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Developmental Biology

Hematopoietic सेल की स्वचालित मात्रा - Undecalcified अस्थि के histological छवियाँ में stromal सेल सहभागिता

Published: April 8, 2015 doi: 10.3791/52544
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 2, 1,5
1Immunodynamics, German Rheumatism Research Center, a Leibniz Institute, 2Biophysical Analytics, German Rheumatism Research Center, a Leibniz Institute, 3Max-Delbrück Center for Molecular Medicine, 4Wimasis GmbH, 5Immunodynamics and Intravital Imaging, Charité - University of Medicine

Abstract

Confocal माइक्रोस्कोपी ऐसे अस्थि मज्जा के रूप में जटिल ऊतकों के भीतर अनेक प्रकार की कोशिकाओं का स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए पसंद की विधि है। कई मामलों में यह इस प्रकार एक करदाता पर निर्भर पूर्वाग्रह शुरू करने और interrater विश्वसनीयता को कम करने का जोखिम असर, मैनुअल गिनती पर निर्भर करता है लेकिन, जैसा कि सेलुलर स्थानीयकरण के विश्लेषण और मात्रा का ठहराव, मुश्किल है। सेल प्रकार उनकी घटना की आवृत्ति में दृढ़ता से भिन्न है, खासकर जब इसके अलावा, यह यादृच्छिक स्थिति से दो कोशिकाओं के परिणाम के बीच सह स्थानीयकरण न्यायाधीश कि क्या अक्सर मुश्किल होता है। इधर, अस्थि मज्जा में सेलुलर सह स्थानीयकरण की निष्पक्ष मात्रा का ठहराव के लिए एक विधि शुरू की है। प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा सहित पूरे murine लंबी हड्डियों के histological वर्गों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल नमूना तैयार है, साथ ही धुंधला प्रोटोकॉल और उच्च संकल्प छवियों के अधिग्रहण का वर्णन है। हिमेटोपोयटिक और गैर hemat की मान्यता से फैले विश्लेषण से कार्यप्रवाहउन कोशिकाओं के बीच सीधे संपर्क की मात्रा का ठहराव के लिए दो-आयामी (2 डी) अस्थि मज्जा छवियों में opoietic सेल प्रकार प्रस्तुत किया है। यह भी एक निश्चित सेल प्रकार आसपास के सेलुलर microenvironment के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए, एक पड़ोस विश्लेषण भी शामिल है। दो प्रकार की कोशिकाओं के सह स्थानीयकरण यादृच्छिक सेल स्थिति के मात्र नतीजा है या कोशिकाओं के बीच तरजीही संघों को दर्शाता है कि क्या मूल्यांकन करने के लिए आदेश में, hematopoietic के रूप में अच्छी तरह से stromal कोशिकाओं के मामले में इस परिकल्पना के परीक्षण के लिए उपयुक्त है जो एक सिमुलेशन उपकरण है, उपयोग किया गया। यह दृष्टिकोण अस्थि मज्जा तक सीमित नहीं है, और histological डेटा की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति के लिए अन्य ऊतकों के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

कारण ऑप्टिकल इमेजिंग सहित माइक्रोस्कोपी में हाल ही में तेजी से तकनीकी विकास करने के लिए, पूरे ऊतक के संदर्भ में कोशिकाओं का विश्लेषण प्रतिरक्षण के लिए तेजी से सुलभ हो गया है। निलंबन में एकल कक्षों के लक्षण वर्णन सेलुलर और आणविक समारोह को समझने के लिए एक मूल्यवान और अपरिहार्य विधि का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, उनके (माइक्रो) -anatomical पर्यावरण के भीतर कोशिकाओं के विश्लेषण में इस तरह के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विकास के रूप में जटिल प्रक्रियाओं में सहयोग करने वाले विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत को समझने के लिए आवश्यक है।

Microscopists छवियों से गुणात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए यह अपेक्षाकृत आसान है, यह आंशिक रूप से की वजह से इस क्षेत्र में विश्लेषण के तरीकों छवि अधिग्रहण में क्या हो सकता है की तुलना में पिछड़ रहे हैं, सच है कि इन आंकड़ों यों के लिए एक चुनौती बनी हुई है। कई शोधकर्ताओं अभी भी समय लेने वाली उनकी ऊतक विज्ञान छवियों में मार्गदर्शन सेल गिनती पर भरोसाइस प्रकार विभिन्न रेटर के बीच एक पूर्वाग्रह शुरू करने और अन्य समूहों द्वारा प्रतिकृति निरोधक। आमतौर पर, एक प्रतिनिधि छवि यह मुश्किल पाठक एक ऐसी घटना के सांख्यिकीय प्रासंगिकता न्याय करने के लिए कर रही है, एक प्रकाशन में सेलुलर स्थिति या सह स्थानीयकरण पर एक बयान को रेखांकित करने के लिए चुना है।

साथ में छवि डेटा की पूरी जानकारी सामग्री शायद ही कभी शोषण किया जाता है कि इस तथ्य के साथ, यह एक और अधिक तेज, निष्पक्ष और व्यापक दृष्टिकोण ऊतकीय छवियों का विश्लेषण करने के लिए की जरूरत पर जोर दिया।

अस्थि मज्जा वयस्क रीढ़ में hematopoiesis की अंग के रूप में महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण कार्यों पर ले जाता है जो एक जटिल ऊतक है। Hematopoietic कोशिकाओं 1,2 के लिए जन्मस्थान होने और बी लिम्फोसाइट विकास तीन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है इसके अलावा, यह भी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं 4 शुरू की और परिपक्व, रीसर्क्युलेटिंग बी कोशिकाओं 5 का समर्थन कर रहे हैं, जहां एक साइट के रूप में कार्य करता है। मैं बनाए रखने में इसके अलावा, अपनी भूमिकाप्रतिरक्षा स्मृति गठन कोशिकाओं के कई प्रकार के 6-9 वहाँ निवास करने के लिए पाया गया है के रूप में mmunological स्मृति तेजी से पिछले दशक में सराहना हो गया है।

जटिल ऊतक अस्थि मज्जा की वास्तुकला और अपने कार्यों के बीच संबंध अभी भी मायावी रहते हैं। ऐसी टी और बी सेल क्षेत्रों के रूप में मैक्रो-डिब्बों में आयोजन किया जाता है, जो माध्यमिक ल्य्म्फोइड अंगों के विपरीत, अस्थि मज्जा एक स्पष्ट मैक्रो-compartmentalization का अभाव है। अब तक अस्थि मज्जा में अलग डिब्बों हड्डी कॉर्टेक्स करने के लिए या vasculature को उनकी निकटता से परिभाषित कर रहे हैं। इस तरह का समर्थन स्टेम सेल, बी कोशिकाओं या इस तरह लंबे समय रहते प्लाज्मा कोशिकाओं (पीसी के रूप में प्रतिरक्षा स्मृति सेल आबादी (के रखरखाव), सीडी 4 + और ​​के विकास के रूप में प्रक्रियाओं के एक नंबर के लिए अस्थि मज्जा में विभिन्न निवासी स्ट्रोमल सेल आबादी का महत्व सीडी 8 + स्मृति टी कोशिकाओं) स्पष्ट रूप से अस्थि मज्जा में सूक्ष्म compartmentalization की एक निश्चित डिग्री है कि वहाँ इंगित करता है।

10 में से कई। अस्थि मज्जा में दृश्य और stromal कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के कारण लंबे, पतले वृक्ष के समान एक्सटेंशन अस्थि मज्जा भर में एक नेटवर्क बनाने के साथ अपने रूपात्मक सुविधाओं के लिए मुश्किल है, और उपयुक्त मार्कर की कमी स्ट्रोमल उप-जनसंख्या भेदभाव करने के लिए।

इन आलों उनके सेलुलर और आणविक compositio के लिए सम्मान के साथ आम सुविधाओं को साझा किस हद तक यह अभी तक के रूप में स्पष्ट नहीं हैएन, और तत्व है जो एक निश्चित जगह अद्वितीय प्रस्तुत करना। Stromal कोशिकाओं के अलावा, hematopoietic सेल प्रकार आलों में से कुछ के लिए कम से कम कुछ संकेतों प्रदान करके एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। जाहिर है, आला संरचना की जटिलता बगल में उनके विश्लेषण की आवश्यकता है, और प्रतिरक्षण और hematologists अपने सेलुलर घटकों के बीच स्थानिक रिश्तों का विश्लेषण करके, जैसे अस्थि मज्जा माइक्रोआर्किटेक्चर, पर ज़ूम करने के लिए यह तेजी से महत्वपूर्ण बन गया है।

इधर, एक रणनीति प्रस्तुत किया है एक स्वचालित और निष्पक्ष तरीके से अस्थि मज्जा में सेलुलर सह स्थानीयकरण और पड़ोस रिश्तों यों की। फ्लोरोसेंट stromal कोशिकाओं और गैर फ्लोरोसेंट hematopoietic कोशिकाओं, undecalcified हड्डियों, पूरे हड्डी को कवर confocal छवियों के अधिग्रहण से ऊतकीय वर्गों की तैयारी है, साथ ही सेलुलर सी की स्वचालित छवि विश्लेषण, काइमेरिक चूहों की पीढ़ी सहित शरण एक विस्तृत कार्यप्रवाहओ-स्थानीयकरण और एक सिमुलेशन उपकरण के द्वारा यादृच्छिक स्थिति से उसका सत्यापन / भेदभाव (चित्रा 8) प्रदान की जाती है।

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Protocol

पशु प्रयोगों पशु कल्याण (Landesamt फर Gesundheit अंड Soziales, बर्लिन) के लिए उपयुक्त राज्य समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया है और मौजूदा दिशा निर्देशों और नियमों (पशु प्रयोग लाइसेंस G0194 / 11) के अनुसार प्रदर्शन किया गया।

फ्लोरोसेंट अस्थि मज्जा chimeric चूहे 1. पीढ़ी

नोट: 9 से पहले वर्णित के रूप में अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंट अस्थि मज्जा काइमेरिक चूहों की पीढ़ी के लिए किया जाता है।

