Automatiseret Kvantificering af hæmatopoietisk celle - stromacelle Interaktioner i Histologiske Billeder af afkalkede Bone

Abstract

Konfokal mikroskopi er den foretrukne metode til analyse af lokaliseringen af ​​flere celletyper inden for komplekse væv, såsom knoglemarv. Er imidlertid vanskelig analyse og kvantificering af cellulær lokalisering, som i mange tilfælde er afhængig af manuel optælling, således bærer risikoen for at indføre et Rater-afhængig fordomme og reducere pålidelighed mellem. Desuden er det ofte vanskeligt at vurdere, om co-lokalisering mellem to celler resultater fra tilfældig placering, især når celletyper varierer stærkt i hyppigheden af ​​deres forekomst. Her indføres en fremgangsmåde til objektiv kvantificering af cellulær co-lokalisering i knoglemarven. Protokollen beskriver fremstillingen prøve anvendes til at opnå histologiske snit af hele murine lange knogler, herunder knoglemarven, samt farvningsprotokol og erhvervelse af billeder med høj opløsning. En analyse workflow, der spænder fra anerkendelsen af ​​hæmatopoietisk og ikke-Hematopoietic celletyper i 2-dimensionelle (2D) knoglemarv billeder til kvantificering af de direkte kontakter mellem de celler præsenteres. Dette omfatter også et kvarter analyse at få oplysninger om den cellulære mikromiljø omkring en bestemt celletype. For at vurdere, om co-lokalisering af to celletyper er den blotte resultat af tilfældig celle positionering eller reflekterer præferentielle associationer mellem cellerne, en simulation værktøj, der er egnet til at teste denne hypotese i tilfælde af hæmatopoietiske samt stromaceller, er anvendes. Denne fremgangsmåde er ikke begrænset til knoglemarv, og kan udvides til andre væv til at tillade reproducerbar, kvantitativ analyse af histologiske data.

Introduction

På grund af den seneste hastige teknologiske udvikling inden mikroskopi, herunder optisk billeddannelse, har analysen af ​​celler i sammenhæng med hele væv blevet stadig tilgængelige for immunologer. Karakteriseringen af ​​enkelte celler i suspension er en værdifuld og uundværlig metode til at forstå cellulære og molekylære funktion. Men analysen af ​​cellerne i deres (mikro) -anatomical miljø er afgørende for at forstå samspillet mellem forskellige celletyper, der samarbejder i komplekse processer såsom udvikling af immunrespons.

Selv om det er forholdsvis let for microscopists at indhente kvalitative oplysninger fra billeder, er det stadig en udfordring at kvantificere disse data, dels på grund af det faktum, at analysemetoder på dette område halter bagefter i forhold til hvad der er muligt i billedoptagelse. Mange forskere stadig er afhængige af tidskrævende manuel celletælling i deres histologiske billeder,således at indføre en skævhed mellem forskellige raters og hindrer replikation af andre grupper. Ofte er en repræsentant billede valgt at understrege en erklæring om cellulær position eller co-lokalisering i en publikation, hvilket gør det svært for læseren at bedømme statistisk relevans af en sådan begivenhed.

Sammen med det faktum, at det fulde indhold af billeddata information sjældent udnyttes, understreger dette behovet for en mere saglig, hurtigere og omfattende tilgang til at analysere histologiske billeder.

Knoglemarven er et komplekst væv, der tager vigtige vitale funktioner som organ for hæmatopoiese hos voksne hvirveldyr. Ud over at være fødestedet for hæmatopoietiske celler ^1,2 og spiller en vigtig rolle i B-lymfocytter udvikling ^3, det fungerer også som et sted, hvor immunreaktioner igangsættes ⁴ og støtter modne, recirkulerende B-celler ^5. Desuden dens rolle i at opretholde immunological hukommelse er blevet stadig mere værdsat i det sidste årti, som flere typer af celler, der udgør immunhukommelse har vist sig at opholde sig der ^6-9.

Relationen mellem den komplekse væv arkitektur knoglemarven og dens funktioner er stadig undvigende. I modsætning til sekundære lymfoide organer, som er organiseret i makro-rum såsom T og B-celle zone, mangler knoglemarven en klar makro-opdeling. Hidtil adskilte rum i knoglemarv er defineret ved deres nærhed til benet cortex eller kar. Betydningen af de forskellige hjemmehørende stromal cellepopulationer i knoglemarven for en række processer såsom støtte stamceller, udvikling af B-celler eller vedligeholdelse af immunologisk hukommelse cellepopulationer (såsom langlivede plasma celler (PC), CD4 ⁺ og CD8 ⁺ hukommelses-T-celler), viser klart, at der er en vis grad af mikro-opdeling i knoglemarven.

10. Visualiseringen og karakterisering af stromale celler i knoglemarven er vanskelig på grund af deres morfologiske træk med lange, tynde dendritiske extensions danner et netværk i hele knoglemarven, og manglen på egnede markører til at skelne stromale subpopulationer.

Det er endnu ikke klart, i hvilket omfang disse nicher deler fællestræk med hensyn til deres cellulære og molekylære Sammensætningn, og hvilke elementer gør en bestemt niche unik. Ud over stromaceller har hæmatopoietiske celletyper blevet vist at spille en afgørende rolle ved at give visse signaler i det mindste for nogle af nicher. Det er klart, kompleksiteten af niche sammensætning kræver deres analyse på stedet, og det er blevet stadig vigtigere for immunologer og hæmatologer at zoome ind på knoglemarv mikroarkitektur, fx ved at analysere de rumlige forhold mellem cellulære komponenter.

Her til en strategi kvantificere cellulære co-lokalisering og naboskab relationer i knoglemarven i en automatiseret og fordomsfri måde præsenteres. En detaljeret workflow herunder produktion af kimære mus, der huser fluorescerende stromaceller og ikke-fluorescerende hæmatopoietiske celler, fremstilling af histologiske snit fra afkalkede knogler, erhvervelse af konfokale billeder dækker hele knogle, såvel som automatiseret billedanalyse af cellulær co-lokalisering og validering / diskrimination fra tilfældig placering af et simuleringsværktøj leveres (figur 8).

Protocol

De dyreforsøg blev godkendt af de relevante statslige udvalg for dyrevelfærd (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) og blev udført i overensstemmelse med gældende retningslinjer og regler (dyreforsøg licens G0194 / 11).

1. Generation af fluorescerende Bone Marrow Kimære mus

BEMÆRK: Produktion af fluorescerende knoglemarv kimære mus for at visualisere stromale knoglemarvsceller udføres som beskrevet før ^9.

