Summary
Rygg rotganglier (DRG) är strukturer som innehåller de sensoriska neuronerna i det perifera nervsystemet. När dissocieras, kan de vara samodlades med SC-liknande adipos-härledda stamceller (ASC), vilket ger en värdefull modell för att studera in vitro nervregeneration och myelination, imitera in vivo miljön på skadeplatsen.
Introduction
Perifera nervskador är vanliga med cirka 9.000 fall i Storbritannien inträffar varje år i en övervägande ung och arbetar befolkningen 1. Trots mikronervreparationsteknik, är normalt återställande av funktion ouppnåeligt med åtföljande nedsatt handen känsla, minskad motorik och frekvent smärta och kallt intolerans 2. Sådana skador har en djup och varaktig inverkan på patienten och deras förmåga att utföra dagliga aktiviteter, med mindre än 60% återvänder till arbetet 3.
Efter skadan, fenotypen och morfologin av nervceller och Schwann celler (SC) förändring i syfte att skapa en lämplig miljö för att möjliggöra axonet groning. Vid transektion, är nerven uppdelad i proximala och distala stubbar; den proximala stumpen är den punkt från vilken den regenerativa processen äger rum, medan den distala stumpen undergår Wallerian degenerering varpå SC detachfrån de skadade axoner, de-differentiera och föröka sig. Detta är grundläggande för att avlägsna myelin skräp och förbereda den distala stumpen för nervåter generationens 4,5. Axon groning stöds av produktionen av neurotropa faktorer och kemokiner släpptes av SC på den distala stumpen, och styrs av den basala lamina kälken efter Wallerian degeneration 6,7. SC anpassa sidan av regenere axonet bildar band av Büngner, vilket stöd axonet tillväxt mot målorganet, minskar förgrening utanför endoneurial röret. Efter reinnervation, SC bilda den nya myelinskidan inslag de regenere axoner, men sensorisk och motorisk funktion är endast delvis återställd 8.
Dorsala rotganglier (DRG) är strukturer belägna i mellankotskivan fora av ryggraden, som innehåller de sensoriska neuronceller innervating perifera organ. När dissocierat, kan de användas som en lämplig in vitro-model för studier av nervregeneration 9-11, inklusive undersökningar av myelinbildning. I synnerhet vuxen DRG-neuroner härma egenskaperna hos dessa celler in vivo och ger en formidabel verktyg för att studera nya strategier för perifer nervreparation i vävnadsteknik.
Samkulturer representera ett dynamiskt system som simulerar in vitro samspelet av två (eller flera) celltyper i en viss in vivo miljö. En av fördelarna med dessa cell samodling modeller är flexibilitet och hög kontroll som kan utövas på den extracellulära miljön. DRG nervceller har använts frekvent i samarbete odlingssystem med SC för att efterlikna den verkliga samspel som sker mellan de två celltyperna i det perifera nervsystemet 10,12 - 14. Det visades att SC utsöndrar extracellulär matris (ECM) proteiner och tillväxtfaktorer som anmärkningsvärt kan förbättraförmåga DRG nervceller att överleva och gro neuriter 15,16. Emellertid SC kräver långa tidsperioder för att proliferera och trots framsteg inom cellodlingsteknik är det fortfarande svårt att generera ett lämpligt antal celler för vävnadstekniska tillämpningar. Dessutom är offrandet av en frisk nerv nödvändig att skörda autolog SC. Därför är det viktigt för både vävnadsteknik och in vitro test av nervregeneration skillnaden i inköps SC. I denna vy kan ASC anses vara ett värdefullt alternativ för utvecklingen av en vävnadsutvecklad konstruktion som ska användas för perifer nervreparation 17,18. Tidigare arbete har visat förmågan hos dessa celler att differentiera till SC-liknande ASC, som uttrycker karakteristiska gliala-markörer, såsom S-100, p75 och gliafibrillärt surt protein (GFAP) 19, liksom den myelinprotein noll (P0) 20 . Utsöndringen av gliala tillväxtfaktorer, såsom hjärn-härledd neurotrofisk faktor (BDNF), nervtillväxtfaktorn (NGF) och gliacell neurotrofisk faktor (GDNF) observerades också 21,22. Därför kan SC-liknande ASC användas som främjare av perifer nervregenere, vilket framgår av både in vitro och in vivo studier 23-26. Dessutom kan ASC skördas genom minimalinvasiva ingrepp i större antal jämfört med andra typer stamcells; frekvensen av stamceller i fettväv är 100- till 1000-faldigt högre än i benmärg 27, och de har en högre proliferationshastighet jämfört med SC och benmärg mesenkymala stamceller.