  1. डेल-Cre विकिरण के लिए उन्हें तैयार करने के लिए (मिलकर लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (tdRFP) सर्वत्र 11-13 व्यक्त चूहों) रोज़ा-tdRFP चूहों x इलाज शुरू। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सर्वव्यापक अभिव्यक्ति के साथ किसी भी अन्य तनाव का उपयोग करें। दो दिनों के विकिरण से पहले पीने के पानी के माध्यम से Neomycin की 1 मिलीग्राम / एमएल और 1 मिलीग्राम / विटामिन की मिलीलीटर (ए, डी 3, ई, सी) प्रशासन।
  2. एक सीज़ियम 137 गामा irradiator वाई के साथ 3.8 ग्रे के साथ दो बार चूहों चमकाना3 घंटा के अंतराल पतली। इस के लिए, संबंधित irradiator के लिए उपयुक्त एक विकिरण पाई पिंजरे में चूहों जगह है।
    नोट: चूहों के विकिरण के लिए, हमारे संस्थान संज्ञाहरण की आवश्यकता नहीं है। विकिरण के लिए संज्ञाहरण के बारे में स्थानीय संस्थागत नीतियों का पालन करें। दर्द के संकेत मिल रहे हैं कि अगर विकिरण के बाद प्रति दिन Carprofen subcutaneously (सुप्रीम कोर्ट) के 5 मिलीग्राम / किलो के साथ पशुओं का इलाज।
  3. अगले दिन, स्थानांतरण बफर 9 में C57BL 6 / दाता चूहों की लंबी हड्डियों से तैयार 3 एक्स 10 6 अस्थि मज्जा कोशिकाओं के एक अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा चूहों पुनर्गठित। अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए Neomycin पर चूहों और विटामिन रखें और इस समय के दौरान उनकी अच्छी तरह से किया जा रहा है और वजन की निगरानी। विशिष्ट प्रयोगात्मक उपचार शुरू करने से पहले प्रतिरक्षा प्रणाली के पुनर्गठन के लिए अनुमति देने के लिए कम से कम चार सप्ताह प्रतीक्षा (जैसे, प्रतिरक्षण) 9।
  4. चूहों बलिदान और एक विच्छेदन बोर्ड पर उन्हें जगह है, 70% इथेनॉल के साथ पैर बाँझ। Euthanizस्थानीय संस्थागत नीतियों के अनुसार ई चूहों। हमारे संस्थान ग्रीवा अव्यवस्था करता है।
  5. जांघों से त्वचा को हटाने के लिए संदंश और कैंची का प्रयोग करें। और्विक हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए मांसपेशियों के ऊतकों को हटा दें। संदंश और कैंची का उपयोग कूल्हे और घुटने संयुक्त से और्विक हड्डी लूक्रस करना। तोड़ने या हड्डी में कटौती नहीं करने के लिए सावधान रहें।
  6. ध्यान से कैंची का उपयोग हड्डी से मांसपेशियों के ऊतकों और उपास्थि के बड़े टुकड़े शेष को हटा दें। प्रयोगशाला टिशू पेपर के साथ हड्डी रगड़ से शेष मांसपेशियों के ऊतकों को हटा दें। फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक पेट्री डिश में साफ हड्डियों को ले लीजिए।
  7. 6 घंटा - 4 के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रेड) में पूरे और्विक हड्डियों को ठीक करें।
  8. पीएफए ​​त्यागें और पीबीएस हे / एन में 10% sucrose में हड्डियों सेते हैं। अगले दिन, 20% सूक्रोज हे / एन में हड्डियों सेते हैं। दिन के बाद, 30% सूक्रोज हे / एन में हड्डियों सेते हैं।

हड्डियों के 2. Cryosectioning

नोट: एक के बाद6 - 30% sucrose में 24 घंटा, हड्डियों फ्रीज और Kawamoto के टेप विधि 14,15 के अनुसार उन्हें cryosection।

  1. सूखी बर्फ और एसीटोन के साथ एक बड़े बीकर (2000 मिलीलीटर मात्रा) तैयार करें (लगभग 2: 1 मात्रा अनुपात, उदाहरण के लिए, सूखी बर्फ की 400 मिलीलीटर और एसीटोन की 200 मिलीलीटर) एक धूआं हुड के नीचे। (- 50 मिलीलीटर लगभग 30) के अंदर हेक्सेन के साथ - (250 मिलीलीटर मात्रा 150) एक छोटे से बीकर रखें। (ठंढ बड़े बीकर के बाहर पर प्रकट होता है, जब तक लगभग 10 मिनट) शांत करने के लिए मिश्रण के लिए प्रतीक्षा करें।
  2. सुपर Cryoembedding मध्यम (SCEM) के साथ लेबल cryomold की ¾ भरें; वे पूरी तरह से वे मोल्ड के किनारों को छूने नहीं है कि देखभाल, डूब रहे हैं जब तक ध्यान से अंदर हड्डियों जगह है। बड़े संदंश के साथ सिर्फ हेक्सेन की सतह को छूने से मोल्ड के नीचे के साथ बीकर में cryomold पकड़।
    1. SCEM फ्रीज के बाहरी किनारों करते हैं (अस्पष्टता ने संकेत दिया है, इस लिए लगभग 15 सेकंड लेता है)। फिर पूरी तरह हेक्सेन में ढालना ड्रॉप और fre के यह बताने के2 मिनट - 1 के लिए एज़े। जमे हुए नमूना बाहर ले जाओ और सिलोफ़न में लपेट और फिर एल्यूमीनियम पन्नी (बाहर सुखाने से नमूना की रक्षा के लिए और प्रकाश के संपर्क से बचने के लिए)। Cryosectioning तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. और्विक हड्डियों के Cryosectioning के लिए कड़ी मेहनत के ऊतकों के लिए एक मानक सूक्ष्म और सूक्ष्म ब्लेड का उपयोग करें।
  4. -24 डिग्री सेल्सियस के लिए सूक्ष्म का नमूना और ब्लेड तापमान सेट करें। नमूना काटने से पहले के बारे में 15 मिनट के लिए सूक्ष्म अंदर बैठते हैं।
    1. SCEM या इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) मध्यम के साथ धातु नमूना धारक के लिए नमूना ब्लॉक को ठीक करें। ब्लॉक यदि आवश्यक हो तो के उन्मुखीकरण को समायोजित करें। हड्डी पूरी तरह से खोल दिया गया है जब तक नमूना ट्रिम और मज्जा दिख रहा है। 7 माइक्रोन के लिए खंड मोटाई (प्रथम खंड त्यागने) समायोजित करें।
    2. एक हिरण चमड़े के कवर लकड़ी के रंग का उपयोग नमूना ब्लॉक के शीर्ष पर चिपचिपा पक्ष के साथ Kawamoto के टेप का एक टुकड़ा को ठीक करें। बाद में, नमूना कटौती और धारा इतना है कि टेप की बारीऊपर की ओर पर तैनात हैं। संदंश का उपयोग कर एक स्लाइड कांच के लिए टेप स्थानान्तरण। स्कॉच टेप के साथ स्लाइड कांच के लिए टेप को ठीक करें।
  5. वर्गों में कम से कम 30 मिनट के लिए दो सूखी और उपयोग जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान। वे एक साथ रहना है कि से बचने के क्रम में एकल स्लाइड्स के बीच spacers के साथ प्लास्टिक स्लाइड बक्से में बेदाग और पैदाल स्लाइड्स स्टोर। सना हुआ और घुड़सवार स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए गत्ते में स्लाइड फ़ोल्डरों के लिए भंडारित किया जा सकता है।

3. छवि संग्रह

  1. आम इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल 9 के अनुसार पिघलना और दाग cryosections। उदाहरण के लिए एक परमाणु दाग, ऊतक अखंडता कल्पना करने के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) शामिल हैं।
    नोट: दाग, उदाहरण के लिए, आरएफपी के लिए stromal कोशिकाओं (एंटी-आरएफपी बायोटिन एंटीबॉडी और streptavidin-एलेक्सा Fluor 555), चूहे विरोधी प्रमुख बुनियादी प्रोटीन (MBP) एंटीबॉडी और विरोधी चूहा-एलेक्सा Fluor 647 एंटीबॉडी के साथ दाग इयोस्नोफिल्स कल्पना करने के लिए , बी कोशिकाओंविरोधी κ प्रकाश चेन fluorescein-आईएसओ thiocyanate (FITC) और विरोधी λ1 प्रकाश चेन FITC एंटीबॉडी के साथ चूहे विरोधी B220-एलेक्सा Fluor 594 एंटीबॉडी और पीसी के साथ (धुंधला प्रक्रिया का ब्यौरा 9 में वर्णित हैं)।
  2. दाग वर्गों माउंट: खंड पर fluoromount की एक बूंद डाल दिया और फिर ध्यान से हवा के बुलबुले के गठन से बचने whilst, एक # 1 गिलास को कवर पर्ची के साथ कवर किया। बाद में, धुंधला के लिए उपयुक्त लेजर लाइनों के साथ सुसज्जित एक साधन के साथ लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करते हैं।
  3. Stromal कोशिकाओं निम्न सेटिंग्स लागू होते हैं, Wimasis उपकरण का उपयोग करने के साथ अस्थि मज्जा hematopoietic कोशिकाओं के स्वचालित सह स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए आदेश में:
    1. एक 20x उद्देश्य लेंस और 708.15 एक्स 708.15 माइक्रोन से देखने का एक क्षेत्र का उपयोग करें। स्वचालित विश्लेषण के लिए, तुलनीय परिणाम रखने के क्रम में 2048 X 2048 पिक्सेल (PX) पर लगातार सभी छवियों का आकार रखने के लिए।
    2. जैसे (स्ट्रोमल संरचनाओं के लिए एक चैनल रिकॉर्ड (जैसे, DAPI, 405 एनएम) और ब्याज की hematopoietic कोशिकाओं (के लिए अतिरिक्त चैनलों जैसे, तीन चैनलों, इयोस्नोफिल्स, बी कोशिकाओं और पीसी के लिए 488/594/633 एनएम)।
    3. 4 16 के औसत लाइन का उपयोग कर रिकॉर्ड छवियों। आदर्श रूप में, एक आसन्न छवियों लेने के द्वारा पूरे और्विक खंड को कवर किया। वैकल्पिक रूप से, अस्थि मज्जा (diaphyseal के साथ ही epiphyseal) के विभिन्न क्षेत्रों से गैर आसन्न तस्वीरें ले लो।
      नोट: आसन्न छवियों (अतिव्यापी क्षेत्रों में कोशिकाओं के दोहराया विश्लेषण से बचने के लिए) के बीच overlaps के निर्माण करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  4. एक माइक्रोस्कोपी छवि फ़ाइल स्वरूप में छवियों को बचाने। जाँच करें और यदि आवश्यक हो, छवि दर्शक / विश्लेषण सॉफ्टवेयर में सभी चैनलों के लिए इसके विपरीत समायोजित।
  5. छवि फ़ाइल निर्यात प्रति तीन जेपीजी फाइलें: DAPI चैनल (लाल / हरी / नीले (आरजीबी) प्रारूप, पीले रंग में कोडित झूठे रंग), स्ट्रोमा चैनल के लिए एक .jpg फ़ाइल (greyscale) और एक जेपीजी के लिए एक .jpg फ़ाइल फ़ाइल युक्तhematopoietic कोशिकाओं के लिए चैनल (3 चैनलों अधिकतम, आरजीबी प्रारूप, जैसे, FITC (पीसी, झूठे रंग: हरा) / एलेक्सा Fluor 594 (बी कोशिकाओं, झूठे रंग: नीला) / एलेक्सा Fluor 647 (इयोस्नोफिल्स, झूठे रंग: लाल)) ।

