer for å tillate cellefesting.
- Etter 24 timers inkubering aspireres mediet og tilsett DRG neuroner på toppen av cellene, som beskrevet i trinn 3.14 og 3.15. Endre medium til et blandet medium inneholdende 50% av stamcelledifferensiering medium og 50% av BS medium. I tillegg reduserer FBS konsentrasjon til 1 til 2,5% i den endelige blandede medium hjelper å unngå spredning av forurensende satellittceller avledet fra DRG dissosiasjon.
- Inkuber ko-dyrket prøvene ved 37 ° C, 5% CO2 og vedlikeholde i kultur i den nødvendige tid for fremtidige forsøk.
Representative Results
Kulturer av dissosierte DRG neuroner representerer en egnet in vitro modell for studiet av nerve regenerering. Men ikke ubehandlede overflater ikke gi et egnet miljø for DRG feste og utvidelse av neuritter. SC-lignende ASC er i stand til å produsere vekstfaktorer og kjemokiner 19 som kan forbedre evnen av DRG-neuroner å spire neuritter når de blir utgitt i kulturmediet. Tilstedeværelsen av SC-lignende ASC i kultursystemet kan derfor spille en viktig rolle i regulering av DRG-funksjoner.
Denne protokollen (figur 1) viser fremgangsmåten for å utføre en direkte ko-kultur av SC-lignende ASC og DRG-neuroner, hvor neuronale celler komme i direkte kontakt med tidligere sådd SC-lignende ASC. Den største vanskeligheten i forbindelse med denne fremgangsmåten er den høye variasjon av antallet av DRG-neuroner høstet fra forskjellige dyr. Av denne grunn, kan resultatene være noen ganger vanskelig å komparativee og en spesiell oppmerksomhet bør rettes i løpet av seeding prosedyre for å få alltid en sammenlignbar celletetthet i hvert forsøk. Protokollen er optimalisert for å redusere minst antall satellittceller igjen fra DRG nevron dissosiasjon hjelp av BSA gradient (trinn 3.11). I tillegg kan cytosin-arabinose (Ara-C) supplement tilsettes til BS medium for ytterligere å minimalisere satellittcellepopulasjon, som beskrevet av Kingham et al., 11. Imidlertid må valg av behandlingstiden for å være nøye balansert med DRG og SC-lignende ASC vitalitet, påvirkes også av tilstedeværelsen av ARA-C supplement i kulturmediet. Derfor er det svært vanskelig å oppnå en satellitt celle gratis-system.
Figur 2 viser viktigheten av SC-lignende ASC for DRG neuritt-spirende i en ko-kulturmodell ved bruk av ubehandlet og kjemisk-modifiserte poly - kaprolakton (PCL) filmer som substrater. DRG nevroner var maintained i kultur i 3 dager i nærvær eller fravær av SC-lignende ASC, ved hjelp av en blandet oppløsning inneholdende 50% av BS medium og 50% av stamcelledifferensiering medium, som beskrevet i trinn 4.5. Etter denne perioden ble cellene fiksert i 4% paraformaldehyd og farget med β-tubulin III (DRG-neuroner) og S100 (SC-lignende ASC) for å undersøke cellemorfologi, og for å studere evnen til DRG-neuroner for å stikke neuritter. Ingen neuritter ble observert på ubehandlede overflater i fravær av SC-lignende ASC (Figur 2A), mens dannelsen av neuritter ble klart forbedret i co-kultur system (Figur 2C). I gjennomsnitt antall neuritter per celle legeme signifikant øket fra 0 til 3 i nærvær av stamceller. Bekreftelse av disse resultater ble også gitt ved scanning-elektronmikroskopi (SEM) analyse, er vist på figur 3. Spesielt SEM bilder viser at evnen til DRG neuroner å spire neuritter forekommer fortrinnsvis i kombinasjonmed SC-lignende ASC, som antydet med de gule piler i figur 3C.
