Summary
Спинной корень ганглиев (DRG) являются структуры, содержащие сенсорные нейроны периферической нервной системы. При диссоциации, они могут быть совместно культивировали с SC, как полученные из жировой ткани стволовые клетки (ASC), обеспечивая ценную модель для изучения в пробирке регенерацию нерва и миелинизации, имитируя среду в естественных условиях в месте повреждения.
Introduction
Повреждений периферических нервов являются общими с примерно 9000 случаев в Великобритании происходит каждый год в основном молодые и работающего населения 1. Несмотря микрохирургической техники ремонт нерва, нормально восстановление функции недостижимо с в результате больной руки ощущение, снижение двигательной функции и частые боли и непереносимость холода 2. Такие травмы глубокое и постоянное воздействие на пациента и их способность выполнять действия в повседневной жизни, с менее чем 60% возвращаются к работе 3.
После травмы, фенотипа и морфологии нейронов и клеток Шванн (SC) изменения для того, чтобы создать подходящую среду, чтобы позволить аксона прорастания. В случае рассечения, нерв делится на проксимальных и дистальных пни; Проксимальный пень быть точка, с которой процесс восстановления происходит, в то время как дистальной культи подвергается валлеровский дегенерации после чего SC Весь текстсо стороны потерпевших аксонов, де-дифференцировать и размножаться. Это основное по устранению миелина мусора и подготовке дистального пень для нервов повторной генерации 4,5. Axon всходов поддерживается производства нейротрофических факторов и хемокинов, опубликованным СК на дальнем пень, и руководствуясь базальной мембраны оставленных после валлеровский вырождение 6,7. SC выровнять наряду с регенерирующим аксона, образующего полосы Büngner, которые помогают рост аксонов к органу-мишени, сокращение разветвлению их за пределами endoneurial трубки. После реиннервации, SC сформировать новый миелиновой оболочки упаковка регенерированных аксонов, но сенсорные и моторные функции лишь частично восстановлены 8.
Спинной корень ганглиев (DRG) представляют собой структуры, расположенные в межпозвоночных отверстий позвоночника, содержащие чувствительные нервные клетки, иннервирующие периферийные органы. При диссоциации, они могут быть использованы в качестве пригодных в пробирке модэль для изучения регенерации нерва 9 - 11, в том числе исследований формирования миелина. В частности, для взрослых DRG нейроны имитировать характеристики в естественных условиях эти клетки и надежным средством инструмент для изучения новых стратегий, периферической восстановления нерва в тканевой инженерии.
Со-культуры представляют собой динамическую систему, которая имитирует в пробирке взаимодействие двух (или более) типов клеток в определенной среде в естественных условиях. Одним из преимуществ этих моделей сотовых совместное культивирование является гибкость и высокую управления, который может быть оказано на внеклеточную среду. DRG нейроны были часто используется в системах совместного культивирования с SC, чтобы имитировать фактические взаимодействие, которое происходит между этими двумя типами клеток в периферической нервной системе 10,12 - 14. Было показано, что СК секретируют внеклеточный матрикс (ECM) белков и факторов роста, которые могут заметно улучшитьСпособность DRG нейронов, чтобы выжить и прорастают невриты 15,16. Тем не менее, SC требуют длительных периодов времени, чтобы размножаться и, несмотря на прогресс в технике культивирования клеток, это по-прежнему трудно создать необходимое количество клеток для тканевой инженерии. Кроме того, жертва здорового нерва необходимость собрать аутологичных СК. Таким образом, разница в поиске SC важно как для тканевой инженерии и в пробирке тестирования регенерации нерва. С этой точки зрения, АСК можно считать ценной альтернативой для развития в тканевой инженерии конструкции, которые будут использоваться для периферической нервных ремонта 17,18. Предыдущие работы показали способность этих клеток дифференцироваться в SC-ASC как, выражая характерные глиальные-маркеры, такие как S-100, P75 и глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP) 19, а также миелина белка нулю (P0) 20 , Секреция глиальных факторов роста, таких как мозговой нейротрофический фактор (BDNF), фактор роста нервов (ФРН) и глиальных клеток нейротрофический фактор (GDNF) также наблюдалось 21,22. Таким образом, как СК-АСК могут быть использованы в качестве промотора периферической регенерации нерва, как продемонстрировано, как в пробирке и в естественных условиях исследования 23 - 26. Кроме того, по возрастающей могут быть собраны с помощью минимально-инвазивных процедур в большее число по сравнению с другими типами стволовых клеток; частота стволовых клеток в жировой ткани 100 до 1000 раз выше, чем в костном мозге 27, и они имеют более высокую скорость пролиферации по сравнению с SC, и костного мозга мезенхимальных стволовых клеток.
