Automatisert Kvantifisering av Hematopoietiske Cell - stromal Cell Samhandling i Histologiske Bilder av Undecalcified Bone

Abstract

Konfokalmikroskopi er metoden for valg for analyse av lokalisering av flere celletyper innenfor komplekse vev som benmargen. Imidlertid er analyse og kvantifisering av cellulær lokalisering vanskelig, som i mange tilfeller er avhengig av manuell telling, og dermed bærer risiko for å innføre en rater avhengig forspenning, og reduserer pålitelighet mellom. Dessuten er det ofte vanskelig å bedømme om ko-lokalisering mellom to celler resulterer fra tilfeldig posisjonering, særlig når celletyper avviker sterkt i hyppigheten av forekomsten. Her er en fremgangsmåte for objektiv kvantifisering av celle co-lokalisering i benmargen innført. Protokollen beskriver prøven oppkjøpet av bilder med høy oppløsning preparat som brukes for å skaffe histologiske snitt av hele murine lange bein inkludert benmargen, samt farging protokollen og. En analyse arbeidsflyt spenner fra anerkjennelsen av blodkreft og ikke-Hematopoietic celletyper i to-dimensjonale (2D) benmargs bilder til kvantifisering av de direkte kontakter mellom disse cellene blir presentert. Dette inkluderer også et nabolag analyse, for å få informasjon om den cellulære mikromiljøet rundt en bestemt celletype. For å evaluere hvorvidt ko-lokalisering av to celletyper er det bare på grunn av tilfeldig celle posisjonering eller reflekterer gunstige forbindelser mellom cellene, et simuleringsverktøy som er egnet til å teste denne hypotesen i tilfelle av hematopoetiske samt stromale celler, er anvendes. Denne fremgangsmåten er ikke begrenset til benmargen, og kan utvides til andre vev for å tillate reproduserbare, kvantitativ analyse av histologiske data.

Introduction

Med hensyn til det siste hurtige utvikling innen mikroskopi, inkludert optisk imaging, har analyse av cellene i sammenheng med hele vevet blitt stadig tilgjengelig for immunologer. Karakteriseringen av enkeltceller i suspensjon representerer en verdifull og uunnværlig metode for å forstå cellulære og molekylære funksjon. Det er imidlertid viktig for forståelsen av interaksjonen mellom forskjellige celletyper som samarbeider i komplekse prosesser som for eksempel utvikling av immunresponser analyse av cellene i deres (mikro) -anatomical miljø.

Mens det er relativt enkelt for microscopists å innhente kvalitativ informasjon fra bilder, er det fortsatt en utfordring å kvantifisere disse dataene, delvis på grunn av det faktum at metoder analyse på dette området henger etter i forhold til hva som er mulig i bildet oppkjøpet. Mange forskere fortsatt stole på tidkrevende manuell celletelling i sine histologi bilder,dermed innføre en skjevhet blant ulike raters og hindre replikering av andre grupper. Ofte, en representant bilde valgt å understreke en uttalelse på mobil stilling eller samlokalisering i en publikasjon, noe som gjør det vanskelig for leseren å bedømme den statistiske relevansen av en slik hendelse.

Sammen med det faktum at den fulle informasjonsinnholdet i bildedata sjelden utnyttes, understreker dette behovet for en mer objektiv, raskere og omfattende tilnærming for å analysere histologiske bilder.

Benmargen er en kompleks vev, som tar på viktige vitale funksjoner som organ for hematopoiesen hos voksne virveldyr. Foruten å være fødestedet for blodkreft cellene ^1,2 og spiller en viktig rolle i B-lymfocytter utvikling ^3, fungerer det også som et sted hvor immunreaksjoner er initiert ^fire og støtter modne, resirkulerende B-celler ^fem. I tillegg er dets rolle i å opprettholde immunological minne har blitt stadig mer verdsatt i det siste tiåret, som flere typer celler som utgjør immun minne har blitt funnet å oppholde seg der ^6-9.