1. Begynde at behandle Del-Cre x ROSA-tdRFP mus (mus, der udtrykker tandem rødt fluorescerende protein (tdRFP) allestedsnærværende ^11-13) for at forberede dem til bestråling. Alternativt kan du bruge en anden stamme med allestedsnærværende udtryk for fluorescerende protein. Administrere 1 mg / ml neomycin og 1 mg / ml af vitaminer (A, D3, E, C) via drikkevandet to dage før bestråling.
2. Bestråle mus to gange med 3,8 Gray med en cæsium 137 gamma-strålerøret witynd et interval på 3 timer. Til dette placere mus i en bestråling pie bur egnet til den pågældende strålerøret.
   BEMÆRK: bestråling af mus, er vores institut ikke kræver anæstesi. Følg de lokale institutionelle politikker for anæstesi for bestråling. Behandl dyr med 5 mg / kg af carprofen subkutant (sc) per dag efter bestråling, hvis der er tegn på smerte.
3. Den næste dag, rekonstruere mus ved en intravenøs injektion af 3 x 10 ⁶ knoglemarvsceller fremstillet af lange knogler i C57BL / 6 donormus i overføringsbuffer ^9. Hold mus på neomycin og vitaminer i op til 2 uger, og overvåge deres trivsel og vægt i denne periode. Vent mindst 4 uger for at give mulighed for rekonstituering af immunsystemet, før de starter de specifikke eksperimentelle behandlinger (f.eks immunisering) ^9.
4. Sacrifice mus og placere dem på en dissektion bord, sterilisere benene med 70% ethanol. Euthanize mus i overensstemmelse med de lokale institutionelle politikker. Vores Institut udfører cervikal dislokation.
5. Brug pincet og saks til at fjerne huden fra lårene. Fjern muskelvæv for at blotlægge den femorale knogle. Luxate den femorale knogle fra hoften og knæet ved hjælp af pincet og saks. Pas på ikke at knække eller skære knoglen.
6. Fjern forsigtigt resterende store stykker af muskelvæv og brusk fra knoglen med en saks. Fjern resterende muskelvæv ved at gnide knoglen med laboratoriet silkepapir. Saml de rensede knogler i en petriskål med phosphatbufret saltvand (PBS).
7. Fix hele femorale knogler i 4% paraformaldehyd (PFA, elektronmikroskopi-grade) for 4 - 6 timer.
8. Kassér PFA og inkuber knogler i 10% sucrose i PBS O / N. Den næste dag, inkuberes knoglerne i 20% saccharose O / N. Dagen efter, inkuberes knoglerne i 30% saccharose O / N.

2. Cryosectioning of Bones

BEMÆRK: Efter 16-24 timer i 30% saccharose, fryse knogler og kryosektion dem efter Kawamoto tape metode ^14,15.

1. Forbered et stort bægerglas (2.000 ml volumen) med tøris og acetone (ca. 2: 1 volumen-forhold, fx 400 ml tøris og 200 ml acetone) under en emhætte. Placer en lille bæger (150-250 ml volumen) med hexan inde (30-50 ml ca). Vent blandingen afkøle (ca. 10 minutter, indtil frosten vises på ydersiden af ​​stort bægerglas).
2. Fyld ¾ af det mærkede kryoformen med Super Cryoembedding Medium (SCEM); omhyggeligt placere knoglerne inde, indtil de er helt nedsænket, at tage sig at de ikke rører ved kanten af ​​formen. Med store pincet holde kryoformen i bægeret med bunden af ​​formen netop rører overfladen af ​​hexan.
   1. Lad de ydre kanter af SCEM fryse (angivet med opacitet, dette tager ca. 15 sek). Så helt droppe formen i hexan og lad det freEze til 1 - 2 min. Tag den frosne prøve og wrap i cellofan og derefter aluminiumsfolie (for at beskytte prøven mod udtørring og for at undgå udsættelse for lys). Opbevares ved -80 ° C indtil cryosectioning.
3. For cryosectioning af femorale knogler bruge en standard mikrotomknive og mikrotomknive klinger til hårdt væv.
4. Indstil prøven og bladet temperatur mikrotomen til -24 ° C. Lad prøven sidde inde mikrotomen for omkring 15 minutter før opskæring.
   1. Fastgør prøveblokken indehaveren af ​​metal prøven med SCEM eller optimal skæring temperatur (OLT) medium. Juster orienteringen af ​​blokken, hvis nødvendigt. Trim prøven, indtil knoglen er fuldt åbnet og marv er synlig. Juster snittykkelse til 7 pm (kassere det første afsnit).
   2. Løs et stykke Kawamoto bånd med den klæbende side på toppen af ​​prøveblokken ved hjælp af en hjort læderbetrukne træspatel. Derefter skæres prøven og drej den, så afsnittet erplaceret på oversiden. Overfør båndet til et dias glas med en pincet. Fastgør båndet til slide glas med Scotch tape.
5. Lad sektioner tørre i mindst 30 minutter og opbevares ved -80 ° C indtil brug. Opbevar ufarvede og umonterede dias i plast slide kasser med afstandsstykker mellem enkelte dias for at undgå, at de hænger sammen. Farvede og monterede dias kan opbevares i op til en uge i pap slide mapper ved 4 ° C.

3. Billede Collection

1. Optø og plet kryosnit efter fælles immunofluorescens protokoller ^9. Omfatter en nuklear farvning, f.eks, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol, dihydrochlorid (DAPI) at visualisere væv integritet.
   BEMÆRK: Stain, for eksempel til RFP at visualisere stromaceller (anti-RFP-biotin-antistof og streptavidin-Alexa Fluor 555), bejdse eosinofiler med rotte-anti-major basisk protein (MBP) antistof og anti-rotte-Alexa Fluor 647-antistof , B-cellermed rotte-anti-B220-Alexa Fluor 594-antistof og pc'er med anti-κ let kæde-fluorescein-iso-thiocyanat (FITC) og anti-λ1 let kæde-FITC-antistoffer (detaljer af farvning procedure er beskrevet i ^9).
2. Monter farvede sektioner: sætte en dråbe fluoromount på sektionen og derefter dække med et # 1 glas dækglas, mens omhyggeligt undgår dannelsen af ​​luftbobler. Efterfølgende udfører laserscanning konfokal mikroskopi med et instrument udstyret med laserlinjerne egnede til farvning.
3. For at optage billeder til automatiseret co-lokalisering analyse af knoglemarvsceller hæmatopoietiske celler med stromale celler ved anvendelse af Wimasis værktøj, gælder følgende indstillinger:
   1. Brug en 20X objektiv og et synsfelt af 708,15 x 708,15 um. For automatiseret analyse, holde størrelsen på alle billeder konsistente på 2.048 x 2.048 pixel (px) for at holde resultaterne sammenlignelige.
   2. Optag en kanal til stromale strukturer (fx (f.eks DAPI, 405 nm) og yderligere kanaler til de hæmatopoietiske celler af interesse (f.eks 3 kanaler, 488/594/633 nm for eosinofiler, B-celler og pc'er).
   3. Optag billeder ved hjælp af linje gennemsnit 4 ^16. Ideelt set dækker hele femorale sektion ved at tage enkelte tilstødende billeder. Alternativt kan du tage ikke-tilstødende billeder fra forskellige regioner i knoglemarven (diafyseale samt epifyserne).
      BEMÆRK: Pas på ikke at producere overlapninger mellem tilstødende billeder (for at undgå gentagne analyser af celler i de overlappende områder).
4. Gem billederne i en mikroskopi billedfil format. Kontroller og om nødvendigt justere kontrasten for alle kanaler i billedfremviseren / analyse software.
5. Eksport 3 .jpg filer pr billedfil: en .jpg fil til DAPI kanal (rød / grøn / blå (RGB-format), falsk farvekodet i gult), en .jpg fil til stroma kanal (gråtoner) og en .jpg fil, der indeholderkanalerne for hæmatopoietiske celler (maksimum 3 kanaler, RGB format, f.eks FITC (PC'er, falske farver: grøn) / Alexa Fluor 594 (B-celler, falske farver: blå) / Alexa Fluor 647 (eosinofiler, falske farver: rød)) .

