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Developmental Biology

Automated quantification des cellules hématopoïétiques - Interactions cellulaires stromales dans les images histologiques de décalcifiées os

Published: April 8, 2015 doi: 10.3791/52544

Abstract

La microscopie confocale est la méthode de choix pour l'analyse de la localisation des multiples types de cellules au sein des tissus complexes tels que la moelle osseuse. Cependant, l'analyse et la quantification de localisation cellulaire est difficile, comme dans de nombreux cas, il se appuie sur le comptage manuel, portant ainsi le risque d'introduire un biais de l'évaluateur-dépendante et réduire fiabilité inter. En outre, il est souvent difficile de juger si la co-localisation entre deux cellules résulte de positionnement aléatoire, en particulier lorsque des types de cellules diffèrent fortement de la fréquence de leur occurrence. Ici, un procédé de quantification non biaisée de la co-localisation cellulaire dans la moelle osseuse est introduite. Le protocole décrit la préparation de l'échantillon utilisé pour obtenir des coupes histologiques de entiers os longs murins y compris la moelle osseuse, ainsi que le protocole de coloration et l'acquisition d'images à haute résolution. Un flux de travail d'analyse allant de la reconnaissance de hématopoïétiques et non-hematopoietic types de cellules dans deux dimensions des images de moelle (2d) de l'os à la quantification des contacts directs entre les cellules est présentée. Cela inclut également une analyse de voisinage, afin d'obtenir des informations sur le microenvironnement cellulaire entourant un certain type de cellule. Afin d'évaluer si la co-localisation de deux types de cellules est la simple conséquence de positionnement cellulaire aléatoire ou reflète associations préférentielles entre les cellules, un outil de simulation qui permet de tester cette hypothèse dans le cas d'hématopoïétiques ainsi que des cellules stromales, est utilisé. Cette approche ne est pas limitée à la moelle osseuse, et peut être étendue à d'autres tissus pour permettre une analyse reproductible, quantitative des données histologiques.

Introduction

En raison des récents développements technologiques rapides dans la microscopie, y compris l'imagerie optique, l'analyse de cellules dans le contexte du tissu entier est devenu de plus en plus accessible pour les immunologistes. La caractérisation des cellules individuelles en suspension représente une méthode utile et indispensable pour comprendre la fonction cellulaire et moléculaire. Cependant, l'analyse des cellules au sein de leur (micro) -anatomical environnement est essentielle pour comprendre les interactions entre les différents types de cellules qui collaborent dans des processus complexes tels que le développement des réponses immunitaires.

Se il est relativement facile pour microscopistes pour obtenir des informations qualitatives à partir d'images, il reste un défi de quantifier ces données, en partie en raison du fait que les méthodes d'analyse dans ce domaine sont à la traîne par rapport à ce qui est possible dans l'acquisition de l'image. De nombreux chercheurs se appuient toujours sur de temps comptage cellulaire manuel dans leurs images d'histologie,introduisant ainsi un biais entre les différents évaluateurs et d'entraver la réplication par d'autres groupes. Souvent, une image représentative est choisie pour souligner une déclaration sur la position cellulaire ou co-localisation dans une publication, ce qui rend difficile pour le lecteur de juger de la pertinence statistique d'un tel événement.

Ensemble, avec le fait que le contenu de l'information complète de données d'image est rarement exploitée, ce qui souligne la nécessité d'une approche plus impartiale, rapide et complète pour analyser les images histologiques.

La moelle osseuse est un tissu complexe, qui prend les fonctions vitales importantes comme l'organe de l'hématopoïèse chez les vertébrés adultes. En plus d'être le lieu de naissance pour les cellules hématopoïétiques 1,2 et de jouer un rôle important dans le développement des lymphocytes B 3, il agit également comme un site où les réactions immunitaires sont initiées 4 et soutient les cellules matures, recirculation B 5. En outre, son rôle dans le maintien imémoire mmunological est devenu de plus en plus apprécié dans la dernière décennie, car plusieurs types de cellules constituant la mémoire immunitaire ont été trouvés d'y résider 6-9.

La relation entre l'architecture tissulaire complexe de la moelle osseuse et de ses fonctions restent toujours insaisissables. Contrairement organes lymphoïdes secondaires, qui sont organisés en macro-compartiments tels que les zones de cellules T et B, la moelle osseuse n'a pas de macro-cloisonnement clair. Jusqu'à présent compartiments distincts dans la moelle osseuse sont définis par leur proximité par rapport au cortex de l'os ou de la vascularisation. L'importance des différentes populations de cellules stromales résident dans la moelle osseuse pour un certain nombre de procédés tels que l'appui des cellules souches, le développement des cellules B ou le maintien de populations de cellules de mémoire immunitaire (tels que les cellules de plasma à long terme (PC), CD4 + et Les cellules CD8 + T mémoires) indique clairement qu'il existe un certain degré de micro-compartimentation dans la moelle osseuse.

10. La visualisation et la caractérisation de cellules stromales de la moelle osseuse est difficile en raison de leurs caractéristiques morphologiques avec de longues extensions dendritiques minces formant un réseau dans la moelle osseuse, et l'absence de marqueurs appropriés de discriminer les sous-populations stromales.

Il ne est pas encore clair dans quelle mesure ces niches ont des caractéristiques communes à l'égard de leur compositio cellulaire et moléculairen, et qui rendent éléments un certain créneau unique. En plus des cellules stromales, des types de cellules hématopoïétiques ont été montrés pour jouer un rôle crucial en fournissant certains signaux au moins pour une partie des créneaux. De toute évidence, la complexité de la composition de niche nécessite leur analyse in situ, et il est devenu de plus en plus important pour les immunologistes et hématologues de zoomer sur la microarchitecture de la moelle osseuse, par exemple, en analysant les relations spatiales entre ses composants cellulaires.

Ici, une stratégie visant à quantifier la co-localisation et de voisinage relations cellulaires dans la moelle osseuse d'une manière automatisée et impartiale est présenté. Un flux de travail détaillé incluant la génération de souris chimériques, l'hébergement cellules fluorescentes stromales et les cellules hématopoïétiques non-fluorescentes, à la préparation de coupes histologiques d'os non décalcifiées, l'acquisition d'images confocales couvrant l'ensemble de l'os, ainsi que l'analyse d'image automatisée de c cellulaireo-localisation et de sa validation / discrimination de positionnement aléatoire par un outil de simulation est fourni (figure 8).

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Protocol

Les expériences sur les animaux ont été approuvés par les commissions compétentes de l'État pour la protection des animaux (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) et ont été réalisées conformément aux lignes directrices actuelles et les règlements (licence d'expérimentation animale G0194 / 11).

1. Production de souris fluorescent moelle osseuse chimériques

REMARQUE: La production de souris chimériques fluorescent de la moelle osseuse de visualiser les cellules stromales de la moelle osseuse est effectuée comme décrit ci-9.