Forholdet mellom den komplekse vevsarkitektur av benmargen og dens funksjoner fortsatt unnvikende. I motsetning til sekundære lymfoide organer, som er organisert i makro avdelinger som T- og B-celle-soner, mangler benmargen en klar makro compartmentalization. Så langt forskjellige avdelinger i benmargen er definert av deres nærhet til beinet cortex eller blodkar. Betydningen av de forskjellige hørende stromale cellepopulasjoner i benmargen for en rekke prosesser som støtter stamceller, utvikling av B-celler eller vedlikehold av immunminnecellepopulasjoner (slik som langvarige plasmaceller (PC-er), CD4 ⁺ og CD8 ⁺ T-celler minne) viser klart at det er en viss grad av mikro-compartmentalization i benmargen.

10. Visualisering og karakterisering av stromale celler i benmargen er vanskelig på grunn av deres morfologiske funksjoner med lange, tynne dendrittiske utvidelser danner et nettverk over hele benmargen, og mangelen på egnede markører for å diskriminere stromal subpopulasjoner.

Det er ennå ikke klart i hvilken grad disse nisjene dele fellestrekk med hensyn til deres cellulært og molekylært composition, og hvilke elementer gjengi en viss nisje unik. I tillegg til stromale celler, hematopoetiske celletyper har vist seg å spille en avgjørende rolle ved å tilveiebringe visse signaler i hvert fall for noen av nisjene. Åpenbart kompleksiteten i nisje sammensetning krever sin analyse in situ, og det har blitt stadig viktigere for immunologer og Hematologer å zoome inn på benmargen mikroarkitektur, f.eks, ved å analysere romlige relasjoner mellom sine cellulære komponenter.

Her, til en strategi kvantifisere cellulære samlokalisering og nabolag relasjoner i benmargen i en automatisert og objektiv måte er presentert. En detaljert arbeidsflyt inkludert generering av kimære mus, husing fluorescerende stromale celler og ikke-fluorescerende hematopoetiske celler, fremstilling av histologiske seksjoner fra undecalcified bein, anskaffelse av konfokale bilder som dekker hele benet, samt den automatiserte bildeanalyse av cellulær co-lokalisering og dens validering / diskriminering fra tilfeldig posisjonering av et simuleringsverktøy er gitt (Figur 8).

Protocol

Dyreforsøk ble godkjent av egnede statlige komiteer for dyrevelferd (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) og ble utført i samsvar med gjeldende retningslinjer og forskrifter (dyreforsøk lisens G0194 / 11).

1. generasjon av Fluorescent Bone Marrow Kimere Mus

MERK: generering av fluorescerende benmarg kimære mus for å visualisere stromale benmargsceller utføres som beskrevet før ^9.

1. Begynne å behandle Del-Cre x ROSA-tdRFP mus (mus som uttrykker tandem rød fluorescerende protein (tdRFP) ubiquitously ^11-13) for å forberede dem for bestråling. Alternativt kan du bruke en hvilken som helst annen stamme med allestedsnærværende uttrykk for fluorescerende protein. Administrere 1 mg / ml neomycin og 1 mg / ml av vitaminer (A, D3, E, C) via drikkevannet to dager før bestråling.
2. Strålebehandling mus to ganger med 3,8 Gray med et Cesium-137 gamma-irradiator witynt et intervall på 3 timer. For dette, plasserer mus i en bestråling pai bur egnet for den respektive irradiator.
   MERK: For bestråling av mus, ikke vår Institute krever ikke narkose. Følg lokale institusjonelle retningslinjer for anestesi for bestråling. Behandle dyr med 5 mg / kg av carprofen subkutant (sc) per dag etter bestrålingen hvis det er tegn til smerte.
3. Neste dag, rekonstituere mus ved en intravenøs injeksjon av 3 x 10 ⁶ benmargceller fremstilt av lange bein av C57BL / 6 donor mus i overføringsbuffer ^9. Hold mus på neomycin og vitaminer for opptil 2 uker og overvåke deres trivsel og vekt i løpet av denne tiden. Vent minst fire uker for å tillate for tilberedning av immunsystemet før de spesifikke eksperimentelle behandlinger (f.eks immunisering) ^9.
4. Ofre mus og plassere dem på en disseksjon bord, sterilisere bena med 70% etanol. Euthanize mus i henhold til lokale institusjonelle politikk. Vårt institutt utfører halshugging.
5. Bruk pinsett og saks for å fjerne hud fra lårene. Fjern muskelvev å eksponere lårbenet. Luxate lårbenet fra hoften og kneleddet ved hjelp av pinsett og saks. Vær forsiktig med å bryte eller skjære beinet.
6. Nøye fjerne gjenværende store biter av muskelvev og brusk fra bein med saks. Fjern gjenværende muskelvev ved å gni benet med laboratorie silkepapir. Samle de rensede benene i en petriskål med fosfatbufret saltvann (PBS).
7. Fikse hele femoral bein i 4% Paraformaldehyde (PFA, elektronmikroskopi-grade) for 4-6 timer.
8. Kast PFA og inkuber bein i 10% sukrose i PBS O / N. Neste dag, inkuber bein i 20% sukrose O / N. Dagen etter, inkuber bein i 30% sukrose O / N.