4. स्वचालित छवि विश्लेषण

  1. छवि विभाजन, सह स्थानीयकरण और पड़ोस विश्लेषण (चर्चा देखें) की मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करने के लिए एक छवि विश्लेषण उपकरण का उपयोग।
  2. Wimasis उपकरणों का उपयोग करते हैं, इस प्रकार आगे बढ़ना:
    1. रेखांकन और छवि के प्रकार का संकेत एक संख्या के बाद एक ही फाइल नाम के साथ छवि प्रति 3 जेपीजी फाइल के सेट अपलोड करें।
    2. Hematopoietic कोशिकाओं के साथ .jpg फ़ाइल के लिए _1 का प्रयोग करें, स्ट्रोमा चैनल के लिए .jpg फ़ाइल के लिए DAPI चैनल, _3 के लिए .jpg फ़ाइल के लिए _2। Image1_1.jpg (hematopoietic कोशिकाओं), Image1_2.jpg (DAPI चैनल), और Image1_3.jpg (स्ट्रोमा चैनल): उदाहरण के लिए। ग्राहक के खाते के माध्यम से छवियों को अपलोड करें।
    3. सेल संपर्क मात्रा का ठहराव के लिएसंबंधित क्षेत्र पर क्लिक करके सेल संपर्क उपकरण का चयन करें। सेल आसपास के क्षेत्र मात्रा का ठहराव के लिए, सेल आसपास उपकरण का चयन और (कोशिकाओं 'किनारों से मापा जाता है) माइक्रोन में वरीय आसपास त्रिज्या दर्ज करें।
    4. परिणामों को डाउनलोड करें।
      नोट: परिणामों के एक सारांश के अलावा, .jpg hematopoietic कोशिकाओं और पता लगाया वस्तुओं की सीमाओं के साथ स्ट्रोमा चैनल दिखा फाइलों पर प्रकाश डाला, साथ ही हर छवि के लिए माप युक्त एकल .csv फ़ाइलों के रूप में प्रदान की जाती हैं .csv फ़ाइल कि सभी अपलोड की गई छवियों के लिए डेटा शामिल हैं।
  3. संपर्क में आने से माप एक उदाहरण के प्रतिनिधि परिणाम में दिखाया गया है stromal कोशिकाओं, या अन्य hematopoietic प्रकार की कोशिकाओं से संपर्क करने, लाल, हरे, या नीले रंग की कोशिकाओं की आवृत्तियों के साथ संपर्क में (hematopoietic कोशिकाओं (लाल, हरे, या नीले रंग की कोशिकाओं) की आवृत्ति निर्धारित चित्रा 4)। आवृत्तियों का निर्धारण करने के लिए, से छवि प्रति दिए गए संपर्क मायने रखता विभाजितकुल सेल छवि प्रति गिना जाता है।
    1. व्यक्तिगत चूहों के साथ प्रयोगों के लिए, एकल चूहों के लिए सभी छवियों की कुल संपर्क मायने रखता तक राशि और सभी छवियों की कुल कोशिकाओं की गिनती का योग द्वारा उन्हें विभाजित।
  4. कदम 4.3 (के रूप में वर्णित आसपास के क्षेत्र माप से, stromal कोशिकाओं और / या अन्य hematopoietic प्रकार की कोशिकाओं को प्राथमिकता निकटता में लाल, हरे या नीले रंग की कोशिकाओं की आवृत्तियों से चयनित दूरी के भीतर, लाल, हरे या नीले रंग की कोशिकाओं की आवृत्ति निर्धारित यह भी देखें प्रतिनिधि परिणाम, चित्रा 4)।

रैंडम अस्थि मज्जा पोजिशनिंग 5. सिमुलेशन

  1. विश्लेषण किया अस्थि मज्जा ऊतकीय छवियों पर यादृच्छिक सेल स्थिति के सिमुलेशन क्रियान्वित करने से पहले, अग्रिम में निम्न फ़ाइलों को तैयार: सेल संपर्क उपकरण, DAPI चैनल के लिए मूल जेपीजी फाइल व मूल .jpg फ़ाइलों द्वारा प्रदान की एकल .csv फ़ाइलें स्ट्रोमल चैनल के लिए।
  2. प्रदर्शन के लिए पंक्तिबद्धछवियों की एक श्रृंखला पर बैच सिमुलेशन (जैसे, एक और्विक अनुभाग से सभी छवियों), एक फ़ोल्डर में सभी मूल .jpg फ़ाइलें (_1, _2 और _3) और इसी एकल .csv फ़ाइलों को इकट्ठा।
    नोट: रैंडम अस्थि मज्जा सेल स्थिति के लिए सिमुलेशन उपकरण अनुरोध पर उपलब्ध है।
  3. बॉक्स "ऑटो-लोड छवि डेटा" जाँच, सिमुलेशन उपकरण प्रारंभ करें।
    नोट: कार्यक्रम .csv फ़ाइल से सेल मायने रखता है और औसत सेल आकार स्वचालित रूप से पढ़ा होगा। ये मान "सेल नंबर 'और' सेल आकार औसत" (चित्रा 5A) के लिए बक्से में प्रदर्शित कर रहे हैं।
  4. .csv फ़ाइलें, यानी, उनके नाम में आम कारक के लिए आम टैग दर्ज करें। बैच मोड अनुकरण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए कि छवि सेट की संख्या दर्ज करें।
  5. (फ़ाइल नाम न खत्म होने वाली _3 के साथ) स्ट्रोमा चैनल से उत्पन्न .jpg फ़ाइल लोड करें।
  6. DAPI चैनल से मुखौटा पैदा करने के लिए सेटिंग दर्ज करें:
    1. बॉक्स "की जांच करें? मुखौटा लागू करें "10 (- 255 रेंज 0) के लिए एक द्विआधारी नकाब में DAPI छवि परिवर्तित करने के लिए सीमा निर्धारित करें।
    2. बॉक्स को चेक करें "चौड़ा करना?" "? 8 बिट" बॉक्स को चेक करें और 5 पिक्सल के लिए फैलाव के ग्रेड निर्धारित किया है। "/ कटाव? डब्ल्यू" बॉक्स को चेक करें।
    3. नकली छवियों के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल आसपास के क्षेत्र त्रिज्या (पड़ोस त्रिज्या) के लिए वांछित मान दर्ज करें। (पिक्सेल स्केलिंग XY: 0.346 माइक्रोन) 2048 X 2048 पिक्सल के आकार के साथ 708.15 एक्स 708.15 माइक्रोन की एक छवि के लिए, 29 PX 10 माइक्रोन के अनुरूप हैं।
  7. बॉक्स को चेक करें "Otsu का प्रयोग करें?" स्ट्रोमल संरचनाओं का स्वत: पता लगाने के लिए Otsu एल्गोरिथ्म 17 उपयोग करने के लिए।
    नोट: यह संपर्क और आसपास के क्षेत्र उपकरण के द्वारा प्रयोग किया जाता है कि एक ही एल्गोरिथ्म है। दर्ज की छवि और नकली छवि की स्वचालित विश्लेषण में एक ही छवि विभाजन कलन विधि का प्रयोग तुलनीय डेटा रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
  8. जो की गिरफ्तारी hematopoietic कोशिकाओं, के लिए सेटिंग दर्ज करेंई गोल आकार के रूप में नकली।
    नोट:, लाल, हरे और नीले रंग की कोशिकाओं के लिए सेल नंबर सीधे (देखें भी 5.6 कदम) .csv फ़ाइल से भरी हुई हैं।
    1. लाल, हरे और नीले रंग की कोशिकाओं के पिक्सल में औसत व्यास की गणना करने के लिए सिमुलेशन उपकरण का उपयोग करें। छवि प्रति कुल सेल गिनती से विभाजित पिक्सल में छवि में प्रत्येक कोशिका प्रकार के कुल क्षेत्र के रूप में एक एकल कोशिका की औसत क्षेत्र का निर्धारण करते हैं। सूत्र का उपयोग कर एक डिस्क की त्रिज्या की गणना के लिए औसत क्षेत्र का उपयोग करें। औसत व्यास निर्धारित करने के लिए त्रिज्या दोगुना है।
  9. वस्तु विभाजन कार्य भी शामिल है कि किसी भी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण सेल प्रकार की कोशिका का आकार वितरण उपाय। सभी हिमेटोपोयटिक प्रकार की कोशिकाओं (18 और चित्रा 5 ब) के लिए σ का निर्धारण करते हैं।
    नोट: दर्ज की गई कोशिकाओं के सेल आकार वितरण स्वचालित छवि विश्लेषण द्वारा निर्धारित नहीं कर रहे हैं, असली वितरण के एक सन्निकटन के रूप में एक गाऊसी वितरण का उपयोग करें। टी की चौड़ाईवह वितरण वक्र σ से वर्णन किया गया है और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए काफी अलग हो सकते हैं। (विवरण के लिए, चित्रा 5 ब देखें)।
    1. अभी भी छवि विश्लेषण उपकरण के द्वारा एक पूरा सेल के रूप में मान्यता प्राप्त है कि छोटी से छोटी वस्तु का वर्णन करता है कि पिक्सल में व्यास: इन मापों से, "सेल आकार कटऑफ" निर्धारित करते हैं।
  10. ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (चित्रा 5A) पर संबंधित बक्सों में पैरामीटर दर्ज करें।
    1. पिक्सल में एक व्यास के रूप में काट सेल आकार, यानी, सिमुलेशन में अनुमति दी न्यूनतम सेल आकार दर्ज करें।
    2. (कदम 5.9 से), लाल, हरे और नीले रंग की कोशिकाओं के लिए सेल आकार के वितरण के अनुकरण के लिए पिक्सल में σ दर्ज करें।
    3. उपधारा "मास्क में सेल" में "हटाएं" बॉक्स की जाँच करें। यह मुखौटा के एक नहीं जाना क्षेत्र के साथ कम से कम एक पिक्सेल के साथ ओवरलैप अगर इस सेटिंग के साथ, इस कार्यक्रम के लिए एक सेल के लिए एक नई स्थिति चुना जाएगा। सेल ओवरलैप से बचने "बॉक्स की जाँच करें? ̶1; उपधारा "सेल बहिष्कार" में।
    4. पिक्सल में दो कोशिकाओं के केंद्रों के बीच की न्यूनतम दूरी दर्ज करें।
      नोट: न्यूनतम दूरी दर्ज की छवियों से निर्धारित किया जाना चाहिए। गलत तरीके से मापा न्यूनतम दूरी दर्ज की गई और नकली छवियों की तुलना के लिए पक्षपाती / कृत्रिम परिणामों को बढ़ावा मिलेगा।
    5. ओवरलैप केंद्र के लिए केंद्र से न्यूनतम दूरी से परिभाषित किया गया है कि अगर 100% करने के लिए ओवरलैप के अधिकतम क्षेत्र सेट करें।
    6. 1000 repetitions के लिए सिमुलेशन उपकरण सेट।
    7. बॉक्स को चेक करें "स्वत: सहेजना कोशिकाओं?" .rect फ़ाइलें (पाठ प्रारूप) के रूप में बैच के प्रत्येक छवि के सभी repetitions के लिए नकली वस्तुओं के समन्वय को बचाने के लिए। बॉक्स को चेक करें "स्वत: सहेजना छवियों?" प्रत्येक नकली छवि के लिए एक झगड़ा फ़ाइल को बचाने के लिए। सहेजी गई फ़ाइलों के लिए एक आम टैग दर्ज करें।
      नोट: "स्वत: सहेजना कोशिकाओं" विकल्प वास्तविक नकली भारतीय सैन्य अकादमी की बचत की तुलना में जब, सिमुलेशन समय चल रहा है और समग्र डेटा का आकार कम कर देता हैGES। .rect फ़ाइलों आयतों के रूप में नकली कोशिकाओं के निर्देशांक बचाने के लिए और यदि आवश्यक हो तो इस प्रकार नकली चित्र में परिवर्तित किया जा सकता है।
  11. "भागो सिमुलेशन" पर क्लिक करके सिमुलेशन शुरू करो।
    नोट: सिमुलेशन उपकरण स्वचालित रूप से दोहराया सिमुलेशन के हर सेट के लिए लाल, हरे, नीले, और stromal कोशिकाओं के साथ, लाल, हरे और नीले रंग की कोशिकाओं के लिए औसत संपर्क मायने रखता है और आसपास के क्षेत्र में गिना जाता सहित हर छवि के 1,000 सिमुलेशन, के लिए एक csv फ़ाइल उत्पन्न करता है । साथ ही, इन सभी मूल्यों के लिए, मानक विचलन (एसटीडी) और मतलब की मानक त्रुटि (SEM) के साथ 1000 सिमुलेशन का मूविंग प्रदान की जाती हैं।
  12. संपर्क आवृत्तियों और 1000 नकली छवियों का एक सेट के आसपास के क्षेत्र आवृत्तियों औसत निर्धारण करते हैं। इस के लिए, छवि प्रति दर्ज की कोशिकाओं की संख्या से औसत से संपर्क करें और आसपास के क्षेत्र में गिना जाता है विभाजित करते हैं। दर्ज की छवि के स्वचालित सह स्थानीयकरण विश्लेषण के परिणामों को आवृत्तियों की तुलना करें।
  13. उपयुक्त stati के लागू करेंविश्लेषण 19 के आधार पर stical तरीकों (चित्रा 7 के लिए, हम एक दो पूंछ Wilcoxon रैंक परीक्षण पर हस्ताक्षर किए थे)।