  1. Commencer à traiter Del-Cre x souris ROSA-tdRFP (souris exprimant la protéine fluorescente rouge tandem (de tdRFP) ubiquitaire 11-13) pour les préparer à l'irradiation. Vous pouvez également utiliser toute autre souche avec l'expression ubiquitaire de la protéine fluorescente. Administrer 1 mg / ml de néomycine et de 1 mg / ml de vitamines (A, D3, E, C) via l'eau de boisson, deux jours avant l'irradiation.
  2. Irradier souris deux fois avec 3,8 Gray avec une césium-137 gamma-irradiation wimince un intervalle de 3 heures. Pour cela, placez la souris dans une tarte cage d'irradiation approprié pour l'irradiateur respective.
    REMARQUE: Pour l'irradiation des souris, notre Institut ne nécessite pas d'anesthésie. Suivez politiques institutionnelles locales concernant l'anesthésie pour l'irradiation. Traiter les animaux avec 5 mg / kg par voie sous cutanée de carprofène (sc) par jour après l'irradiation se il ya des signes de douleur.
  3. Le lendemain, la reconstitution des souris par une injection intraveineuse de 3 x 10 6 cellules de moelle osseuse préparées à partir d'os longs de souris donneuses C57BL / 6 dans un tampon de transfert 9. Gardez les souris sur la néomycine et vitamines pour un maximum de deux semaines et de surveiller leur bien-être et de poids pendant cette période. Attendez au moins quatre semaines pour permettre la reconstitution du système immunitaire avant de commencer les traitements expérimentaux spécifiques (par exemple, la vaccination) 9.
  4. Sacrifiez souris et placez-les sur une planche de dissection, stériliser les jambes avec 70% d'éthanol. Euthanizsouris e conformément aux politiques institutionnelles locales. Notre Institut effectue dislocation cervicale.
  5. Utilisez une pince et des ciseaux pour enlever la peau des cuisses. Retirer le tissu musculaire pour exposer l'os fémoral. Luxer l'os fémoral de l'articulation de la hanche et du genou aide de pinces et ciseaux. Veillez à ne pas casser ou couper l'os.
  6. Retirez délicatement reste de gros morceaux de tissu musculaire et le cartilage de l'os en utilisant des ciseaux. Retirer le tissu musculaire restant en frottant l'os avec du papier absorbant de laboratoire. Recueillir les ossements nettoyés dans une boîte de Pétri avec du tampon phosphate salin (PBS).
  7. Fixer os fémoraux entières dans 4% de paraformaldehyde (PFA, microscopie électronique de qualité) pour 4 à 6 h.
  8. Jeter PFA et incuber os de 10% de saccharose dans du PBS O / N. Le lendemain, incuber les os de 20% de saccharose O / N. Le lendemain, incuber les os de 30% de saccharose O / N.

2. Cryosectioning of Bones

NOTE: Après une6-24 h dans 30% de saccharose, de geler les os et les cryosection selon la méthode de la bande de Kawamoto 14,15.

  1. Préparer un grand bécher (2000 ml de volume) avec de la glace sèche et d'acétone (environ 2: 1 ratio de volume, par exemple, 400 ml de glace sèche et 200 ml d'acétone) sous une hotte. Placez un petit gobelet (150 à 250 ml de volume) avec de l'hexane à l'intérieur (30 à 50 ml environ). Attendre que le mélange refroidir (environ 10 min, jusqu'à ce que le gel se affiche sur le côté extérieur du grand bêcher).
  2. Remplissez les ¾ de la cryomoule marqué avec Super Cryoembedding moyen (SCEM); placer soigneusement les os à l'intérieur jusqu'à ce qu'ils soient totalement immergés, en prenant soin qu'ils ne touchent pas les bords du moule. Avec de grandes pinces tenir le cryomoule dans le bécher avec le fond du moule vient de toucher la surface de l'hexane.
    1. Laissez les bords extérieurs du gel de SCEM (indiqué par l'opacité, cela prend environ 15 secondes). Puis déposez pleinement le moule dans l'hexane et laissez-freEze pour 1-2 min. Sortez l'échantillon congelé et envelopper dans du cellophane, puis une feuille d'aluminium (pour protéger l'échantillon de sécher et d'éviter l'exposition à la lumière). Conserver à -80 ° C jusqu'à cryosectioning.
  3. Pour cryosectioning des os fémoraux utiliser un lames de microtome et microtome standard pour les tissus durs.
  4. Réglez la température de l'échantillon et la lame du microtome à -24 ° C. Laissez l'échantillon se asseoir à l'intérieur du microtome pendant environ 15 minutes avant de couper.
    1. Fixer le bloc d'échantillons au titulaire de l'échantillon métallique avec SCEM ou la température de coupe optimale (OCT) moyen. Ajuster l'orientation du bloc si nécessaire. Couper l'échantillon jusqu'à l'os est complètement ouvert et la moelle est visible. Réglez l'épaisseur de coupe à 7 pm (jeter la première section).
    2. Correction d'un morceau de ruban adhésif Kawamoto avec le côté collant sur le dessus du bloc de l'échantillon à l'aide d'une spatule en bois recouvert de cuir cerfs. Par la suite, couper l'échantillon et tourner la bande de sorte que la section estpositionnée sur le côté supérieur. Transférer la bande à une lame de verre en utilisant une pince. Fixer la bande à la lame de verre avec du ruban adhésif Scotch.
  5. Laissez sections sécher pendant au moins 30 min et de les stocker à -80 ° C jusqu'à l'utilisation. Stocker les lames non colorées et non montés dans des boîtes de diapositives en plastique avec entretoises entre les diapositives simples afin d'éviter qu'elles collent ensemble. Lames colorées et montées peuvent être stockés pendant jusqu'à une semaine en carton dossiers de diapositives à 4 ° C.

Collection 3. Image

  1. Décongeler et cryosections tache selon des protocoles communs d'immunofluorescence neuf. Inclure un colorant nucléaire, par exemple, 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure (DAPI) pour visualiser l'intégrité des tissus.
    REMARQUE: Teinté, par exemple, pour DP de visualiser les cellules stromales (anti-DP-biotine anticorps et la streptavidine-Alexa Fluor 555), les éosinophiles de tache avec de rat anti-protéine basique majeure (MBP) anticorps et anti-rat-Alexa Fluor 647 anticorps , les cellules Bavec de rat anti-B220-Alexa Fluor 594 anticorps et PC avec la lumière anti-κ chaîne fluorescéine-isothiocyanate (FITC) et des anticorps anti-chaîne λ1-FITC lumineuse (détails de la procédure de coloration sont décrits dans 9).
  2. Montez coupes colorées: mettre une goutte de Fluoromount sur la section, puis couvrir avec un couvercle en verre feuillet n ° 1, tout en évitant soigneusement la formation de bulles d'air. Par la suite, effectuer microscopie confocale à balayage laser avec un instrument équipé de lignes laser appropriés pour la coloration.
  3. Pour enregistrer des images pour l'analyse automatisée co-localisation de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse avec des cellules stromales en utilisant l'outil Wimasis, appliquer les paramètres suivants:
    1. Utilisez un objectif 20X et un champ de vision de 708,15 x 708,15 um. Pour l'analyse automatisée, garder la taille de toutes les images cohérentes à 2048 x 2048 pixels (px) afin de maintenir les résultats comparables.
    2. Enregistrer une chaîne pour les structures stromales (par exemple, (par exemple, DAPI, 405 nm) et des canaux supplémentaires pour les cellules hématopoïétiques d'intérêt (par exemple, trois canaux, 488/594/633 nm pour les éosinophiles, les lymphocytes B et les PC).
    3. Enregistrez les images en utilisant la ligne moyenne 4 16. Idéalement, couvrent toute la section fémorale en prenant des images adjacentes simples. Sinon, prendre des photos non adjacentes de différentes régions de la moelle osseuse (diaphysaire ainsi que l'épiphyse).
      REMARQUE: Veillez à ne pas produire des chevauchements entre les images adjacentes (pour éviter les analyses répétées de cellules dans les zones de chevauchement).
  4. Enregistrez les images dans un format microscopie fichier image. Vérifier et, si nécessaire, régler le contraste pour tous les canaux dans le logiciel d'affichage / d'analyse.
  5. Export 3 fichiers .jpg par fichier image: un fichier .jpg pour le canal DAPI (rouge / vert / bleu (RVB) de format, fausses couleurs codées en jaune), un fichier .jpg pour le canal de stroma (niveaux de gris) et un .jpg fichier contenantles canaux de cellules hématopoïétiques (3 canaux maximales, le format RGB, par exemple, FITC (PC, fausse couleur: vert) / Alexa Fluor 594 (cellules B, fausses couleurs: bleu) / Alexa Fluor 647 (éosinophiles, fausses couleurs: rouge)) .