2. Cryosectioning of Bones

MERK: Etter 16-24 timer i 30% sukrose, fryse bein og cryosection dem i henhold til Kawamoto rens tape metode ^14,15.

1. Tilbered en stort begerglass (2000 ml volum) med tørris og aceton (ca. 2: 1 volumforhold, f.eks, 400 ml tørr is og 200 ml aceton) under en avtrekkshette. Plasser en liten beger (150-250 ml volum) med heksan innsiden (30-50 ml ca.). Vente på at blandingen er avkjølt (ca. 10 min, til frost vises på utsiden av det store begerglasset).
2. Fyll ¾ av den merkede cryomold med Super Cryoembedding Medium (SCEM); nøye plassere bein inne til de er fullstendig oppslukt, ta vare på at de ikke berører kantene på formen. Med store tang hold cryomold i begerglasset med bunnen av formen bare berøre overflaten av heksan.
   1. La de ytre kantene av SCEM fryse (angitt med opasitet, dette tar omtrent 15 sekunder). Deretter helt slippe formen inn i heksan og la det freEze i 1 - 2 minutter. Ta ut den frosne prøven og pakk inn i cellofan og deretter aluminiumsfolie (for å beskytte prøven fra å tørke ut, og for å unngå eksponering for lys). Oppbevares ved -80 ° C inntil cryosectioning.
3. For cryosectioning av femoral bein bruke en standard mikrotom og mikrotom kniver for harde vev.
4. Still prøven og blad temperaturen i mikrotom til -24 ° C. La prøven sitte inne mikrotomen i ca 15 minutter før du skjærer.
   1. Fix prøven blokk til metall prøveholderen med SCEM eller optimal skjæring temperatur (OCT) medium. Justere orienteringen av blokken om nødvendig. Trimme prøven inntil benet er helt åpne og margen er synlig. Juster delen tykkelse til 7 mikrometer (forkaste den første delen).
   2. Fikse et stykke Kawamoto tape med den klebrige siden på toppen av prøven blokken ved hjelp av en hjort skinn trespatel. Deretter kuttet prøven og snu båndet slik at den delen erplassert på oversiden. Overføre båndet til et lysbilde glass med tang. Fikse tapen til lysbilde glass med Scotch tape.
5. La seksjoner tørke i minst 30 minutter og lagres ved -80 ° C inntil bruk. Lagre ufargede og umonterte lysbilder i plast lysbilde bokser med avstandsstykker mellom enkelt lysbilder for å unngå at de holder sammen. Farget og monterte lysbilder kan lagres i opp til en uke i papp lysbilde mapper ved 4 ° C.