4. Automatiseret Image Analysis

1. Brug et billede analyseværktøj til at udføre billedet segmentering, kvantificering af co-lokalisering og kvarter analyse (se diskussion).
2. Hvis du bruger Wimasis værktøjer, gøres følgende:
   1. Upload sæt af 3 .jpg filer pr billede med det samme filnavn efterfulgt af en understregning og et tal, som angiver typen af ​​billedet.
   2. Brug _1 for .jpg fil med hæmatopoietiske celler, _2 for .jpg fil til DAPI kanal, _3 for .jpg fil til stroma kanal. For eksempel: Image1_1.jpg (hæmatopoietiske celler), Image1_2.jpg (DAPI kanal), og Image1_3.jpg (stroma kanal). Upload billeder via kundens konto.
   3. For celle-kontakt kvantificeringvælge den celle-kontakt værktøjet ved at klikke på det respektive område. For celle nærhed kvantificering vælge cellen nærhed værktøjet og indtast foretrukne nærhed radius i um (som måles fra cellernes kanter).
   4. Hent resultaterne.
      BEMÆRK: Resultaterne er angivet som .jpg-filer, der viser de hæmatopoietiske celler og stroma kanal med grænserne for de fundne objekter fremhæves, samt enkelte .csv-filer, der indeholder målinger for hvert billede, ud over et resumé .csv fil, indeholder data for alle uploadede billeder.
3. Fra kontakten målinger bestemme hyppigheden af ​​hæmatopoietiske celler (rød, grøn eller blå celler) i kontakt med stromale celler, eller hyppigheden af ​​røde, grønne eller blå celler kontakte andre hæmatopoietiske celletyper (et eksempel er vist i Repræsentative resultater Figur 4). For at bestemme frekvenserne, opdele de givne kontaktoplysninger tællinger pr billede vedden samlede celle tæller per billede.
   1. For eksperimenter med individuelle mus, opsummere de samlede kontaktoplysninger tællinger af alle billeder til de enkelte mus og dele dem med summen af ​​de samlede celletal på alle billeder.
4. Fra området målinger bestemme frekvensen af ​​røde, grønne eller blå celler inden for den valgte afstand fra stromale celler og / eller hyppigheden af ​​røde, grønne eller blå celler i den foretrukne nærhed til de andre hæmatopoietiske celletyper som beskrevet i trin 4.3 ( se også Repræsentative resultater, figur 4).

5. Simulering af Random Bone Marrow Positionering

1. Før den udfører simuleringer af tilfældig celle positionering på de analyserede knoglemarv histologiske billeder, forberede følgende filer på forhånd: de enkelte .csv-filer, som cellen kontakt værktøj, de originale .jpg-filer til DAPI kanal og de originale .jpg-filer for det stromale kanal.
2. For at udførebatch simuleringer på en serie af billeder (f.eks billeder fra en femoral sektion), indsamle alle originale .jpg-filer (_1, _2 og _3) og den tilsvarende enkelt .csv-filer i en mappe.
   BEMÆRK: simuleringsværktøj for tilfældig knoglemarv celle positionering er til rådighed efter anmodning.
3. Start simuleringsværktøj, markere feltet "Auto-load billeddata".
   BEMÆRK: Programmet vil læse celletal og gennemsnitlig cellestørrelse fra .csv-filen automatisk. Disse værdier vises i felterne for "Cell nummer" og "Cell størrelse AVG" (figur 5A).
4. Indtast den fælles tag for de .csv-filer, dvs fælles faktor i deres navne. Indtast antallet af billedsæt, der skal bruges til batch-mode simulering.
5. Læg .jpg fil genereret fra stroma kanal (med filnavn slutter _3).
6. Indtast indstillingerne for generering masken fra DAPI kanal:
   1. Marker feltet "? Anvend masken "Indstil tærsklen for konvertering af DAPI billede i en binær maske til 10 (interval 0-255).
   2. Marker feltet "8-bit?" Check boksen "Dilate?", Og indstil kvalitet af dilation til 5 px. Marker feltet "w / erosion?«.
   3. Indtast den ønskede værdi for nærhed radius (kvarter radius), der anvendes til analyse af de simulerede billeder. For et billede af 708,15 x 708,15 um med en størrelse på 2.048 x 2.048 px (pixel skalering xy: 0,346 um), 29 px svarer til 10 um.
7. Check boksen "Brug Otsu?" For at bruge Otsu algoritme ¹⁷ til automatisk registrering af stromale strukturer.
   BEMÆRK: Dette er den samme algoritme, der anvendes af kontakt og nærhed værktøj. Brug af samme billede segmentering algoritme i den automatiserede analyse af det optagede billede og den simulerede billede er afgørende for at holde dataene sammenlignelige.
8. Indtast indstillingerne for hæmatopoietiske celler, hvor Are simuleret som cirkulære former.
   BEMÆRK: celletal for rød, grøn og blå celler direkte indlæses fra .csv-fil (se også trin 5.6).
   1. Brug simuleringsværktøj til at beregne den gennemsnitlige diameter i px af røde, grønne og blå celler. Bestem den gennemsnitlige areal af en enkelt celle som det samlede areal af hver celletype i billedet i px divideret med det samlede celletal per billede. Brug det gennemsnitlige areal til at beregne radius af en disk ved hjælp af formlen. Dobbelt radius for at bestemme den gennemsnitlige diameter.
9. Mål cellestørrelsesfordeling af de analyserede celletyper med et billede analyse software, som indeholder objektsegmentering funktioner. Bestem σ for alle hæmatopoietiske celletyper ⁽¹⁸ og figur 5B).
   BEMÆRK: Da fordelingerne cellestørrelse på de optagede celler ikke er bestemt af den automatiserede billedanalyse, brug en Gauss-fordeling som en tilnærmelse af de reelle fordelinger. Bredden af ​​than fordelingskurve er beskrevet af σ og kan være helt forskellige for forskellige celletyper. (For yderligere oplysninger se figur 5B).
   1. Ud fra disse målinger, bestemme "cellestørrelse cutoff": diameteren i px, der beskriver den mindste objekt stadig anerkendt som en komplet celle ved billedanalyse værktøj.
10. Indtast parametre i de respektive bokse på den grafiske brugergrænseflade (figur 5A).
    1. Indtast cellestørrelse afskåret, dvs den minimale cellestørrelse tilladt i simuleringen, som en diameter i px.
    2. Indtast σ i px til simulering af cellestørrelsesfordeling for røde, grønne og blå celler (fra trin 5.9).
    3. Check "Slet" boksen i underafsnittet "Celler i Mask". Med denne indstilling, vil programmet har valgt en ny position til en celle, hvis den overlapper med mindst en pixel med en no-go område af masken. Marker feltet "Undgå celle overlap? ̶1; i underafsnittet "Cell udstødelse".
    4. Indtast den tilladte mindste afstand mellem centrene af to celler i px.
       BEMÆRK: Den mindste afstand skal bestemmes fra de optagede billeder. Fejlagtigt målte minimumsafstande vil føre til forudindtaget / kunstige resultater til sammenligning af optagne og simulerede billeder.
    5. Indstil det maksimale areal af overlap på 100%, hvis overlapningen er defineret ved den mindste afstand fra center til center.
    6. Sæt simuleringsværktøj til 1.000 gentagelser.
    7. Marker feltet "Automatisk lagring celler?" For at gemme koordinaterne til de simulerede objekter for alle gentagelser af hvert billede af partiet som .rect filer (tekst format). Marker feltet "Automatisk lagring billeder?" For at gemme et .tiff fil for hvert simuleret billede. Indtast et fælles tag for de gemte filer.
       BEMÆRK: "? Automatisk lagring celler" option reducerer simulering køretid og samlet data størrelse i forhold til, når du gemmer den faktiske simulerede imaGES. De .rect filer gemme koordinaterne de simulerede celler som rektangler og kan således omdannes til simulerede billeder, hvis det er nødvendigt.
11. Start simuleringen ved at klikke på "Kør simulation".
    BEMÆRK: simuleringsværktøj automatisk genererer en .csv-fil til de 1.000 simuleringer af hvert billede, herunder de gennemsnitlige kontakt tæller og omegn tæller for rød, grøn og blå celler med rød, grøn, blå og stromale celler til hver sæt gentagne simuleringer . Derudover, for alle disse værdier, gennemsnit af de 1.000 simuleringer med standardafvigelse (STD) og standardfejl af middelværdien (SEM) er forudsat.
12. Bestem den gennemsnitlige kontakt frekvenser og omegn frekvenser på et sæt af 1.000 simulerede billeder. For dette, opdele den gennemsnitlige kontakt og omegn tæller den indspillede celletal per billede. Sammenlign frekvenserne til resultaterne af den automatiserede co-lokalisering analyse af det optagne billede.
13. Anvend passende statistical metoder afhængigt af analysen ¹⁹ (for figur 7, vi anvendte en to-halet Wilcoxon signed rank test).