4. Analyse d'image automatisé

  1. Utilisez un outil d'analyse d'image pour effectuer la segmentation d'images, quantification de co-localisation et l'analyse de voisinage (voir Discussion).
  2. Si vous utilisez les outils Wimasis, procédez comme suit:
    1. Téléchargez les ensembles de trois fichiers .jpg par image avec le même nom de fichier suivi par un soulignement et un numéro indiquant le type de l'image.
    2. Utilisez _1 pour le fichier .jpg avec des cellules hématopoïétiques, _2 pour le fichier .jpg pour le canal DAPI, _3 pour le fichier .jpg pour le canal de stroma. Par exemple: Image1_1.jpg (cellules hématopoïétiques), Image1_2.jpg (canal DAPI), et Image1_3.jpg (canal de stroma). Télécharge les images via le compte client.
    3. En cas de contact de la cellule de quantificationchoisissez l'outil de contact de cellule en cliquant sur le champ correspondant. Pour voisinage cellulaire quantification, choisissez l'outil de voisinage cellulaire et entrer dans le rayon de voisinage préféré dans um (qui est mesurée à partir des bords des cellules).
    4. Télécharger les résultats.
      REMARQUE: Les résultats sont fournis sous forme de fichiers .jpg montrant les cellules hématopoïétiques et le canal de stroma avec les limites des objets détectés en surbrillance, ainsi que les fichiers .csv uniques contenant les mesures pour chaque image, en plus d'un résumé .csv fichier contient les données de tous les images téléchargées.
  3. De le contact mesures déterminent la fréquence des cellules hématopoïétiques (rouge, vert, ou cellules bleues) en contact avec les cellules stromales, ou les fréquences de cellules rouges, verts ou bleus en contact avec les autres types de cellules hématopoïétiques (un exemple est illustré dans Les résultats représentatifs , Figure 4). Afin de déterminer les fréquences, diviser les chefs d'accusation de contact donnés par image parla cellule totale compte par image.
    1. Pour les expériences avec des souris individuelles, résumer les chefs d'accusation de contact total de toutes les images pour les souris simples et de les diviser par la somme des chiffres totaux de cellules de toutes les images.
  4. A partir des mesures de voisinage, déterminer la fréquence des cellules rouge, verte ou bleue à l'intérieur de la distance sélectionnée à partir de cellules stromales et / ou les fréquences des globules rouges, vertes ou bleues dans le voisinage le plus pratique pour les autres types de cellules hématopoïétiques comme décrit à l'étape 4.3 ( voir aussi Les résultats représentatifs, figure 4).

5. Simulation de Random moelle osseuse Positionnement

  1. Avant d'exécuter les simulations de positionnement cellulaire aléatoire sur la moelle osseuse images histologiques analysés, préparer les fichiers suivants à l'avance: les fichiers .csv simples fournies par l'outil de contact de la cellule, les fichiers .jpg d'origine pour le canal DAPI et les fichiers .jpg d'origine pour le canal de stroma.
  2. Pour effectuersimulations de lots sur une série d'images (par exemple, toutes les images d'une section fémorale), recueillent tous les fichiers .jpg d'origine (_1, _2 et _3) et les fichiers .csv simples correspondants dans un seul dossier.
    REMARQUE: L'outil de simulation pour le positionnement des cellules de moelle osseuse aléatoire est disponible sur demande.
  3. Lancer l'outil de simulation, cochez la case "Auto-charge données d'image".
    NOTE: Le programme va lire les numérations cellulaires et taille moyenne des cellules à partir du fichier .csv automatiquement. Ces valeurs sont affichées dans les boîtes pour "Le nombre de cellules" et "AVG de taille de la cellule" (figure 5A).
  4. Entrez le tag commun pour les fichiers .csv, ce est à dire, le facteur commun dans leurs noms. Entrez le nombre de séries d'images qui devraient être utilisés pour la simulation en mode batch.
  5. Chargez le fichier .jpg généré par le canal de stroma (avec nom de fichier se terminant _3).
  6. Entrez les paramètres pour générer le masque du canal DAPI:
    1. Cochez la case "? Appliquer le masque "Régler le seuil pour convertir l'image DAPI dans un masque binaire à 10 (plage de 0 à 255).
    2. Cochez la case "8-bit?" Cochez la case "Homothétie?" Et réglez la note de la dilatation à 5 px. Cochez la case "w / érosion?".
    3. Entrer la valeur désirée pour le rayon de voisinage (rayon de voisinage) utilisés pour l'analyse des images simulées. Pour une image de 708,15 x 708,15 um avec une taille de 2048 x 2048 px (pixel échelle xy: 0,346 um), 29 px correspond à 10 um.
  7. Cochez la case "Utiliser Otsu?" Pour utiliser l'algorithme de Otsu 17 pour la détection automatique des structures stromales.
    NOTE: Ce est le même algorithme qui est utilisé par l'outil de contact et environs. Utilisant le même algorithme de segmentation d'image dans l'analyse automatisée de l'image enregistrée et l'image simulée est crucial afin de conserver les données comparables.
  8. Entrez les paramètres de cellules hématopoïétiques, laquelle Are simulé formes circulaires.
    REMARQUE: Les numéros de cellulaires pour les cellules rouges, verts et bleus sont chargés directement à partir du fichier .csv (voir aussi l'étape 5.6).
    1. Utilisation de l'outil de simulation pour calculer le diamètre moyen des cellules px rouge, vert et bleu. Déterminer la surface moyenne d'une cellule unique que la surface totale de chaque type de cellule dans l'image px divisé par le nombre total de cellules par image. Utilisez la zone moyenne pour calculer le rayon d'un disque à l'aide de la formule. Double du rayon de déterminer le diamètre moyen.
  9. Mesurer la distribution de la taille des cellules des types de cellules analysées avec un logiciel d'analyse d'image qui comprend des fonctions de segmentation d'objets. Déterminer σ pour tous les types de cellules hématopoïétiques (18 et la figure 5B).
    REMARQUE: Étant donné que les distributions de taille de cellule des cellules enregistrées ne sont pas déterminées par l'analyse d'images automatisée, en utilisant une distribution gaussienne comme une approximation des distributions réelles. La largeur de la tcourbe de distribution il est décrit par σ et peut être très différente pour les différents types de cellules. (Pour plus de détails, voir la figure 5B).
    1. A partir de ces mesures, déterminer le "seuil de taille de cellule": le diamètre en px qui décrit le plus petit objet encore reconnu comme une cellule complète par l'outil d'analyse d'image.
  10. Entrer des paramètres dans les boîtes respectives sur l'interface utilisateur graphique (figure 5A).
    1. Entrer la taille de la cellule coupée, ce est à dire, la taille de cellule minimum autorisée dans la simulation, comme un diamètre px.
    2. Entrée en px σ pour la simulation de la distribution de taille de cellule pour des cellules rouge, verte et bleue de l'étape (5.9).
    3. Cochez la case "Supprimer" dans le paragraphe "Les cellules de masque". Avec ce réglage, le programme choisira une nouvelle position pour une cellule se il chevauche au moins un pixel d'une zone de non-du masque. Cochez la case "éviter les chevauchements cellulaire? ̶1; dans le paragraphe "l'exclusion de cellule".
    4. Entrez la distance minimale autorisée entre les centres des deux cellules en px.
      REMARQUE: La distance minimale doit être déterminée à partir des images enregistrées. Tort distances minimales mesurées mèneront à des résultats biaisés / artificiel pour la comparaison d'images enregistrées et simulées.
    5. Définir la zone de chevauchement maximal de 100% si le chevauchement est définie par la distance minimale de centre à centre.
    6. Régler l'outil de simulation pour 1000 répétitions.
    7. Cochez la case "cellules Autosave?" Pour enregistrer les coordonnées des objets simulés pour toutes les répétitions de chaque image du lot en tant que fichiers .rect (format texte). Cochez la case "des images de sauvegarde automatique?" Pour enregistrer un fichier .tiff pour chaque image simulée. Entrez une étiquette commune pour les fichiers enregistrés.
      REMARQUE: Le "? Cellules Autosave" option réduit la simulation temps de fonctionnement et la taille globale de données, par rapport à lors de l'enregistrement de la réelle simulée images. Les fichiers .rect enregistrer les coordonnées des cellules simulées par des rectangles et peuvent donc être convertis en images simulées si nécessaire.
  11. Lancer la simulation en cliquant sur «simulation Exécuter".
    REMARQUE: L'outil de simulation génère automatiquement un fichier .csv pour les 1 000 simulations de chaque image, y compris les chefs d'accusation de contact moyennes et les chiffres de environs pour les globules rouges, verts et bleus avec des cellules rouges, vertes, bleues, et stromales pour chaque ensemble de simulations répétées . De plus, pour toutes ces valeurs, moyennes des 1 000 simulations avec déviation standard (STD) et l'erreur standard de la moyenne (SEM) sont fournis.
  12. Déterminer la moyenne des fréquences de contact et les fréquences de voisinage d'un ensemble de 1000 images simulées. Pour cela, diviser le contact moyen et compte de voisinage par le nombre de cellules enregistrées par image. Comparer les fréquences des résultats de l'analyse de co-localisation automatique de l'image enregistrée.
  13. Appliquer stati appropriéesméthodes stical fonction de l'analyse 19 (de la figure 7, nous avons utilisé un Wilcoxon bilatéral signé test de rang).