3. bildesamlingen

1. Tine og beis frysesnitt i henhold til felles immunofluorescence protokoller ^9. Inkluder en kjernefysisk flekk, for eksempel, 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole dihvdroklorid (DAPI) for å visualisere vev integritet.
   MERK: Flekk, for eksempel, for å visualisere RFP stromale celler (anti-RFP-biotin antistoff og streptavidin-Alexa Fluor 555), flekk eosinofiler med rotte-anti-dur basisk protein (MBP) antistoff og anti-rotte-Alexa Fluor 647 antistoffet , B-cellermed rotte-anti-B220-Alexa Fluor 594-antistoff og PC med anti-κ lettkjede-fluorescein-iso-tiocyanat (FITC) og anti-λ1 lettkjede-FITC antistoff (detaljer av fargeprosedyre er beskrevet i ^9).
2. Montere fargete snitt: sette en dråpe fluoromount på seksjonen og deretter dekke med en # 1 glassdekselstrimmel, mens nøye unngå dannelse av luftbobler. Deretter utfører laserskanning konfokalmikroskopi med et instrument utstyrt med laserlinjene egnet for farging.
3. For å ta bilder for automatisert samlokalisering analyse av benmarg hematopoetiske celler med stromalceller bruker Wimasis verktøy, gjelder følgende innstillinger:
   1. Bruk en 20X objektiv og et synsfelt på 708,15 x 708,15 mikrometer. For automatisert analyse, holde størrelsen på alle bildene konsistente på 2048 x 2048 piksler (px) for å holde resultatene sammenlignbare.
   2. Spill en kanal for stromale strukturer (f.eks (f.eks DAPI, 405 nm) og flere kanaler for hematopoetiske celler av interesse (f.eks, 3 kanaler, 488/594/633 nm for eosinofile, B-celler og PC).
   3. Ta opp bilder med linje i snitt fire ^16. Ideelt dekke hele lårbens seksjon ved å ta enkelt tilstøtende bilder. Alternativt, ta ikke-tilstøtende bilder fra ulike regioner i benmargen (diafysile samt epiphyseal).
      MERK: Vær forsiktig med å produsere overlapping mellom tilstøtende bilder (for å unngå gjentatt analyse av celler i de overlappende områder).
4. Lagre bildene i en mikros bildefil format. Sjekk og eventuelt justere kontrast for alle kanaler i bildefremvisning / analyse programvare.
5. Eksport tre JPG-filer per bildefil: en jpg fil for DAPI kanal (rød / grønn / blå (RGB) format, falsk fargekodet i gult), en jpg fil for stroma kanal (gråtoner) og en .jpg fil som inneholderkanalene for blodkreft celler (3 kanaler maksimum, RGB-format, f.eks FITC (PCer, falske farger: grønn) / Alexa Fluor 594 (B-celler, falske farger: blå) / Alexa Fluor 647 (eosinofile, falske farger: rød)) .

4. Automatisert Bildeanalyse

1. Bruke et bildeanalyse verktøyet til å utføre bildesegmentering, kvantifisering av samlokalisering og nabolag analyse (se diskusjon).
2. Hvis du bruker Wimasis verktøy, gjør som følger:
   1. Last opp settene med 3 JPG-filer per bilde med samme filnavn etterfulgt av en understreking og et tall som angir hvilken type bildet.
   2. Bruk _1 for jpg fil med hematopoetiske celler, _2 for jpg fil for DAPI kanal, _3 for jpg fil for stroma kanal. For eksempel: Image1_1.jpg (blodkreft cellene), Image1_2.jpg (DAPI kanal), og Image1_3.jpg (stroma kanal). Laste opp bildene via kundekonto.
   3. For celle kontakt kvantifiseringvelge cellen kontakt verktøyet ved å klikke på den respektive felt. For celle nærhet kvantifisering, velge cellen nærhet verktøyet og angi den foretrukne nærhet radius i mikrometer (som er målt fra cellenes kanter).
   4. Last ned resultatene.
      MERK: Resultatene er gitt som .jpg-filer som viser hematopoetiske celler og stroma kanal med grensene for de oppdagede objektene fremhevet, samt enkelt .csv filer som inneholder målingene for hvert bilde, i tillegg til et sammendrag .csv-fil som inneholder data for alle opplastede bilder.
3. Fra kontakt målinger bestemme hyppigheten av blodkreft celler (rød, grønn eller blå celler) i kontakt med stromale celler, eller frekvensene av røde, grønne eller blå celler kontakte de andre hematopoietiske celletyper (et eksempel er vist i Representative Results , figur 4). For å bestemme frekvensene, dele de gitte kontakt teller per bilde avden totale celle tellinger per bilde.
   1. For eksperimenter med individuelle mus, oppsummere de totale kontakt tellinger av alle bildene for enkelt mus og dele dem med summen av samlede legemer på alle bildene.
4. Fra omegn målinger, bestemme frekvensen av røde, grønne eller blå cellene i den valgte avstand fra stromale celler og / eller frekvensene av røde, grønne eller blå celler i den foretrukne nærhet til de andre blodkreft celletyper som beskrevet i trinn 4.3 ( se også Representant Resultater, figur 4).