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Representative Results

Kawamoto के टेप विधि के साथ undecalcified हड्डी के cryosections काटना diaphysis में और साथ ही साथ epiphyseal क्षेत्रों में दोनों, पूरे हड्डी अभी mineralized हड्डी से जुड़ी endosteal क्षेत्र की अस्थि मज्जा के साथ, एक अक्षुण्ण खंड के रूप में कटौती करने की अनुमति देता है उनके घरनदार हड्डी के उच्च घनत्व (चित्रा 1)। वर्गों के परमाणु धुंधला तैयारी में छोटे दरारें पूरी तरह से टाला नहीं जा सकता है, हालांकि sinusoids और धमनियों की संरचना के रूप में अच्छी तरह से पैरेन्काइमा के जालीदार नेटवर्क बरकरार रहता है कि पता चलता है।

एक लाल फ्लोरोसेंट चिमेरिक अस्थि मज्जा का एक immunofluorescence धुंधला का उदाहरण है और इसके बाद के विश्लेषण के रूप में, एक इयोस्नोफिल्स के लिए धुंधला (प्रमुख बुनियादी प्रोटीन, MBP), पीसी (κ और λ प्रकाश श्रृंखला) और बी कोशिकाओं (B220) दिखाया गया है। चूहे फिटकिरी आईपी में चिकन γ ग्लोब्युलिन (एनपी CGG) के लिए युग्मित 100 माइक्रोग्राम प्रति के 4-हाइड्रोक्सी-3-nitrophenylacetyl hapten, 4 हफ्तों के बाद से प्रतिरक्षित गयापुनर्गठन, 21 दिन बाद पीबीएस चतुर्थ में एनपी सीजीजी के 50 माइक्रोग्राम प्रति के साथ बढ़ाया और बढ़ावा देने के एक दिन बाद 30 पर विश्लेषण किया गया। स्वचालित छवि विश्लेषण भी जालीदार प्रक्रियाओं के बहुत छोटे टुकड़े सहित स्ट्रोमल संरचनाओं की एक बहुत ही सटीक मान्यता में हुई। Stromal कोशिकाओं के सेल नंबर यहाँ प्रस्तुत प्रणाली के साथ निर्धारित नहीं किया जा सकता है छवियों में सभी टुकड़ों का पता लगाने के आदेश (चित्रा 2) में, कोई आकार सीमा स्ट्रोमल चैनल के लिए पेश किया गया था (यह भी चर्चा देखें)। पीसी और इयोस्नोफिल्स बी कोशिकाओं की तुलना में बड़े होते हैं और यह भी एक अधिक विषम आकार दिखा। सभी तीन प्रकार की कोशिकाओं में अच्छी तरह से पहली नज़र में मान्यता दी गई है। सेलुलर समूहों, विशेष रूप से बी कोशिकाओं की, अच्छी तरह से अलग हो गए थे। विश्लेषण उपकरण उपर्युक्त प्रकार की कोशिकाओं (इयोस्नोफिल्स, पीसी, बी कोशिकाओं) के लिए अनुकूलित है। अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए, समायोजन आवश्यक हो सकता है। सेल संपर्क उपकरण के द्वारा उत्पन्न .csv फ़ाइलें hematopoietic कोशिकाओं के लिए निम्न संबंधित माप होते हैं:प्रत्येक सेल की आबादी के लिए सेल गिनती; पिक्सल में प्रत्येक कोशिका आबादी के लिए कुल क्षेत्रफल; संपर्क (इस मामले इयोस्नोफिल्स में) लाल कोशिकाओं की गिनती, हरी कोशिकाओं (यहां पीसी) या लाल, हरे, नीले या ग्रे कोशिकाओं (stromal कोशिकाओं) के साथ नीले रंग की कोशिकाओं (यहां बी कोशिकाओं)। सेल आसपास उपकरण के द्वारा उत्पन्न .csv फ़ाइलें hematopoietic कोशिकाओं के लिए निम्नलिखित माप शामिल: प्रत्येक कोशिका आबादी के लिए सेल गिनती; पिक्सल में प्रत्येक कोशिका आबादी के लिए कुल क्षेत्रफल; लाल, हरे, नीले, और ग्रे कोशिकाओं (stromal कोशिकाओं) के साथ, लाल, हरे और नीले रंग की कोशिकाओं के आसपास के क्षेत्र गिनती।

छवि विश्लेषण उपकरणों की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए, स्वचालित विश्लेषण का परिणाम 6 प्रशिक्षित रेटर (चित्रा 3) द्वारा एक मैनुअल गिनती की तुलना में कर रहे थे। सभी रेटर विश्लेषण के लिए समान चित्र प्राप्त किया। Stromal संरचनाओं और hematopoietic कोशिकाओं ध्यान से एक छवि विश्लेषण उपकरण के साथ रेखांकित किया गया है और ब्याज की इन क्षेत्रों बचाया और विश्लेषण किया गया। स्ट्रोमल संरचनाओं के लिए, छवि प्रति कुल क्षेत्रफलस्वचालित और मैन्युअल विश्लेषण के बीच तुलना में था। प्रशिक्षित रेटर ठीक पहचान करने के लिए मैन्युअल रूप से गिना (चित्रा 3A) स्ट्रोमा के कुल क्षेत्रफल का आकार के लिए मनाया बड़े विचरण से परिलक्षित रूप stromal संरचनाओं, मुश्किल लग रहा था। यहाँ, स्वचालित विश्लेषण प्रशिक्षित रेटर द्वारा पता लगाया औसत क्षेत्र के करीब एक मूल्य निर्धारित की। मैन्युअल रूप से गिना से सभी कोशिकाओं के लिए, स्वचालित विश्लेषण उपकरण कोशिकाओं के एक से थोड़ा कम राशि निर्धारित की। हालांकि, पीसी और इयोस्नोफिल्स के लिए, संख्या पुस्तिका की गिनती के लिए मनाया interrater विचरण की सीमा में अभी भी था। स्वचालित विश्लेषण से पता लगाया बी कोशिकाओं की संख्या, हालांकि, थोड़ा इस रेंज (चित्रा 3A) नीचे था। स्वचालित विश्लेषण द्वारा निर्धारित औसत सेल आकार (PX में क्षेत्र) पीसी के लिए 512 पिक्सल, इयोस्नोफिल्स के लिए 436 पिक्सल था, और बी कोशिकाओं के लिए 317 पिक्सल, प्रशिक्षित रेटर इयोस्नोफिल्स के लिए पीसी के लिए 515 पिक्सल, 464 पिक्सल का एक आकार निर्धारित किया है, जबकि और बी कोशिकाओं के लिए 291 पिक्सल। इस प्रकार, औसत गबी कोशिकाओं, पीसी, और स्वचालित विश्लेषण द्वारा निर्धारित इयोस्नोफिल्स के लिए पक्ष के आकार का मार्गदर्शन रेटर (3B चित्रा) द्वारा निर्धारित औसत सेल आकार के बराबर था। यह स्वचालित छवि विश्लेषण उपकरण अब उम्मीदवार अस्थि मज्जा आला सेल प्रकार के सीधे संपर्क यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, एक निश्चित सेल प्रकार पड़ोसी stromal कोशिकाओं या अन्य hematopoietic कोशिकाओं प्रकार की कोशिकाओं की आवृत्ति निर्धारित किया जा सकता है। अस्थि मज्जा पीसी और अपने संपर्कों के विश्लेषण से कोशिकाओं, इयोस्नोफिल्स, बी कोशिकाओं stromal करने के लिए, और अन्य पीसी 10 और 20 माइक्रोन (चित्रा -4 ए) के भीतर इन प्रकार की कोशिकाओं पड़ोसी पीसी के रूप में अच्छी तरह आवृत्ति, दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, स्ट्रोमा के साथ विभिन्न हिमेटोपोयटिक प्रकार की कोशिकाओं के संपर्क आवृत्तियों (4B चित्रा) मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

सिमुलेशन उपकरण के साथ इन कोशिकाओं के यादृच्छिक अस्थि मज्जा स्थिति का अनुकरण प्रदर्शन से पहले, एक GAUS के रूप में सेल आकार के वितरण का वर्णन है कि मापदंडोंSian वितरण निर्धारित किया जाना है। एक सममित और "घंटी के आकार का" वक्र के रूप में देखे जा सकते हैं, जो एक गाऊसी वितरण, के लिए, केवल दो मापदंडों निर्धारित करने की आवश्यकता है: वक्र के शिखर पर स्थित है, जहां वक्र (मोड, यानी, के केंद्र का स्थान ) और सुडौल वक्र की चौड़ाई (इस उपर्युक्त σ पैरामीटर द्वारा वर्णित है)। यह प्रक्रिया पीसी, इयोस्नोफिल्स, और बी कोशिकाओं (चित्रा 5 ब) के लिए यहां दिखाया गया है। मापा सेल आकार वितरण बी कोशिकाओं के लिए, σ द्वारा वर्णित वितरण वक्र की चौड़ाई पीसी और इयोस्नोफिल्स के लिए की तुलना में छोटी है, कि दिखा। पिक्सल में परिभाषित σ मान रहे थे, जबकि सिमुलेशन के लिए, तीन सेल आबादी के लिए मापा σ के रिश्तेदार मूल्यों, (यानी, बी कोशिकाओं हमेशा एक दो बार के रूप में संकीर्ण आकार पीसी की तुलना में वितरण 'और इयोस्नोफिल्स' से प्रेरित थे) बनाए रखा गया दर्ज की गई कोशिकाओं के दृश्य उपस्थिति मैच के लिए सेट (चित्रा6B)। यह बी कोशिकाओं के लिए 2 px की एक σ और पीसी और इयोस्नोफिल्स दोनों के लिए चार px की एक σ लागू करने के लिए हमें का नेतृत्व किया। सेल आकार कटऑफ मापा सेल आकार वितरण से निर्धारित किया गया था। एक 17 पिक्सल व्यास के लिए अग्रणी 220 पिक्सल पर एक cutoff एक परिपत्र वस्तु (लगभग 7 माइक्रोन) के लिए और बी कोशिकाओं के लिए 20 पिक्सल व्यास में जिसके परिणामस्वरूप पीसी और इयोस्नोफिल्स, 300 पिक्सल वस्तु आकार में एक cutoff, के लिए (लगभग 6 माइक्रोन) का इस्तेमाल किया गया था अनुकरण के लिए।

