Abstract
共焦点顕微鏡は、骨髄のような複雑な組織内の複数の細胞型の局在の分析のために選択される方法である。多くの場合、それは、このように評価者に依存するバイアスを導入し者間信頼性を低下させる危険性を有する、手動カウントに依存しているしかし、細胞局在の分析及び定量化は困難である。また、細胞型は、それらの出現頻度に強く異なる場合は特に、ランダムな位置からの二つのセルの結果の間の共局在するかどうかを判断することはしばしば困難である。ここでは、骨髄中の細胞の共局在の公平な定量化するための方法が導入される。プロトコルは、骨髄を含む全マウスの長骨の組織学的切片を得るために使用される試料調製、ならびに染色プロトコルと高解像度画像の取得を記載している。造血細胞および非ヘマトの認識及ぶ分析のワークフローこれらの細胞間の直接的なコンタクトの定量に2次元（2D）骨髄画像におけるopoietic細胞型が提示される。これはまた、特定の細胞型を、周囲の細胞微小環境に関する情報を取得するために、近傍分析を含む。 2つの細胞型の共局在は、ランダムセル測位の単なる結果であるか、または細胞間の優先的な関連性を反映しているかどうかを評価するために、造血ならびに間質細胞の場合には、この仮説をテストするのに適したシミュレーションツールは、ある使用。このアプローチは、骨髄に限定されず、組織学的データの再現性のある、定量的な分析を可能にする他の組織にも拡張することができる。
Introduction
、光学イメージングを含む顕微鏡における近年の急速な技術開発、に、全組織のコンテキスト内の細胞の解析は、免疫学者のためにますますアクセス可能となっています。懸濁液中の単一細胞の特徴は、細胞および分子の機能を理解するための貴重な不可欠な方法を表す。しかし、それらの（マイクロ）-anatomical環境内の細胞の解析は、免疫応答の発生のような複雑なプロセスに協力種々の細胞型の間の相互作用を理解するために不可欠である。
顕微鏡研究は、画像から定性的な情報を取得することが比較的容易であるが、それは部分的にはこの分野での分析方法は、画像取得が可能であるものと比較して遅れているという事実のために、これらのデータを定量化するための課題である。多くの研究者は、まだ、時間がかかり、その組織学的画像におけるマニュアル細胞計数を頼るしたがって、異なる評価者の間でバイアスを導入し、他のグループによって複製を妨げる。多くの場合、1代表画像は、それがハード読者はこのようなイベントの統計的関連性を判断できるようにすること、出版物における細胞の位置や共局在に関する声明を下線に選択される。
一緒にされた画像データの完全な情報内容はほとんど利用されないという事実と、この組織学的画像を分析するためのより公平な、迅速かつ包括的アプローチの必要性を強調している。
骨髄は、大人の脊椎動物の造血器官として重要な生体機能にかかる複雑な組織である。造血細胞1,2-ための出生地であるとBリンパ球の発達3に重要な役割を果たしている他に、免疫反応は4を開始し、成熟した、循環B細胞5をサポートしているサイトとして作用する。私の維持に加えて、その役割免疫記憶を構成する細胞のいくつかの種類が存在6-9存在することが判明しているようにmmunologicalメモリは、ますます10年間で明らかになり、理解されている。
骨髄およびその機能の複雑な組織構造との関係は依然としてとらえどころのないままである。そのようなTおよびB細胞のゾーンとしてマクロ区画に編成されて二次リンパ器官とは異なり、骨髄をクリアマクロ区画を欠いている。これまでのところ、骨髄中の個別のコンパートメントは、骨皮質に、または血管系への近接によって定義されています。そのような幹細胞を支持するようなプロセスの数の骨髄中の様々な常駐間質細胞集団の重要性は、そのような長命形質細胞（パソコン）などの免疫記憶細胞集団（CD4 +のB細胞またはメンテナンスの開発およびCD8 +メモリーT細胞）は、明らかに、骨髄中の微小区画のある程度があることを示している。
これらのニッチは、それらの細胞および分子は複合に対する共通の特徴を共有してどの程度としてはまだ明らかではないn、および要素は、特定のニッチが一意レンダリング。間質細胞に加えて、造血細胞型は、ニッチのいくつかについて、少なくとも特定の信号を提供することによって、重要な役割を果たすことが示されている。明らかに、ニッチ組成の複雑さは、 その場でそれらの分析を必要とし、免疫学者や血液学者がその細胞成分間の空間的関係を分析することによって、例えば 、骨髄マイクロアーキテクチャにズームインすることがますます重要になってきた。
ここでは、自動化された公平な方法で、骨髄における細胞の共局在及び近隣関係を定量化するための戦略が提示されている。蛍光性の間質細胞及び非蛍光造血細胞を保有するキメラマウスの生成を含むワークフローの詳細、脱灰骨からの組織切片の調製、骨全体を覆って共焦点画像の取得、並びに携帯cは自動画像解析O-ローカライズおよびシミュレーションツールによってランダムポジショニングからの検証/差別が（ 図8）が設けられている。
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Protocol
動物実験は動物福祉（LandesamtエリーゼGesundheitウントSoziales、ベルリン）のための適切な状態委員会によって承認された、現在のガイドラインと規則（動物実験のライセンスG0194 / 11）に従って行った。
蛍光骨髄キメラマウスの1世代
注：9の前に説明したように、骨髄間質細胞を可視化する蛍光骨髄キメラマウスの作製が行われる。
- デル-Creリコンビナーゼを治療開始照射のためにそれらを準備する（マウスは11-13遍在タンデム赤色蛍光タンパク質（tdRFP）を発現する）ROSA-tdRFPマウスxは。また、蛍光タンパク質の遍在的な発現を持つ他の菌株を使用しています。二日照射前の飲料水を介してネオマイシン1mg / mlのビタミンの1 mg / mlの（A、D3、E、C）を投与する。
- セシウム137ガンマ照射wiは3.8グレイで二回マウスに照射3時間の間隔薄い。このために、それぞれの照射に適した照射パイケージにマウスを置く。
注：マウスの照射には、私たちの研究所は麻酔を必要としません。照射のための麻酔に関する現地機関の方針に従ってください。痛みの兆候がある場合、照射後の一日あたりのカルプロフェン皮下（SC）の5 mg / kgを持つ動物を扱う。 - 翌日、転送バッファ9におけるC57BL / 6ドナーマウスの長骨から調製した3×10 6個の骨髄細胞を静脈内注射によりマウスを再構成する。最大2週間ネオマイシン上のマウスとビタミンを維持し、この時間の間に彼らの幸福と重量を監視します。特定の実験的治療（ 例えば 、予防接種）9を開始する前に、免疫系の再構成を可能にするために、少なくとも4週間待つ。
- マウスを犠牲にし、解剖ボードの上に置き、70％エタノールで足を殺菌する。 Euthaniz現地機関の方針に従って、電子マウス。私たちの研究所は頸椎脱臼を行います。
- 太ももから皮膚を除去するために鉗子とハサミを使用してください。大腿骨を露出させるために筋肉組織を削除します。鉗子やハサミを使って、股関節と膝関節から大腿骨をLuxate。骨を壊すか切らないように注意してください。
- 慎重にはさみを使用して骨から筋肉組織および軟骨の残りの大部分を削除する。実験室のティッシュペーパーで骨を擦ることによって、残りの筋肉組織を削除します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いてペトリ皿中で洗浄骨を集める。