Эта работа призвана обеспечить подробный протокол на выполнение высокоэффективные урожаи диссоциированных DRG нейронов и ASC соответственно, причем последний дифференцированы в SC-подобных клеток. Таким образом, совместное культивирование этих двух типов клеток обеспечит очень практическую систему, которую можно использовать для будущих исследований о способности DRG NEurons прорастать невриты и механизмы формирования миелиновой на разных лесов для нервов тканевой инженерии.
Protocol
Примечание: Все эксперименты с участием животных были проведены в соответствии с Великобританией животных (научные процедуры) Закона 1986 года.
1. Экспериментальная установка
- Перед началом тканей и клеток урожай, убедитесь, что все инструменты должны быть стерильными. Если необходимо, автоклав пару острых хирургических ножниц, очень тонким пинцетом и штраф стандартных щипцов. Также стерилизовать каждый субстрат до посева клеток с помощью УФ-стерилизации, экспозицию этанол или паровой стерилизации, как это необходимо.
- Подготовка массовой информации для сбора урожая и дифференцировки стволовых клеток
- Подготовка среды роста стволовых клеток, содержащий минимальную поддерживающую среду (α-MEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 200 мМ L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина (PS).
- Подготовка 10 мМ маточного раствора форсколина путем растворения 10 мг форсколина в 2,436 мл стерильной диметилового sulfoxyde. Использование при конечной концентрации 14 мкМ. </ Li>
- Подготовка 35 мг / мл исходного раствора ретиноевой кислоты путем растворения 50 мг в 1,43 мл стерильной диметилсульфоксид sulfoxyde. Использование при конечной концентрации 350 нг / мл.
- Подготовка тромбоцитарный фактор роста (PDGF) запасов (100 мкг / мл) путем растворения 10 мкг лиофилизированного порошка в 100 мкл стерильной дистиллированной воды. Используйте до конечной концентрации 5 нг / мл.
- Подготовка основной фактор роста фибробластов (bFGF) запасов (100 мкг / мл) путем растворения 50 мкг лиофилизированного порошка в 500 мкл стерильной дистиллированной воды. Использование при конечной концентрации 10 нг / мл.
- Подготовка дифференцировки стволовых клеток среду, содержащую среду роста стволовых клеток, дополненной 14 мкМ форсколина, 126 нг / мл фактора роста глиальных-2 (GGF-2), 5 нг / мл тромбоцитарного фактора роста (PDGF), и 10 нг / мл основной фактор роста фибробластов (bFGF).
- Подготовка информации и фондовых решений для урожая нейронов и диссоциации
- Подготовка BottenstEin и Сато (BS) средний 28, путем добавления 1% PS и 1% N2 дополнение к F12, Хама. Рассчитать конечный объем, необходимый в 500 мкл на лунку (при использовании 24-луночного планшета).
- Подготовьте запасы коллагеназы IV в среде F12 Хама в концентрации 1,25% мас / об. Фильтр-стерилизовать решения и хранить при температуре -20 ° C до 200 мкл аликвоты.
- Подготовка бычьей поджелудочной железы запасов трипсина в среде F12 Хама в концентрации 2,5% мас / об, фильтр-стерилизовать и хранить при -20 ° С в 200 мкл аликвоты.
- Подготовка фактор роста нервов (NGF) маточного раствора при концентрации 5 мкг / мл в стерилизованным фильтрацией 1 мг / мл жирной кислоты, свободной бычьего сывороточного альбумина (БСА) раствора в среде F12 и хранить при -20 ° С в 200 мкл аликвоты. Не фильтровать NGF после восстановления.
- В случае не модификация поверхности не была выполнена, флаг покровные / пластины с поли-D-лизином (0,1 мг / мл в течение 15 мин при комнатной температуре) И / или ламинин (2-10 мкг / см 2 в течение 2 ч при 37 ° С) для поддержки нейронов прикрепление и рост аксонов в соответствующих случаях.