Detta arbete syftar till att ge ett detaljerat protokoll för att utföra högeffektiva skördar av dissocierade DRG nervceller och ASC respektive den senare differentieras till SC-liknande celler. Den samodling av dessa två celltyper kommer därför att ge ett mycket praktiskt system som kan användas för framtida studier på förmågan hos DRG neurons att gro neuriter och mekanismerna för myelinbildning på olika byggnadsställning för nervvävnadsteknik.
Protocol
OBS: Alla försök med djur utföras i enlighet med de brittiska Djur (vetenskapliga förfaranden) Act, 1986.
1. Experimentell Set-up
- Före start vävnads- och cellskörd, kontrollera att alla verktyg är sterila. Oavsett behov, autoklav ett par vassa kirurgiska saxar, en mycket fin pincett och en fin standard pincett. Också sterilisera varje substrat före cellsådd med UV sterilisering, etanol exponering eller ångsterilisering som är lämpligt.
- Beredning av media för stamcellsskörd och differentiering
- Förbered stamcelltillväxtmedium, innehållande Minimum Essential Medium (α-MEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 200 mM L-glutamin och 1% penicillin-streptomycin (PS).
- Förbered en 10 mM stamlösning av forskolin genom att lösa 10 mg forskolin i 2,436 ml steril dimetylsulfoxid. Använd vid slutlig koncentration av 14 ^ M. </ Li>
- Förbered en 35 mg / ml stamlösning av vitamin A-syra genom att lösa 50 mg i 1,43 ml steril dimetylsulfoxid. Använd vid slutlig koncentration av 350 ng / ml.
- Förbered blodplättshärledd tillväxtfaktor (PDGF) lager (100 | ig / ml) genom att lösa 10 pg av lyofiliserat pulver i 100 | il destillerat sterilt vatten. Använd vid slutlig koncentration av 5 ng / ml.
- Förbered basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) lager (100 | ig / ml) genom att lösa 50 pg av lyofiliserat pulver i 500 | il destillerat sterilt vatten. Använd vid slutlig koncentration på 10 ng / ml.
- Förbered stamcelldifferentieringsmedium, innehållande stamcellstillväxt-medium kompletterat med 14 | iM forskolin, 126 ng / ml glial tillväxtfaktor-2 (GGF-2), 5 ng / ml blodplättshärledd tillväxtfaktor (PDGF), och 10 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF).
- Beredning av media och lagerlösningar för neuron skörd och dissociation
- Förbered BottenstEin och Satos (BS) medium 28, genom att tillsätta 1% PS och ett% N2 supplement till Hams F12-medium. Beräkna den slutliga volymen behövs som 500 | il per brunn (vid användning av en 24-brunnars platta).
- Förbered kollagenas IV lager i Hams F12-medium vid en koncentration av 1,25% vikt / volym. Filter-sterilisera lösningen och förvara vid -20 ° C som 200 | il alikvoter.
- Förbered bovina pankreatiska trypsin lager i Hams F12-medium vid en koncentration av 2,5% vikt / volym, filter-sterilisera och förvara vid -20 ° C som 200 | il alikvoter.
- Förbered nervtillväxtfaktor (NGF) förrådslösning vid en koncentration av 5 | ig / ml i en filtersteriliserad 1 mg / ml fettsyrafritt bovint serumalbumin (BSA) -lösning i F12-medium och förvara vid -20 C som 200 | il alikvoter. Filtrera inte NGF efter beredning.
- Om ingen ytmodifiering har utförts, päls täck / plattor med poly-D-lysin (0,1 mg / ml i 15 minuter vid rumstemperatur) Och / eller laminin (2-10 | ig / cm 2 under 2 h vid 37 ° C) för att stödja neuronvidhäftning och neuritutväxt som är lämpligt.
- Värm alltid upp media i ett vattenbad vid 37 ° C före användning.