Representative Results

Skæring snit af uafkalket knogle med Kawamoto tape fremgangsmåde tillader hele knogle, der skal skæres som et intakt sektion med knoglemarv endosteale region stadig fastgjort til mineraliseret knogle, både i diafyse samt i epiphyseal områder med deres høj densitet af trabekulær knogle (figur 1). Nuklear farvning af sektionerne viser, at selv små revner i præparatet ikke helt kan undgås, strukturen af ​​sinusoider og arterier samt det retikulære netværk af parenkym forbliver intakt.

Som et eksempel på en immunfluorescensfarvning af røde fluorescerende kimære knoglemarv og efterfølgende analyse, en farvning for eosinofiler (major basic protein, MBP), pc'er (κ og λ let kæde) og B-celler (B220) vist. Mus blev immuniseret med 100 ug af 4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten koblet til kylling γ-globulin (NP-CGG) i alun ip, 4 uger efterrekonstituering boostet med 50 ug NP-CGG i PBS iv 21 dage senere og analyseret på dag 30 efter boost. Den automatiserede billedanalyse resulterede i en meget præcis anerkendelse af stromale strukturer, herunder også meget små fragmenter af retikulære processer. Da celle antal stromaceller ikke kan bestemmes med systemet præsenteres her (se også Diskussion), blev der ikke størrelsestærskel indført for stromale kanal, for at opdage alle fragmenter i billederne (figur 2). PC'er og eosinofiler er større end B-celler og viser også en mere heterogen form. Alle tre celletyper er blevet godt anerkendt ved første øjekast. Cellular klynger, især af B-celler, blev godt adskilt. Analysen værktøj er optimeret til de ovennævnte celletyper (eosinofiler, pc'er, B-celler). For andre celletyper, kan være nødvendigt justeringer. De .csv-filer genereret af cellekontakt værktøj indeholder følgende relevante målinger for hæmatopoietiske celler:celletal for hver cellepopulation; samlede areal for hver celle population i px; kontakt optælling af røde blodlegemer (i dette tilfælde eosinofile), grønne celler (her pc'er) eller blå celler (her B-celler) med rød, grøn, blå eller grå celler (stromale celler). De .csv-filer genereret af cellen nærhed værktøj indeholder følgende målinger for hæmatopoietiske celler: celletal for hver celle population; samlede areal for hver celle population i px; nærhed optælling af røde, grønne og blå celler med rød, grøn, blå og grå celler (stromale celler).

For at validere kvaliteten af billedet analyseværktøjer de, blev resultaterne af den automatiserede analyse sammenlignet med en manuel optælling af 6 uddannede raters (Figur 3). Alle raters modtog identiske billeder til analyse. Stromale strukturer og hæmatopoietiske celler blev omhyggeligt skitseret med et billede analyseværktøj og disse regioner af interesse blev reddet og analyseret. For stromale strukturer, det samlede areal pr billedeblev sammenlignet mellem automatisk og manuel analyse. Stromale strukturer syntes at være vanskeligt for de uddannede raters at fastslå nøjagtigt, som afspejles i den store varians observeret for størrelsen af det samlede areal af stroma tælles manuelt (figur 3A). Her automatiseret analyse bestemmes en værdi tæt på det gennemsnitlige areal opdaget af uddannede raters. For alle celler, det automatiserede analyseværktøj bestemt en lidt lavere mængde celler end tælles manuelt. Men for pc'er og eosinofiler, antallet var stadig i området interrater varians observeret for de manuelle tællinger. Antallet af B-celler detekteres ved automatiseret analyse, var imidlertid lidt under dette interval (figur 3A). Den gennemsnitlige cellestørrelse (område px) som bestemt ved automatiseret analyse var 512 px til pc'er, 436 px for eosinofiler og 317 px for B-celler, mens uddannede raters bestemmes en størrelse på 515 px til pc'er, 464 px for eosinofiler, og 291 px for B-celler. Således er den gennemsnitlige CEll størrelse til B-celler, pc'er og eosinofiler bestemt ved automatiseret analyse var sammenlignelige med de gennemsnitlige cellestørrelser bestemt ved manuelle raters (figur 3B). Denne automatiserede billede analyseværktøj kan nu anvendes til at kvantificere direkte kontakter kandidat knoglemarv niche celletyper. Endvidere kan hyppigheden af ​​celler af en bestemt celletype tilstødende stromaceller eller andre hæmatopoietiske celletyper bestemmes. En analyse af knoglemarv pc'er og deres kontakter til stromale celler, eosinofiler, B-celler og andre pc'er er vist, såvel som hyppigheden af pc'er tilstødende disse celletyper inden for 10 og 20 um (figur 4A). Derudover kan frekvenserne af forskellige hæmatopoietiske celletyper med stroma kontakt kvantificeres (figur 4B).