Det skal påpekes at bruken av laminin-modifiserte substrater (inkludert laminin-avledede peptider) i kultursystemer som inneholder DRG-nevroner er ofte definert som en egnet tilstand for neuronal cellekultur, har bemerkelsesverdige virkninger på neuritt-dannelse og utvidelse 30-32 . Men resultatene som er vist i figur 2D, og Figur 3D viser at en kombinasjon av kjemiske og biologiske signaler kan ytterligere forsterke responsen av DRG-neuroner.
Figur 1. Utarbeidelse av den direkte DRG-SC-lignende ASC co-kultur system. DRG nevroner og ASC er hentet henholdsvis fra ryggsøylen og visceral og lyske fett av voksen male Sprague-Dawley-rotter. Etter oppslutning av fettvev gjennom en kaskade av enzymatiske reaksjoner, er ASC differensiert i SC-lignende celler og opprettholdt i sub-konfluente betingelser inntil nødvendig. SC-lignende ASC er pre-seeded på hvert substrat 24 timer før den DRG innhøsting. På dag, er DRG neuroner dissosiert og ekstraheres gjennom en serie av enzymatiske og mekaniske handlinger. Nervecellene blir deretter sådd på toppen av tidligere sådd SC-lignende ASC og vedlikeholdes i kultur inntil analysert (blandet medium: inneholder 50% av stamcelle differensiering medium og 50% av modifisert BS medium). Klikk her for å se et større versjon av denne figur.
Figur 2. Fluorescens bilder av DRG nevroner i ulike dyrkningsforhold.(A) ubehandlede PCL-filmer, (B) RGD-modifiserte PCL-filmer, (C) ko-dyrket med SC-lignende ASC på ubehandlede PCL-filmer, (D) ko-dyrket med SC-lignende ASC på RGD-modifiserte PCL-filmer. Celler ble opprettholdt i kultur i tre dager ved hjelp av en blandet oppløsning inneholdende 50% av modifisert BS medium og 50% av stamcelledifferensiering medium. Etter denne tiden ble cellene fiksert i 4% paraformaldehyd, permeabilisert i en Triton-X-løsning, og ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert med 1% BSA. Neuronale celler ble deretter farget mot β-tubulin III (FITC; grønn), og SC-lignende ASC mot S-100 (AlexaFluor568; rød) antistoffer. Endelig atomkjerner ble farget med DAPI (blå). Bildene ble anskaffet ved hjelp av en fluorescens mikroskop (Olympus BX60, Japan). (Re-print med tillatelse fra de Luca et al. 30. Klikk her for å vise større version av denne figuren.
Figur 3. SEM bilder av DRG nevroner i ulike dyrkningsforhold (A) ubehandlede PCL filmer (B) RGD-modifiserte PCL filmer;. (C) co-kultivert med SC-lignende ASC på ubehandlede PCL filmer, (D) co-kultivert med SC-lignende ASC på RGD-modifisert PCL filmer. De gule piler indikerer kontaktpunktene mellom SC-lignende ASC og DRG, bekrefter deres direkte samhandling i co-kultur system. Celler ble holdt i kultur for 3 dager og fast i 2,5% glutaraldehyd. Etter dehydrering i gradert etanolserie (50%, 70%, 90%, 100%) ble cellene til slutt skyllet i heksametyldisilazan og tørkes før montering på stubber og gull sputtering for SEM-analyse. Bildene ble anskaffet ved hjelp av en SEM (Zeiss EVO60, UK) med en akselererende volTage 10kV. (Re-print med tillatelse fra de Luca et al. 30. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
DRG nevroner er hyppig brukt blant nevronale celler for primær kultur for å studere regenerering av nevroner etter aksotomi in vivo. Her en nøyaktig protokoll for DRG høste fra voksne rotter er presentert, med sikte på å redusere bestanden av satellittceller i omgivelsene uten å ødelegge neuronoverlevelse. Som ASC differensiert i et SC-lignende fenotype er en gyldig alternativ til SC for celleterapier, er en SC-lignende ASC / DRG ko-kultur-system også beskrevet i detalj.