2. Fett-derived Stem Cell (ASC) Skörd och differentiering i en SC Fenotyp
- ASC skörd från visceral och inguinala fett vuxna Sprague-Dawley
- Före start, förbereda ett rör med 10 till 15 ml av Hanks balanserade saltlösning (HBSS) kompletterat med 1% volym / volym av PS-lösning och förvara på is tills fett skörd.
- Avsluta råttan genom cervikal dislokation och halshuggning. Raka råtta och gör ett snitt genom den bukhuden, exponera de inre organen och undvika blödning. Ta bort visceralt fett som omsluter magen och tarmarna (vanligtvis kännetecknas av en fet gul konsistens) och inguinal fett som omger testiklarna från en vuxen Sprague-Dawley. Överföra tue fett i röret med HBSS på is.
- I ett biologiskt säkerhetsskåp (klass II) finhacka fettet med hjälp av en sax och en steril rakblad tills fin konsistens är nådd och överföra den till ett rör innehållande 15 ml 0,2% vikt / volym kollagenas typ I-lösning nyberedd och filtersteriliserades på dagen.
- Överför röret i ett vattenbad vid 37 ° C och lämnar fettvävnad att smälta i närvaro av enzymet under 30 min-1 h under kontinuerlig omröring. Övervaka matsmältningen noga och stanna innan vävnaden är helt dissocierade, kommer detta att förbättra cellviabilitet och cellutbyte. Filter Theun-dissocierade vävnaden genom en 100 ìm cell sil.
OBS: God vävnad matsmältningen kommer att resultera i homogen konsistens av fettet, synliga genom ögat när försiktigt snurra röret, skaffa en beige utseende. - Neutralisera enzymet genom att tillsätta 15 ml stamcelltillväxtmedium innehållande fetalt bovint serum vid 37 ° C och centrifugeralösning vid 160 g under 10 min för att samla den stromala vaskulära fraktionen, inklusive stamceller, på botten av röret.
- I detta skede kan pelleten resuspenderas i 1 ml röda blodkroppar lysbuffert att avlägsna föroreningar blodkroppar. Efter resuspension och pipettering i 1 min, tillsätt 10 ml färsk stamcellstillväxt-medium och centrifugera vid 160 g under 10 min.
- Försiktigt aspirera supernatanten från röret, ta hand om den deponerade cellpelleten i botten. Resuspendera cellerna i 10 ml stamcelltillväxtmedium, överföra dem till en 75 cm 2 kolvar och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2. Behåll cellerna vid sub-sammanflytande nivåer tills passagen 1-2, ändra mediet var 3 dagar.
- ASC differentiering till en SC fenotyp
- Vid passagen 1-2, ta bort stamcellstillväxtmedium från 75 cm 2-kolv och ersätta den med 10 ml färskt medium innehållande 1 mM β-merkaptoetanol nyligen preparöd och filtersteriliserades på dagen. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under 24 timmar. På detta stadium är det viktigt att cellerna ympas vid låg densitet (30%) innan differentiering.
- Tvätta cellerna försiktigt med HBSS, aspirera och ersätta den med 10 ml medium innehållande 350 ng / ml retinoinsyra. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under 72 timmar. Försök att minimera exponeringen av cellmedium för ljus.
- Efter 3 dagar, tvätta cellerna försiktigt med HBSS, aspirera och ersätta den med 10 ml av stamcellsdifferentiering medium (se steg 1.2.6). Behåll cellerna vid sub-sammanflytande nivåer, ändra mediet var 3 dagar.
OBS: Efter två veckor av inkubation ASC differentieras till SC-liknande ASC, som uttrycker deras karakteristiska fenotyp (såsom visas av Kingham et al 5.). De kan sedan användas fram till den 10: e passagen utan märkbara förändringar i beteende 29.
- Avsluta råttan genom cervikal dislokation och halshuggning. Raka råttan och lyft huden för att exponera ryggraden. Använda vassa saxar, excide ryggraden tar extra hand om de trånga organ och blodkärl. Överför ryggrad i ett biologiskt säkerhetsskåp (klass II) med användning av en petriskål och avlägsna eventuell ryggstycket.