Inden du udfører en simulering af tilfældige knoglemarv positionering af disse celler med simuleringsværktøj, de parametre, som beskriver cellestørrelsesfordeling som Gaussian fordeling skal fastlægges. For en Gauss-fordeling, som kan visualiseres som en symmetrisk og kurve "klokkeformet", behøver kun to parametre, der skal bestemmes: placeringen af midten af kurven (den tilstand, dvs hvor toppen af kurven er placeret ) og bredden af ​​det symmetriske kurve (dette er beskrevet af ovennævnte σ parameter). Denne procedure er vist her for pc'er, eosinofiler, og B-celler (figur 5B). Målte distributioner cellestørrelse viser, at for B-celler, bredden af ​​fordelingen kurven beskrevet ved σ er mindre end for pc'er og eosinofiler. For simuleringen blev de relative værdier af σ målt for de tre cellepopulationer vedligeholdt (dvs. B-celler blev altid simuleret ved en dobbelt så snæver størrelsesfordeling end pc'er «og eosinofiler), mens σ værdier defineret i px var Indstil til det visuelle udseende af de optagede celler (figur6B). Dette førte os til at anvende en σ på 2 px for B-celler og en σ på 4 px til både pc'er og eosinofiler. Den cellestørrelse cutoff blev bestemt ud fra de målte fordelinger cellestørrelse. For pc'er og eosinofiler, en cutoff på 300 px objekt størrelse, hvilket resulterer i 20 px diameter for en cirkulær objekt (ca. 7 um) og for B-celler en cutoff ved 220 px, hvilket fører til en 17 px diameter (ca. 6 um) blev anvendt til simulering.

For at definere områder i den simulerede tilfældigt billede, hvor cellerne får lov til at blive placeret ved simuleringsværktøj blev en maske fra nukleare signaler i DAPI kanal af et knoglemarv histologisk billede (figur 6A). En værdi på 10 blev bestemt til at være den optimale intensitet tærsklen for frembringelse af binære billeder (øverste panel, højre billede). Det bestemmes af Otsu algoritme tærskel ikke fører til fuld anerkendelse af alle kerner i billedet (øverste panel, center billede), på samme måde som faste intensitettærskler på 50 eller 150 (nedre panel, venstre og center image) .Den relevansen af kontakter pc'er, eosinofiler, eller B-celler med stromale celler (figur 4B) blev testet under anvendelse af simulering værktøj (figur 7). Denne analyse viste signifikant højere kontakt satser i de optagede billeder i forhold til simulering for pc'er og B-celler (figur 7A), i overensstemmelse med begrebet stromale nicher understøtter disse populationer. Dette blev bekræftet i 5 individuelle fluorescerende kimære mus (figur 7B, D). I modsætning hertil blev ingen klar forskel bestemmes i tilfælde af eosinofiler (figur 7A, C).

Figur 1. Oversigt fluorescens billede af et længdesnit af et murint lårben cryosectioned med Kawamoto tape metode. Båndet fremgangsmåde tillader cutting sektioner med en intakt endosteale region, både i diafyseale samt i epiphyseal områder fra uafkalket knogle. A 7 um tyk knogle sektion af en naiv C57BL / 6 mus blev farvet for det ekstracellulære matrixprotein laminin (rød) til Sca-1 for at visualisere arterioler (grøn) og for kerner (blå, DAPI). 47 fliser af 1.446 x 1.088 um, opløsning 1.360 x 1.024 px blev optaget og syet til at skabe overblik billede. Dette billede blev taget på en bred felt fluorescens mikroskop, med en 10X objektiv (0,45 NA). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2. Automatiseret påvisning af stromale og hæmatopoietisk knoglemarvsceller. En lårbensknogle sektion af et rødt fluorescerende chiMeric mus på dag 30 efter boost blev farvet for RFP (grå) at visualisere stroma, MBP (rød, eosinofiler), κ og λ let kæde (grøn, PC) og B220 (blå, B-celler). Venstre: Original billede erhverves på et konfokalt mikroskop, ved anvendelse af en 20 x objektiv linse (0,8 NA) og et synsfelt af 708,15 x 708,15 um. Højre: opdelt billede. Konturerne af de anerkendte objekter fremhæves. De hvide rektangler markerer området vist på de nederste billeder. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3. Validering af billedanalyse automatiseret af uddannede raters. (A) Samlet areal af stromale strukturer og totale celletal af hæmatopoietiske celler tælles af uddannede testere i et (stromale strukturer), 10 (pc'er), to (eosinofiler) og et billede (B-celler) i forhold til celleantal opnås ved automatiseret billedanalyse. Dots repræsenterer individuelle raters (n = 5 - 6). Søjler angiver middelværdier eller automatisk bestemte værdier. (B) Object størrelsesfordelingen af manuelt tælles objekter i forhold til den gennemsnitlige objekt størrelse bestemmes ved automatiseret analyse. For at tage højde for de forskellige frekvenser af de forskellige celletyper blev pc'er tælles i 10 eosinofiler i to og B-celler i et billede. Dots repræsenterer enkelte objekter. Linjer angiver middelværdien. (C) Manuel skitsering af stromale strukturer af uddannet raters. Venstre: originale billede. I midten: eksempler på manuelt analyserede billeder. Til højre:. Stromale strukturer afsløres med automatisk analyse Klik her for at se en større udgave af dette tal.

"Figur 4" src = "/ files / ftp_upload / 52544 / 52544fig4highres.jpg" width = "700" />
Figur 4. Automatiseret co-lokalisering analyse af pc'er, eosinofiler, B-celler og stromaceller i den femorale knoglemarv. (A) Venstre: Frekvens af pc'er i direkte kontakt med stromale strukturer, eosinofiler, B-celler eller andre pc'er i fluorescerende kimære mus på dag 30 efter boost. Midterste og højre: Frekvens af pc'er i 10 um nærhed eller 20 pm nærhed af stromale strukturer, eosinofiler, B-celler eller andre pc'er. Dele af denne figur (direkte kontakt, 10 um omegn) ændres fra Zehentmeier et al. ⁹ (B) Hyppigheden af pc'er, eosinofiler og B-celler i direkte kontakt med stromale strukturer. 52-515 pc'er, 918-3179 eosinofiler, 4146-13063 B celler i 10-21 billeder blev talt fra 5 fluorescerende kimære mus på dag 30 efter boost, poolet fra to uafhængige forsøg. Dots repræsenterer individuelle mus. Linjer angiver median.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5. Bestemmelse af cellestørrelse fordeling af knoglemarv pc'er, eosinofiler og B-celler. (A) skærmbillede af grafiske brugergrænseflade (GUI) af simuleringen værktøjet. (B) Fordelingen cellestørrelse (område px) af pc'er (κ og λ let kæde, grøn), eosinofiler (MBP, rød) og B-celler (B220, blå) er vist i histogrammer målt efter objekt genkendelse af Volocity software (øverste panel). I femorale knoglemarv billeder (nederste del), opdaget pc'er er markeret med rødt (overlay gul), eosinofiler i blå (overlay violet) og B-celler i gult (overlay grå). Billede segmentering blev udført ved at sætte en størrelse grænse på 180 px minimum for pc'er,300 px for eosinofiler og 220 px for B-celler. 250 genstande blev målt til PC, 650 objekter for eosinofiler og 3.000 objekter til B-celler. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 6. Frembringelse af masken for simuleret tilfældig celle positionering. (A) Den oprindelige DAPI kanal (gul) samt overlejringer af DAPI med binære billeder genereret ved at anvende forskellige tærskler er vist. Masken genereret fra det binære billede (tærskel indstillet til 10) er vist nedenfor (nedre panel, højre billede). Sorte områder udgør forbudte områder, hvide områder repræsenterer områder, hvor cellerne er tilladt at blive placeret. (B) Det optagede billede (til venstre) og den tilsvarende simulerede billede (til højre) viser høj visuellighed. Eosinofiler (MBP), pc'er (κ og λlight kæde), B-celler (B220) og stromale celler (RFP) vises. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 7. Direkte kontakt af hæmatopoietiske celletyper med stromale strukturer i optagede vs. simulerede billeder. (A) Frekvens af pc'er, eosinofiler og B-celler i direkte kontakt med stroma i simulerede forhold til optagede billeder af fluorescerende kimære mus på dag 30 efter injektionen. Linjer forbinder tilsvarende simulerede og optagne billeder (prikker). Billeder af en repræsentant mus er vist i hvert plot. (B) Frekvensen af pc'er, eosinofile og B-celler i direkte kontakt med stroma i simuleret forhold til optagne billeder af 5 individuelle mus fra to uafhængige forsøg. Wilcoxon signed rank test, to-tailed (pc'er: *** p = 0,0001 * p = 0,0371 * p = 0,0161; ** p = 0,0012; **** p <0,0001; eosinofiler: *** p = 0,0007 ; p = 0,1055 * p = 0,0161; p = 0,4143; *** p = 0,0007; B-celler: **** p <0,0001; ** p = 0,0020; *** p = 0,0005; ** p = 0,0012 ; **** p <0,0001). Dots repræsenterer individuelle billeder. Bjælker angiver middelværdien. P-værdier 0,05 anses betydelige forskelle. Stjernerne i tal viser følgende P-værdier: ns: p> 0,05; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001; ****: P 0,0001. Dele af dette tal (direkte kontakt af pc'er med stromale strukturer) ændres fra Zehentmeier et al. ⁹ Klik her for at se en større udgave af dette tal.