- 6時間 - 4 4％パラホルムアルデヒド（PFA、電子顕微鏡グレード）で全体の大腿骨を固定してください。
- PFAを捨て、PBS O / Nが10％スクロース中骨をインキュベートする。次の日は、20％のスクロースO / Nで骨をインキュベートする。翌日は、30％ショ糖のO / Nで骨をインキュベートする。
骨の2.凍結切片化
注：1の後6 - 30％スクロース中24時間、骨を凍結し、川本のテープ法14,15に応じて、それらを凍結切片。
- ドライアイスとアセトンとの大きなビーカー（2000ミリリットルの体積）を調製し（約2：1の体積比が、 例えば、ドライアイスを400mlとアセトン200ml）ヒュームフードの下で。 （ - 約50ミリリットル30）内部のヘキサンで - （250mlのボリューム150）小さなビーカーを置きます。 （霜が大きなビーカーの外側に表示されるまで、約10分）を冷却するためにミックスのを待ちます。
- スーパーCryoembeddingミディアム（SCEM）で標識クリオモールドの3/4を埋める。彼らは完全に彼らは金型のエッジに触れないように注意しながら、浸漬されるまで、慎重に内部の骨を置く。大鉗子でちょうどヘキサンの表面に接触型の底とビーカーにクリオモールドを保持する。
- SCEM凍結の外縁をしましょう（不透明で示され、これは約15秒かかります）。その後、完全にヘキサン中に金型をドロップし、FRE、それを聞かせて2分 - 1エズ。凍結試料を取り出し、セロハンに包んで、その後アルミ箔（乾燥からサンプルを保護し、光への暴露をさけるため）。凍結切片まで-80℃で保存。
- 大腿骨の凍結切片のための硬組織のための標準的なミクロトームとミクロトームの刃を使用しています。
- -24°Cにミクロトームのサンプルとブレードの温度を設定します。サンプルは切断前の約15分間ミクロトームの内側に座ってみましょう。
- SCEMまたは最適な切削温度（OCT）中で金属試料ホルダーにサンプルブロックを修正。必要に応じてブロックの向きを調整します。骨が完全に開放され、骨髄が表示されるまで、サンプルをトリミング。 7μmの切片厚を（最初のセクションを破棄）を調整します。
- 鹿革で覆われた木製のヘラを使ってサンプルブロックの上に粘着面と川本テープの一部を修正しました。その後、サンプルを切断し、部分になるようにテープを回し上側に位置する。鉗子を用いてスライドガラスにテープを転送します。スコッチテープでスライドガラスにテープを固定します。
- の項では、少なくとも30分間乾燥させますと使用まで-80℃で保管してください。彼らは一緒に固執することを避けるために、単一のスライド間のスペーサーを有するプラスチック製のスライドボックス内の未染色とアンマウントさスライドを保管してください。染色し、マウントされたスライドを4℃で一週間までの段ボールスライドフォルダを保存することができる。
3.画像コレクション
- 一般的な免疫蛍光プロトコル9に応じて解凍し、染色凍結切片。核染色を含み、 例えば、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸（DAPI）組織の完全性を視覚化する。
注：染色は、例えば、RFP用の間質細胞（抗RFPビオチン抗体およびストレプトアビジン - アレクサフルオロ555）、ラット抗主要塩基性タンパク質（MBP）抗体および抗ラットアレクサフルオロ647抗体による染色、好酸球を可視化する、B細胞ラット抗B220-アレクサフルオロ594抗体および抗κ軽鎖、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）および抗λ1軽鎖-FITC抗体でのPCで（染色手順の詳細は9に記載されている）。 - 染色した切片をマウントします。セクションにfluoromountの一滴を配置し、慎重に、気泡の形成を回避しながら、＃1ガラスカバースリップでカバーしています。その後、染色に適したレーザーラインを装備した機器とレーザー走査共焦点顕微鏡を行う。
- Wimasisツールを使用して、間質細胞と骨髄の造血細胞の自動化された共局在化分析のための画像を記録するために、以下の設定を適用する。
- 20X対物レンズと708.15 X 708.15程度の視野を使用してください。自動分析のために、比較可能な結果を維持するために2048のx 2048ピクセル（ピクセル）で整合性のすべての画像のサイズを維持する。
- 間質構造のためのレコードの1チャネル（ 例えば、 例えば、DAPI、405 nm）であり、追加の関心の造血細胞のためのチャネル（ 例えば、3チャネル、好酸球、B細胞およびPC用488/594/633 nm）を。
- 4 16を平均ラインを使用して、レコードの画像が。理想的には、単一の隣接する画像を撮影することにより全体の大腿骨部分をカバーしています。代替的に、骨髄（骨幹部ならびに骨端）の様々な領域からの非隣接の写真を撮る。
注：（重なる領域内のセルの繰り返し分析を避けるために）隣接した画像間のオーバーラップを生成しないように注意してください。
- 顕微鏡画像のファイル形式で画像を保存します。確認し、必要に応じて、画像ビューア/解析ソフトウェアの全チャネルのコントラストを調整。
- 画像ファイルごとにエクスポート3 .jpgファイル：DAPIチャンネル（赤/緑/青（RGB）形式、黄色でコード化された偽色）のための1 .jpgファイル、間質チャネル（グレースケール）のための1 .jpgファイルと1 .JPG含むファイル造血細胞のためのチャネル（3チャネルの最大、RGBフォーマット、 例えば、FITC（パソコン、偽色：緑）/アレクサフルオロ594（B細胞、偽色：青）/アレクサフルオロ647（好酸球、偽色：赤）） 。
4.自動画像解析
- 画像分割、共局在し、近傍分析（説明を参照）の定量化を行うために画像解析ツールを使用します。
- Wimasisツールを使用している場合は、以下の手順に従ってください
- 下線と画像の種類を示す番号が続き、同じファイル名で画像あたり3 .jpgファイルのセットをアップロードします。
- 造血細胞との.jpgファイル用_1を使用して、間質チャネルのための.jpgファイルのためのDAPIチャネル、_3ための.jpgファイル用_2。たとえば、次のようにImage1_1.jpg（造血細胞）、Image1_2.jpg（DAPIチャネル）、およびImage1_3.jpg（間質チャネル）。顧客口座を経由して画像をアップロードします。
- セルコンタクト定量化のためにそれぞれのフィールドをクリックして、セルコンタクトツールを選択します。細胞周辺の定量化のために、細胞周辺ツールを選択し、（細胞のエッジから測定される）程度で優先近傍半径を入力してください。
- 結果をダウンロードします。
注：検出された物体の境界と造血細胞と間質チャネルを示す.jpgファイルが強調されているような結果が提供され、同様にその要約.csvファイルに加えて、すべての画像のための測定を含む単一の.csvファイル、すべてのアップロードされた画像のデータが含まれています。
- 接触測定から例は代表的な結果に示されている（間質細胞と接触して造血細胞（赤色、緑色、または青色細胞）の頻度を決定する、または、赤色、緑色、または青色の細胞の頻度は、他の造血細胞型を接触させること図4）。周波数を決定するために、することにより、画像当たりの所定の接触数を分割総細胞は、画像ごとにカウントします。