- Dividera ryggraden i hälften längs längdaxeln med användning av sterila och vassa kirurgiska saxar att exponera sladden vävnad. Vid denna punkt, är det bra att skära ryggraden i två mindre segment under nivån av bröstkorgen, för att göra det lättare att hantera under DRG neuron skörden. Med fin pincett, försiktigt bort alla sladden vävnaden, uppmärksamma inte dra och ta bort DRG rötterna. Detta sätt DRG och rötter kommer att exponeras inom de vertebrala kanalerna, fortfarande inneslutet i kolonnen. Observera DRG som vitt trådar Coming ut direkt från kanalerna.
- Dra ut hela DRG roten (inte bara DRG) från ryggkotornas kanalerna med hjälp väldigt fin pincett, gå djupt in i vertebrala kanalerna och uppmärksamma att inte skada rötterna i ganglierna. Överför DRG i en liten petriskål (60 mm 2) innehållande 3-4 ml Hams F12-medium kompletterat med 1% PS. Om du använder olika djur, använda separata rätter.
- Enligt en dissekera mikroskop, rengör DRG av eventuellt överskott av nervrötter som omger nervknutar med sterila pincett och en skalpell för att minska gliaceller kontamination cell. Överför DRG i en liten petriskål (35 mm 2) med 1,8 ml färskt F12-medium.
- Lägg 200 ul av 1,25% vikt / volym kollagenas typ IV-stamlösning (slutlig koncentration av 0,125%) och inkubera DRG vid 37 ° C, 5% CO2 under 1 h. Försiktigt aspirera mediet med ett glas pipett uppmärksamma att inte aspirera eller skada DRG. Lägg färskt F12-medium smidigterad med 0,125% vikt / volym kollagenas typ IV-enzym och inkubera under 1 timme såsom beskrivits tidigare.
- Sug på medellång och försiktigt tvätta DRG med F12-medium. Tillsätt sedan 1,8 ml av F12-medium och 200 | il av trypsin (slutkoncentration av 0,25% vikt / volym) och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 30 min.
- Avlägsna trypsin och tillsätt 1 ml av F12-medium kompletterat med 500 | il av FBS att gripa den enzymatiska reaktionen. Aspirera medium och tvätta försiktigt DRG med F12-medium för tre gånger för att avlägsna spår av serum.
- Lägg 2 ml färskt F12-medium och noggrant överföra DRG med mediet i ett 15 ml rör med hjälp av en glaspipett. Dissociera försiktigt DRG nervceller genom att pipettera upp och ned (ca 8-10 gånger) med glaspipett (plastspetsar kan användas som alternativ).
- Låt pelleten avsätts i botten av röret och samla mediet i ett nytt rör. Lägg 2 ml färskt F12-medium till röret innehållande pelleten och upprepa mechanical dissociation med glaspipett. Upprepa detta steg tills suspensionen blir homogena (ca 3-4 gånger) och samla alla dissocierade DRG i nytt rör. Denna metod minskar stressen som härrör från den mekaniska dissociation och förbättrar lönsamheten för nervceller.
- Filtrera den resulte homogeniserad suspensionen i en ny 15 ml tub med hjälp av en 100 ìm cell sil för att ta bort un-dissocierade nervceller och annat skräp. I detta skede kan det vara lämpligt att först filtrera cellsuspension i en 50 ml tub och sedan överföra lösningen i mindre röret med hjälp av en glaspipett. Centrifugera suspensionen vid 110 g under 5 minuter.
- Bered en 15% bovint serumalbumin (BSA) genom tillsats av 500 | il av en 30% BSA-lösning till 500 | il av F12-medium. Långsamt pipettera lösningen ned väggen i ett 15 ml rör för att skapa en gradvis proteinkedja. I detta skede är det bra att hålla röret i 45 ° vinkel och långsamt släppa BSA med siffrorna påfalken röret som en referens för att bilda "spår".
- Aspirera supernatanten från steg 3,10 lämna 500 | il i botten av röret och resuspendera cellpelleten i samma medium. Sakta pipett suspensionen längs protein leden tidigare framställts i steg 3,11 (använda siffrorna på röret som referens) och centrifugera vid 500 g i 5 min.
- Aspirera supernatanten och suspendera pelleten i 1 ml modifierad BS medium (eller ett blandat medium för SC-liknande ASC / DRG co-kultur, som beskrivs nedan i steg 4.5.