- Всегда разогреть носитель на водяной бане при 37 ° С перед использованием.
2. полученные из жировой ткани стволовых клеток (ASC) Сбор и дифференциация в SC фенотипа
- Урожай ASC от висцерального и паховой жира взрослого самца Sprague-Dawley крыс
- Перед началом, подготовить трубку с 10-15 мл Хэнкса сбалансированного солевого раствора (HBSS) с добавкой 1% объем / объем раствора и магазина PS на льду до сбора жира.
- Завершить крысу путем смещения шейных позвонков и обезглавливание. Бритье крысу и сделать надрез через кожу живота, выставляя внутренние органы и избежать кровотечения. Удалить висцерального жира, окружающую желудок и кишечник (обычно характеризуется жировой желтый консистенции) и паховая жир, окружающий яички от взрослого мужского Sprague-Dawley крысы. Передача йе жира в пробирку, содержащую HBSS на льду.
- В кабинете биологической безопасности (класс II) мелко нарезать сало, используя ножницы и стерильный лезвие до нежной консистенцией достигается и передать его в пробирку, содержащую 15 мл 0,2% вес / v тип коллагеназы I решение свежеприготовленного и фильтр-стерилизовать в день.
- Передача трубки в водяной бане при 37 ° С и оставляют на жировую ткань, чтобы переварить в присутствии фермента в течение 30 мин-1 час при непрерывном перемешивании. Следить за пищеварение тесно и остановиться перед ткань полностью диссоциированы, это позволит улучшить жизнеспособность клеток и выход клеток. Фильтр Theun-диссоциированных ткани через сито 100 мкм клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хороший ткани пищеварение приведет к однородной консистенции жира, видимого на глаз, когда мягко закрученной трубки, приобретая бежевый внешний вид. - Нейтрализовать добавлением фермента 15 мл среды роста стволовых клеток, содержащих фетальной бычьей сыворотки при 37 ° С и центрифугируютРаствор при 160 г в течение 10 мин, чтобы собрать стромальных сосудов фракции, в том числе стволовых клеток, в нижней части трубы.
- На этой стадии осадок может быть повторно суспендируют в 1 мл эритроцитов буфера для лизиса для удаления загрязнений клеток крови. После ресуспендирования и пипеткой в течение 1 мин, добавить 10 мл свежей среды для роста стволовых клеток и центрифуге при 160 г в течение 10 мин.
- Тщательно аспирата супернатант из трубки, заботясь осажденного осадка клеток в нижней части. Ресуспендируют клеток в 10 мл среды для роста стволовых клеток, передавать их в 75 см 2 колбы и инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2. Поддерживать клетки при суб-сливающийся уровнях до прохода 1-2, изменение среды каждые 3 дня.
- ASC дифференциации к фенотипу, SC
- При прохождении 1-2, удалить среду роста стволовых клеток из 75 см 2 колбу и заменить его 10 мл свежей среды, содержащей 1 мМ β-меркаптоэтанола только что прекрасный и фильтр стерилизуют в день. Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 24 ч. На этой стадии очень важно, что эти клетки высевали при низкой плотности (30%) перед началом дифференциации.
- Вымойте клетки тщательно с HBSS, аспирация и заменить его 10 мл среды, содержащей 350 нг / мл ретиноевой кислоты. Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 72 ч. Постарайтесь свести к минимуму воздействие на клеточную среду к свету.
- После 3 дней, промыть клетки тщательно с HBSS, аспирация и заменить его 10 мл дифференцирование стволовых клеток среды (см шаг 1.2.6). Поддерживать клетки при суб-сливающийся уровнях, изменяя среду каждые 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 2 недель инкубации, ASC дифференцированы в SC, как ASC, выражая свою характерную фенотип (как показано на Кингем и др. 5). Они затем могут быть использованы вплоть до 10-го прохода без заметных изменений в поведении 29.
- Завершить крысу путем смещения шейных позвонков и обезглавливание. Бритье крысу и снять кожу, чтобы выставить позвоночник. Использование острыми ножницами, подакцизных позвоночник, принимая дополнительный уход из закрытых органов и кровеносных сосудов. Передача позвоночника в кабинете биологической безопасности (класс II) с использованием чашки Петри и удалите спинной части.