कोशिकाओं सिमुलेशन उपकरण के द्वारा रखा जा करने की अनुमति दी जाती है, जहां नकली यादृच्छिक छवि में क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए, एक मुखौटा एक अस्थि मज्जा ऊतकीय छवि (चित्रा 6A) के DAPI चैनल में परमाणु संकेतों से उत्पन्न किया गया। 10 के एक मूल्य द्विआधारी छवियों (ऊपरी पैनल, सही छवि) पैदा करने के लिए इष्टतम तीव्रता दहलीज होने के लिए निर्धारित किया गया था। Otsu एल्गोरिथ्म द्वारा निर्धारित सीमा से तय की तीव्रता के लिए इसी प्रकार, छवि में सभी नाभिक से भरा मान्यता (ऊपरी पैनल, केंद्र छवि) के लिए नेतृत्व नहीं करता है50 या 150 का थ्रेसहोल्ड (कम पैनल, छोड़ दिया और केंद्र छवि) stromal कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) के साथ पीसी, इयोस्नोफिल्स, या बी कोशिकाओं के संपर्क की व्याप्ति प्रासंगिकता सिमुलेशन उपकरण (चित्रा 7) का उपयोग कर परीक्षण किया गया था। इस विश्लेषण इन आबादियों का समर्थन स्ट्रोमल आलों की अवधारणा के साथ लाइन में पीसी और बी कोशिकाओं (चित्रा 7A) के लिए सिमुलेशन, की तुलना में दर्ज की गई छवियों में काफी अधिक संपर्क दरों का पता चला। यह 5 व्यक्ति फ्लोरोसेंट काइमेरिक चूहों (चित्रा 7B, डी) में पुष्टि की गई। इसके विपरीत, कोई स्पष्ट अंतर इयोस्नोफिल्स (चित्रा 7A, सी) के मामले में निर्धारित किया गया था।

चित्र 1
Kawamoto के टेप विधि के साथ cryosectioned एक murine फीमर के एक अनुदैर्ध्य खंड चित्रा 1. अवलोकन प्रतिदीप्ति छवि। टेप विधि cuttin की अनुमति देता हैएक अक्षुण्ण endosteal क्षेत्र के साथ जी वर्गों, diaphyseal में के रूप में अच्छी तरह से epiphyseal क्षेत्रों में undecalcified हड्डी से दोनों। एक भोले C57BL 6 / माउस की एक 7 माइक्रोन मोटी हड्डी खंड धमनियों (हरा) और नाभिक के लिए (नीला, DAPI) कल्पना करने के लिए Sca-1 के लिए, बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन Laminin (लाल) के लिए सना हुआ था। 1446 X 1088 माइक्रोन से 47 टाइल्स, संकल्प 1360 X 1024 पिक्सल दर्ज की गई और सिंहावलोकन छवि बनाने के लिए सिले थे। यह छवि एक 10x उद्देश्य लेंस (0.45 एनए) के साथ, एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर अधिग्रहण कर लिया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
स्ट्रोमल और hematopoietic अस्थि मज्जा कोशिकाओं के चित्रा 2. स्वचालित पहचान। एक लाल फ्लोरोसेंट ची के एक और्विक हड्डी अनुभागको बढ़ावा देने के एक दिन बाद 30 पर meric माउस स्ट्रोमा, MBP (लाल, इयोस्नोफिल्स), κ और λ प्रकाश श्रृंखला (हरे, पीसी) और B220 (नीले, बी कोशिकाओं) कल्पना करने के लिए आरएफपी (ग्रे) के लिए सना हुआ था। वाम: मूल छवि एक 20x उद्देश्य लेंस (0.8 एनए) और 708.15 एक्स 708.15 माइक्रोन से देखने का एक क्षेत्र का उपयोग कर, एक confocal खुर्दबीन पर हासिल कर ली। अधिकार: खंडों छवि। मान्यता प्राप्त वस्तुओं की रूपरेखा पर प्रकाश डाला जाता है। सफेद आयतों नीचे चित्र में दिखाया क्षेत्र को चिह्नित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा प्रशिक्षित रेटर द्वारा स्वचालित छवि विश्लेषण 3. मान्यकरण। (ए) एक (स्ट्रोमल संरचनाओं) में स्ट्रोमल संरचनाओं और प्रशिक्षित रेटर द्वारा गिना hematopoietic कोशिकाओं की कुल सेल नंबर के कुल क्षेत्र, 10 स्वचालित छवि विश्लेषण द्वारा प्राप्त सेल नंबर की तुलना में (पीसी), दो (इयोस्नोफिल्स) और एक छवि (बी कोशिकाओं)। डॉट्स व्यक्ति रेटर का प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 5-6)। बार्स मतलब मूल्यों या स्वचालित रूप से निर्धारित मूल्यों से संकेत मिलता है। स्वचालित विश्लेषण द्वारा निर्धारित औसत वस्तु के आकार की तुलना में मैन्युअल रूप से गिना वस्तुओं की (बी) वस्तु आकार के वितरण। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के विभिन्न आवृत्तियों के लिए खाते में करने के लिए, पीसी के एक छवि में दो और बी कोशिकाओं में, 10 में इयोस्नोफिल्स गिना रहे थे। डॉट्स व्यक्तिगत वस्तुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। लाइन्स मतलब संकेत मिलता है। (सी) प्रशिक्षित रेटर द्वारा स्ट्रोमल संरचनाओं के मैनुअल outlining है। वाम: मूल छवि। मध्य: मैन्युअल विश्लेषण किया छवियों के उदाहरण हैं। अधिकार:। स्वचालित विश्लेषण से पता लगाया स्ट्रोमल संरचनाओं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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ऊरु अस्थि मज्जा में पीसी, इयोस्नोफिल्स, बी कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं की चित्रा 4. स्वचालित सह स्थानीयकरण विश्लेषण। (ए) वाम: स्ट्रोमल संरचनाओं, इयोस्नोफिल्स, बी कोशिकाओं या बढ़ावा देने के एक दिन बाद 30 पर फ्लोरोसेंट काइमेरिक चूहों में अन्य पीसी के साथ सीधे संपर्क में पीसी की आवृत्ति। मध्य और सही: 10 माइक्रोन आसपास या स्ट्रोमल संरचनाओं, इयोस्नोफिल्स, बी कोशिकाओं या अन्य पीसी के 20 माइक्रोन आसपास के क्षेत्र में पीसी की आवृत्ति। यह आंकड़ा (सीधा संपर्क, 10 माइक्रोन आसपास के क्षेत्र) के हिस्से। Zehentmeier एट अल से संशोधित स्ट्रोमल संरचनाओं के साथ सीधे संपर्क में पीसी, इयोस्नोफिल्स और बी कोशिकाओं के 9 (बी) आवृत्ति हैं। 52-515 पीसी, 918-3179 इयोस्नोफिल्स, 10-21 छवियों में 4,146-13,063 बी कोशिकाओं दो स्वतंत्र प्रयोगों से जमा को बढ़ावा देने के एक दिन बाद 30 पर 5 फ्लोरोसेंट काइमेरिक चूहों से गिना रहे थे। डॉट्स व्यक्तिगत चूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं। लाइन्स मंझला संकेत मिलता है।: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
अस्थि मज्जा पीसी, इयोस्नोफिल्स और बी कोशिकाओं की कोशिका का आकार वितरण 5. निर्धारण चित्रा। सिमुलेशन उपकरण के ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) (ए) स्क्रीनशॉट। (हरी κ और λ प्रकाश श्रृंखला,) पीसी (बी) सेल आकार वितरण (PX में क्षेत्र), इयोस्नोफिल्स (MBP, लाल) और बी कोशिकाओं Volocity सॉफ्टवेयर (ऊपरी पैनल) द्वारा वस्तु मान्यता के बाद के रूप में मापा (B220, नीला) histograms में दिखाया गया है। ऊरु अस्थि मज्जा छवियों (कम पैनल) में, पीसी (पीले उपरिशायी), पीले रंग में ब्लू (ओवरले बैंगनी) में इयोस्नोफिल्स और बी कोशिकाओं (ग्रे उपरिशायी) लाल रंग में चिह्नित कर रहे हैं का पता चला। छवि विभाजन, पीसी के लिए 180 पिक्सल की एक न्यूनतम आकार सीमा से सेटिंग के द्वारा प्रदर्शन किया गया थाइयोस्नोफिल्स के लिए 300 पिक्सल और बी कोशिकाओं के लिए 220 पिक्सल। 250 वस्तुओं, पीसी के लिए इयोस्नोफिल्स के लिए 650 वस्तुओं और बी कोशिकाओं के लिए 3,000 वस्तुओं मापा गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
नकली यादृच्छिक सेल स्थिति के लिए मुखौटा 6. पीढ़ी चित्रा। (ए) के विभिन्न थ्रेसहोल्ड लगाने से उत्पन्न द्विआधारी छवियों के साथ DAPI की मूल DAPI चैनल (पीला) के रूप में अच्छी तरह से ओवरले दिखाए जाते हैं। बाइनरी छवि (सीमा 10 करने के लिए सेट) से उत्पन्न मुखौटा (कम पैनल, सही छवि) के नीचे प्रदर्शित किया जाता है। काले क्षेत्रों नहीं जाना क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं, सफेद क्षेत्रों (बी)। दर्ज की छवि कोशिकाओं रखा जा करने की अनुमति है उन क्षेत्रों में जहाँ का प्रतिनिधित्व करते हैं (बाएं) और इसी नकली छवि (दाएं) दृश्य उच्च दिखानेमेल। इयोस्नोफिल्स (MBP), पीसी (κ और λlight श्रृंखला), बी कोशिकाओं (B220) और (आरएफपी) प्रदर्शित कर रहे हैं stromal कोशिकाओं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
बनाम दर्ज नकली छवियों में स्ट्रोमल संरचनाओं के साथ hematopoietic सेल प्रकार की चित्रा 7. प्रत्यक्ष संपर्क। में स्ट्रोमा के साथ सीधे संपर्क में पीसी, इयोस्नोफिल्स और बी कोशिकाओं (ए) आवृत्ति को बढ़ावा देने के एक दिन बाद 30 पर फ्लोरोसेंट काइमेरिक चूहों की दर्ज की छवियों की तुलना में नकली। लाइन्स छवियों (डॉट्स) नकली और दर्ज की गई इसी कनेक्ट। एक प्रतिनिधि माउस की छवियाँ प्रत्येक प्लाट में दिखाए जाते हैं। स्ट्रोमा के साथ सीधे संपर्क में पीसी, इयोस्नोफिल्स और बी कोशिकाओं (बी) आवृत्तियों में 5 की दर्ज की छवियों की तुलना में नकली दो स्वतंत्र प्रयोगों से व्यक्तिगत चूहों। Wilcoxon रैंक परीक्षण, दो पूंछ (पीसी पर हस्ताक्षर किए: *** पी = 0.0001, * पी = 0.0371, * पी = 0.0161; ** पी = 0.0012; **** पी <.0001; इयोस्नोफिल्स: *** पी = 0.0007 ; पी = 0.1055, * पी = 0.0161; पी = 0.4143; *** पी = 0.0007, बी कोशिकाओं: **** पी <.0001; ** पी = 0.0020; *** पी = 0.0005; ** पी = 0.0012 ; **** पी <.0001)। डॉट्स व्यक्तिगत छवियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। बार्स मतलब संकेत मिलता है। पी मूल्यों 0.05 महत्वपूर्ण मतभेद माना जाता है। एनएस: आंकड़े में तारों निम्नलिखित पी मूल्यों का संकेत P> 0.05; *: पी .05; **: पी .01; ***: पी 0.001; ****: पी .0001। यह आंकड़ा (स्ट्रोमल संरचनाओं के साथ पीसी का सीधा संपर्क) के कुछ हिस्सों Zehentmeier एट अल से संशोधित कर रहे हैं। 9 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