- 個々のマウスを用いた実験のために、単一のマウスのすべての画像の全接触数を合計し、全ての画像の総細胞数の和でそれらを分割する。
- 近傍の測定値から、ステップ4.3に記載のように（他の造血細胞型への間質細胞および/または好適な近傍に、赤色、緑色または青色細胞の周波数から選択された距離内に赤、緑、青の細胞の頻度を決定する代表的な結果、 図4）も参照。
ランダム骨髄ポジショニング5.シミュレーション
- 分析した骨髄組織学的画像にランダムセルの位置のシミュレーションを実行する前に、事前に以下のファイルを準備します。セルコンタクトツール、DAPIチャネル用のオリジナルの.jpgファイルとオリジナルの.jpgファイルによって提供される単一の.csvファイルを間質チャンネルに対する。
- 実行するために一連の画像上のバッチシミュレーションは（ 例えば、1大腿部からのすべての画像）は、1フォルダ内のすべての元の.jpgファイル（_1、_2と_3）と対応する単一の.csvファイルを収集。
注：ランダム骨髄細胞の位置決めのためのシミュレーションツールは、リクエストに応じて入手可能です。 - 、シミュレーションツールを起動]チェックボックスを「自動ロード·画像データ」。
注：プログラムは、.csvファイルから細胞数と平均セルサイズを自動的に読み込みます。これらの値は、「セル番号」と「セルサイズAVG」（ 図5A）のチェックボックスに表示される。 - .CSVファイル、 すなわち、名前に共通因子に共通のタグを入力します。バッチモードのシミュレーションに使用されるべき画像セットの数を入力する。
- （ファイル名のエンディング_3付き）間質チャネルから生成された.jpgファイルをロードします。
- DAPIチャンネルからマスクを生成するための設定を入力します。
- "チェックボックスをオンにしますマスクの適用」10（範囲0から255）にバイナリマスクにDAPI画像を変換するためのしきい値を設定します？。
- ボックスにチェックを入れ「膨らませる？」「？8ビットの「ボックスをチェックし、5 PXに拡張のグレードを設定。 「浸食/ wの？」チェックボックスをオンにします。
- シミュレートされた画像の解析に使用する周辺半径（近傍半径）のために必要な値を入力します。 2048 X 2048、PX（ピクセルスケーリングXY：0.346ミクロン）のサイズが708.15 X 708.15以下の画像の場合は、29 PXは、10μmに相当する。
- ボックスにチェックを入れ「大津を使用しますか？ "間質構造の自動検出のために大津のアルゴリズム17を使用する。
注：これは、接触および周辺ツールで使用されているのと同じアルゴリズムです。記録された画像とシミュレートされた画像の自動解析に同じ画像分割アルゴリズムを使用すると、比較可能なデータを維持するために重要である。 - 造血細胞のための設定を入力し、そのAReは、円形としてシミュレート。
注：赤、緑、青のセルのセル番号を直接CSVファイルからロードされる（また、5.6のステップを参照）。- 赤、緑、青のセルのピクセルの平均直径を計算するシミュレーションツールを使用する。画像あたりの総細胞数で割ったPXにおける画像の各細胞型の総面積として単一のセルの平均面積を決定します。式を使用して、ディスクの半径を計算するために平均的な領域を使用します。平均直径を決定するために半径を倍増。
- オブジェクトセグメンテーション機能を含む任意の画像解析ソフトウェアを使用して分析した細胞型のセルサイズ分布を測定する。すべての造血細胞型（18及び図5B）のためのσを決定します。
注：記録された細胞の細胞サイズ分布は、自動画像解析により決定されていないので、実際の分布の近似としてガウス分布を使用する。 Tの幅彼分布曲線は、σによって記述され、種々の細胞型のために非常に異なることができる。 （詳細は、 図5（b）参照 ）。- 静止画像解析ツールによって完全な細胞として認識され、最小のオブジェクトを記述するピクセルの直径：これらの測定から、「セルサイズカットオフ」を決定する。
- グラフィカル·ユーザ·インタフェース（ 図5（a））上のそれぞれのボックスにパラメータを入力します。
- PXで直径として、セルサイズカットオフ、 すなわち、シミュレーションで許容される最小セルサイズを入力します。
- （ステップ5.9）から、赤、緑、青のセルのセルサイズ分布のシミュレーションのためのピクセルでσを入力する。
- サブセクション「マスク内の細胞」の「削除」チェックボックスをオンにします。それはマスクの無行くエリアで少なくとも一つの画素と重なっている場合は、この設定では、プログラムは、セルの新しい位置を選択しましたします。セルオーバーラップを避ける」チェックボックスをオンにします？̶1;サブセクションの「セルの除外」。
- PXで2つのセルの中心間の最小許容距離を入力します。
注：最小距離が記録された画像から決定される必要がある。誤って測定された最小距離が記録され、シミュレートされた画像の比較のための偏った/人工結果につながる。 - オーバーラップは中心から中心までの最小距離によって定義されている場合は100％にオーバーラップの最大面積を設定します。
- 千回繰り返しシミュレーションツールを設定します。
- ボックス「自動保存細胞を？」チェック.rectファイル（テキスト形式）などのバッチの各画像のすべての繰り返しのためにシミュレートされたオブジェクトの座標を保存します。ボックス「自動保存·イメージ？」それぞれのシミュレートされた画像のための.TIFFファイルを保存するを確認してください。保存されたファイルのための共通のタグを入力します。
注： "自動保存細胞」オプションは、実際のシミュレートされたimaのを保存する場合に比べて、シミュレーション実行時間と全体のデータサイズを削減GES。 .rectファイルが長方形としてシミュレートされたセルの座標を保存し、必要に応じてこのようにシミュレーション画像に変換することができる。
- 「ファイル名を指定して実行シミュレーション」をクリックしてシミュレーションを開始します。
注：シミュレーションツールは、自動的に繰り返しシミュレーションのあらゆるセットについて、赤、緑、青、および間質細胞と、赤色、緑色および青色の細胞について平均接触回数付近数を含むすべての画像1000のシミュレーションのためのCSVファイルを生成する。さらに、すべてのこれらの値、標準偏差（STD）及び平均の標準誤差（SEM）1,000シミュレーションの平均値が提供される。 - 千シミュレーション画像の1セットの平均接触頻度付近の周波数を決定する。このために、画像ごとに記録された細胞数によって平均接触付近のカウントを分割します。記録画像の自動化された共局在解析の結果に周波数を比較してください。
- 適切なstatiが適用解析19に応じてstical方法は（ 図7のために、我々は、両側ウィルコクソンの順位検定を締結し使用した）。
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Representative Results
カワモトテープ法で脱灰骨の凍結切片を切断し骨幹ならびにそれらと骨端領域の両方で、まだ石灰化した骨に取り付けられた内膜領域の骨髄を、骨全体が完全な部分として切断することができ骨梁の高密度（ 図1）。切片の核染色は、調製物中の小さな亀裂を完全に回避することはできないが、正弦波と動脈の構造ならびに実質の網状ネットワークがそのままとどまることがわかる。