- Разделите позвоночника пополам вдоль продольной оси, используя стерильные и острые хирургические ножницы, чтобы разоблачить мозга ткани. В этот момент, было бы полезно, чтобы отрезать позвоночник в двух небольших сегментов ниже уровня грудной клетки, чтобы сделать его проще в обращении во время уборки DRG нейронов. Использование тонких щипцов, осторожно удалите всю шнур ткани, обращая внимание, чтобы не тянуть и удаления корней DRG. Таким образом, DRG и корни будут подвергаться в позвоночных каналах, по-прежнему заключен в колонке. Соблюдайте DRG как белых нитях ЦОИнг непосредственно из каналов.
- Вытяните весь корень DRG (а не только DRG) из позвонков каналов с помощью очень тонких щипцов, углубляясь в позвоночных каналов и уделяя внимание, чтобы не повредить корни ганглиев. Передача DRG в небольшую чашку Петри (60 мм 2), содержащей 3-4 мл среды F12 Хэма, дополненной 1% PS. При использовании других животных, использовать отдельные блюда.
- Под микроскопом рассекает, очистить DRG от избытка нервных корешков, окружающих ганглиев с помощью стерильного пинцета и скальпеля для снижения загрязнения глиальных клеток. Передача DRG в небольшую чашку Петри (35 мм 2) с 1,8 мл свежей среды F12.
- Добавить 200 мкл 1,25% мас / об Тип коллагеназы IV маточного раствора (конечная концентрация 0,125%) и инкубируют в DRG при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 1 часа. Тщательно аспирата среду со стеклянной пипетки, обращая внимание, чтобы не аспирата или повредить DRG. Добавить свежие F12, эластичнойтаджи с 0,125% мас / об типа коллагеназы IV фермента и инкубировали в течение 1 ч, как описано ранее.
- Аспирируйте среды и аккуратно мыть DRG с F12 средой. Добавить затем 1,8 мл среды F12 и 200 мкл трипсина (конечная концентрация 0,25% мас / об) и инкубировали при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 30 мин.
- Удалить трипсин и добавить 1 мл среды F12, дополненной 500 мкл ФБС, чтобы арестовать ферментативной реакции. Аспирируйте среды и осторожно мыть DRG с F12 средой три раза, чтобы удалить следы сыворотки.
- Добавить 2 мл свежей среды F12 и тщательно передачи DRG со средой в 15 мл пробирку с помощью стеклянной пипетки. Аккуратно отделить ГВС нейроны с помощью пипетки вверх и вниз (около 8-10 раз) со стеклянной пипетки (пластиковые советы могут быть использованы в качестве альтернативы).
- Разрешить осадок, чтобы осесть на дно пробирки и собирают среду в новую пробирку. Добавить 2 мл свежей среды F12 с трубкой, содержащей осадок и повторите мechanical диссоциации с стеклянной пипетки. Повторите этот шаг, пока подвеска не становится гомогенным (примерно 3-4 раз) и собрать все диссоциированную DRG в новую пробирку. Этот метод уменьшает стресс, вытекающий из механической диссоциации и повышает жизнеспособность нейронов.
- Фильтр полученного гомогенизированной суспензии в новую пробирку 15 мл с помощью мкм клеточный фильтр 100 для удаления не-диссоциированных нейронов и другого мусора. На этой стадии, может быть удобно, чтобы первый фильтр клеточной суспензии в 50 мл пробирку, а затем передать решение в меньший трубки с помощью стеклянной пипетки. Центрифуга суспензии при 110 г в течение 5 мин.
- Подготовка 15% бычьего сывороточного альбумина (BSA) путем добавления 500 мкл 30% BSA раствора к 500 мкл среды F12. Медленно пипетки раствор вниз по стенке 15 мл пробирку, чтобы создать постепенное след белка. На этом этапе, было бы полезно, чтобы удерживать трубу под углом 45 ° и медленно высвобождают BSA с использованием номера насокол трубка в качестве эталона для формирования «дорожки».
- Аспирата супернатант со стадии 3,10 уходящую 500 мкл на дне пробирки, и ресуспендируют осадок клеток в той же среде. Медленно пипетки подвески вдоль белка след ранее полученного на стадии 3,11 (используйте цифры на трубы в качестве эталона) и центрифуге при 500 г в течение 5 мин.
- Аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл модифицированного BS среды (или смешанной среде для SC-подобный ASC / DRG совместного культивирования, как описано ниже на этапе 4.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: объем вновь приостановить DRG нейроны могут быть сделаны до фактического объема требуется, в зависимости от концентрации последней ячейки нужного и количество образцов для заполнена. Одно животное будет обеспечивать достаточное количество клеток для эксперимента пластины 24-а. - Инкубируйте семенами образцов при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 2 часов, чтобы позволить прикрепление клеток и, наконец, добавить свежий BS среду, дополненную 50 нг / мл фа роста нервовCTOR (NGF).
4. Прямая Co-культура SC-как ASC и DRG нейронов
- Поддержание SC-как ASC в культуре на суб-сливающийся уровнях, как описано в шаге 2.2.3. Двадцать четыре часа в до сбора урожая DRG, аспирации дифференциации среду стволовых клеток и промыть клетки с HBSS. Аспирируйте и инкубировать в 3 мл трипсина при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 3 мин.
- Проверка под световым микроскопом, что все клетки были отделены от колбы. Слегка постучите колбу, чтобы помочь отряд. Добавить 7 мл среды, чтобы остановить реакцию трипсина, собирают суспензию клеток в 15 мл пробирку и центрифугируют при 110 г в течение 5 мин.
- Аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5 мл дифференцировки стволовых клеток среды. Количество клеток с использованием гемоцитометра и разбавленной клеточной суспензии в соответствии с требуемой конечной концентрации. В идеале, посев 20000 SC-как ASC / см 2 будет гарантировать сливающийся слой клеток.
- Семенной SC-какASC на подложке и инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 24 ч, чтобы позволить прикрепление клеток.
- После 24 ч инкубации аспирации среды и добавить DRG нейроны в верхней части клеток, как описано в стадии 3,14 и 3,15. Изменение среды в смешанной среде, содержащей 50% стволовых клеток дифференцировки среды и 50% от BS среды. Кроме того, снижение концентрации FBS в 1-2,5% в конечном смешанной среде помогает избежать распространения загрязняющих спутниковые клетки, полученные из КСГ диссоциации.
- Инкубируйте совместном культивировании образцов при 37 ° С, 5% СО 2 и поддерживать в культуре в течение необходимого времени для будущих испытаний.
Representative Results
Культуры диссоциированных нейронов DRG, представляют подходит в модели пробирке для изучения регенерации нерва. Тем не менее, необработанные подложки не обеспечивают благоприятных условий для крепления DRG и расширение нейритов. SC-как ASC способны производить факторы роста и хемокины 19, которые могут улучшить способность DRG нейронов прорастают невриты, когда они будут освобождены в культуральной среде. Поэтому наличие SC-как ASC в системе культуры могут играть важную роль в регуляции функций DRG.
Этот протокол (Рисунок 1) иллюстрирует процедуру для выполнения прямого сотрудничества культуру SC-как ASC и DRG нейронов, в течение которых нервные клетки получают в непосредственном контакте с ранее посеянного SC-как ASC. Основная трудность, связанная с этой процедурой, является высокая изменчивость количества нейронов DRG собранных из различных животных. По этой причине, результаты могут быть иногда трудно COMPARе и особое внимание должно быть уделено в процессе сева, чтобы получить всегда сравнимую плотность клеток в каждом эксперименте. Протокол был оптимизирован для уменьшения меньшей мере такое число сателлитных клеток, оставшихся с DRG нейронов диссоциации с использованием градиента BSA (шаг 3,11). Кроме того, цитозин-арабинозы (Ara-C) добавки могут быть добавлены к среде BS, с тем чтобы в дальнейшем свести к минимуму спутника популяции клеток, как описано Кингем соавт. 11. Тем не менее, выбор времени обработки должна быть тщательно сбалансированы с DRG и SC-как ASC жизненной силы, также зависит от наличия ARA-C дополнения в культуральной среде. Таким образом, это очень трудно выполнить штрафной спутниковой системы клеток.