700 "/>
। - Hematopoietic सेल के लिए मात्रा का ठहराव दृष्टिकोण से 8 चित्रा पूरा कार्यप्रवाह murine अस्थि मज्जा में स्ट्रोमल सेल बातचीत दृष्टिकोण के तीन प्रमुख भागों में बांटा गया है: 1. murine अस्थि मज्जा वर्गों तैयार कर रहे हैं और कच्चे डेटा लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी, 2 से इकट्ठा किया जाता है । दर्ज की छवियों की स्वचालित विश्लेषण और अस्थि मज्जा कोशिकाओं के यादृच्छिक स्थिति का अनुकरण दर्ज की गई और नकली छवियों से प्राप्त 3. संपर्क और पड़ोस मायने रखता तुलना कर रहे हैं, प्रदर्शन किया है। इनपुट (छवि फ़ाइलें) और स्वचालित विश्लेषण के उत्पादन में (पाठ फ़ाइल) नीले रंग में संकेत दिया है, इनपुट (छवि फ़ाइलें) और निर्गम (पाठ फ़ाइलें और, वैकल्पिक रूप से, छवि फ़ाइलें) सिमुलेशन उपकरण के हरे रंग में संकेत दिया है। कृपया क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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Discussion

आधुनिक ऑप्टिकल इमेजिंग के तरीकों में प्रगति के बावजूद, ऊतकीय डेटा का विश्लेषण अब भी अक्सर उचित मात्रा का ठहराव उपकरणों और तरीकों, के अभाव के कारण या ब्याज के एक छोटे से क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित है कि पक्षपातपूर्ण विश्लेषण द्वारा रुकावट है। यहाँ प्रस्तुत synergistic दृष्टिकोण छवि पूरे अस्थि मज्जा क्षेत्र को कवर विश्लेषण, स्वचालित विभाजन और विभिन्न हिमेटोपोयटिक और stromal सेल प्रकार, सह स्थानीयकरण विश्लेषण की मान्यता वस्तु, और एक नया कस्टम द्वारा प्रदान की गैर बेतरतीब ढंग से होने वाली संपर्कों के अंत में एक मान्यकरण उपकरण को जोड़ती है डिजाइन किए सिमुलेशन सॉफ्टवेयर।

अस्थि मज्जा सहित पूरे हड्डियों के ऊतक विज्ञान की वजह से एक खंड में मौजूद विभिन्न ऊतक घनत्व के लिए प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो गया है - एक हाथ बहुत मुश्किल है, mineralized हड्डी पर, आसानी से जब कटौती बाधित हो जाता है, जो दूसरी ओर अत्यंत नाजुक मज्जा, पर एक साथ हड्डी के साथ। एक वैकल्पिक, हड्डी वर्गों दबाव को काटने के लिए टेप पद्धति के रूप मेंented यहाँ 14,15 यह जिससे बरकरार (चित्रा 1) endosteal क्षेत्रों छोड़ रहा है, ऊतक कि स्थिर लाभ है। अस्थिकोरक में समृद्ध होने के अलावा, इन क्षेत्रों में स्टेम सेल रखरखाव 20 में एक भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है।

विकास की प्रक्रिया और अस्थि मज्जा में सेलुलर रखरखाव में stromal कोशिकाओं की महत्वपूर्ण भूमिका तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है। हालांकि, इन दुर्लभ, कमजोर कोशिकाओं का विश्लेषण दो कारणों के लिए मुश्किल साबित हो गया है: पहला, वे अस्थि मज्जा से अलग करने के लिए मुश्किल हो जाता है; दूसरा, स्ट्रोमल आबादी के बीच विविधता की डिग्री नहीं जाना जाता है, और इसलिए एक stromal कोशिकाओं के लिए वर्णित किया गया है कि कुछ मार्कर का उपयोग करके एक महत्वपूर्ण जनसंख्या याद कर सकते हैं। फ्लोरोसेंट अस्थि मज्जा काइमेरा उत्पन्न करने के लिए विधि fluorescently चिह्नित करने के लिए उपयोगी है और बाद में एक पूरे के रूप में अस्थि मज्जा stromal सेल आबादी का विश्लेषण। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन मील मेंअस्थि मज्जा के सीई सभी mesenchymal कोशिकाओं endothelial कोशिकाओं और अस्थिकोरक सहित कल्पना कर रहे हैं। यह एक ऐसी काइमेरिक चूहों से डेटा का विश्लेषण किया जाता है, तो ध्यान में रखा जाना चाहिए। यह भी विकिरण जीवित प्राप्तकर्ता मूल के hematopoietic कोशिकाओं का एक खतरा नहीं है, भले ही इन कोशिकाओं को आमतौर पर केवल इस प्रकार ऊतकीय विश्लेषण 9 को प्रभावित करने नहीं, दाता CD45 + कोशिकाओं की तुलना में देखने के क्षेत्र में प्रति एक बहुत छोटे से क्षेत्र को कवर किया। जाहिर है, इस विधि स्ट्रोमल (उप) आबादी का एक और अधिक विशिष्ट पता लगाने के साथ बाद में एक चरण में जोड़ा जाना चाहिए। वर्तमान में, इन कोशिकाओं का विश्लेषण ज्यादातर एक ही समय में विश्लेषण किया जा सकता है कि मानकों की संख्या पर कोई सीमा लगाने की वजह से उपरोक्त कारणों के लिए ऊतक विज्ञान द्वारा किया जाता है। मल्टी पैरामीटर के विकास के इन सीमाओं पर काबू पाने में मदद मिलेगी माइक्रोस्कोपी में विश्लेषण करती है।

छवि विश्लेषण के दौरान, विभाजन मूल Otsu के कलन विधि का उपयोग किया गया था। मूलतः, इस क्लस्टरिंग आधारित thresholding विधि स्वचालित रूप से एक द्विआधारी छवि 17, जिसके परिणामस्वरूप में दिए गए चैनल में सबसे कम सांख्यिकीय विचलन के साथ दो समूहों में अग्रभूमि (संकेत) और पृष्ठभूमि (शोर) पिक्सल का इष्टतम अलग होने के लिए तीव्रता दहलीज निर्धारित करता है। इधर, Otsu की विधि मूल छवि का प्राकृतिक लघुगणक संस्करण के लिए लागू किया गया था, वह यह है:

Otsu के लिए इनपुट छवि = एलएन (इनपुट छवि)

Otsu की विधि पृष्ठभूमि के रूप में मंद कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं क्योंकि यह प्रतिदीप्ति छवियों के लिए बेहतर काम करता है। लघुगणक समारोह में जोड़ने Otsu एल्गोरिथ्म द्वारा दो अलग-अलग वर्गों में एक बेहतर कोशिकाओं की जुदाई और पृष्ठभूमि के लिए अनुमति देता है। हालांकि, अकेले तीव्रता thresholding ठीक एकल वस्तुओं का पता लगाने के लिए पर्याप्त नहीं है। छवियों में अच्छी तरह से अलग वस्तुओं का पता लगाने के लिए जब यह कुशलता से काम करता है, लेकिन यह समूहों के भीतर स्थित अलग एकल कक्षों के लिए पर्याप्त नहीं है। सेल प्रकार के कुछ के रूप में है किऐसे इयोस्नोफिल्स या बी कोशिकाओं के रूप में, अक्सर ऊतक में एक समूह है, हमारे लिए ब्याज के थे, DAPI चैनल में उनके नाभिक कश्मीर = 10 21। साथ तीव्रता हिस्टोग्राम की कश्मीर का मतलब है क्लस्टरिंग के आधार पर एक कलन विधि का उपयोग खंडों गया सेल विभाजन एल्गोरिथ्म (10 डिब्बे में क्लस्टर) dimmest पिक्सल के लिए छात्रों को साजिश और लगातार सेल जैसी वस्तुओं के गठन के लिए दिखेगा। इन वस्तुओं फिर कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया जाएगा। सभी पिक्सल का इस्तेमाल किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप नाभिक तो क्लस्टर अलग होने के लिए अन्य चैनलों के लिए लागू किया जाता है कि एक मुखौटा उत्पन्न करने के लिए फैली हुई कर रहे हैं।

यह वजह से एक दूसरे का संबंध के लिए इस विश्लेषण कॉम्पैक्ट हैं कि hematopoietic कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन यह इन बड़े, फैल आउट कोशिकाओं की सीमाओं का निर्धारण करने के लिए संभव नहीं है, क्योंकि यह stromal कोशिकाओं के लिए सम्मान के साथ सीमित है कि ध्यान दिया जाना चाहिए कि उनके एक जालीदार नेटवर्क के रूप में है कि वृक्ष के समान एक्सटेंशन। इस प्रकार, सेल stromal कोशिकाओं के लिए मायने रखता हैउपलब्ध नहीं कराया जा सकता है। स्ट्रोमा-विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण के तहत भाग्य-मानचित्रण संवाददाताओं के माध्यम से एकल कक्षों लेबल लिम्फ नोड्स में और कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं की लेबलिंग के लिए ("Brainbow" प्रणाली 22 का प्रयोग करके) न्यूरॉन्स के लिए प्रकाशित किया गया है क्या के अनुसार, इस मुद्दे का समाधान होगा 23।

30 पिक्सल नीचे वस्तुओं को छोड़कर द्वारा सभी चैनलों के लिए एक शोर में कमी कदम को लागू करने के अलावा, आकार अपवर्जन हिमेटोपोयटिक के लिए वस्तु मान्यता की प्रक्रिया में लागू है, लेकिन कोशिकाओं stromal नहीं किया गया था। बाहर रखा जा सकता सेक्शनिंग द्वारा काट रहे थे कि कोशिकाओं के छोटे टुकड़े; हालांकि, नुकसान कोशिकाओं की एक स्पष्ट मान्यता के पक्ष में इस मामले में उपेक्षा की जा सकती है। दो से तीन आयामों से विश्लेषण और अनुकरण का विस्तार इस सीमा को पार करेंगे। विधियों का विकास निश्चित रूप वीं में मदद मिलेगी, बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी या प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी / SPIM से जैसे पूरे mounts में सेलुलर वितरण, अध्ययन करने के लिएसम्मान है। बहु-घटक niches के जटिल सेलुलर संरचना का अध्ययन करने के क्रम में, यह भी बगल में विश्लेषण किया जा रहा है कि मानकों की संख्या का विस्तार करने के लिए आवश्यक हो जाएगा। Cytometric मात्रा का ठहराव के साथ संयोजन में ऊतकीय जानकारी के Multiparameter विश्लेषण के लिए आशाजनक दृष्टिकोण, 25 हाल ही में 24 प्रकाशित किया गया है।