OBS: Volymen att åter upphäva DRG nervceller kan göras fram till den faktiska volym som krävs, beroende på den slutliga cellkoncentrationen önskas och det antal prover som skall seedas. Ett djur kommer att ge tillräckligt med celler för en 24-brunnars platta experimentet. - Inkubera de sådda proverna vid 37 ° C, 5% CO2 under 2 h för att tillåta cellvidhäftning och slutligen tillsätta färsk BS-medium kompletterat med 50 ng / ml av nervtillväxtfaktor factor (NGF).
4. Direkt Co-kultur av SC-liknande ASC och DRG nervceller
- Behåll SC-liknande ASC i kultur vid sub-sammanflytande nivåer som beskrivs i steg 2.2.3. Tjugofyra timmar före DRG skörd, aspirera stamcellsdifferentiering medium och tvätta cellerna med HBSS. Aspirera och inkubera i 3 ml trypsin vid 37 ° C, 5% CO2 under 3 min.
- Kontrollera under ett ljusmikroskop att alla cellerna har lossnat från kolven. Knacka försiktigt på kolven för att hjälpa lossnar. Lägg 7 ml medium för att stoppa trypsin reaktionen samla cellsuspension i en 15 ml rör och centrifugera vid 110 g under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 5 ml stamcelldifferentieringsmedium. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer och späd cellsuspensionen enligt den slutliga koncentration som krävs. Helst sådd 20.000 SC-liknande ASC / cm2 skulle garantera ett sammanhängande lager av celler.
- Seed SC-liknandeASC på substratet och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 24 timmar för att tillåta cellvidhäftning.
- Efter 24 timmars inkubation, aspirera på medellång och lägga till DRG nervceller ovanpå cellerna som beskrivs i steg 3.14 och 3.15. Ändra medium till ett blandat medium innehållande 50% av stamcellsdifferentiering medium och 50% av BS-substrat. Dessutom minska FBS koncentrationen till 1-2,5% i den slutliga blandade mediet hjälper att undvika spridning av förorenande satellitceller härledda från DRG dissociation.
- Inkubera samodlade prover vid 37 ° C, 5% CO2 och upprätthålla i kultur under erforderlig tid för framtida tester.
Representative Results
Kulturer av dissocierade DRG-neuroner representerar en lämplig in vitro-modell för studier av nervregenerering. Men obehandlade substrat inte ger en lämplig miljö för DRG fastsättning och förlängning av neuriter. SC-liknande ASC kan producera tillväxtfaktorer och kemokiner 19 som kan förbättra möjligheterna för DRG nervceller att gro neuriter när de släpps i odlingsmediet. Närvaron av SC-liknande ASC i odlingssystemet kan därför spela en viktig roll i regleringen av DRG funktionerna.
Detta protokoll (fig 1) illustrerar förfarandet för att utföra en direkt samodling av SC-liknande ASC och DRG-neuroner, under vilken neuronala celler kommer i direkt kontakt med tidigare såddes SC liknande ASC. Den huvudsakliga svårigheten i samband med denna procedur är den höga variabiliteten av antalet DRG-neuroner som skördats från olika djur. Av denna anledning kan resultaten vara ibland svårt att COMPARe och en särskild uppmärksamhet bör ägnas under sådd förfarandet för att få alltid en jämförbar celltäthet i varje experiment. Protokollet har optimerats för att minska åtminstone antalet satellitceller kvar från DRG neuron dissociation använder BSA gradienten (steg 3,11). Dessutom kan cytosin-arabinos (Ara-C) komplement tillsättas till BS mediet i syfte att ytterligare minimera satellitens cellpopulation, såsom beskrivs av Kingham et al. 11. Dock behöver valet av behandlingstiden vara noga vägas mot den DRG och SC-liknande ASC vitalitet, även påverkas av närvaron av ARA-C tillskott i odlingsmediet. Därför är det mycket svårt att åstadkomma en satellitcell fri-systemet.