Det er allment kjent at laminin (eller laminin-avledet peptidsekvenser) har en gunstig effekt på neuron overlevelse og neurite dannelse 31-33. Når du utfører DRG nevroner kulturer det er derfor anbefalt å tidligere frakk hver underlaget med laminin for å unngå tap av funksjonalitet av nerveceller. Konseptet med laminin belegg gjelder også biomateriale substrater for utforming avvevsteknologi konstruksjoner, så som poly - kaprolakton (PCL) brukes ofte for fabrikasjon av nerve ledningene 30. Også, demonstrerte tidligere arbeid som fibrin matriser er egnede materialer for nevronale kulturer i tre dimensjon 11.
I tillegg til proteinbelegg, ko-kulturmodeller gi verdifulle forhold for DRG neuron overlevelse og et egnet miljø for å studere interaksjoner som forekommer mellom nevroner og SC i det perifere nervesystemet etter skade. Celler kan også bli transplantert in vivo ved bruk av nevrale enhetene for å forkorte den tid rekruttering av autologe celler ved skadestedet. Dette er spesielt viktig i alvorlige skader, som kan føre til celle senescens / død og muskelatrofi. Selv SC er de viktigste gliaceller som er involvert i prosessen med perifer nerveregenerering og myelinisering, deres begrensede tilgjengelighet og deres sakte proliferasjonsrate gjør dem uegnetfor tissue engineering applikasjoner 34. ASC er et gyldig alternativ på grunn av sin overflod og evne til å differensiere i SC fenotype, uttrykker spesifikke gliale markører og viser funksjonelle likheter til innfødte SC 19. ASC er også i stand til å produsere proteiner og vekstfaktorer 5 som kan være fordelaktig for dannelse og utvidelse av neuritter av DRG-neuroner i en ko-kultur-system. Imidlertid kan to forskjellige ko-kultursystemer settes opp som funksjon av de eksperimentelle behov. Det foreslås i denne utredningen metoden er en revidert versjon av et veletablert protokollen i vårt laboratorium 11, og det innebærer en direkte kontakt mellom de to celletypene (direkte co-kultur), der den andre celletype (DRG nevroner) sås på toppen av de andre (SC-lignende ASC). Denne metode er basert på tidligere funn som viste viktigheten av tilstedeværelsen av en glial cellelaget på substratet ved såing nevronkulturer 35
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative |
| 15 ml plastic tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 50 ml plastic tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 75 cm2 flasks | Corning | BC301 | |
| Retinoic Acid >98% HPLC | Sigma | R2625 | |
| ARA-C supplement | Sigma | C6645 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 aa) | Peprotech | 100-18B | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9205 | |
| Collagenase type I | Gibco | 17100-017 | Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion |
| Collagenase type IV | Worthington Biochemical | LS004188 | Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1001 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 | |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | FB50253 | Sharp material to be disposed accordingly |
| Glial Growth Factor-2 (GGF-2) | Acorda Therapeutics | GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200 ng/ml | |
| Nutrient Mix F12 HAM | Sigma | N6658 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9394 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
| N-2 supplement (100x) | Invitrogen | 17502 | |
| Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Penicillin-Streptomycin (PS) | Sigma | P0781 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Corning | 430165 | |
| Recombinant Human PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | |
| Trypsin | Invitrogen | 25200-056 | Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks |
| Trypsin (2x bovine pancreatic) | Worthington Biochemical | LS003703 | This is used for DRG dissociation |
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma | M8042 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Prepare the solution in the biological cabinet |
References
- Wiberg, M., Terenghi, G. Will it be possible to produce peripheral nerves. Surg Technol Int. 11, 303-310 (2003).
- Terzis, J. K., Sun, D. D., Thanos, P. K. Historical and basic science review: past, present, and future of nerve repair. J Reconstr Microsurg. 13 (3), 215-225 (1997).