संपर्क विश्लेषण दो वस्तुओं के ओवरलैप बढ़ाता द्वारा प्रदर्शन किया गया था। प्रत्यक्ष संपर्क में कम से कम एक पिक्सेल का एक ओवरलैप के रूप में परिभाषित किया गया था। महत्वपूर्ण बात है, इस विश्लेषण माइक्रोस्कोपी छवियों का संकल्प द्वारा सीमित है और इसलिए माइक्रोस्कोप में इस्तेमाल उद्देश्य लेंस की संख्यात्मक एपर्चर, और पिनहोल आकार पर है, साथ ही तरंग दैर्ध्य और उत्तेजना के मोड पर निर्भर करता है। यहाँ दिखाए गए विश्लेषण में, fluorochrome के संयोजन के साथ एक 0.8 एनए, 20X उद्देश्य 488, 561, 594 के साथ उत्साहित है, और एक फोटान उत्तेजना का उपयोग कर 633 एनएम लागू किया गया था। इसलिए, पार्श्व संकल्प के बीच मूल्यों0.372 और 0.483 माइक्रोन प्राप्त किया गया। इस दावे विभिन्न सेल सबसेट का मुक़ाबला के बारे में किए जाने के लिए अनुमति देता है; हालांकि, यह सेलुलर बातचीत में शामिल ख्यात आणविक तंत्र के बारे में कोई जानकारी नहीं देता है। साथ ही, इस तरह के 2 फोटॉन intravital माइक्रोस्कोपी के रूप में अन्य तरीकों इन कहनेवाला संपर्कों 9 के लक्षण वर्णन में सुधार करने की जरूरत है। इन मुलाकातों 26 वास्तव में कार्य कर रहे हैं अगर फोर्स्टर गुंजयमान ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) आधारित प्रणालियों पुष्टि करने के लिए कर सकते हैं।

ऊतक niches के सेलुलर microenvironment का मूल्यांकन करने के लिए, यह प्रत्यक्ष सेल संपर्कों का विश्लेषण करने के लिए, लेकिन यह भी एक निश्चित ब्याज की सेल प्रकार ("आसपास के क्षेत्र विश्लेषण") के पड़ोस में सेल प्रकार यों के लिए न केवल महत्वपूर्ण है। इससे पहले इस तरह के नाभिक 27 की स्थिति के आधार पर जहाजों के रूप में कोशिकाओं और ऊतकों संरचनाओं के बीच की दूरी को मापा अध्ययन प्रकाशित। हम determin में रुचि रखते थे के बाद सेसाइटोप्लास्मिक मात्रा करने के लिए परमाणु के अनुपात के साथ अलग भाग में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की दूरी, आईएनजी, हम सतहों के बीच की दूरी को मापने के लिए पसंद करते हैं। यह अंत करने के लिए, हम PX को माइक्रोन से मूल्यों को बदलने के बाद एक cell's सीमा से Euclidian दूरी निर्धारित करने से आसपास के क्षेत्र त्रिज्या गणना की थी। इयूक्लिडियन दूरी दो पिक्सल और फार्मूला 28 से वर्णित किया जा सकता है के बीच सीधी लाइन दूरी है:
1 समीकरण

जैसे की एक इयूक्लिडियन दूरी, एक लक्ष्य सेल की सीमाओं के पिक्सल से 10 माइक्रोन के भीतर अपनी सीमाओं के पिक्सल के साथ कोशिकाओं को इस सेल पड़ोसी के रूप में गिना गया।

अपने मौजूदा रूप में, विश्लेषण केवल एक सेल से संपर्क किया है या इस प्रकार केवल एक द्विआधारी हाँ / नहीं लक्षण वर्णन प्रदान करने, एक ही या अलग प्रकार का एक और सेल से संपर्क किया है कि निर्धारित करता है। सेल की वास्तविक संख्याइसमें से एक निश्चित दायरे में ब्याज की सेल से संपर्क करें या कर रहे हैं कि गणना नहीं है। अगले कदम के लिए संपर्क करने या कोशिकाओं पड़ोसी के समूह आकार का पता लगाया और एक ही प्रकार के अलग अलग लक्ष्य कोशिकाओं के बीच तुलना की जा सकती है कि एक तरह से वर्तमान विश्लेषण का विस्तार करने के लिए किया जाएगा। यह एक ऐसी हिमेटोपोयटिक गौण कोशिकाओं का एक अलग योगदान 29-33 चर्चा की गई है, जिसके लिए अस्थि मज्जा प्लाज्मा कोशिकाओं के लिए जीवित रहने की जगह है, के रूप में अस्थि मज्जा आलों की संरचना के बारे में महत्वपूर्ण अतिरिक्त जानकारी के लिए नेतृत्व करेंगे।

वस्तु मान्यता एल्गोरिदम Wimasis से विशेषज्ञों को उनके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कस्टम समाधान सेवा का उपयोग करने और अनुरोध पर उपलब्ध हैं के साथ एक साथ अनुकूलित किया गया। एक अन्य विकल्प ऐसे Definiens, Volocity, या Imaris, या CellProfiler के रूप में इस तरह के फ्रीवेयर के रूप में छवि विश्लेषण, के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर या तो उपयोग करने के लिए है।

स्वचालित सेल विभाजन और छवि विश्लेषण उपकरणों हमदो मापदंडों, अर्थात् वस्तु के आकार और विभिन्न सेल आबादी में कोशिकाओं की संख्या के संबंध में छह प्रशिक्षित छवि रेटर द्वारा प्रदान की मैन्युअल रूप से डेटा का विश्लेषण के साथ अपने परिणामों की तुलना द्वारा मान्य कर रहे हैं। चित्रा 3 बी, hematopoietic कोशिकाओं (पीसी, इयोस्नोफिल्स, और बी सेल) के लिए औसत वस्तु आकार में दिखाया गया है उनके अधिक अनियमित आकार की तुलना में शायद की वजह से, प्लाज्मा कोशिकाओं और इयोस्नोफिल्स के लिए मैनुअल आकार निर्धारण के लिए एक उच्च विचरण के साथ, दोनों तरीकों के बीच समान था कोशिकाओं बी। सेल नंबर की स्वचालित पता लगाने के लिए मैन्युअल रूप से पता चला लोगों की तुलना में थोड़ा कम मूल्यों झुकेंगे। वे बी कोशिकाओं के मामले में इन मूल्यों के नीचे थे, जबकि विशेष रूप से, वे शायद कारण एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जो B220 की अभिव्यक्ति का एक उच्च विविधता, करने के लिए, इयोस्नोफिल्स और पीसी के मामले में मार्गदर्शन मूल्यों की सीमा के भीतर अभी भी थे बी कोशिकाओं के लिए। B220 ऊपर विनियमित अस्थि मज्जा में बी सेल भेदभाव के दौरान हो जाना जाता है, और बी कम के साथ कोशिकाओं के साथ ही उच्च मैंB220 के लिए ntensity धुंधला मनाया जा सकता है। कम B220 संकेतों के साथ बी कोशिकाओं को जल्द से जल्द चरण बी कोशिकाओं का बहिष्कार करने के लिए मार्ग प्रशस्त किया है जो हो सकता है एप्लाइड सीमा से नीचे गिर गया। स्वचालित पता लगाने के लिए एक कम सीमा से इस मुद्दे को हल कर सकते हैं। कारण उनके कम कॉम्पैक्ट, अधिक वृक्ष के समान करने के लिए पता लगाने के लिए कड़ी मेहनत कर रहे है, जो stromal कोशिकाओं, और बढ़ाया आउट आकृति विज्ञान के लिए, पुस्तिका का पता लगाने व्यक्ति रेटर के बीच उच्च प्रसरण में हुई। दिलचस्प बात यह है स्ट्रोमा की औसत कुल क्षेत्रफल विश्लेषण अच्छी तरह रेटर द्वारा व्यक्तिगत पूर्वाग्रह के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए अनुकूल है, यह दर्शाता है कि स्वचालित रूप से निर्धारित कुल क्षेत्रफल के बराबर था। साथ में ले ली, इन आंकड़ों से स्वचालित परिणाम आम तौर पर मार्गदर्शन विश्लेषण के औसत मूल्यों का प्रतिनिधित्व और अच्छी तरह से विश्लेषण में interrater परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए उपयुक्त हैं कि दिखा।

ऊतक के संरचनात्मक सीमाओं के भीतर कोशिकाओं के यादृच्छिक और गैर यादृच्छिक स्थिति भेदभाव करने के लिए, एक सिमुलेशन उपकरण विकसित किया गया था। Durसिमुलेशन आईएनजी, बेतरतीब ढंग से तैनात hematopoietic कोशिकाओं के साथ एक कृत्रिम छवि हर दर्ज की अस्थि मज्जा ऊतकीय छवि के लिए बनाया जाता है। सबसे पहले, स्ट्रोमा चैनल छवि अपने मूल स्वरूप में उपयोग किया जाता है। एक मुखौटा है, इस प्रकार बाइनरी स्वरूप में छवि परिवर्तित करने, एक निश्चित तीव्रता के आधार पर सीमा से लागू करने के द्वारा DAPI छवि से उत्पन्न होता है; बाइनरी मुखौटा तो पिक्सेल आधारित फैलाव और कटाव के कई चरणों से होकर गुजरती है। मुखौटा नकली कोशिकाओं रखा जा करने की अनुमति दी जाती है, जहां छवि क्षेत्र में क्षेत्रों को परिभाषित करता है। नकली कोशिकाओं के केन्द्रों के समन्वय के लिए एक वर्दी यादृच्छिक संख्या जनरेटर द्वारा प्रदान की जाती हैं, सीमाओं जो की छवि आकार के द्वारा निर्धारित किया जाता है। दर्ज की गई छवियों की स्वचालित छवि विश्लेषण द्वारा निर्धारित प्रत्येक आबादी के लिए सेल नंबर और औसत सेल आकार के बारे में सूचना नकली hematopoietic सेल आबादी को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। नकली सेल व्यास एक आयामी गाऊसी वितरण का पालन करने के लिए माना जाता है, जो वास्तविक सेसेल व्यास बेतरतीब ढंग से चुना जाता है: न्यूनतम स्वीकार्य वस्तु के आकार के लिए सेल आकार में कटौती नापसंद पेश कर रहे हैं इतना है कि व्यास फिर संशोधित किया गया है। मामले में नकली सेल एक या एक से अधिक पिक्सल एक नहीं जाना क्षेत्र के साथ ओवरलैप या किसी अन्य को पहले से ही रखा सेल (दर्ज की छवियों में निर्धारित के रूप में केंद्र के लिए केंद्र से चार माइक्रोन), नई यादृच्छिक निर्देशांक से एक पूर्वनिर्धारित दूरी के भीतर हो जाएगा कि इस तरह तैनात किया जाएगा व्यास अनछुए छोड़ दिया है जबकि चुना जाएगा। नकली कोशिकाओं की संख्या दर्ज की छवि में कोशिकाओं की संख्या के बराबर होती है, जब तक यह दोहराया जाएगा।