Figur 2 visar hur viktigt det är SC-liknande ASC för DRG neurit groning i en co-kultur modell med obehandlade och kemiskt modifierade poly - kaprolakton (PCL) filmer som substrat. DRG nervceller var maintained i kultur under tre dagar i närvaro eller frånvaro av SC-liknande ASC, med användning av en blandad lösning innehållande 50% av BS-medium och 50% av stamcellsdifferentieringsmedium, såsom beskrivs i steg 4,5. Efter denna period, fixerades celler i 4% paraformaldehyd och färgades med β-tubulin III (DRG nervceller) och S100 (SC-liknande ASC) för att undersöka cell morfologi och studera möjligheten för DRG nervceller att sticka ut neuriter. Inga neuriter observerades på obehandlade ytor i frånvaro av SC-liknande ASC (Figur 2A), medan bildningen av neuriter var klart förbättrats i samodlingssystemet (figur 2C). I genomsnitt var antalet neuriter per cellkroppen ökat markant från 0 till 3 i närvaro av stamceller. Bekräftelse av dessa resultat gavs också med svepelektronmikroskopi (SEM) analys, som visas i figur 3. I synnerhet är de SEM-bilder visar att förmågan hos DRG-neuroner att gro neuriter sker huvudsakligen i sambandmed SC-liknande ASC, såsom indikeras av de gula pilarna i fig 3C.
Det bör påpekas att användningen av laminin-modifierade substrat (inklusive laminin-härledda peptider) i kultursystem som innehåller DRG nervceller har ofta definierats som en lämplig förutsättning för neuronal cellodling, med anmärkningsvärda effekter på neuritbildning och tillbyggnad 30-32 . Emellertid, de resultat som visas i figur 2D och figur 3D visar att kombinationen av kemiska och biologiska ledtrådar ytterligare kan förbättra svaret av DRG-neuroner.
Figur 1. Beredning av direkta DRG-SC-liknande ASC samodlingssystemet. DRG nervceller och ASC härleds respektive från ryggraden och visceralt och inguinala fett vuxen male Sprague-Dawley. Efter digestion av fettvävnad genom en kaskad av enzymatiska reaktioner, är ASC differentieras till SC-liknande celler och upprätthölls i sub-konfluenta betingelser tills det behövs. SC-liknande ASC är pre-seedade på varje substrat 24 tim innan DRG skörden. På dagen, är DRG-neuroner heras och dissocierades genom en serie av enzymatiska och mekaniska åtgärder. De nervceller sedan seedade på toppen av tidigare seedade SC-liknande ASC och underhålls i kultur tills analyseras (blandat medium: innehållande 50% av stamcellsdifferentiering medium och 50% av modifierad BS-medium). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fluorescens bilder av DRG-neuroner i olika odlingsbetingelser.(A) obehandlade PCL filmer, (B) RGD-modifierade PCL filmer, (C) samodlades med SC-liknande ASC på obehandlade PCL filmer, (D) samodlades med SC-liknande ASC på RGD-modifierade PCL filmer. Celler hålls i kultur under 3 dagar med användning av en blandad lösning innehållande 50% av modifierad BS-substrat och 50% av stamcelldifferentieringsmedium. Efter denna tid fixerades celler i 4% paraformaldehyd, permeabiliseras i en Triton-X-lösning, och icke-specifika bindningsställen blockerades med 1% BSA. Neuronala Cellerna färgades sedan mot β-tubulin III (FITC, grön) och SC-liknande ASC mot S-100 (AlexaFluor568; röd) antikroppar. Slutligen kärnor färgades med DAPI (blå). Bilder förvärvades med användning av ett fluorescensmikroskop (Olympus BX60, Japan). (Re-print med tillstånd från de Luca et al. 30. Klicka här för att se en större versjon av denna figur.
Figur 3. SEM bilder av DRG nervceller i olika odlingsbetingelser (A) obehandlade PCL filmer (B) RGD-modifierade PCL filmer;. (C) samodlades med SC-liknande ASC på obehandlade PCL filmer, (D) samodlade med SC-liknande ASC på RGD-modifierad PCL filmer. De gula pilarna indikerar kontaktpunkterna mellan SC-liknande ASC och DRG, bekräftar deras direkta interaktion i samodlingssystemet. Celler hålls i kultur under 3 dagar och fixerades i 2,5% glutaraldehyd. Efter dehydrering i graderad etanolserie (50%, 70%, 90%, 100%), cellerna slutligen sköljas i hexametyldisilazan och torkas innan montering på stubbar och guld sputtering för SEM-analys. Bilder förvärvades med hjälp av en SEM (Zeiss EVO60, Storbritannien) med en accelererande volTage av 10kV. (Re-print med tillstånd från de Luca et al. 30. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
DRG nervceller används ofta bland neuronala celler för primär kultur att studera regeneration av nervceller efter axotomi in vivo. Här en korrekt protokoll för DRG skörd från vuxna råttor presenteras, syftar till att minska populationen av satellitceller i den omgivande miljön utan att kompromissa med neuronal överlevnad. Som ASC differentieras till en SC-liknande fenotyp är ett giltigt alternativ till SC för cellterapi, är en SC-liknande ASC / DRG samodlingssystemet också beskrivs i detalj.