700 "/>
. Figur 8. Komplet workflow af kvantificering fremgangsmåde for hæmatopoietisk celle - stromale celle interaktioner i murine knoglemarv Tilgangen er opdelt i tre hoveddele: 1. murine knoglemarv sektioner er forberedt og rå data indsamles af laserscanning konfokal mikroskopi, 2 . den automatiske analyse af de optagne billeder og simulering af tilfældige placering af knoglemarvsceller udføres, 3. kontaktpunkterne og naboskab tællinger opnået fra optagede og simulerede billeder sammenlignes. Input (billedfiler) og output (tekstfil), i den automatiske analyse er angivet i blå, er indgangen (billedfiler) og output (tekstfiler og eventuelt billedfiler) af simuleringsværktøj angivet med grønt. Klik her for et større version af dette tal.

Discussion

På trods af de fremskridt i moderne optiske billeddiagnostiske metoder, er analysen af ​​histologiske data stadig ofte hæmmet af mangel på ordentlig kvantificering værktøjer og metoder, eller ved fordomsfulde analyser, der fokuserer på et lille område af interesse. Den synergistiske tilgang præsenteres her kombinerer billedanalyse dækker hele knoglemarven region, automatiseret segmentering og objekt anerkendelse af forskellige hæmatopoietiske og stromale celletyper, co-lokalisering analyse, og endelig en validering værktøj af ikke-tilfældigt forekommende kontakter leveres af en ny kun- designet simulation software.

Histologi af hele knogler, herunder knoglemarv har været vanskelig at udføre på grund af de forskellige væv tætheder stede i en sektion - på den ene side meget hårdt, mineraliseret knogle, på den anden side ekstremt skrøbelige marv, som bliver let forstyrret når cut sammen med knoglen. Som et alternativ, båndet metode til at skære knogle sektioner presteret her ^14,15 har den fordel, at det stabiliserer væv, derved forlader endosteal områder intakte (figur 1). Udover at være rige på osteoblaster, er disse områder blevet foreslået at spille en rolle i stamcelle vedligeholdelse ^20.

Den afgørende rolle, som stromale celler i udviklingsprocesser og cellulær vedligeholdelse i knoglemarven bliver mere og mere tydelig. Imidlertid har analysen af ​​disse sjældne, skrøbelige celler vist sig at være vanskeligt af to grunde: For det første er de vanskelige at isolere fra knoglemarven; sekund, graden af ​​heterogenitet blandt stromale befolkning ikke kendt, og derfor kunne man glip af en vigtig befolkning ved hjælp af bestemte markører, der er blevet beskrevet for stromaceller. Fremgangsmåden til at generere fluorescerende knoglemarv kimærer er nyttigt at fluorescens-mærket og derefter analysere knoglemarv stromal celle befolkningen som helhed. Imidlertid bør det bemærkes, at i disse miCE Alle mesenchymale celler i knoglemarven visualiseres, herunder endotelceller og osteoblaster. Dette skal tages i betragtning, hvis data fra sådanne kimære mus analyseres. Selv om der er også en risiko for hæmatopoietiske celler af modtagerens oprindelse overlevende bestrålingen disse celler typisk kun dækker et meget lille areal pr synsfelt i forhold til donor CD45 ⁺ celler, hvorfor de ikke påvirker den histologiske analyse ^9. Klart, at denne metode kombineres i et efterfølgende trin med en mere specifik påvisning af stromale (under) populationer. I øjeblikket er analysen af ​​disse celler for det meste udført af histologi på grund af de ovennævnte grunde, indførelse af en begrænsning på antallet af parametre, der kan analyseres på samme tid. Udviklingen af ​​multi-parameter analyser mikroskopi vil bidrage til at overvinde disse begrænsninger.

Under billedanalyse blev segmentering udført ved anvendelse af originale Otsu algoritme. HovedsageligDette klyngedannelse-baserede tærskelværdiansættelse metode bestemmes automatisk tærsklen intensitet for den optimale separation af forgrunden (signal) og baggrund (støj) pixels i to grupper med laveste statistisk forskel i en given kanal, hvilket resulterer i et binært billede ^17. Her blev Otsu metode anvendt på den naturlige logaritme version af det oprindelige billede, som er:

Input billede til Otsu = ln (Input billede)

Det fungerer bedre for fluorescensbilleder siden Otsu metode kan identificere dim celler som baggrund. Tilføjelse af logaritmisk funktion giver mulighed for en bedre adskillelse af cellerne og baggrund i to forskellige klasser af Otsu algoritme. Men intensitet tærskelværdiansættelse alene er ikke nok til præcist at detektere enkelte objekter. Det virker effektivt, når påvisning godt adskilte objekter i billeder, men det er ikke tilstrækkeligt til at adskille enkelte celler placeret i klyngerne. Da nogle af de celletyper,var af interesse for os, såsom eosinofiler eller B-celler, ofte samlet i vævet, blev deres kerner i DAPI kanal segmenteret ved hjælp af en algoritme baseret på k-means clustering af intensiteten histogram med k = 10 ^21. Den celle segmentering algoritme vil plotte lyseste til de meget svagt pixel (grupperet i 10 spande) og konstant ser for dannelsen af ​​celle-der ligner den objekter. Vil derefter blive defineret Disse objekter som celler. Når der er anvendt alle pixels, de resulterende kerner dilaterede at generere en maske, anvendes derefter til de andre kanaler for klynge separation.