赤色蛍光キメラ骨髄およびその後の分析の免疫蛍光染色の例としては、好酸球（主要塩基性タンパク質、MBP）、パソコン（κおよびλ軽鎖）およびB細胞（B220）の染色が示されている。マウスは、ミョウバンIPでチキンγグロブリン（NP-CGG）に結合された100μgの4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルハプテン、4週間後で免疫化した再構成は、21日後に、PBS IVにNP-CGG50μgのでブーストとブーストの後30日目に分析した。自動画像解析には、網状のプロセスの非常に小さな断片を含む、間質構造の非常に正確な認識をもたらした。間質細胞の細胞数は、ここで提示システムを用いて決定することができないので、画像中のすべてのフラグメントを検出するために（ 図2）で、全くサイズ閾値は、間質チャネルのために導入されなかった（これも説明を参照）。 PCおよび好酸球がB細胞より大きく、また、より不均一な形状を示す。すべての3つの細胞型はよく一見認識されている。特に、B細胞の細胞クラスターは、十分に分離された。分析ツールは、上記の細胞型（好酸球、パソコン、B細胞）のために最適化される。他の細胞型の場合は、調整が必要になることがあります。セルコンタクトツールで生成した.csvファイルには、造血細胞のために以下の関連の測定値が含まれています。各細胞集団についての細胞カウント;ピクセル内の各細胞集団の総面積。連絡先（この場合は好酸球）、赤血球の数、緑色セル（ここではパソコン）や、赤、緑、青または灰色細胞（間質細胞）の青色セル（ここではB細胞）。細胞周辺ツールによって生成した.csvファイルは、造血細胞のための以下の測定を含む：各細胞集団についての細胞数を、ピクセル内の各細胞集団の総面積。赤、緑、青、グレー細胞（間質細胞）と、赤、緑、青の細胞の近傍カウント。
画像解析ツールの品質を検証するために、自動化された分析の結果は、6訓練された評価者（ 図3）による手動カウントと比較した。すべての評価者は、分析のために、同一の画像を受け取った。間質構造および造血細胞を慎重に画像解析ツールで概説し、これらの関心領域が保存され、分析された。間質構造、画像当たりの総面積のために自動および手動の分析間で比較した。訓練を受けた評価者を正確に認識するために手動で計数した（ 図3A）、間質の総面積の大きさで観察された大きな分散に反映されるように間質構造は、困難であると思われた。ここでは、自動化された分析は、訓練を受けた評価者によって検出された平均面積に近い値を決定した。手動で数えなく全てのセルに対して、自動分析ツールは、細胞のわずかに低い量を決定した。しかし、PCや好酸球のために、数が手動カウントのために観察者間の分散の範囲にまだあった。自動化分析によって検出B細胞の数が、しかしながら、わずかにこの範囲（ 図3A）未満であった。訓練を受けた評価者は、パソコン、好酸球のために464ピクセル515ピクセルのサイズを決定しながら、自動化された分析により決定される平均セルサイズ（ピクセル内の領域）は、PC用の512ピクセル、好酸球のために436ピクセル、およびB細胞について317ピクセルであったおよびB細胞についての291ピクセル。このように、平均C自動解析によって決定B細胞、PC、および好酸球のためのエルサイズは手動評価者（ 図3B）で測定した平均セルサイズと同等であった。この自動画像解析ツールは、現在の候補骨髄ニッチの細胞型の直接的な接触を定量することができる。さらに、特定の細胞型の隣接間質細胞または他の造血細胞型の細胞の頻度を決定することができる。骨髄PCや細胞、好酸球、B細胞、および他のPC間質するそれらの接点の分析示され、ならびに10および20ミクロン（ 図4A）内のこれらの細胞型に隣接するPCの頻度。さらに、間質との種々の造血細胞型の接触頻度（ 図4B）を定量することができる。
シミュレーションツールでこれらの細胞のランダム骨髄測位のシミュレーションを実行する前に、GAUSとしてセルサイズ分布を記述するパラメータシャン分布が決定されなければならない。対称及び「ベル形」曲線として可視化することができるガウス分布については、唯一の2つのパラメータが決定される必要がある：曲線のピークが位置する曲線（モード、 すなわち、中心の位置を）と対称な曲線の幅（これは、上述したσのパラメータによって記述される）。この手順は、パソコン、好酸球、およびB細胞（ 図5B）のためにここに示されている。測定されたセルサイズ分布は、B細胞について、σによって記述分布曲線の幅がPCや好酸球よりも小さい、ことを示している。ピクセルで定義されたσ値があったが、シミュレーションのために、3つの細胞集団について測定されたσの相対値は、（ すなわち、B細胞は、常にパソコン」と好酸球」の2倍の狭いサイズ分布によってシミュレートされた）に維持した記録された細胞の視覚的な外観と一致するように設定します（ 図図6（b））。これは、B細胞のための2 PXのσとPCと好酸球の両方の4 PXのσを適用するために私たちを導いた。セルサイズカットオフは、測定セルサイズ分布から決定した。円形オブジェクト（約7μm）のための17のPX直径（約6μm）につながる220 PXでのカットオフが、使用されたB細胞のための20のPX直径、結果300 PXのオブジェクトサイズのPCおよび好酸球のために、カットオフ、シミュレーションのため。
細胞はシミュレーションツールによって配置が許可されているシミュレートされたランダム画像内の領域を定義するために、マスクは、骨髄組織像（ 図6A）のDAPIチャネルにおける核信号から生成した。 10の値は、バイナリイメージ（上パネル、右画像）を生成するための最適な強度閾値であると決定された。大津のアルゴリズムによって決定された閾値は、固定された強度と同様に、画像内の全ての核の完全な認識（上パネル、中央の画像）につながらない50または150のしきい値（下のパネル、左と中央の画像）間質細胞（ 図4B）を搭載したPC、好酸球、またはB細胞の接点の.theの関連性は、シミュレーションツール（ 図7）を用いて試験した。この分析は、これらの集団を支持間質ニッチの概念に沿ったPCおよびB細胞（ 図7A）のシミュレーションと比較して、記録された画像において有意に高い接触率を明らかにした。これは、5個体の蛍光キメラマウス（ 図7B、D）で確認された。対照的に、明確な違いは、好酸球（ 図7A、C）の場合には決定されなかった。
川本のテープ法で凍結切片マウス大腿骨の縦断面図1.概要蛍光画像。テープ法はcuttinことができます無傷の骨内膜領域とのGセクション、骨幹部でだけでなく、骨端領域での、非脱灰骨から両方。ナイーブC57BL / 6マウスの厚さ7μmの骨部は、細動脈（緑色）および核のために（青色DAPI）を可視化したSca-1のために、細胞外マトリックスタンパク質ラミニン（赤色）について染色した。 1446 X 1088ミクロンの47のタイル、解像度1360 X 1024 PXが記録され、概観画像を作成するためにステッチされた。この画像は10倍対物レンズ（0.45 NA）で、広視野蛍光顕微鏡で取得した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
間質および造血骨髄細胞の図2.自動検出。赤色蛍光カイの大腿骨のセクション追加免疫後30日目量体マウスκおよびλ軽鎖（緑、PCS）及びB220（ブルー、B細胞）、MBP（赤、好酸球）、間質を可視化するためにRFP（グレー）について染色した。左：元画像が20X対物レンズ（0.8 NA）と708.15 X 708.15程度の視野を使用して、共焦点顕微鏡で取得しました。右：セグメント化された画像。認識対象物の輪郭が強調されている。白い長方形は、下の画像に示されている領域をマーク。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