Рисунок 2 показывает важность SC-как ASC для DRG нейрита прорастания в модели сокультуры использованием необработанного и химически модифицированный поли - капролактоном (PCL) фильмы в качестве субстратов. DRG нейроны почтаntained в культуре в течение 3 дней в присутствии или в отсутствие SC-ASC как, используя смешанный раствор, содержащий 50% BS среды и 50% стволовых клеток дифференцировки среде, как описано в стадии 4,5. После этого периода клетки фиксировали в 4% параформальдегида и окрашивали β-тубулина III (DRG нейронов) и S100 (SC-как ASC), чтобы исследовать морфологию клеток и изучение способности DRG нейронов, чтобы выступать невриты. Нет невриты не наблюдалось на необработанных поверхностей в отсутствии SC-как ASC (рис 2а), в то время как формирование нейритов явно улучшилось в системе сокультуры (рис 2С). В среднем, количество нейритов в теле клетки значительно увеличилось от 0 до 3, в присутствии стволовых клеток. Подтверждение этих результатов была также методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ анализ), как показано на рисунке 3. В частности, изображения СЭМ показывают, что способность нейронов DRG прорастать нейритов происходит преимущественно в сочетаниис SC-как ASC, как указано желтыми стрелками на фиг.3С.
Следует отметить, что использование модифицированного ламинина субстратов (в том числе ламинин, полученных пептидов) в культуральных системах, содержащих нейронов DRG был часто определяется как состояние, пригодное для культуры клеток нейронов, имеющих значительные эффекты на нейритов формирования и расширения 30 - 32 , Тем не менее, результаты, показанные на рисунке 2D и 3D фиг показывает, что сочетание химических и биологических сигналов может еще больше повысить реакцию DRG нейроны.
Рисунок 1. Получение прямого DRG-SC-подобной системе возрастанию совместным культивированием. DRG нейроны и возрастанию получены соответственно из позвоночного столба и висцерального жира и паховой взрослых Malе Sprague-Dawley крыс. После переваривания жировой ткани через каскад ферментативных реакций, ASC дифференцированы в SC-подобных клеток и поддерживается в суб-сливающихся условиях, пока не понадобится. SC-как ASC предварительно отобранный на каждой подложки 24 ч предварительного урожая DRG. В день, DRG нейроны извлекаются и диссоциированных через серию ферментативных и механических воздействий. Нейроны затем высевают на верхней части ранее посеянного SC-как ASC и не поддерживали в культуре до проведения анализа (смешанной среде: содержащие 50% дифференцирование стволовых клеток среды и 50% модифицированного BS среды). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть больше версия этой фигуры.
Рисунок 2. Флуоресцентные изображения DRG нейронов в различных условиях культуры.() Необработанные PCL фильмы, РГД-модифицированные фильмы PCL (B), (C) совместно культивировали с SC-как ASC на необработанных PCL фильмов, (D) совместно культивировали с SC-как ASC на РГД-модифицированных пленок PCL. Клетки поддерживали в культуре в течение 3 дней с использованием смешанного раствора, содержащего 50% модифицированного BS среды и 50% дифференцировки стволовых клеток среды. После этого времени клетки фиксировали в 4% параформальдегида, проницаемыми в Тритон-X раствором, а неспецифические сайты связывания блокировали 1% BSA. Нервные клетки затем окрашивали против β-тубулина III (FITC, зеленый) и SC-как ASC против S-100 (AlexaFluor568, красный) антител. Наконец ядра окрашивали DAPI (синий). Изображения были получены с использованием флуоресцентного микроскопа (Olympus BX60, Япония). (Повторная печать с разрешением от де Лука и др. 30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большие версионный этой фигуры.