5. Simulering av Random Bone Marrow Positioning

1. Før du utfører simuleringer av tilfeldige celle posisjonering på de analyserte beinmargs histologiske bilder, forberede følgende filer på forhånd: de enkle .csv filer som tilbys av cellen kontakt verktøyet, de originale JPG-filer for DAPI kanalen og de originale JPG-filer for stromal kanal.
2. For å utførebatch simuleringer på en serie bilder (f.eks alle bilder fra en femoral seksjon), samle alle originale JPG-filer (_1, _2 og _3) og de ​​tilsvarende enkelt .csv filer i en mappe.
   MERK: simuleringsverktøy for tilfeldig benmarg celle posisjonering er tilgjengelig på forespørsel.
3. Start simuleringsverktøy, sjekk boksen "Auto-load image data".
   MERK: Programmet vil lese celletall og gjennomsnittlig cellestørrelse fra CSV-filen automatisk. Disse verdiene vises i boksene for "Cell nummer" og "Cell størrelse AVG" (figur 5A).
4. Skriv inn felles tag for CSV-filene, dvs. den felles faktor i deres navn. Skriv inn antall bildesett som skal brukes for batch-modus simulering.
5. Laste jpg fil generert fra stroma kanal (med filnavn som slutter _3).
6. Angi innstillingene for generering masken fra DAPI kanal:
   1. Kryss av i boksen "? Påfør masken "Sett terskelen for å konvertere den DAPI bildet inn i en binær maske til 10 (range 0-255).
   2. Kryss av i boksen "8-bit?" Kryss av i boksen "Utvid?" Og sette karakteren av utvidelse til fem px. Kryss av i boksen "w / erosjon?".
   3. Inn ønsket verdi for nærområdet radius (området radius) som benyttes for analyse av de simulerte bilder. For et bilde av 708,15 x 708,15 um med en størrelse på 2048 x 2048 piksler (bildeelement skalering xy: 0,346 um), 29 px tilsvarer 10 um.
7. Sjekk boksen "Bruk Otsu?" For å bruke Otsu algoritme ¹⁷ for automatisk registrering av stromale strukturer.
   MERK: Dette er den samme algoritmen som brukes av kontakten og omegn verktøy. Ved hjelp av det samme bildet segmentering algoritmen i automatisk analyse av det registrerte bildet og den simulerte bildet er avgjørende for å holde dataene sammenlignbare.
8. Angi innstillingene for blodkreft celler, som are simulert som sirkulære former.
   MERK: celle tall for røde, grønne og blå cellene er direkte lastet fra CSV-filen (se også trinn 5.6).
   1. Bruke simuleringsverktøyet for å beregne gjennomsnittlig diameter i px av røde, grønne og blå celler. Bestem gjennomsnittlig areal på en enkelt celle som det totale arealet av hver celletype i bildet i px dividert med det totale celletall per bilde. Bruk gjennomsnittlig areal for å beregne radius av en plate ved hjelp av formelen. Doble radius for å bestemme den gjennomsnittlige diameter.
9. Måle cellestørrelsesfordelingen av de analyserte celletyper med en hvilken som helst programvare for bildeanalyse som omfatter objektsegmenteringsfunksjoner. Bestem σ for alle blodkreft celletyper ⁽¹⁸ og Figur 5B).
   MERK: Siden celle størrelsesfordelingen av de registrerte cellene ikke bestemmes av automatiserte bildeanalyse, bruk en Gaussisk fordeling som en tilnærming til den virkelige distribusjoner. Bredden tHan fordelingskurve er beskrevet av σ og kan være helt forskjellig for forskjellige celletyper. (For detaljer, se figur 5B).
   1. Fra disse målingene, bestemme "celle størrelse cutoff": diameteren i px som beskriver den minste objektet fortsatt anerkjent som en komplett celle av bildeanalyseverktøyet.
10. Skriv inn parametre i de respektive boksene på det grafiske brukergrensesnittet (figur 5A).
    1. Gå inn i cellestørrelse avskåret, dvs. den minste cellestørrelse som i simuleringen, så en diameter i px.
    2. Tast σ i px for simulering av cellestørrelsesfordelingen for rød, grønn og blå celler (fra trinn 5.9).
    3. Sjekk "Slett" boksen i avsnittet "Celler i Mask". Med denne innstillingen, vil programmet valgte en ny stilling for en celle hvis den overlapper med minst én piksel med en no-go området av masken. Kryss av i boksen "Unngå celle overlapping? ̶1; i avsnittet "Cell eksklusjon".
    4. Skriv inn tillatt minimumsavstanden mellom sentrene i to celler i px.
       MERK: Minste avstand må bestemmes fra de innspilte bilder. Feilaktig målt minimumsavstander vil føre til partisk / kunstige resultater for sammenligning av registrerte og simulerte bilder.
    5. Angi maksimal område av overlapping til 100% hvis overlappen er definert av den minste avstand fra senter til senter.
    6. Still simuleringsverktøy til 1000 repetisjoner.
    7. Kryss av i boksen "autolagringscellene?" For å lagre koordinatene for de simulerte objekter for alle repetisjoner av hver bilde av batch som .rect filer (tekst-format). Kryss av i boksen "autolagrings bilder?" For å lagre en TIFF-fil for hver simulerte bildet. Skriv inn en felles kode for lagrede filer.
       NB: "? Autolagringscellene" alternativet reduserer simulering driftstid og generell datastørrelse, sammenlignet med når du lagrer den faktiske simulert imatot. De .rect filer lagre koordinatene for de simulerte celler som rektangler, og kan således omdannes til simulerte bilder hvis nødvendig.
11. Starte simuleringen ved å klikke på "Kjør simuleringen".
    MERK: simuleringsverktøy genererer automatisk en CSV-fil for de 1000 simuleringer av hvert bilde, inkludert de gjennomsnittlige kontakt teller og omegn teller for rød, grønn og blå celler med rød, grønn, blå og stromale celler for hvert sett gjentatte simuleringer . I tillegg til alle disse verdiene, gjennomsnitt av 1000 simuleringer med standardavvik (STD) og standardfeil (SEM) er gitt.
12. Bestemme den gjennomsnittlige kontakt frekvenser og omegn frekvenser av ett sett av 1000 simulerte bilder. For dette, dele den gjennomsnittlige kontakt og omegn teller med den innspilte celletall per bilde. Sammenligne frekvensene til resultatene av den automatiserte co-lokalisering analyse av det lagrede bildet.
13. Bruke riktige statistical metoder avhengig av analysen ¹⁹ (for Figur 7, vi brukte en tosidig Wilcoxon signert rank test).