Det är allmänt känt att laminin (eller laminin-härledda peptidsekvenser) har en gynnsam effekt på neuron överlevnad och neuritbildning 31-33. När du utför DRG neuron kulturer är det därför klokt att tidigare belägga varje substrat med laminin för att undvika förlust av funktionaliteten hos de neuronala celler. Begreppet laminin beläggningar gäller även biomaterial substrat för utformning avvävnadstekniska konstruktioner, såsom poly - kaprolakton (PCL) används ofta för tillverkning av nervledningar 30. Också visat tidigare arbete att fibrinmatriser är lämpliga material för neuronala kulturer i tre dimensioner 11.
Förutom proteinbeläggning, co-kultur modeller ger värdefulla förutsättningar för DRG neuron överlevnad och en lämplig miljö för att studera det samspel som sker mellan nervceller och SC i det perifera nervsystemet efter skada. Celler kan också transplanteras in vivo genom att använda neurala enheter i syfte att förkorta rekryteringstiden för autologa celler vid skadeplatsen. Detta är särskilt viktigt i allvarliga skador, vilket kan leda till cellåldrande / död och muskelatrofi. Även SC är de viktigaste gliaceller involverade i processen för perifer nervregenerering och myelination, deras begränsade tillgången och deras långsamma spridning hastighet gör dem olämpligaför vävnadstekniska tillämpningar 34. ASC är ett giltigt alternativ på grund av sitt överflöd och förmåga att differentiera till SC fenotyp, som uttrycker specifika gliaceller markörer och visar funktionella likheter med infödda SC 19. ASC har även möjlighet att tillverka proteiner och tillväxtfaktorer 5 som kan vara till nytta för bildandet och utvidgning av neuriter från DRG nervceller i en samodlingssystemet. Däremot kan två olika co-odlingssystem sättas upp som funktion av de experimentella behov. Den föreslagna i denna uppsats metod är en reviderad version av en väletablerad protokoll i vårt laboratorium 11 och det innebär en direkt kontakt mellan de två celltyper (direkt samodling), i vilket den andra celltyp (DRG nervceller) ympas på toppen av de andra (SC-liknande ASC). Detta synsätt bygger på tidigare fynd som visade vikten av närvaron av en gliaceller skikt på substratet när sådd neuronala kulturer 35
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative |
| 15 ml plastic tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 50 ml plastic tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 75 cm2 flasks | Corning | BC301 | |
| Retinoic Acid >98% HPLC | Sigma | R2625 | |
| ARA-C supplement | Sigma | C6645 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 aa) | Peprotech | 100-18B | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9205 | |
| Collagenase type I | Gibco | 17100-017 | Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion |
| Collagenase type IV | Worthington Biochemical | LS004188 | Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1001 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 | |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | FB50253 | Sharp material to be disposed accordingly |
| Glial Growth Factor-2 (GGF-2) | Acorda Therapeutics | GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200 ng/ml | |
| Nutrient Mix F12 HAM | Sigma | N6658 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9394 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
| N-2 supplement (100x) | Invitrogen | 17502 | |
| Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Penicillin-Streptomycin (PS) | Sigma | P0781 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Corning | 430165 | |
| Recombinant Human PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | |
| Trypsin | Invitrogen | 25200-056 | Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks |
| Trypsin (2x bovine pancreatic) | Worthington Biochemical | LS003703 | This is used for DRG dissociation |
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma | M8042 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Prepare the solution in the biological cabinet |
References
- Wiberg, M., Terenghi, G. Will it be possible to produce peripheral nerves. Surg Technol Int. 11, 303-310 (2003).