Рисунок 3. СЭМ изображения DRG нейроны в различных условиях культивирования РГД-модифицированные пленки PCL (A) необработанные PCL пленки (B);. (С) совместно культивировали с SC-типа ASC на необработанных PCL пленок, (D) совместно культивировали с SC-как ASC на RGD-модифицированных PCL фильмов. Желтые стрелки указывают на точки соприкосновения между НК-как ASC и DRG, подтверждающие их прямое взаимодействие в системе сокультуры. Клетки поддерживали в культуре в течение 3 дней и фиксировали в 2,5% глутарового альдегида. После дегидратации в градуированной серии этанола (50%, 70%, 90%, 100%), клетки, наконец, промывают в гексаметилдисилазана и сушат перед установкой на заглушки и золотое напыление для анализа SEM. Изображения были получены с помощью сканирующего электронного микроскопа (Zeiss EVO60, Великобритания) с ускоряющим общество 10кВ. (Повторная печать с разрешением от де Лука и др. 30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Discussion
DRG нейроны часто используется среди нервных клеток для первичной культуры для изучения регенерации нейронов после аксотомии в естественных условиях. Вот точный протокол для урожая DRG от взрослых крыс представлены, направленных на сокращение населения сателлитных клеток в окружающую среду без ущерба выживаемость нейронов. Как ASC дифференцировались в фенотип SC-подобные реальной альтернативой SC для клеточной терапии, АСК / DRG Система совместное культивирование СК, как также описано подробно.
Широко известно, что ламинин (или ламинин полученные пептидные последовательности) имеют положительный эффект на выживаемость нейронов и образование нейритов 31 - 33. При выполнении DRG нейронов культур Поэтому рекомендуется, чтобы покрыть каждую ранее подложки с ламинин, чтобы избежать какой-либо потери функциональных нейрональных клеток. Концепция ламинином покрытий также относится к биоматериала субстратов для проектированияТканевая инженерия конструкции, такие как поли - капролактоном (PCL) часто используется для изготовления нервных каналах 30. Кроме того, предыдущая работа показала, что фибрин матрицы подходящие материалы для нейронов культур в трёхмерную 11.
В дополнение к белка покрытием, модели со-культуры дают ценные условий для выживания нейронов DRG и подходящей среды для изучения взаимодействий, которые происходят между нейронами и SC в периферической нервной системе после травмы. Клетки также могут быть пересажены в естественных условиях с помощью нейронных устройств для того, чтобы сократить время набора аутологичных клеток в месте повреждения. Это особенно важно в тяжелых травм, которые могут привести к клеточного старения / смерти и атрофии мышц. Хотя СК являются наиболее важными глиальные клетки, участвующие в процессе регенерации нервов периферической и миелинизации, их ограниченной доступности и их медленной скорости пролиферации делает их непригоднымидля тканевой инженерии 34. ASC являются реальной альтернативой из-за их обилия и способности дифференцироваться в фенотип SC, выражая определенные глиальные маркеры и показывая функциональные сходства в родной SC 19. ASC также способны производить белки и факторы роста 5, которые могут быть полезны для формирования и расширения нейритах по DRG нейронов в системе сокультуры. Тем не менее, две системы отличаются одним из культуры могут быть установлены в зависимости от потребностей эксперимента. Метод, предложенный в этой статье, пересмотренный вариант хорошо установленным протоколом в нашей лаборатории 11 и включает в себя непосредственный контакт между двумя типами клеток (прямой совместной культуры), в котором второй тип клеток (DRG нейроны) высевают на верхней части других (SC-подобный ASC). Этот подход основан на предыдущих выводов, которые продемонстрировали важность наличия глиальных слоя клеток на подложке при посеве культуры нейронов 35
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative |
| 15 ml plastic tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 50 ml plastic tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 75 cm2 flasks | Corning | BC301 | |
| Retinoic Acid >98% HPLC | Sigma | R2625 | |
| ARA-C supplement | Sigma | C6645 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 aa) | Peprotech | 100-18B | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9205 | |
| Collagenase type I | Gibco | 17100-017 | Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion |
| Collagenase type IV | Worthington Biochemical | LS004188 | Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1001 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 | |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | FB50253 | Sharp material to be disposed accordingly |
| Glial Growth Factor-2 (GGF-2) | Acorda Therapeutics | GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200 ng/ml | |
| Nutrient Mix F12 HAM | Sigma | N6658 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9394 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
| N-2 supplement (100x) | Invitrogen | 17502 | |
| Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Penicillin-Streptomycin (PS) | Sigma | P0781 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Corning | 430165 | |
| Recombinant Human PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | |
| Trypsin | Invitrogen | 25200-056 | Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks |
| Trypsin (2x bovine pancreatic) | Worthington Biochemical | LS003703 | This is used for DRG dissociation |
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma | M8042 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Prepare the solution in the biological cabinet |
References
- Wiberg, M., Terenghi, G. Will it be possible to produce peripheral nerves. Surg Technol Int. 11, 303-310 (2003).