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Representative Results

Cryosections d'os non décalcifié de coupe avec la méthode de la bande Kawamoto permet à l'ensemble de l'os à couper en tant que partie intacte, avec de la moelle osseuse de la région endo-osseux encore attaché à l'os minéralisé, à la fois dans la diaphyse, ainsi que dans les zones de épiphysaires avec leur forte densité de l'os trabéculaire (Figure 1). Coloration nucléaire des sections révèle que, bien que de petites fissures dans la préparation ne peuvent pas être entièrement évités, la structure des sinusoïdes et les artères, ainsi que le réseau réticulaire du parenchyme reste intact.

A titre d'exemple d'une coloration par immunofluorescence de rouge fluorescent chimérique moelle osseuse et son analyse subséquente, une coloration pour les éosinophiles (protéine basique majeure, MBP), PC (κ et la lumière λ chaîne) et des cellules B (B220) est signalée. Les souris ont été immunisées avec 100 ug de 4-hydroxy-3-nitrophénylacétyl haptène couplé à γ-globuline de poulet (NP-CGG) dans de l'alun ip, 4 semaines aprèsreconstitution, un rappel avec 50 pg de NP-CGG dans PBS iv 21 jours plus tard et analysé sur 30 jours après le rappel. L'analyse d'image automatisée donné lieu à une reconnaissance très précise des structures stromales, y compris également très petits fragments de processus réticulaires. Étant donné que le nombre de cellules des cellules stromales ne peut être déterminée avec le système présenté ici (voir également discussion), pas de seuil de taille a été introduit pour la voie de stroma, afin de détecter tous les fragments dans les images (figure 2). PC et les éosinophiles sont plus grandes que les cellules B et montrent également une forme plus hétérogène. Tous les trois types de cellules ont été bien reconnu au premier coup d'œil. Amas cellulaires, notamment des cellules B, ont été bien séparés. L'outil d'analyse est optimisée pour les types de cellules mentionnés ci-dessus (PC, les eosinophiles, les lymphocytes B). Pour les autres types de cellules, des ajustements pourraient être nécessaires. Les fichiers .csv générés par l'outil de contact de cellules contiennent les mesures pertinentes suivantes pour les cellules hématopoïétiques:le nombre de cellules de chaque population cellulaire; surface totale pour chaque population de cellules dans px; nombre de contact des globules rouges (dans ce cas, les éosinophiles), les cellules vertes (ici PC) ou des cellules bleues (ici des cellules B) avec des cellules rouges, verts, bleus ou gris (cellules stromales). Les fichiers .csv générés par l'outil de voisinage de cellules contiennent les cotes suivantes pour les cellules hématopoïétiques: nombre de cellules de chaque population cellulaire; surface totale pour chaque population de cellules dans px; Nombre de voisinage de globules rouges, verts et bleus avec des globules rouges, verts, bleus, gris et (cellules stromales).

Afin de valider la qualité des outils d'analyse d'image, les résultats de l'analyse automatisée ont été comparées à celle d'un comptage manuel par six évaluateurs formés (figure 3). Tous les évaluateurs ont reçu des images identiques pour analyse. Structures stromales et les cellules hématopoïétiques ont été soigneusement décrites avec un outil d'analyse d'image et ces régions d'intérêt ont été enregistrées et analysées. Pour les structures stromales, la superficie totale par imagea été comparée entre l'analyse automatique et manuel. Structures stromales semblaient être difficile pour les évaluateurs formés pour reconnaître précisément, comme en témoigne la grande variance observée pour la taille de la superficie totale du stroma comptés manuellement (figure 3A). Ici, l'analyse automatisée déterminé une valeur proche de la surface moyenne détectée par des évaluateurs formés. Pour toutes les cellules, l'outil d'analyse automatisée détermine une quantité légèrement plus faible de cellules comptées que manuellement. Toutefois, pour les PC et les éosinophiles, le nombre était encore dans la gamme de la variance interjuge observée pour les comptages manuels. Le nombre de cellules B détectées par analyse automatisé était toutefois légèrement inférieure à cette gamme (Figure 3A). La taille moyenne des cellules (zone en px) telle que déterminée par l'analyse automatisée était 512 px pour les PC, 436 px pour les éosinophiles, et 317 px pour les cellules B, tandis que les évaluateurs formés ont déterminé une taille de 515 px pour les PC, 464 px pour les éosinophiles, et pour 291 px cellules B. Ainsi, la moyenne cell taille pour les cellules B, les PC et les éosinophiles déterminées par l'analyse automatisée était comparable à la taille des cellules moyennes déterminées par des évaluateurs manuelles (figure 3B). Cet outil d'analyse d'image automatisée peut maintenant être utilisé pour quantifier les contacts directs de types de cellules de candidat niche os de moelle. En outre, la fréquence des cellules d'un type cellulaire de cellules stromales voisins ou d'autres types de cellules hématopoïétiques peut être déterminée. Une analyse des ordinateurs de la moelle osseuse et leurs contacts de cellules stromales, les éosinophiles, les lymphocytes B, et d'autres ordinateurs est représentée, ainsi que la fréquence des ordinateurs voisins, ces types de cellules à l'intérieur de 10 um et 20 (figure 4A). De plus, les fréquences de contact de différents types de cellules hématopoïétiques avec stroma peuvent être quantifiés (figure 4B).

Avant d'effectuer une simulation de positionnement de la moelle osseuse aléatoire de ces cellules avec l'outil de simulation, les paramètres qui décrivent la distribution de la taille des cellules en tant que GausRépartition sian à être déterminée. Pour une distribution de Gauss, qui peut être visualisée sous la forme d'une courbe «en cloche», et symétrique, seuls deux paramètres doivent être déterminés: l'emplacement du centre de la courbe (le mode, ce est à dire, lorsque le pic de la courbe se trouve ) et la largeur de la courbe symétrique (ce est décrit par le paramètre σ susmentionné). Cette procédure est montrée ici pour les PC, les éosinophiles et les lymphocytes B (figure 5B). Mesurées distributions de taille de cellule indiquent que, pour les cellules B, la largeur de la courbe de distribution décrite par σ est plus faible que pour les PC et les éosinophiles. Pour la simulation, les valeurs relatives de σ mesurée pour les trois populations de cellules ont été maintenues (par exemple, les cellules B ont toujours été simulés par une distribution de deux fois plus étroite de la taille de celle de PC »et éosinophiles), tandis que les valeurs de σ définis dans px étaient ensemble pour correspondre à l'apparence visuelle des cellules enregistrées (Figure6B). Cela nous a conduit à appliquer une σ de 2 px pour les cellules B et σ de 4 px pour les PC et les éosinophiles. Le seuil de coupure de la taille des cellules a été déterminée à partir des distributions de mesure de la taille des cellules. Pour les PC et les éosinophiles, une coupure à 300 px taille de l'objet, résultant en 20 px diamètre pour un objet circulaire (environ 7 um) et pour les cellules B une coupure à 220 px, conduisant à un diamètre de 17 px (environ 6 um) a été utilisé pour la simulation.