訓練を受けた評価者による自動画像解析の図3の検証。 （A）は 、1（間質構造）における間質構造および訓練を受けた評価者によって計数造血細胞の総細胞数の総面積は、10 （パソコン）、2（好酸球）および自動画像解析により得られた細胞数と比較して1つの画像（B細胞）。ドットは、個々の評価者を表す（6 - n = 5）であった。バーは、平均値または自動的に決定された値を示している。自動化された分析で測定した平均オブジェクトサイズと比較して、手動で計数したオブジェクトの（B）オブジェクトのサイズ分布。種々の細胞型の異なる周波数を考慮するために、PCは、10で一つの画像に2つ、B細胞中の好酸球を計数した。ドットは個々のオブジェクトを表す。行は、訓練された評価者による間質構造の意味。（C）手動アウトラインを示している。左：元のイメージ。中央の手動分析した画像の例。右：自動化された分析で検出された間質構造この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
「図4「SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 52544 / 52544fig4highres.jpg"幅= "700" />
大腿骨髄中のPC、好酸球、B細胞および間質細胞の図4の自動共局在分析。 （A）左：間質構造、好酸球、B細胞または追加免疫後30日目の蛍光キメラマウスで他のPCと直接接触するパソコンの頻度。ミドルと右：10μmの近くまたは間質の構造、好酸球、B細胞または他のPCの20ミクロン付近でのPCの頻度。この図（直接接触、10ミクロン付近）の一部がら Zehentmeierから変更されている。質の構造と直接接触しているパソコン、好酸球およびB細胞の9（B）頻度。 52から515までのPC、918から3179まで好酸球、10-21画像中の4146から13063 B細胞は、2つの独立した実験からプールし、追加免疫後30日目に5蛍光キメラマウスからカウントした。ドットは個々のマウスを表している。行は、中央値を示している。：//www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
骨髄パソコン、好酸球およびB細胞の細胞サイズ分布5.測定図。シミュレーションツールのグラフィカル·ユーザー·インターフェース（GUI）の（A）のスクリーンショット。パソコン（κおよびλ軽鎖、緑）、（赤MBP）、好酸球およびB細胞（B）のセルサイズ分布（ピクセル内の領域） Volocityソフトウェア（上のパネル）による物体認識の後に測定される（B220、青）のヒストグラムに示されている。大腿骨髄画像（下のパネル）で、PCは（黄色オーバーレイ）、黄色、青（オーバーレイバイオレット）における好酸球およびB細胞は（灰色のオーバーレイ）は赤でマークされて検出されました。画像分割は、パソコン180ピクセルの最小サイズ閾値を設定することにより行った好酸球およびB細胞について220ピクセル、300ピクセル。 250オブジェクトは、PC用の好酸球のための650のオブジェクトおよびB細胞のための3000のオブジェクトを測定した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
シミュレートされたランダムなセル位置決めのためのマスクの6世代図。様々な閾値を適用することによって生成されたバイナリ画像をDAPIの（A）元のDAPIチャネル（黄色）ならびにオーバーレイが示されている。二値画像（しきい値を10に設定）から生成されたマスクは、（下のパネル、右画像）の下に表示されます。非移動領域を表し、白い部分は、細胞を配置することが許可されている領域を表す黒い領域（B）記録された画像（左）及び対応するシミュレートされた画像（右）は、視覚的に高い表示類似。好酸（MBP）、パソコン（κとλlightチェーン）、B細胞（B220）との間質細胞（RFP）が表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
シミュレートされたイメージ対で記録された間質構造を有する造血細胞型の7直接接触する図。 （A）免疫後30日目の蛍光キメラマウスの記録された画像と比較して、シミュレートにおける間質と直接接触しているパソコン、好酸球およびB細胞の頻度。行は、対応するシミュレートされたと記録された画像（ドット）を接続。一つの代表的なマウスの画像は、それぞれのプロットに示されている。間質と直接接触したPC、好酸球およびB細胞（B）周波数の5の記録された画像と比較して、シミュレート 2つの独立した実験からの個々のマウス。ウィルコクソンの順位検定を締結し、両側（PCS：*** P = 0.0001; * P = 0.0371; * P = 0.0161; ** P = 0.0012; **** P <0.0001、好酸球：*** P = 0.0007 ; P = 0.1055; * P = 0.0161; P = 0.4143; *** P = 0.0007; B細胞：**** P <0.0001; ** P = 0.0020; *** P = 0.0005; ** P = 0.0012 ; ***はp <0.0001）。ドットは個々の画像を表す。バーは平均値を示している。 P値が0.05を有意差と見なされる。 NS：図中のアスタリスクは、以下のP値を示すP> 0.05。 *：P 0.05; **：P 0.01; ***：P 0.001; ****：P 0.0001。この図（間質構造を持つPCを直接接触）の一部がZehentmeier らから変更されている。9 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図8造血細胞のための定量的アプローチの完全なワークフロー-マウス骨髄間質細胞相互作用のアプローチは、3つの主要な部分に分割されている：1.マウス骨髄切片を調製し、生データは、レーザー走査共焦点顕微鏡によって集められ、2 。記録された画像の自動解析および骨髄細胞のランダムな位置のシミュレーションが記録され、シミュレートされた画像から得られる3接点及び近傍カウントが比較され、実行される。自動分析の入力（画像ファイル）と出力（テキストファイル）は、入力（画像ファイル）が、青色で示され、シミュレーションツールの出力（テキストファイルと、必要に応じて、画像ファイル）が緑色で表示されている。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
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Discussion
現代の光学イメージング法の進歩にもかかわらず、組織学的データの分析は、依然として多くの場合、適切な定量化ツールおよび方法の欠如によって、または関心対象の小領域に集中偏った分析によって妨げられる。ここに提示相乗的なアプローチは、全体の骨髄領域を覆う画像解析を組み合わせた自動セグメンテーションおよび様々な造血細胞および間質細胞型、共局在化分析、新しいお客が提供する非ランダムに発生コンタクトの最後に検証ツールの物体認識設計されたシミュレーションソフトウェア。