उपकरण स्ट्रोमल संरचनाओं ऊतक के भीतर एक निश्चित मैट्रिक्स के रूप में कार्य करते हुए hematopoietic कोशिकाओं, अस्थि मज्जा के भीतर स्वतंत्र रूप से तैनात किया जा सकता है कि इस धारणा पर आधारित था। उपकरण parenchymal क्षेत्रों sinusoids की एक जटिल प्रणाली से पार कर रहे हैं, जहां अस्थि मज्जा में स्थिति के लिए अनुकूलित किया गया था। इसी प्रकार का एक मॉडलिंग दृष्टिकोण हाल ही में आदेश Frenette और सह कार्यकर्ताओं द्वारा प्रकाशित किया गया थाकुल ऊरु अस्थि मज्जा की मात्रा 25 के बारे में 30% तक है जो stromal कोशिकाओं और संवहनी संरचनाओं, के संबंध में hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की स्थिति का विश्लेषण। इस आशय के लिए सही करने के लिए आदेश में, यहाँ प्रस्तुत सिमुलेशन उपकरण क्षेत्रों में से एक मुखौटा पर आधारित है कोशिकाओं रखा जा करने की अनुमति दी जाती थे। यह नाभिक का प्रतिनिधित्व वस्तुओं एक 5-कदम फैलाव से विस्तार किया गया, जिसमें एक परमाणु दाग छवि का उपयोग करके हासिल की थी binarization के बाद (6 चित्रा देखें)। एक कम सेलुलर घनत्व, यानी, ऐसी हड्डी और sinusoids के रूप में नाभिक के कम घनत्व के साथ क्षेत्रों नकाब में योगदान और इसलिए क्षेत्रों नहीं जाना नहीं बन जाएगा। फैलाव प्रक्रिया द्वारा इन नहीं जाना क्षेत्रों की एक कृत्रिम कमी से बचने के क्रम में, एक 5-कदम कटाव इस प्रकार क्षेत्रों अनछुए (इसलिए "की अनुमति") उच्च परमाणु घनत्व छोड़ने, जबकि बड़ा बहिष्कार क्षेत्रों दोबारा खोलने, बाद में लागू किया गया था। इस विधि को आसानी से अन्य ल्य्म्फोइड अंगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। टी उन मेंमुद्दों ऐसे साइटोप्लास्मिक लेबलिंग के रूप में अन्य तरीकों मुखौटा बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, (एक उच्च कोशिका द्रव्य / नाभिक अनुपात के साथ कोशिकाओं मौजूद हैं, जहां क्षेत्रों में, उदाहरण के लिए) इस विधि का काम नहीं कर सकते थे।

Hematopoietic कोशिकाओं जिसका आकार प्रत्येक कोशिका प्रकार की गणना की औसत व्यास के साथ सहमति व्यक्त की, जो मतलब है की एक गाऊसी यादृच्छिक संख्या जनरेटर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था परिपत्र वस्तुओं के रूप में नकली थे। वितरण की चौड़ाई एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित रूप में दर्ज की छवियों में मापा सेल आकार वितरण पर आधारित था। प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए मापा सेल आकार वितरण से निर्धारित के रूप में छोटे सेलुलर टुकड़े स्वचालित छवि विश्लेषण में बाहर रखा गया है कि खाते में लेने के क्रम में, सेल आकार नापसंद कटौती शुरू किए गए थे (चित्रा 5 देखें)।

स्वाभाविक रूप से, यह उनके आकार और आकार में अपेक्षाकृत एक समान हैं लेकिन कोशिकाओं है कि एक के मामले में समस्याओं को जन्म दे सकता है कि सेल प्रकार के लिए अच्छी तरह से काम करता हैइन मानकों के संबंध में अत्यधिक विषम रहे हैं। यह इस विश्लेषण में वे एक नियमित रूप से, लगभग गोल आकार के अधिकारी है कि आम में है जो अस्थि मज्जा (granulocytes, hematopoietic progenitors और लिम्फोसाइटों) में प्रमुख hematopoietic प्रकार की कोशिकाओं, के लिए अनुकूलित है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। हालांकि, इस पद्धति वृक्ष के समान कोशिकाओं या मैक्रोफेज, दृढ़ता से अनियमित सेल शरीर के साथ प्रकार की कोशिकाओं के लिए परीक्षण नहीं किया गया है। का विश्लेषण ऐसी कोशिकाओं में सुधार सेल क्लस्टर जुदाई एल्गोरिदम 24 के रूप में भी विस्तृत आकार-विश्लेषण और न केवल अलग आकार, लेकिन यह भी अलग आकार की कोशिकाओं के अनुकरण के लिए आवश्यकता सहित, हमारे स्वचालित छवि विश्लेषण करने के साथ ही अनुकरण के दृष्टिकोण के लिए नई चुनौतियों को पेश करेंगे। एक विकल्प के रूप में दर्ज सटीक आकार के साथ काम करता है कि एक सिमुलेशन दृष्टिकोण होगा। हालांकि, यह इस पद्धति काफी मॉडल प्रणाली का नियतात्मक व्यवहार में वृद्धि होगी कि ध्यान दिया जाना चाहिए।

नकली अनुभव के लिएriments, हर दर्ज की छवि के लिए अनुकरण का 1000 पुनरावृत्ति उत्पन्न किया गया। यह कई repetitions के उपयोग के बारे में 3% करने के लिए सिमुलेशन प्रक्रिया से ही योगदान रिश्तेदार त्रुटि कम हो जाएगा। सेल सेल सह स्थानीयकरण मूल्यों यादृच्छिक हैं कि सिमुलेशन से गणना कर रहे हैं अगर अर्थात्, तो सिमुलेशन प्रक्रिया ही एन मापा छवि प्रति सिमुलेशन की संख्या है, जहां एक एन -1/2 त्रुटि समारोह, की विशेषता होगी। इस मापा सह स्थानीयकरण मूल्यों का संचित त्रुटि के लिए सिमुलेशन प्रक्रिया से ही योगदान है। इस प्रकार, एन = 1000 के लिए योगदान त्रुटि 3.16% है। केवल .JPEG या झगड़ा प्रारूप में .rect फ़ाइलों के रूप में नकली छवियों (एक साधारण पाठ प्रारूप) के बजाय के रूप में वास्तविक छवियों (सॉफ्टवेयर में भी एक विकल्प बचत जब यहाँ दिखाया सिमुलेशन 1000 repetitions के प्रति छवि प्रति 60 मिनट के लिए 20 के लिए दौड़ा )।

साथ में ले ली, इस दृष्टिकोण ऊतकीय छवि का एक निष्पक्ष, उच्च throughput विश्लेषण के लिए अनुमति देता हैs और सांख्यिकीय प्रासंगिक डेटा की पीढ़ी के लिए सक्षम बनाता है। यह अलग अलग परिस्थितियों में सेलुलर स्थानीयकरण की तुलना में उपयोगी हो सकता है। इसके अलावा, भविष्य में अस्थायी घटक कर सकते अस्थि मज्जा में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की गतिशीलता पर और अधिक डेटा के रूप में, अस्थि मज्जा सेल आंदोलनों की एक मॉडलिंग दृष्टिकोण में एकीकृत किया जा उपलब्ध हो जाता है। यह विधि तब इस तरह के संचलन में अस्थि मज्जा से कोशिकाओं की लामबंदी, उदाहरण के लिए, एक तीव्र सूजन 34 के मामले में न्यूट्रोफिल रूप में इस प्रणाली के perturbations अनुकरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आगे प्रतिरक्षा कोशिकाओं स्मृति के लिए एक भंडारण स्थान के रूप में अस्थि मज्जा के समारोह को स्पष्ट करने के लिए, एक भी अस्तित्व कारकों के लिए प्रतिस्पर्धा करने के लिए मॉडल इसे विस्तार देने की कल्पना कर सकते हैं। इसके अलावा, अलग niches के बीच संभव crosstalk को संबोधित है, साथ ही आलों की प्रेरण किया जा सकता है। साथ में, यह शारीरिक परिवर्तनों को समझने में मदद मिलेगी w के रूप में (जैसे, स्टेम कोशिकाओं में पुनर्योजी व्यवहार के लिए चलाता है)पक्ष autoimmune विकार, रसौली, या तीव्र सूजन के मामले में उदाहरण के लिए एक पूरे के रूप में प्रणाली के रोग perturbations, के रूप में। प्रयोग और मॉडलिंग के चलने का एक अवधारणा के रूप में हिस्सा, नई परिकल्पनाओं, बारी में फिर से प्रयोगात्मक परीक्षण किया जा सकता है, जो सिमुलेशन, के आधार पर निर्मित किया जा सकता है जिससे आगे ऊतकों की जटिलता के भीतर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के समारोह और बातचीत को समझने के लिए मदद।

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Acknowledgments

हम बहुमूल्य विचार विमर्श के लिए एंड्रियास Radbruch धन्यवाद। हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए जानवरों की देखभाल और रॉबर्ट गुंठर साथ सहायता के लिए Gruczek, पैट्रिक Thiemann और मैनुएला Ohde SABINE के लिए आभारी हैं। हम पांडुलिपि की proofreading के लिए ऊतक विज्ञान के नमूनों का मूल्यांकन और रैंडी Lindquist के लिए हमारे प्रशिक्षित रेटर लौरा Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, कैट्रीन रोथ, फ्लोरेंस Pache और कथरीना हॉर्न धन्यवाद। हम MBP के विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए जे और एन ली, मेयो क्लीनिक, Scottsdale, एरिज़ोना, संयुक्त राज्य अमरीका धन्यवाद।

इस काम के intravital माइक्रोस्कोपी के लिए जिमी-एक DFG कोर सुविधा नेटवर्क अनुदान द्वारा और द्वारा DFG HA5354 / 4-1, द्वारा समर्थित किया गया TRR130 / TP17, और DFG AEHSZ के लिए 2165 (HA5354 / 6-1) के लिए अंतर्राष्ट्रीय मैक्स प्लैंक द्वारा समर्थित किया गया संक्रामक रोगों और इम्यूनोलॉजी (IMPRS-ईदी), बर्लिन के लिए स्कूल।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neomycin Sigma N6386 SIGMA Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC Serumwerke Bernburg 1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin) Sigma P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg Rockland D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade) Science Services 15713 EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose Carl Roth 4621.1
Dry ice
Acetone Sigma-Aldrich 179124 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane Sigma-Aldrich 208752 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard) Sakura 4557 25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583
Kawamoto's SCEM embedding medium Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit  Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9) Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile Thermo Scientific 3052835 L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated Rockland 600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin Life Technologies S-32355
Rat anti-MBP J. and N. Lee available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647 Life Technologies A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594 produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium DAKO S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) Carl Roth H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm) VWR 48311-703
Laser scanning confocal microscope equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow Wimasis, Munich The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime Microsoft free download
Simulation tool for random cell positioning available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software  free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).

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References

  1. Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
  2. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
  3. Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
  4. Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
  5. Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
  6. Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
  7. Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
  8. Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
  9. Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
  10. Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
  11. Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
  12. Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
  13. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
  14. Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
  15. Smith, C. L., et al. Basic confocal microscopy. Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).
  16. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
  17. Hughes, I., Hase, T. Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2010).
  18. Quinn, G. P., Keough, M. J. Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2002).
  19. Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
  20. MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. 1965 Jun 21-Jul 18, Statistical Laboratory of the University of California, Berkeley, , University of California Press. Berkeley, CA. 666 (1967).
  21. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  22. Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
  23. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
  24. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
  25. Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
  26. Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
  27. Danielsson, P. E. Euclidian distance mapping. Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).
  28. Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells - a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
  29. Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
  30. Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
  31. Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
  32. Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
  33. Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).

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Hematopoietic सेल की स्वचालित मात्रा - Undecalcified अस्थि के histological छवियाँ में stromal सेल सहभागिता
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Zehentmeier, S., Cseresnyes, Z.,… More

Zehentmeier, S., Cseresnyes, Z., Escribano Navarro, J., Niesner, R. A., Hauser, A. E. Automated Quantification of Hematopoietic Cell – Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone. J. Vis. Exp. (98), e52544, doi:10.3791/52544 (2015).

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