Afin de définir les zones dans l'image aléatoire simulé où les cellules sont autorisés à être placé par l'outil de simulation, un masque a été généré à partir des signaux nucléaires dans le canal DAPI d'une image histologique de la moelle osseuse (figure 6A). Une valeur de 10 a été déterminé comme le seuil d'intensité optimale pour générer les images binaires (panneau supérieur, image de droite). Le seuil déterminé par l'algorithme de Otsu ne conduit pas à la pleine reconnaissance de tous les noyaux dans l'image (panneau supérieur, image du centre), de façon similaire à intensité fixeseuils de 50 ou 150 (panneau inférieur, gauche et image du centre) .La pertinence des contacts de PC, les éosinophiles, ou des cellules B avec des cellules stromales (figure 4B) a été testé en utilisant l'outil de simulation (figure 7). Cette analyse a révélé des taux significativement plus élevés de contact dans les images enregistrées par rapport à la simulation pour les PC et les cellules B (figure 7A), en ligne avec le concept de niches stromales l'appui de ces populations. Cela a été confirmé dans 5 individuels souris chimériques fluorescentes (Figure 7B, D). En revanche, aucune différence nette a été déterminée dans le cas d'eosinophiles (Figure 7A, C).

Figure 1
Figure 1. Vue d'ensemble image de fluorescence d'une coupe longitudinale d'un fémur murin cryosectioned avec la méthode de la bande de Kawamoto. La méthode du ruban permet cuttindes sections de g avec une région endo-osseux intact, à la fois dans la diaphysaire ainsi que dans les zones de épiphysaires, à partir d'os non décalcifié. A 7 pm section osseuse épaisse d'une naïve souris C57BL / 6 a été coloré pour la protéine de la matrice extracellulaire laminine (rouge), pour Sca-1 pour visualiser les artérioles (vert) et pour les noyaux (bleu, DAPI). 47 tuiles de 1446 x 1088 um, résolution 1360 x 1024 px ont été enregistrées et cousu pour créer l'image aperçu. Cette image a été acquise sur un microscope à fluorescence grand champ, avec un objectif 10X (0,45 NA). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. automatisé de détection de cellules stromales et hématopoïétiques de la moelle osseuse. Une section de fémur d'un rouge fluorescent chiMeric souris sur 30 jours après rappel a été colorée pour DP (gris) pour visualiser stroma, MBP (rouge, éosinophiles), κ et λ chaîne légère (vert, PC) et B220 (bleu, cellules B). Gauche: Image d'origine acquis sur un microscope confocal, en utilisant une lentille objectif 20X (0,8 NA) et un champ de vision de 708,15 x 708,15 um. À droite: image segmentée. Les contours des objets reconnus sont mis en évidence. Les rectangles blancs marquent la zone indiquée sur les images de fond. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Validation de l'analyse d'image automatisée par des évaluateurs formés. (A) Superficie totale des structures stromales et le nombre total de cellules de cellules hématopoïétiques comptés par des évaluateurs formés dans une (structures stromales), 10 (PC), deux (eosinophiles) et une image (cellules B) par rapport aux nombres de cellules obtenues par analyse d'image automatisée. Les points représentent les évaluateurs individuels (n = 5-6). Les barres indiquent les valeurs moyennes ou les valeurs déterminées automatiquement. Distribution de taille (B) d'objets d'objets comptés manuellement par rapport à la taille moyenne de l'objet déterminé par l'analyse automatisée. Afin de tenir compte des différentes fréquences des différents types cellulaires, les ordinateurs ont été comptées dans 10, en deux éosinophiles et les cellules B dans une image. Les points représentent des objets individuels. Les lignes indiquent moyenne. (C) exposant Manuel des structures stromales par des évaluateurs formés. Gauche: image d'origine. Moyen: exemples d'images analysées manuellement. Droite:. Structures stromales détectées par analyse automatisée Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4. Analyse automatisée de co-localisation de PC, les éosinophiles, les lymphocytes B et les cellules stromales de la moelle osseuse du fémur. (A) Gauche: Fréquence des PC en contact direct avec les structures stromales, les éosinophiles, des cellules B ou d'autres ordinateurs chez la souris chimérique fluorescente sur 30 jours après le rappel. Milieu et à droite: Fréquence de PC dans 10 um ou 20 um voisinage voisinage de structures stromales, les éosinophiles, des cellules B ou d'autres PC. Certaines parties de ce chiffre (contact direct, 10 um environs) sont modifiés à partir Zehentmeier et al. 9 (B) Fréquence de PC, les éosinophiles et les lymphocytes B en contact direct avec les structures stromales. 52-515 PC, 918-3179 éosinophiles, de 4146 à 13063 cellules B dans 10 à 21 images ont été comptés à partir de 5 souris chimériques fluorescentes sur 30 jours après le rappel, mis en commun à partir de deux expériences indépendantes. Les points représentent les souris individuelles. Les lignes indiquent la médiane.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "Target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Détermination de la distribution de la taille des cellules de la moelle osseuse PC, les éosinophiles et les cellules B. (A) Capture d'écran de l'interface utilisateur graphique (GUI) de l'outil de simulation. (B) La distribution de la taille des cellules (zone en px) de PC (κ et de la lumière λ chaîne, vert), éosinophiles (MBP, rouge) et les cellules B (B220, bleu) est affiché en histogrammes, mesurée après avoir objet la reconnaissance par le logiciel Volocity (panneau supérieur). Dans les images de la moelle osseuse du fémur (panneau inférieur), détectés PC sont marqués en rouge (superposer jaune), les éosinophiles en bleu (superposition violet) et les cellules B en jaune (superposer gris). Segmentation de l'image a été réalisée en fixant un seuil de taille minimale de 180 px pour les PC,300 pour les éosinophiles px px et 220 pour les cellules B. 250 objets ont été mesurés pour PC, 650 objets pour éosinophiles et 3000 objets pour les cellules B. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Génération du masque pour le positionnement de la cellule aléatoire simulé. (A) Le canal original DAPI (jaune), ainsi que des superpositions avec DAPI images binaires générées en appliquant différents seuils sont représentés. Le masque généré à partir de l'image binaire (seuil fixé à 10) est affiché ci-dessous (panneau inférieur, image de droite). Les zones noires représentent zones interdites, les zones blanches L'image enregistrée représentent des zones où les cellules sont autorisés à être placé. (B) (à gauche) et l'image simulée correspondant (à droite) montrent une forte visuellesimilarité. Éosinophiles (MBP), PC (κ et de la chaîne λlight), les cellules B (B220) et des cellules stromales (RFP) sont affichés. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Le contact direct de types de cellules hématopoïétiques avec les structures du stroma dans des images simulées enregistrées vs. (A) Fréquence de PC, les éosinophiles et les lymphocytes B en contact direct avec stroma dans simulé par rapport aux images enregistrées de souris chimérique fluorescente sur 30 jours après le rappel. Connecter les lignes correspondant simulées et les images enregistrées (points). Images d'une souris représentant sont présentés dans chaque parcelle. (B) les fréquences de PC, les éosinophiles et les lymphocytes B en contact direct avec stroma dans simulé par rapport aux images enregistrées 5 souris individuelles à partir de deux expériences indépendantes. Wilcoxon test de rang, deux de Virginie (PC: *** p = 0,0001; p = 0,0371 * *; p = 0,0161; p = 0,0012 ** ****; p <0,0001; éosinophiles: *** p = 0,0007 ; p = 0,1055; p = 0,0161 *; p = 0,4143; p = 0,0007 ***; cellules B: **** p <0,0001; ** p = 0,0020; p = 0,0005 ***; ** p = 0,0012 ; **** p <0,0001). Les points représentent les images individuelles. Les barres indiquent moyenne. Les valeurs P de 0,05 sont considérées comme des différences significatives. Les astérisques dans les chiffres indiquent les valeurs suivantes: P ns: p> 0,05; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001; ****: 0,0001 p. Certaines parties de ce chiffre (contact direct de PC avec des structures stromales) sont modifiés à partir Zehentmeier et al. 9 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