- Terzis, J. K., Sun, D. D., Thanos, P. K. Historical and basic science review: past, present, and future of nerve repair. J Reconstr Microsurg. 13 (3), 215-225 (1997).
- Bruyns, C. N., Jaquet, J. B., Schreuders, T. A., Kalmijn, S., Kuypers, P. D., Hovius, S. E. Predictors for return to work in patients with median and ulnar nerve injuries. J Hand Surg Am. 28 (1), 28-34 (2003).
- Geuna, S., Raimondo, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int Rev Neurobiol. 87 (09), 27-46 (2009).
- Kingham, P. J., Kalbermatten, D. F., Mahay, D., Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G. Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Exp Neurol. 207 (2), 267-274 (2007).
- Stoll, G., Jander, S., Myers, R. R. Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller’s observations to neuroinflammation. J Peripher Nerv Syst. 7 (1), 13-27 (2002).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annu Rev Biomed Eng. 5, 293-347 (2003).
- Johnson, E. O., Zoubos, A. B., Soucacos, P. N. Regeneration and repair of peripheral nerves. Injury. 36S (4), S24-S29 (2005).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An efficient method for dorsal root ganglia neurons purification with a one-time anti-mitotic reagent treatment. PloS One. 8 (4), e60558 (2013).
- Stettner, M., Wolffram, K., et al. A reliable in vitro model for studying peripheral nerve myelination in mouse. J Neurosci Meth. 214 (1), 69-79 (2013).
- Kingham, P. J., Mantovani, C., Terenghi, G. Stem cell and neuron co-cultures for the study of nerve regeneration. Method Mol Biol. 695, 115-127 (2011).
- Nissinen, M., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Mol Cell Neurosci. 37 (3), 568-578 (2008).
- Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
- Lewallen, K. a, Aa Shen, Y. -, De la Torre, A. R., Ng, B. K., Meijer, D., Chan, J. R. Assessing the role of the cadherin/catenin complex at the Schwann cell-axon interface and in the initiation of myelination. J Neurosci. 31 (8), 3032-3043 (2011).
- Evans, G. R. Challenges to nerve regeneration. Semin Surg Oncol. 19 (3), 312-318 (2000).
- Webber, C., Zochodne, D. The nerve regenerative microenvironment: early behavior and partnership of axons and Schwann cells. Exp Neurol. 223 (1), 51-59 (2010).
- Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells: current findings and future persperctives. Discov Med. 11 (57), 160-170 (2011).
- Faroni, A., Terenghi, G., Reid, A. J. Adipose-derived stem cells and nerve regeneration: promises and pitfalls. Int Rev Neurobiol. 108, 121-136 (2013).
- Strem, B. M., Hicok, K. C., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
- Xu, Y., Liu, L., et al. Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adipose-derived stem cells in vitro. Brain Res. 1239, 49-55 (2008).
- Tomita, K., Madura, T., Sakai, Y., Yano, K., Terenghi, G., Hosokawa, K. Glial differentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy. Neuroscience. 236, 55-65 (2013).
- Clauser, L., Tieghi, R., Palmieri, A., Carinci, F. Adipose-derived stem cells secrete neurotrophic factors. Annals of Oral and Maxillofacial Surgery. 1 (2), 1-5 (2013).
- Di Summa, P. G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., Kalbermatten, D. F. Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (9), 1544-1552 (2010).
- Di Summa, P. G., Kalbermatten, D. F., Pralong, E., Raffoul, W., Kingham, P. J., Terenghi, G. Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts. Neuroscience. 181, 278-291 (2011).
- Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats. Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).
- Zhang, Y., Luo, H., et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).
- Gomillion, C. T., Burg, K. J. L. Stem cells and adipose tissue engineering. Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).
- Mantovani, C., Raimondo, S., et al. Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages. Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).
- Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated. Tissue Eng. 19 (3-4), 368-379 (2013).
- Fudge, N. J., Mearow, K. M. Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate. BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).
- Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels. Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).
- Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration. Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).
- Richardson, J. a, Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films. J Neural Eng. 8 (4), 046015 (2011).
- Seggio, aM., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth. J Neural Eng. 7 (4), 046001 (2010).
- Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules. Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).
- Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth. Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).