Det skal bemærkes, at denne analyse fungerer godt for hæmatopoietiske celler, som er kompakt, men at den er begrænset med hensyn til stromaceller, da det ikke er muligt at bestemme grænserne for disse store, spredt ud celler på grund af sammenkobling af deres dendritiske udvidelser, der danner en retikulære netværk. Således tæller for stromaceller celleikke kan tilvejebringes. Mærkning enkelte celler via skæbne-mapping reportere under kontrol af stroma promotorer vil løse dette problem, efter hvad der er udgivet i neuroner (metoden "Brainbow" systemet ²²⁾ og til mærkning af follikulære dendritiske celler i lymfeknuderne ^23.

Ud over at anvende et trin støjreduktion til alle kanaler ved at udelukke objekter under 30 px blev størrelseseksklusion anvendes i fremgangsmåden objekt anerkendelse for hæmatopoietiske men ikke stromaceller. Små fragmenter af celler, der blev skåret ved sektionering kan udelukkes; dog kan tabet blive forsømt i dette tilfælde til fordel for en entydig anerkendelse af cellerne. Udvidelse af analysen og simulering fra to til tre dimensioner vil overvinde denne begrænsning. Udviklingen af metoder til at studere cellulær fordeling i hele underlag, fx ved multi foton mikroskopi eller lys ark mikroskopi / SPIM, vil helt sikkert hjælpe i ther respekt. For at undersøge den komplekse cellulære sammensætning af flerkomponent-nicher, vil det også blive nødvendigt at udvide antallet af parametre, der bliver analyseret in situ. Lovende metoder til multiparameter-analyse af histologisk information i kombination med cytometrisk kvantificering er blevet offentliggjort for nylig ^{24, 25.}

Kontakten blev udført ved at kvantificere overlapningen af ​​to objekter. Direkte kontakt blev defineret som en overlapning på mindst en pixel. Vigtigt er denne analyse begrænset af opløsningen af ​​mikroskopi billeder og afhænger derfor af bølgelængden og tilstanden af ​​excitation, samt om den numeriske apertur af objektivlinsen anvendes i mikroskopet, og pinhole størrelse. I analysen er vist her, en 0,8 NA, 20X objektiv med fluorokromkombinationer ophidset med 488, 561, 594 og 633 nm ved hjælp af en foton excitation blev anvendt. Derfor værdier lateral opløsning mellem0,372 og 0,483 um blev opnået. Dette gør det muligt påstande, der skal foretages om sammenstillingen af ​​forskellige celledelmængder; Men betyder det ikke give nogen oplysninger om formodede molekylære mekanismer involveret i cellulære interaktioner. Derudover er der behov for andre metoder, såsom 2-foton intravital mikroskopi at forbedre karakterisering af disse intercellulære kontakter ^9. Förster-resonante (FRET) -baserede systemer kan være med til at bekræfte, om disse interaktioner er faktisk funktionel ^26.

For at vurdere den cellulære mikromiljø væv nicher, er det ikke kun vigtigt at analysere de direkte celle-kontakter, men også til at kvantificere de celletyper i nærheden af ​​en bestemt celletype af interesse ("omegn analyse"). Tidligere offentliggjorte undersøgelser målte afstande mellem celler og væv strukturer, såsom fartøjer baseret på positionen af kernen ^27. Da vi var interesserede i determining afstanden af ​​forskellige celletyper, delvis med varierende forhold mellem kerne og cytoplasma volumen, vi foretrak at måle afstanden mellem overflader. Til dette formål har vi beregnet nærhed radius ved at bestemme den euklidiske afstand fra et cellens grænse efter konvertering af værdier fra um til px. Den euklidiske afstand er den lineære afstand mellem to pixels og kan beskrives ved formlen ^28:

Celler med pixels af deres grænser inden for en euklidisk afstand af fx 10 um fra pixels af en målcelle grænser blev talt som nabo denne celle.

I sin nuværende form, kun analysen bestemmer, om en celle er kontaktet eller kontaktet af en anden celle i den samme eller anden type, hvilket giver kun et binært JA / NEJ karakterisering. Det faktiske antal cellers, der kontakter cellen af ​​interesse, eller er inden for en vis radius fra den er ikke beregnet. Det næste skridt vil være at forlænge den nuværende analyse på en måde, at gruppen størrelse at kontakte eller tilstødende celler kan påvises og sammenlignes mellem forskellige målceller af samme type. Dette vil føre til yderligere vigtige informationer om sammensætningen af knoglemarv nicher, såsom overlevelse niche for knoglemarv plasmaceller, som en varierende bidrag hæmatopoietiske accessoriske celler er blevet diskuteret ^29-33.

Genkendelsesalgoritmer Objektet blev optimeret sammen med specialister fra Wimasis ved hjælp af deres kommercielt tilgængelig brugerdefineret løsning service og er tilgængelige efter anmodning. En anden mulighed er at bruge enten kommercielt tilgængelige software til billedanalyse, som Definiens, Volocity eller Imaris eller freeware såsom CellProfiler.

De automatiserede celle segmentering og image analyseværktøjer vire valideret ved at sammenligne deres resultater med manuelt analyserede data fra 6 trænede billede raters med hensyn til to parametre, nemlig objektet størrelse og antallet af celler i forskellige cellepopulationer. Som vist i figur 3B, er den gennemsnitlige objekt størrelse for hæmatopoietiske celler (pc'er, eosinofiler, og B-celler) var ens mellem de to metoder, med en højere varians til manuel størrelsesbestemmelse for plasmaceller og eosinofiler, sandsynligvis på grund af deres mere uregelmæssig form sammenlignet at B-celler. Automatiseret påvisning af celletal gav lidt lavere værdier end de manuelt fundne dem. Især var de stadig inden for området af de manuelle værdier i tilfælde af eosinofiler og pc'er, mens de var under disse værdier i tilfælde af B-celler, sandsynligvis på grund af en højere heterogenitet af ekspression af B220, der blev anvendt som en markør for B-celler. B220 vides at være opreguleret i B celledifferentiering i knoglemarven, og B-celler med lav såvel som høj ikan observeres ntensity farvning for B220. B-celler med lave B220 signaler faldt under den påførte tærskel, hvilket kan have ført til udelukkelse af de tidligste fase B-celler. En lavere tærskel for automatiseret påvisning kan løse dette problem. For stromale celler, som er sværere at opdage på grund af deres mindre kompakt, mere dendritiske og strakte ud morfologi, resulterede den manuelle registrering i høje afvigelser mellem de enkelte raters. Interessant, det gennemsnitlige samlede areal af stroma var lig med det samlede fastslåede automatisk areal, hvilket indikerer, at analysen er velegnet til at kompensere for de enkelte fordrejninger efter raters. Taget sammen viser disse data, at de automatiserede resultater generelt repræsenterer gennemsnitsværdierne for manuelle analyser og er velegnede til at reducere interrater variabilitet i analysen.