700 "/>
. Figure 8. flux de travail complet de l'approche de quantification des cellules hématopoïétiques - interactions cellulaires stromales de la moelle osseuse murine L'approche est divisé en trois grandes parties: 1. sections de la moelle osseuse de souris sont préparés et données brutes sont recueillies par microscopie à balayage laser confocal, 2 . l'analyse automatisée des images enregistrées et la simulation de positionnement aléatoire des cellules de moelle osseuse est effectuée, 3. Les chiffres de contact et de voisinage obtenus à partir des images enregistrées et simulées sont comparées. L'entrée (fichiers d'image) et de sortie (fichier texte) de l'analyse automatisée est indiqué en bleu, l'entrée (fichiers d'image) et de sortie (fichiers texte et, éventuellement, des fichiers d'image) de l'outil de simulation est indiqué en vert. Se il vous plaît cliquer sur ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Malgré les progrès dans les méthodes modernes d'imagerie optique, l'analyse des données histologiques est encore souvent entravé par le manque d'outils de quantification appropriés et des méthodes, ou par des analyses biaisées qui se concentrent sur une petite zone d'intérêt. L'approche synergique présenté ici combine l'analyse d'image couvrant la région de la moelle osseuse entière, la segmentation automatique et la reconnaissance d'objets de divers types de cellules hématopoïétiques et stromales, des analyses de co-localisation, et, enfin, un outil de validation de contacts non aléatoire se produisant fournies par une nouvelle sur mesure un logiciel de simulation conçu.

L'histologie des os entiers, y compris la moelle osseuse a été difficile à réaliser en raison des différentes densités des tissus présents dans une section - d'une part la très dur, os minéralisé, d'autre part la moelle extrêmement fragile, qui obtient facilement perturbé à la coupe avec l'os. Comme alternative, la méthode de bande pour couper les sections osseuses pres14,15 ENTED ici présente l'avantage qu'il stabilise le tissu, en laissant ainsi les zones d'endo-osseux intact (figure 1). En plus d'être riche en ostéoblastes, ces domaines ont été suggérés pour jouer un rôle dans l'entretien des cellules souches 20.

Le rôle crucial des cellules stromales dans les processus de développement et de maintenance cellulaire dans la moelle osseuse est de plus en plus évidente. Toutefois, l'analyse de ces cellules rares, fragiles se est avéré être difficile pour deux raisons: d'abord, ils sont difficiles à isoler de la moelle osseuse; secondes, le degré d'hétérogénéité de la population stromale ne est pas connu, et donc on pourrait manquer une importante population en utilisant certains marqueurs qui ont été décrites pour les cellules stromales. Procédé pour générer des chimères de moelle osseuse fluorescentes est utile de marquer par fluorescence et ensuite analyser la population de cellules stromales de moelle osseuse dans son ensemble. Toutefois, il convient de noter que dans ces miCE Tous les cellules mésenchymateuses de la moelle osseuse sont visualisées, y compris les cellules endotheliales et les ostéoblastes. Ceci doit être pris en compte si les données provenant de ces souris chimériques sont analysées. Même si il ya aussi un risque de cellules hématopoïétiques d'origine bénéficiaire survivants l'irradiation, ces cellules généralement ne couvrent qu'une très petite zone par champ de vue par rapport à la CD45 + cellules du donneur, donc pas affecter l'analyse histologique neuf. De toute évidence, cette méthode doit être combiné dans une étape ultérieure avec une détection plus précise des stromales (sous-) populations. Actuellement, l'analyse de ces cellules se fait principalement par histologie pour les raisons mentionnées ci-dessus, imposant une limite sur le nombre de paramètres qui peuvent être analysés en même temps. Le développement de multi-paramètre analyses en microscopie aidera à surmonter ces limites.

Lors de l'analyse d'image, la segmentation est effectuée en utilisant l'algorithme de Otsu origine. EssentiellementCette méthode de seuillage basée clustering détermine automatiquement le seuil d'intensité pour la séparation optimale de l'avant-plan (signal) et de fond (bruit) en deux groupes de pixels avec la divergence statistique le plus bas dans un canal donné, résultant en une image binaire 17. Ici, la méthode d'Otsu a été appliqué à la version naturelle de logarithme de l'image d'origine, à savoir:

l'image d'entrée pour Otsu = ln (Image d'entrée)

Cela fonctionne mieux pour les images de fluorescence depuis la méthode d'Otsu peut identifier les cellules sombres comme arrière-plan. L'ajout de la fonction logarithmique permet une meilleure séparation des cellules et le fond en deux classes différentes par l'algorithme de Otsu. Cependant, un seuil d'intensité ne est pas suffisante pour détecter précisément des objets uniques. Il fonctionne de manière efficace lors de la détection des objets bien séparées dans les images, mais il ne est pas suffisante pour des cellules individuelles situées au sein des clusters. Comme certains des types de cellules quiont un intérêt pour nous, comme éosinophiles ou des cellules B, sont souvent regroupés dans le tissu, les noyaux dans le canal DAPI ont été segmentés en utilisant un algorithme basé sur le regroupement de l'histogramme d'intensité avec k = 10 21. Le moyen de k- algorithme de segmentation cellulaire tracera les plus brillants aux pixels plus obscures (regroupés dans 10 bacs) et constamment rechercher la formation d'objets de cellules ressemblant. Ces objets seront ensuite définies comme cellules. Quand tous les pixels ont été utilisés, les noyaux résultants sont dilatées pour générer un masque qui est ensuite appliqué sur les autres canaux pour la séparation de la grappe.

Il convient de noter que cette analyse fonctionne bien pour des cellules hématopoïétiques qui sont compacts, mais qu'elle est limitée par rapport aux cellules stromales, comme il ne est pas possible de déterminer les frontières de ces grandes cellules, étalé en raison de l'interconnexion de leur prolongements dendritiques qui forment un réseau réticulaire. Ainsi, compte cellule pour les cellules stromalesne peut pas être fourni. Étiquetage des cellules individuelles via journalistes sort de cartographie sous le contrôle de promoteurs spécifiques de stroma permettra de résoudre ce problème, selon ce qui a été publié pour les neurones (en utilisant le "Brainbow« système 22) et pour l'étiquetage des cellules dendritiques folliculaires dans les ganglions lymphatiques 23.

En plus d'appliquer une étape de réduction du bruit à tous les canaux en excluant les objets ci-dessous 30 px, exclusion de taille a été appliqué dans le processus de reconnaissance d'objet pour hématopoïétiques mais pas stromales cellules. De petits fragments de cellules qui ont été coupés en sectionnant peuvent être exclus; Toutefois, la perte peut être négligée dans ce cas en faveur d'une reconnaissance sans équivoque des cellules. L'extension de l'analyse et la simulation de deux à trois dimensions permettra de surmonter cette limitation. Le développement de méthodes pour étudier la distribution cellulaire dans les montagnes entières, par exemple, par microscopie de photons multiples ou la lumière feuille microscopie / SPIM, va certainement aider à ece est le respect. Afin d'étudier la composition cellulaire complexe de niches multi-composants, il deviendra également nécessaire d'étendre le nombre de paramètres qui sont en cours d'analyse in situ. Des approches prometteuses pour l'analyse multiparamétrique de l'information histologique en combinaison avec cytométrie quantification ont été publiés récemment 24, 25.