Representative Results

Skjærefrysesnitt av undecalcified ben med Kawamoto tape-metoden gjør det mulig for hele benet som skal kappes som en intakt del, med benmargen av endosteal område fremdeles er festet til mineralisert ben, både i diaphysis samt i epiphyseal områder med sin høy tetthet av trabekulært ben (figur 1). Nukleær farging av seksjonene viser at selv om små sprekker i fremstilling og kan ikke fullstendig unngås, strukturen av sinusoider og arterier så vel som den retikulære nettverk av parenchyma forblir intakt.

Som et eksempel på en immunfluorescens farging av røde fluorescerende kimære benmarg og påfølgende analyse, blir en farging for eosinofile (major basisk protein, MBP), PC (κ og λ lett kjede) og B-celler (B220) er vist. Mus ble immunisert med 100 pg av 4-hydroksy-3-nitrophenylacetyl hapten koblet til kylling γ globulin (NP-CGG) i alun ip, 4 uker ettertilberedning, styrket med 50 mikrogram av NP-CGG i PBS iv 21 dager senere og analysert på dag 30 etter boost. Den automatiserte bildeanalyse resulterte i en meget nøyaktig gjenkjenning av stromale strukturer, herunder også meget små fragmenter av retikulære prosesser. Siden cellen antall stromale celler ikke kan fastslås med systemet som presenteres her (se også diskusjon), ingen størrelsesterskelen ble innført for stromal kanalen, for å påvise alle fragmenter i bildene (figur 2). PC-er og eosinofile er større enn B-celler og viser også en mer heterogen form. Alle tre celletyper har blitt godt anerkjent ved første øyekast. Cellulære klynger, spesielt B-celler, var godt adskilt. Analyseverktøyet er optimalisert for de ovennevnte celletyper (eosinofiler, PC-er, B-celler). For andre celletyper, kan det være nødvendig med justeringer. CSV-filene som genereres av cellen kontakt verktøyet inneholde følgende relevante målinger for blodkreft cellene:celleantall for hver cellepopulasjon; totalt areal for hver cellepopulasjonen i px; kontakt telling av røde blodceller (i dette tilfellet eosinofile), grønne celler (her PCer) eller blå celler (her B-celler) med rød, grønn, blå eller grå celler (stromale celler). CSV-filene som genereres av cellen nærhet verktøy inneholde følgende målinger for blodkreft celler: celletall for hver celle befolkningen; totalt areal for hver cellepopulasjonen i px; nærhet telling av røde, grønne og blå celler med rød, grønn, blå og grå celler (stromale celler).