- Bruyns, C. N., Jaquet, J. B., Schreuders, T. A., Kalmijn, S., Kuypers, P. D., Hovius, S. E. Predictors for return to work in patients with median and ulnar nerve injuries. J Hand Surg Am. 28 (1), 28-34 (2003).
- Geuna, S., Raimondo, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int Rev Neurobiol. 87 (09), 27-46 (2009).
- Kingham, P. J., Kalbermatten, D. F., Mahay, D., Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G. Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Exp Neurol. 207 (2), 267-274 (2007).
- Stoll, G., Jander, S., Myers, R. R. Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller’s observations to neuroinflammation. J Peripher Nerv Syst. 7 (1), 13-27 (2002).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annu Rev Biomed Eng. 5, 293-347 (2003).
- Johnson, E. O., Zoubos, A. B., Soucacos, P. N. Regeneration and repair of peripheral nerves. Injury. 36S (4), S24-S29 (2005).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An efficient method for dorsal root ganglia neurons purification with a one-time anti-mitotic reagent treatment. PloS One. 8 (4), e60558 (2013).
- Stettner, M., Wolffram, K., et al. A reliable in vitro model for studying peripheral nerve myelination in mouse. J Neurosci Meth. 214 (1), 69-79 (2013).
- Kingham, P. J., Mantovani, C., Terenghi, G. Stem cell and neuron co-cultures for the study of nerve regeneration. Method Mol Biol. 695, 115-127 (2011).
- Nissinen, M., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Mol Cell Neurosci. 37 (3), 568-578 (2008).
- Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
- Lewallen, K. a, Aa Shen, Y. -, De la Torre, A. R., Ng, B. K., Meijer, D., Chan, J. R. Assessing the role of the cadherin/catenin complex at the Schwann cell-axon interface and in the initiation of myelination. J Neurosci. 31 (8), 3032-3043 (2011).
- Evans, G. R. Challenges to nerve regeneration. Semin Surg Oncol. 19 (3), 312-318 (2000).
- Webber, C., Zochodne, D. The nerve regenerative microenvironment: early behavior and partnership of axons and Schwann cells. Exp Neurol. 223 (1), 51-59 (2010).
- Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells: current findings and future persperctives. Discov Med. 11 (57), 160-170 (2011).
- Faroni, A., Terenghi, G., Reid, A. J. Adipose-derived stem cells and nerve regeneration: promises and pitfalls. Int Rev Neurobiol. 108, 121-136 (2013).
- Strem, B. M., Hicok, K. C., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
- Xu, Y., Liu, L., et al. Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adipose-derived stem cells in vitro. Brain Res. 1239, 49-55 (2008).
- Tomita, K., Madura, T., Sakai, Y., Yano, K., Terenghi, G., Hosokawa, K. Glial differentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy. Neuroscience. 236, 55-65 (2013).
- Clauser, L., Tieghi, R., Palmieri, A., Carinci, F. Adipose-derived stem cells secrete neurotrophic factors. Annals of Oral and Maxillofacial Surgery. 1 (2), 1-5 (2013).
- Di Summa, P. G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., Kalbermatten, D. F. Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (9), 1544-1552 (2010).
- Di Summa, P. G., Kalbermatten, D. F., Pralong, E., Raffoul, W., Kingham, P. J., Terenghi, G. Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts. Neuroscience. 181, 278-291 (2011).
- Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats. Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).
- Zhang, Y., Luo, H., et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).
- Gomillion, C. T., Burg, K. J. L. Stem cells and adipose tissue engineering. Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).
- Mantovani, C., Raimondo, S., et al. Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages. Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).
- Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated. Tissue Eng. 19 (3-4), 368-379 (2013).
- Fudge, N. J., Mearow, K. M. Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate. BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).
- Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels. Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).
- Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration. Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).
- Richardson, J. a, Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films. J Neural Eng. 8 (4), 046015 (2011).
- Seggio, aM., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth. J Neural Eng. 7 (4), 046001 (2010).
- Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules. Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).
- Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth. Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).