L'analyse de contact a été effectuée en quantifiant le chevauchement de deux objets. Le contact direct a été défini comme un recouvrement d'au moins un pixel. Fait important, cette analyse est limitée par la résolution des images de microscopie et dépend donc de la longueur d'onde et le mode d'excitation, ainsi que sur l'ouverture numérique de la lentille d'objectif utilisée dans le microscope, et la taille sténopé. Dans l'analyse présentée ici, un objectif de 0,8 NA, 20X avec des combinaisons de fluorochrome excité avec 488, 561, 594 et 633 nm en utilisant une excitation photonique a été appliquée. Par conséquent, la résolution latérale valeurs entre0,372 et 0,483 pm ont été atteints. Cela permet assertions être faites sur la juxtaposition de différents sous-ensembles de cellules; toutefois, il ne donne aucune information sur les mécanismes moléculaires putatifs impliqués dans les interactions cellulaires. En outre, d'autres méthodes telles que deux photons microscopie intravitale sont nécessaires pour améliorer la caractérisation de ces contacts intercellulaires neuf. Transfert d'énergie (FRET) systèmes-based Förster-résonance peuvent aider à confirmer si ces interactions sont réellement fonctionnelle 26.

Afin d'évaluer le microenvironnement cellulaire de niches de tissu, il est non seulement important d'analyser les contacts cellulaires directs mais aussi de quantifier les types de cellules dans le voisinage d'un certain type de cellules d'intérêt («analyse de voisinage»). Auparavant publié des études distances entre les cellules et les structures tissulaires telles que mesurées navires fonction de la position du noyau 27. Comme nous étions intéressés à déterminment la distance de divers types de cellules, en partie avec des ratios de nucléaire variant au volume cytoplasmique, nous avons préféré pour mesurer la distance entre les surfaces. À cette fin, nous avons calculé le rayon de voisinage en déterminant la distance euclidienne à partir d'une limite cell's après la conversion des valeurs de pm à px. La distance euclidienne est la distance en ligne droite entre deux pixels et peut être décrit par la formule 28:
Equation 1

Les cellules avec des pixels à l'intérieur de leurs limites d'une distance euclidienne par exemple, 10 um à partir des pixels des frontières de l'une cellule cible ont été comptés en tant que voisin de cette cellule.

Dans sa forme actuelle, l'analyse ne détermine si une cellule est mise en contact ou approché par une autre cellule du type identique ou différent, donc un seul binaire OUI / NON caractérisation. Le nombre réel de celluless qui sont en contact la cellule d'intérêt ou sont dans un certain rayon de celle-ci ne est pas calculé. L'étape suivante consiste à étendre l'analyse actuelle de manière que la taille du groupe de mise en contact ou des cellules voisines peut être détectée et comparée entre les différentes cellules cibles du même type. Cela conduira à des informations importantes concernant la composition des niches de la moelle osseuse, comme la niche de survie pour les cellules plasmatiques de la moelle osseuse, pour lequel une contribution variable de cellules hématopoïétiques accessoires a été discuté 29-33.

Les algorithmes de reconnaissance d'objets ont été optimisés avec les spécialistes de Wimasis utilisent leur service de solution personnalisée disponible dans le commerce et sont disponibles sur demande. Une autre option est d'utiliser soit des logiciels disponibles dans le commerce pour l'analyse d'image, tels que Definiens, Volocity ou Imaris ou freeware comme CellProfiler.

La segmentation de la cellule et d'analyse d'image des outils automatisés nousre validé en comparant leurs résultats avec les données analysées manuellement fournies par six évaluateurs formés d'image par rapport à deux paramètres, à savoir la taille de l'objet et le nombre de cellules dans diverses populations de cellules. Comme le montre la figure 3B, la taille de l'objet en moyenne pour les cellules hématopoïétiques (de PC, les éosinophiles et les lymphocytes B) était similaire entre les deux méthodes, avec une variance plus élevée pour la détermination de la taille manuelle des cellules plasmatiques et les éosinophiles, probablement en raison de leur forme plus irrégulière comparée aux cellules B. La détection automatique du nombre de cellules a donné des valeurs légèrement plus faibles que ceux détectés manuellement. Notamment, ils étaient encore dans la fourchette des valeurs manuelles dans le cas des éosinophiles et des PC, alors qu'ils étaient en dessous de ces valeurs dans le cas des cellules B, probablement dû à une hétérogénéité d'expression plus élevé du B220, qui a été utilisé comme marqueur pour les cellules B. B220 est connue pour être régulée à la hausse au cours de la différenciation des cellules B dans la moelle osseuse et les cellules B à faible ainsi que de haute intensity coloration pour B220 peut être observée. cellules B avec des signaux faibles de B220 ont chuté en dessous du seuil appliquée, qui peut avoir conduit à l'exclusion des cellules plus tôt-étape b. Un seuil inférieur pour la détection automatisée peut résoudre ce problème. Pour les cellules stromales, qui sont plus difficiles à détecter en raison de leur moins compact, plus dendritique, et la morphologie étendu, la détection manuelle entraîné élevés écarts entre les évaluateurs individuels. Fait intéressant, la superficie totale moyenne de stroma était égale à la superficie totale déterminée automatiquement, ce qui indique que l'analyse est bien adapté pour compenser préjugés individuels par les évaluateurs. Pris ensemble, ces données montrent que les résultats automatisés représentent généralement les valeurs moyennes des analyses manuelles et sont bien adaptés pour réduire la variabilité inter-juges dans l'analyse.

Afin de discriminer positionnement aléatoire et non aléatoire des cellules à l'intérieur des limites structurelles du tissu, un outil de simulation a été développé. Durtion de la simulation, une image artificielle à l'aide des cellules hématopoïétiques positionnées de manière aléatoire est créé pour chaque image enregistrée histologique de la moelle osseuse. En premier lieu, l'image du canal de stroma est utilisé dans son format d'origine. Un masque est générée à partir de l'image DAPI par application d'un seuil basé sur l'intensité déterminée, convertissant ainsi l'image en format binaire; le masque binaire subit ensuite plusieurs étapes de la dilatation et l'érosion à base de pixels. Le masque définit les zones dans le domaine de l'image où les cellules simulées sont autorisés à être placé. Les coordonnées des centres des cellules simulées sont fournis par un générateur de nombre aléatoire uniforme, dont les limites où déterminées par la taille de l'image. Information sur le nombre de cellules et la taille moyenne des cellules de chaque population déterminée par analyse d'image automatisée des images enregistrées sont utilisées pour définir les populations de cellules hématopoïétiques simulées. Le diamètre de la cellule de simulation est supposée suivre une distribution gaussienne unidimensionnelle à partir duquel le véritablediamètre des cellules est choisi au hasard: Le diamètre est ensuite modifié de sorte que la taille des cellules seuils pour la taille minimale de l'objet admissible sont introduits. Dans le cas de la cellule simulée serait positionné de telle sorte qu'un ou plusieurs pixels se chevauchent avec une zone de non-ou seraient à une distance prédéfinie d'une autre cellule déjà placé (4 um de centre à centre tel que déterminé dans les images enregistrées), nouvelles coordonnées aléatoires on choisira alors que le diamètre est laissé inchangé. Ceci sera répété jusqu'à ce que le nombre de cellules simulées égal au nombre de cellules dans l'image enregistrée.