For at skelne tilfældige og ikke-tilfældige placering af celler inden for de strukturelle begrænsninger i vævet, blev en simulering værktøj udviklet. During simuleringen er en kunstig billede med tilfældigt placerede hæmatopoietiske celler skabt for hver registreret knoglemarv histologisk billede. Først stroma kanal billedet anvendes i det oprindelige format. En maske er genereret fra DAPI billede ved at anvende en fast intensitet baseret tærskel, således at omdanne billedet til binært format; den binære maske gennemgår derefter flere trin af pixel baseret dilatation og erosion. Masken definerer områder i billedfeltet hvor simulerede celler er tilladt at blive placeret. Koordinaterne for centrene af de simulerede celler er angivet af et ensartet tilfældige tal generator, og grænserne for, hvor bestemt af billedstørrelsen. Information om celleantallet og gennemsnitlig cellestørrelse for hver population bestemt ved automatiseret billedanalyse af de optagne billeder anvendes til at definere de simulerede hæmatopoietiske cellepopulationer. Antages simulerede cellediameter at følge en én-dimensional gaussisk fordeling, hvorfra den faktiskecellediameter vælges tilfældigt: Diameteren derefter ændret, således at celle størrelse cut-offs til den mindste tilladte objekt størrelse introduceres. Hvis den simulerede celle ville være placeret således, at en eller flere pixels overlapper med en no-go område eller ville være inden for en foruddefineret afstand fra en anden allerede placeret celle (4 pm fra center til center, som bestemt i optagne billeder), nye tilfældige koordinater vil blive valgt, mens diameteren efterlades uforandret. Dette vil blive gentaget, indtil antallet af simulerede celler er lig med antallet af celler i det optagne billede.

Værktøjet er baseret på den antagelse, at hæmatopoietiske celler kan placeres frit i knoglemarven, mens stromale strukturer fungere som en fast matrix i vævet. Værktøjet blev optimeret til situationen i knoglemarven, hvor parenkymale områder krydses af et komplekst system af sinusoids. En lignende modellering fremgangsmåde blev for nylig offentliggjort af Frenette og medarbejdere med henblik på atanalysere positionering af hæmatopoietiske stamceller i forhold til stromaceller og vaskulære strukturer, som udgør omkring 30% af den samlede femorale knoglemarv bind ^25. For at korrigere for denne effekt, er simuleringsværktøj præsenteres her baseret på en maske områder blev cellerne får lov til at blive placeret. Dette blev opnået ved anvendelse af en nuklear plet billede, hvori objekterne repræsenterer kernerne blev ekspanderet med en 5-trins dilatation (se figur 6) efter binarisering. Områder med lav celletæthed, dvs. lav densitet af kerner såsom knogle og sinusoids, ikke vil bidrage til masken og bliver derfor no-go områder. For at undgå en kunstig reduktion af disse forbudte områder ved dilatation procedure blev en 5-trins erosion anvendes senere, og dermed genåbne større udelukkelse områder, samtidig med at den høje nukleare tæthed (derfor "tilladt") områder uændret. Denne metode kan let tilpasses til andre lymfoide organer. I de tspørgsmål var denne metode måske ikke arbejde (fx i områder, hvor celler med en høj cytoplasma / kerne-forhold er til stede), andre metoder såsom cytoplasmatisk mærkning kan bruges til at oprette masken.

Hæmatopoietiske celler blev simuleret som cirkulære objekter, hvis størrelse bestemmes ved hjælp af en Gaussisk tilfældig tal generator, middelværdien som aftalt med den beregnede gennemsnitlige diameter af hver celletype. Bredden af ​​fordelingen var baseret på målte celle størrelse udlodninger i optagne billeder som fastsat af en billedanalyse software. For at tage hensyn til, at små cellulære fragmenter blev udelukket i automatiseret billedanalyse blev cellestørrelse cut-offs indført som bestemt ud fra de målte celle størrelsesfordelinger for hver celletype (se figur 5).

Naturligvis Dette virker godt for celletyper, som er relativt ensartet i størrelse og form, men kan føre til problemer i tilfælde af celler, som enre meget heterogene med hensyn til disse parametre. Det skal bemærkes, at denne analyse er optimeret til de store hæmatopoietiske celletyper i knoglemarven (granulocytter, hæmatopoietiske stamfædre og lymfocytter), som har det til fælles, at de har en regelmæssig, næsten afrundet form. Imidlertid er denne metode ikke blevet testet for dendritiske celler eller makrofager, celletyper med stærkt uregelmæssige cellelegemer. Med analysen af sådanne celler vil præsentere nye udfordringer til vores automatiske billedanalyse samt simuleringen tilgang, herunder behovet for forbedrede celle klynge adskillelse algoritmer ²⁴ samt detaljerede form-analyse og simulering af ikke blot forskellig størrelse, men også forskelligt formede celler. Et alternativ ville være en simulation tilgang, der arbejder med de nøjagtige former som registreret. Imidlertid skal det bemærkes, at denne metode vil stige betydeligt den deterministiske adfærd modelsystemet.

For det simulerede experiments blev 1000 gentagelser af simulering for hver optagede billede genereret. Brug af denne mange gentagelser vil reducere den relative fejl bidraget med simuleringen processen sig til omkring 3%. Nemlig hvis celle-celle-co-lokalisering værdier beregnes ud fra simuleringer, der er tilfældigt, så simuleringen proces selv vil blive karakteriseret ved en N ^-1/2 fejlfunktionen, hvor N er antallet af simuleringer pr målte billede. Dette er andelen efter simuleringen processen sig til den akkumulerede fejl af de målte co-lokalisering værdier. Således for N = 1.000 den indskudte fejl er 3,16%. De viste simuleringer kørte i 20 til 60 minutter pr billede pr 1.000 gentagelser når kun gemme de simulerede billeder som .rect filer (en simpel tekst format) snarere end som egentlige billeder i .jpeg eller .tiff format (også en mulighed i softwaren ).

Tilsammen denne fremgangsmåde giver mulighed for en neutral, high-throughput analyse af histologiske billedes og muliggør genereringen af ​​statistisk relevante data. Dette kan være nyttigt at sammenligne cellulære lokalisering under forskellige betingelser. Desuden tidsmæssig komponent kan i fremtiden blive integreret i et modelmetode af knoglemarv celle bevægelser, som flere data på motiliteten af ​​forskellige celletyper i knoglemarven bliver tilgængelig. Denne fremgangsmåde kan derefter anvendes til at simulere perturbationer i systemet, såsom mobilisering af celler fra knoglemarven til kredsløbet, f.eks neutrofiler i tilfælde af en akut inflammation ^34. For yderligere at belyse funktionen af ​​knoglemarven som et opbevaringssted for immune hukommelsesceller, kan man også forestille sig at udvide den til at modellere konkurrencen for overlevelse faktorer. Også kunne eventuel krydstale mellem forskellige nicher rettes, samt induktion af nicher. Sammen vil dette hjælpe til at forstå de fysiologiske ændringer (f.eks udløser for regenerativ adfærd i stamceller) som well som de patologiske forstyrrelser af systemet som helhed, for eksempel i tilfælde af autoimmune sygdomme, neoplasi eller akut inflammation. Som en del af en iterativ begreb eksperiment og modellering, nye hypoteser kan genereres på grundlag af de simuleringer, som igen igen kan testes eksperimentelt og dermed bidrage til yderligere at forstå funktion og samspil mellem forskellige celletyper i kompleksiteten af ​​væv.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)	Science Services	15713	EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Dry ice
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM embedding medium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. and N. Lee		available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium	DAKO	S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocal microscope			equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow	Wimasis, Munich		The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime	Microsoft		free download
Simulation tool for random cell positioning			available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions			We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software			free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).