骨髄を含む全体の骨の組織学に起因つのセクションに存在する様々な組織の密度に実行することが困難であった - 一方では非常に難しい、石灰化した骨、一方で簡単にカット中断されます非常に壊れやすい骨髄、一緒に骨と。代替的に、骨切片のプリアンプを切断するためのテープ法として取得済みのは、ここ14,15は 、それによって無傷（ 図1）内膜領域を残して、組織を安定化させるという利点を有する。骨芽細胞が豊富であることに加えて、これらの領域は、幹細胞の維持20において役割を果たすことが示唆されている。
発生過程と骨髄中の細胞の維持に間質細胞の重要な役割は、ますます明らかになってきている。しかしながら、これらの稀な、壊れやすい細胞の分析は、2つの理由から困難であることが分かっている：第一に、それらは骨髄から単離することが困難である。第二の、間質集団間の異質性の程度が不明であるため、一方が、間質細胞について記載されている特定のマーカーを使用して、重要な集団を逃すかもしれない。蛍光骨髄キメラを生成するための方法は、蛍光マークに有用であり、その後、全体として骨髄間質細胞集団を分析する。しかし、注目すべきは、これらのマイルで骨髄のCEのすべての間葉系細胞は、内皮細胞および骨芽細胞を含む、可視化される。このようなキメラマウスからのデータを分析する場合に考慮される必要がある。照射生存レシピエント由来の造血細胞の危険性もあるにもかかわらず、これらの細胞は、典型的にのみ、従って、組織学的分析9に影響を与えない、ドナーCD45 +細胞と比較して、視野当たりの非常に小さな領域をカバーする。明らかに、この方法は、間質（サブ）集団の、より特異的に検出すると、後の工程で組み合わされるべきである。現在、これらの細胞の分析は、主に、同時に分析することができるパラメータの数に制限を課し、上記の理由により組織学によって行われる。マルチパラメータの開発は、これらの制限を克服するのに役立ちます顕微鏡で分析する。
画像解析の間に、セグメント化は、元の大津のアルゴリズムを用いて行った。本質的に、このクラスタリングベースの閾値処理方法が自動的に二値画像17で、その結果、与えられたチャネルで最低の統計的発散との2つのグループにフォアグラウンド（信号）とバックグラウンド（ノイズ）のピクセルの最適な分離のための強度閾値を決定します。ここでは、大津の手法は、元の画像の自然対数のバージョンに適用された、つまり：
大津のln =（入力画像）の入力画像
大津の方法は、背景として薄暗い細胞を識別することができるので、これは蛍光画像のためのより良い動作します。対数関数を追加すると、大津のアルゴリズムにより、二つの異なるクラスへの細胞と背景のよりよい分離を可能にする。しかし、単独の強度閾値を正確に単一のオブジェクトを検出するのに十分ではない。画像内の十分に分離したオブジェクトを検出する際に、効率的に動作し、それがクラスタ内に配置された単一細胞を分離するのに十分ではない。その細胞型の一部として頻繁に組織で一緒にクラスタ化され、DAPIチャネルにおけるそれらの核をk = 10 21と強度ヒストグラムのk平均クラスタリングに基づくアルゴリズムを使用してセグメント化された、そのような好酸球またはB細胞として、私たちのために興味深いものでした。セルセグメンテーションアルゴリズムは、（10ビンにクラスタ化された）最も暗いピクセルに明るいをプロットし、常に細胞類似するオブジェクトの生成を探します。これらのオブジェクトは、次に細胞として定義される。全ての画素が使用されている場合、得られる核をクラスタ分離するための他のチャネルに適用されるマスクを生成するために拡張されている。
なお、この分析は、コンパクトであり、造血細胞のためにうまく機能することが、それは、それらの結線のためにこれらの大きな、広がるアウトセルの境界を決定することができないように、間質細胞に関して制限されることに留意すべきである網状ネットワークを形成する樹状エクステンション。従って、細胞は、間質細胞をカウント提供することができない。間質特異的プロモーターの制御下で運命マッピングレポーター介して単一細胞を標識する（「Brainbow "システム22を使用する）ニューロンに公開されたものによれば、この問題を解決し、リンパ節における濾胞樹状細胞の標識のためであろう23。
30ピクセル以下のオブジェクトを除くすべてのチャンネルのノイズ低減ステップを適用することに加えて、サイズ排除、造血のための物体認識の過程で適用されるが、細胞間質しなかった。切片によって切断された細胞の小さな断片が除外されてもよい。しかし、損失は、細胞の明白な認識を支持し、この場合には無視することができる。 2〜3次元からの分析とシミュレーションを拡張するこの限界を克服します。マルチフォトン顕微鏡または光シート顕微鏡/ SPIMにより、例えばホールマウントで細胞分布を研究するための方法の開発が、、、確かに目のに役立つだろう尊敬です。多成分ニッチの複雑な細胞組成を研究するために、それはまた、 その場で分析されているパラメータの数を拡張するために必要となる。フローサイトメトリー定量化と組み合わせて、組織学的情報のマルチパラメータ分析のための有望なアプローチは、最近24、25公開されている。
接触解析は、2つのオブジェクトの重なりを定量することによって行った。直接接触は、少なくとも一つの画素のオーバーラップと定義した。重要なことに、この分析は、顕微鏡画像の解像度によって制限されるので、顕微鏡に用いられる対物レンズの開口数、およびピンホール大きさだけでなく、波長および励起のモードに依存する。ここに示した分析では、蛍光色素の組み合わせ0.8 NA、20X対物レンズ488、561、594で励起され、1つの光子励起を用いて633nmで適用した。したがって、横方向の解像度の値の間0.372と0.483程度が達成された。このアサーションは、様々な細胞サブセットの並置に関して行うことを可能にする。しかしながら、それは、細胞間相互作用に関与する推定上の分子機構についての情報を与えない。さらに、このような2光子生体顕微鏡検査などの他の方法は、これらの間のコンタクト9の特性を改善するために必要とされる。フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）は、システムがこれらの相互作用は、26実際に機能しているかを確認することができますベース。
組織ニッチの細胞の微小環境を評価するために、それだけでなく、直接の細胞接触を分析することが重要であるだけでなく、関心のある特定の細胞型（「近傍分析」）の近傍の細胞型を定量化する。以前に発表された研究は、核27の位置に基づいて、このような容器のような細胞と組織構造との間の距離を測定した。我々はdeterminに興味を持っていたので種々の細胞型の距離がる、細胞質体積に核の比率を変化させた部分には、表面間の距離を測定することが好ましい。この目的のために、我々は、ピクセルに以下の値を変換した後cell's境界からのユークリッド距離を決定することによって近傍の半径を算出した。ユークリッド距離は、2つの画素間の直線距離であり、式28で表すことができる。 
例えば、ユークリッド距離、ターゲットセルの境界の画素から10ミクロン以内の境界の画素を有する細胞は、この隣接セルとしてカウントした。
現在の形態では、分析は、細胞は、したがって、バイナリYES / NOの特徴付けを提供しない、同じまたは異なるタイプの別の細胞によって接触または接近しているか否かを判断する。セルの実際の数目的の細胞に連絡するか、そこから一定の半径内にあるSが計算されません。次のステップは、細胞に接触または隣接するグループのサイズが検出され、同じタイプの異なる標的細胞との間で比較することができるような方法で現在の分析を拡張するであろう。これは、造血補助細胞の変化の寄与は29-33議論されているために、骨髄形質細胞の生存ニッチとして骨髄ニッチの組成物に関する重要な追加情報につながる。