- Terzis, J. K., Sun, D. D., Thanos, P. K. Historical and basic science review: past, present, and future of nerve repair. J Reconstr Microsurg. 13 (3), 215-225 (1997).
- Bruyns, C. N., Jaquet, J. B., Schreuders, T. A., Kalmijn, S., Kuypers, P. D., Hovius, S. E. Predictors for return to work in patients with median and ulnar nerve injuries. J Hand Surg Am. 28 (1), 28-34 (2003).
- Geuna, S., Raimondo, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int Rev Neurobiol. 87 (09), 27-46 (2009).
- Kingham, P. J., Kalbermatten, D. F., Mahay, D., Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G. Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Exp Neurol. 207 (2), 267-274 (2007).
- Stoll, G., Jander, S., Myers, R. R. Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller’s observations to neuroinflammation. J Peripher Nerv Syst. 7 (1), 13-27 (2002).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annu Rev Biomed Eng. 5, 293-347 (2003).
- Johnson, E. O., Zoubos, A. B., Soucacos, P. N. Regeneration and repair of peripheral nerves. Injury. 36S (4), S24-S29 (2005).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An efficient method for dorsal root ganglia neurons purification with a one-time anti-mitotic reagent treatment. PloS One. 8 (4), e60558 (2013).
- Stettner, M., Wolffram, K., et al. A reliable in vitro model for studying peripheral nerve myelination in mouse. J Neurosci Meth. 214 (1), 69-79 (2013).
- Kingham, P. J., Mantovani, C., Terenghi, G. Stem cell and neuron co-cultures for the study of nerve regeneration. Method Mol Biol. 695, 115-127 (2011).
- Nissinen, M., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Mol Cell Neurosci. 37 (3), 568-578 (2008).
- Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
- Lewallen, K. a, Aa Shen, Y. -, De la Torre, A. R., Ng, B. K., Meijer, D., Chan, J. R. Assessing the role of the cadherin/catenin complex at the Schwann cell-axon interface and in the initiation of myelination. J Neurosci. 31 (8), 3032-3043 (2011).
- Evans, G. R. Challenges to nerve regeneration. Semin Surg Oncol. 19 (3), 312-318 (2000).
- Webber, C., Zochodne, D. The nerve regenerative microenvironment: early behavior and partnership of axons and Schwann cells. Exp Neurol. 223 (1), 51-59 (2010).
- Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells: current findings and future persperctives. Discov Med. 11 (57), 160-170 (2011).
- Faroni, A., Terenghi, G., Reid, A. J. Adipose-derived stem cells and nerve regeneration: promises and pitfalls. Int Rev Neurobiol. 108, 121-136 (2013).
- Strem, B. M., Hicok, K. C., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
- Xu, Y., Liu, L., et al. Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adipose-derived stem cells in vitro. Brain Res. 1239, 49-55 (2008).
- Tomita, K., Madura, T., Sakai, Y., Yano, K., Terenghi, G., Hosokawa, K. Glial differentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy. Neuroscience. 236, 55-65 (2013).
- Clauser, L., Tieghi, R., Palmieri, A., Carinci, F. Adipose-derived stem cells secrete neurotrophic factors. Annals of Oral and Maxillofacial Surgery. 1 (2), 1-5 (2013).
- Di Summa, P. G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., Kalbermatten, D. F. Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (9), 1544-1552 (2010).
- Di Summa, P. G., Kalbermatten, D. F., Pralong, E., Raffoul, W., Kingham, P. J., Terenghi, G. Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts. Neuroscience. 181, 278-291 (2011).
- Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats. Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).
- Zhang, Y., Luo, H., et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).
- Gomillion, C. T., Burg, K. J. L. Stem cells and adipose tissue engineering. Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).
- Mantovani, C., Raimondo, S., et al. Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages. Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).
- Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated. Tissue Eng. 19 (3-4), 368-379 (2013).
- Fudge, N. J., Mearow, K. M. Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate. BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).
- Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels. Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).
- Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration. Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).
- Richardson, J. a, Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films. J Neural Eng. 8 (4), 046015 (2011).
- Seggio, aM., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth. J Neural Eng. 7 (4), 046001 (2010).
- Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules. Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).
- Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth. Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).