L'outil a été fondée sur l'hypothèse que les cellules hématopoïétiques peuvent être positionnés librement à l'intérieur de la moelle osseuse, tandis que les structures stromales agissent comme une matrice fixe à l'intérieur du tissu. L'outil a été optimisé pour la situation dans la moelle osseuse où les zones parenchymateuses sont traversés par un système complexe de sinusoïdes. Une approche de modélisation similaire a été récemment publié par Frenette et ses collègues pouranalyser le positionnement des cellules souches hématopoïétiques par rapport à des cellules stromales et des structures vasculaires, qui représentent environ 30% du volume de la moelle osseuse fémorale totale 25. Pour corriger cet effet, l'outil de simulation présenté ici est basé sur un masque de zones ont été cellules sont autorisés à être placé. Ceci a été réalisé en utilisant une image de colorant nucléaire, dans lequel les objets représentant les noyaux ont été élargis par une dilatation de 5 l'étape (voir figure 6) après binarisation. Les zones à faible densité cellulaire, ce est à dire, une faible densité de noyaux tels que les os et sinusoïdes, ne contribueront pas à le masque et donc devenir no-go zones. Afin d'éviter une réduction artificielle de ces zones de non-par la procédure de dilatation, une érosion cinq étapes a été appliquée par la suite, ouvrant ainsi à de plus grandes zones d'exclusion, tout en laissant la forte densité nucléaire (d'où «autorisé») zones inchangée. Ce procédé peut être facilement adapté à d'autres organes lymphoïdes. Dans les tquestions étaient cette méthode pourrait ne pas fonctionner (par exemple, dans les zones où les cellules avec un ratio élevé cytoplasme / noyau sont présents), d'autres méthodes telles que l'étiquetage cytoplasmique peuvent être utilisés pour créer le masque.

Les cellules hématopoïétiques ont été simulés en tant qu'objets circulaires dont la taille a été déterminée en utilisant un générateur de nombre aléatoire gaussienne, dont la moyenne d'accord avec le diamètre moyen calculé de chaque type de cellule. La largeur de la distribution est basée sur mesurées distributions de taille de cellule dans des images enregistrées telles que déterminées par un logiciel d'analyse d'image. Afin de tenir compte du fait que de petits fragments cellulaires ont été exclus de l'analyse d'image automatique, la taille des cellules des seuils ont été introduites comme déterminé à partir des distributions de taille de cellule mesurée pour chaque type de cellule (voir figure 5).

Naturellement, cela fonctionne bien pour des types de cellules qui sont relativement uniformes en taille et leur forme, mais peut conduire à des problèmes dans le cas de cellules qui are très hétérogène par rapport à ces paramètres. Il convient de noter que cette analyse est optimisée pour les principaux types de cellules hématopoïétiques dans la moelle (granulocytes, lymphocytes et des progéniteurs hématopoïétiques) osseuse, qui ont en commun le fait qu'ils possèdent une forme régulière, presque arrondie. Cependant, cette méthode n'a pas été testé pour les cellules dendritiques ou des macrophages, des types de cellules avec des organismes cellulaires fortement irréguliers. L'analyse de ces cellules vont présenter de nouveaux défis à notre analyse d'image automatisée ainsi que l'approche de simulation, y compris la nécessité d'améliorer la grappe de cellules séparation algorithmes 24 ainsi que la forme-analyse détaillée et simulation de non seulement les cellules différemment de taille mais aussi de forme différente. Une alternative serait une approche de simulation qui fonctionne avec les formes exactes comptabilisées. Cependant, il faut noter que cette méthode augmenterait de manière significative le comportement déterministe du système modèle.

Pour l'expé simuléep é riences, 1000 répétitions de la simulation pour chaque image enregistrée ont été générés. En utilisant ce nombre de répétitions permettra de réduire l'erreur relative apportés par le processus de simulation elle-même à environ 3%. A savoir, si les valeurs de cellule à cellule co-localisation est calculé à partir de simulations qui sont aléatoires, alors le processus de simulation elle-même sera caractérisée par une fonction d'erreur -1/2 N, où N est le nombre de simulations par image mesuré. Ce est la contribution du procédé de simulation elle-même à l'erreur cumulée des valeurs de co-localisation de mesure. Ainsi, pour N = 1 000 l'erreur contribué est 3,16%. Les simulations présentées ici couru pour 20 à 60 min par image et par mille répétitions lorsque seul l'enregistrement des images simulées en tant que fichiers .rect (un format texte simple) plutôt que des images que réels au format .jpeg ou .tiff (également une option dans le logiciel ).

Pris ensemble, cette approche permet un impartiale, analyse à haut débit de l'image histologiques et permet la production de données pertinentes sur le plan statistique. Cela peut être utile pour comparer la localisation cellulaire dans des conditions différentes. En outre, le composant temporel dans le futur peuvent être intégrés dans une approche de modélisation des mouvements de cellules de moelle osseuse, que de nouvelles données sur la motilité des divers types de cellules dans la moelle osseuse devient disponible. Ce procédé peut ensuite être utilisé pour simuler des perturbations du système, telles que la mobilisation de cellules de la moelle osseuse dans la circulation, par exemple, les neutrophiles dans le cas d'une inflammation aiguë 34. Pour élucider la fonction de la moelle osseuse comme un lieu de stockage pour les cellules de mémoire immunitaire, on peut aussi imaginer l'étendre à modéliser la concurrence pour les facteurs de survie. En outre, la diaphonie possible entre niches distinctes pourrait être abordée, ainsi que l'induction de niches. Ensemble, cela aidera à comprendre les changements physiologiques (par exemple, les déclencheurs du comportement de régénération dans les cellules souches) que well que les perturbations pathologiques du système dans son ensemble, par exemple dans le cas de maladies auto-immunes, néoplasie, ou inflammation aiguë. Dans le cadre d'un concept itératif de l'expérience et de la modélisation, de nouvelles hypothèses peuvent être générés sur la base des simulations, qui à leur tour peuvent à nouveau être testés expérimentalement, contribuant ainsi à mieux comprendre le fonctionnement et l'interaction des différents types de cellules à l'intérieur de la complexité des tissus.

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Acknowledgments

Nous remercions Andreas Radbruch pour des discussions intéressantes. Nous sommes reconnaissants à Sabine Gruczek, Patrick Thiemann et Manuela Ohde de l'aide pour les soins aux animaux et Robert Günther pour une excellente assistance technique. Nous remercions nos évaluateurs formés Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florence Pache et Katharina Corne de l'évaluation des échantillons histologiques et Randy Lindquist pour la relecture du manuscrit. Nous remercions J. et N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, Etats-Unis pour des anticorps spécifiques MBP.

Ce travail a été soutenu par DFG HA5354 / 4-1, par-JIMI une subvention de réseau d'installations de base pour la microscopie intravitale DFG et en TRR130 / TP17, et la DFG POUR 2165 (HA5354 / 6-1) pour AEHSZ a été soutenue par l'International Max Planck l'école pour les maladies infectieuses et l'immunologie (IMPRS-IDI), Berlin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neomycin Sigma N6386 SIGMA Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC Serumwerke Bernburg 1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin) Sigma P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg Rockland D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade) Science Services 15713 EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose Carl Roth 4621.1
Dry ice
Acetone Sigma-Aldrich 179124 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane Sigma-Aldrich 208752 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard) Sakura 4557 25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583
Kawamoto's SCEM embedding medium Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit  Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9) Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile Thermo Scientific 3052835 L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated Rockland 600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin Life Technologies S-32355
Rat anti-MBP J. and N. Lee available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647 Life Technologies A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594 produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium DAKO S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) Carl Roth H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm) VWR 48311-703
Laser scanning confocal microscope equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow Wimasis, Munich The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime Microsoft free download
Simulation tool for random cell positioning available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software  free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).

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References

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Automated quantification des cellules hématopoïétiques - Interactions cellulaires stromales dans les images histologiques de décalcifiées os
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Zehentmeier, S., Cseresnyes, Z., Escribano Navarro, J., Niesner, R. A., Hauser, A. E. Automated Quantification of Hematopoietic Cell – Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone. J. Vis. Exp. (98), e52544, doi:10.3791/52544 (2015).

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