物体認識アルゴリズムはWimasisから専門家が彼らの商業的に入手可能なカスタムソリューションサービスを使用して、リクエストに応じて利用できますと一緒に最適化した。別のオプションは、Definiens、Volocity、またはIMARIS、またはCellProfilerなどのフリーウェアとして画像解析のための市販のソフトウェアのいずれかを使用することである。
自動細胞分割及び画像解析ツールは、我々再つのパラメータ、すなわち、オブジェクトのサイズおよび種々の細胞集団中の細胞数に対して6訓練された画像の評価者によって提供される手動で分析されたデータと、それらの結果を比較することによって検証した。 図3Bに示すように、造血細胞（パソコン、好酸球、およびB細胞）の平均オブジェクトサイズは、形質細胞および好酸球の手動サイズ決定のためのより高い分散を有する、両方の方法の間で類似していた、おそらく、それらのより不規則な形状に起因する比較B細胞へ。細胞数の自動検出は、手動検出のものよりもわずかに低い値が得られた。それらは、マーカーとして使用されたB220の発現の高い不均一性に起因し、おそらくB細胞の場合、これらの値を下回った一方注目すべきことに、彼らは、好酸球およびPCの場合には手動の値の範囲内に残っていたB細胞について。 B220は、骨髄中のB細胞分化の間にアップレギュレートされることが知られており、低および高iを有するB細胞れるB220用ntensity染色を観察することができる。低B220信号とB細胞は、最も早い段階のB細胞の排除をもたらした可能性が適用された閾値を下回った。自動検出の下限しきい値は、この問題を解決することがあります。それらの少ないコンパクトな、より多くの樹枝状に検出することが困難である間質細胞、および伸びアウト形態について、手動検出は、個々の評価者との間に高分散された。興味深いことに、間質の平均の総面積は、分析は評価者によって、個々のバイアスを補償するために適していることを示す、自動的に決定総面積と同等であった。まとめると、これらのデータは、自動化された結果は、一般的に手動分析の平均値を表し、分析者間での変動を低減するのに非常に適していることを示している。
組織の構造上の制限内の細胞のランダムおよび非ランダム配置を区別するために、シミュレーションツールを開発した。 DURシミュレーションをる、ランダムに配置された造血細胞を用いた人工画像は、すべて記録された骨髄組織像のために作成されている。まず、間質チャンネル画像を元の形式で利用されている。マスクは、このようにバイナリ形式に画像を変換し、一定の強度に基づくしきい値を適用することによって、DAPI画像から生成される。バイナリマスクは、ピクセルベースの膨張と収縮の複数のステップを経る。マスクは、シミュレートされた細胞を配置することが許可されている画像フィールド内の領域を定義する。シミュレートされたセルの中心の座標は、一様な乱数発生器、画像サイズによって決定されるそれらの境界によって提供される。記録された画像の自動画像解析により決定された各集団についての細胞数及び平均気泡サイズに関する情報は、シミュレートされた造血細胞集団を定義するために使用される。シミュレートされた気泡径は、1次元ガウス分布に従うと仮定される実際のセル径がランダムに選択される：最小許容オブジェクトサイズのセルのサイズカットオフが導入されるように、直径が、修正されている。ケースでシミュレートされたセルは、1つ以上のピクセルが無行くエリアと重複または別の既に配置セル（記録画像で決定されるように中心から中心4μm）を、新たなランダム座標から所定の距離内にあるように配置されることになる直径が変更されず残っている間に選択されます。シミュレートされたセルの数が記録された画像中の細胞の数に等しくなるまでこれが繰り返される。
ツールは、間質構造は、組織内の固定マトリックスとして作用する一方、造血細胞は、骨髄内で自由に配置することができるという仮定に基づいていた。このツールは、実質領域が正弦波の複雑なシステムが通過する骨髄中の状況に最適化した。類似のモデリング手法は、最近するためにフレネットと共同研究者によって発表された総大腿骨髄ボリューム25の約30％を構成して、間質細胞及び血管構造に関連して、造血幹細胞の位置を分析する。この影響を補正するために、ここで提示シミュレーションツールは、細胞を配置することが許可された領域のマスクに基づいている。これは、核を表すオブジェクトが5段階の膨張によって拡張された核染色画像を使用することによって達成された二値化後（ 図6参照）。低い細胞密度の領域、 すなわち、そのような骨や正弦波などの核の低密度は、マスクに貢献するため、NO-GOの領域になっていないことはありません。拡張手技によるこれらの非移動領域の人工的な減少を避けるために、5段階の浸食は、この分野変わらない（従って「許可」）、高核密度を残しながら、より大きな除外領域を再開、その後に適用した。この方法は、容易に他のリンパ器官に適応させることができる。それらのT IN問題は、この方法が機能しない場合がありました（ 例えば、高い細胞質/核比を有する細胞が存在する領域で）、そのような細胞の標識のような他の方法は、マスクを作成するために使用することができる。
造血細胞は、そのサイズが各細胞型の計算された平均直径と一致し、その平均ガウス乱数発生器を用いて測定した円形のオブジェクトとしてシミュレートした。分布の幅は、画像分析ソフトウェアにより決定される記録された画像における測定されたセルサイズ分布に基づいていた。各細胞型について測定されたセルサイズ分布から決定される小さな携帯フラグメントは自動画像解析から除外されたことを考慮するために、セルサイズのカットオフを導入した（ 図5参照）。
当然のことながら、これは、それらのサイズおよび形状が比較的均一であるが、細胞の場合には問題につながる可能性の細胞型に適していこれらのパラメータに関して、非常に不均一な再。なお、この分析は、それらが規則的な、ほぼ丸みを帯びた形状を有している点で共通している骨髄（顆粒球、造血前駆細胞およびリンパ球）の主要な造血細胞型のために最適化されることに留意されたい。しかし、この方法は、樹状細胞またはマクロファージ、強く不規則な細胞体を有する細胞型のために試験されていない。そのような細胞を分析する改善された細胞クラスター分離アルゴリズム24ならびにばかりの詳細な形状解析およびシミュレーションの必要異なるサイズも異なる形状のセルを含むシミュレーションアプローチに我々の自動画像解析に新たな課題を提示するだけでなくなります。代替手段は、記録された正確な形状で動作シミュレーションアプローチだろう。しかし、この方法はかなりモデルシステムの決定的挙動を増大させることに留意しなければならない。
シミュレートされたEXPEのためにrimentsは、すべての記録された画像のシミュレーションを1000回繰り返し、生成された。この多くの繰り返しを使用すると、約3％にシミュレーションプロセス自体が寄与する相対誤差を低減します。細胞間の共局在の値はランダムであるシミュレーションから算出された場合、すなわち、次にシミュレーションプロセス自体は、Nは測定画像あたりのシミュレーションの数であるN -1/2誤差関数によって特徴付けられる。これは測定された共局在値の累積誤差にシミュレーションプロセス自体による貢献である。このように、N = 1,000貢献誤差は3.16パーセントです。唯一.rectファイル（単純なテキスト形式）としてではなく、.JPEGまたは.TIFF形式の実際の画像のようなシミュレートされた画像を保存する際に、ここで示したシミュレーションは、ソフトウェアオプションも（1,000回の繰り返しごとの画像あたり20から60分間走った）。
まとめると、このアプローチは、組織像の公平な、ハイスループット分析を可能にするsと統計的に関連するデータの生成を可能にします。これは、異なる条件下での細胞局在を比較するのに有用であり得る。骨髄中の種々の細胞型の運動性に対する、より多くのデータが利用可能になるようまた、時間成分は、将来的に、骨髄細胞の動きのモデリング手法に統合することができる。この方法は、その後、急性炎症34の場合には、好中球、例えば 、循環系への骨髄由来細胞の動員のように、システムの摂動をシミュレートするために使用することができる。さらに、免疫されたメモリセルのための記憶場所としての骨髄の機能を解明するためには、また、生存因子のための競争をモデル化するためにそれを拡張することが想像できる。また、別個のニッチとの間の可能なクロストークに対処ならびにニッチの誘導することができる。一緒に、これは生理的な変化を理解するのに役立ちますWなど（ 例えば、幹細胞における再生行動のトリガー）自己免疫疾患、新生物、または急性炎症の場合には、例えば、システム全体の病理学的摂動としてのエル。実験およびモデル化の反復的概念の一部として、新たな仮説は、順番に再び一層の組織の複雑性内で種々の細胞型の機能との相互作用を理解するのに役立つ、実験的に試験することができるシミュレーションに基づいて生成することができる。
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Acknowledgments
私たちは貴重な議論アンドレアスRadbruchに感謝。私たちは、優れた技術支援のための動物のケアとロバート·ギュンターの支援のためのザビーネGruczek、パトリックThiemannとマヌエラOhdeに感謝しています。私たちは、原稿の校正のための組織学サンプルの評価とランディリンドクイストのために私たちの訓練を受けた評価者ローラ·Oehme、Jannikeバヤット-Sarmadi、Karolinポロック、カトリン·ロス、フィレンツェPacheとカタリーナ·ホーンに感謝。私たちは、MBP特異的抗体のためのJ.とN·リー、メイヨークリニック、スコッツデール、アリゾナ州、米国に感謝します。
この作品は、生体顕微鏡用JIMI-DFG中核施設ネットワークグラントによって及びTRR130 / TP17により、DFG HA5354 / 4-1によってサポートされていました、そしてAEHSZに2165 FOR DFG（HA5354 / 6-1）は、国際マックス·プランクによってサポートされていました感染症や免疫（IMPRS-IDI）、ベルリンのための学校。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neomycin |  Sigma |
N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08 |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin) | Sigma |
P4333, H3375 | |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland |
D602-0100 | |
| 20% Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-sucrose | Carl Roth |
4621.1 | |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma-Aldrich |
179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07 |
| Hexane | Sigma-Aldrich |
208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09 |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura |
4557 | 25 x 20 x 5 mm |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura |
4583 | |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP |
||
| Microtome blade MX35 premier plus, low profile | Thermo Scientific |
3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01") |
| Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland |
600-406-379 | |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies |
S-32355 | |
| Rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| Goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies |
A-21247 | |
| Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| Mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| Rat anti-k light chain - FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma |
D9542 SIGMA | |
| Fluorescent mounting medium | DAKO |
S3023 | |
| Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth |
H875.2 | |
| Superfrost slides glasses (75 x 25 mm) | VWR |
48311-703 | |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich |
The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request. | |
| VC2012 runtime | Microsoft | free download | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download) | ||
| Fiji image analysis software | free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
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