For å bekrefte kvaliteten av de bilde analyseverktøy, ble resultatene av automatiserte analyser sammenlignet med en manuell telling av 6 trent raters (figur 3). Alle raters mottatt identiske bilder for analyse. Stromale strukturer og hematopoetiske celler ble nøye beskrevet med et bilde analyseverktøy og disse regionene av interesse ble lagret og analysert. For stromale strukturer, det totale arealet per bildevar sammenlignet mellom automatisert og manuell analyse. Stromale strukturer så ut til å være vanskelig for de trente raters å gjenkjenne presist, noe som reflekteres ved den store variasjon som ble observert for størrelsen av det totale arealet av stroma tellet manuelt (figur 3A). Her, automatisert analyse bestemmes en verdi nær gjennomsnittet området oppdaget av opplært raters. For alle cellene, den automatiserte analyseverktøyet bestemmes en litt lavere mengde enn celler tellet manuelt. Men for PCer og eosinofile, var tallet fortsatt i området av inter varians observert for de manuelle tellinger. Antall B-celler oppdages av automatisert analyse, var imidlertid litt under dette området (figur 3A). Gjennomsnittlig cellestørrelse (område i px) som bestemmes av automatisert analyse var 512 px for PC-er, 436 px for eosinofile, og 317 px for B-celler, mens trente raters bestemt en størrelse på 515 px for PC-er, 464 px for eosinofile, og 291 px for B-celler. Således var den gjennomsnittlige cell størrelse for B-celler, PC og eosinofile bestemmes av den automatiserte analysen var sammenlignbar med den gjennomsnittlige cellestørrelser bestemmes av manuelle raters (Figur 3B). Dette automatisert bildeanalyse verktøyet kan nå brukes til å kvantifisere direkte kontakt med kandidat benmargs nisje celletyper. Videre kan frekvensen av celler av en viss celletype nabo stromale celler eller andre hematopoetiske celletyper bestemmes. En analyse av benmarg PCer og sine kontakter til stromale celler, eosinofile celler, B-celler, og andre PC-er er vist, så vel som frekvensen av PC nabo disse celletyper innen 10 og 20 um (figur 4A). Dessuten kan kontakt frekvenser av forskjellige hematopoietiske celletyper med stroma kvantifiseres (figur 4B).

Før å utføre en simulering av tilfeldig benmarg posisjonering av disse cellene med simuleringsverktøyet, de parametere som beskriver cellestørrelsesfordelingen som en Gaussian fordeling må bestemmes. For en Gaussisk fordeling, som kan visualiseres som et symmetrisk og "klokkeformet" kurve, bare to parametere må bestemmes: plassering av sentrum av kurven (modus, det vil si, hvor toppen av kurven ligger ) og bredden av den symmetriske kurven (dette er beskrevet i det ovenfor nevnte σ parameter). Denne prosedyren er vist her for PCer, eosinofile, og B-celler (Figur 5B). Målte cellestørrelsesfordelingen viser at, for B-celler, er bredden på fordelingskurven beskrevet av σ mindre enn for PC og eosinofiler. For simuleringen, ble de relative verdier av σ målt for de tre cellepopulasjoner opprettholdes (dvs., ble B-celler alltid simulert ved en dobbelt så snever størrelsesfordeling enn for PC 'og eosinofiler'), mens de σ verdiene definert i px var satt til å matche det visuelle utseendet til de registrerte celler (Figur6B). Dette førte oss til å gjelde en σ av 2 px for B-celler og en σ av 4 px for både PC og eosinofiler. Cellestørrelsen cutoff ble bestemt fra de målte cellestørrelsesfordelinger. For PCer og eosinofiler, en cutoff ved 300 px objektstørrelse, noe som resulterer i 20 px diameter for en sirkulær gjenstand (ca. 7 nm), og for B-celler en cutoff ved 220 px, som fører til en 17 px diameter (ca 6 um) ble benyttet for simuleringen.

For å definere områder i den simulerte tilfeldig bilde hvor cellene får lov til å bli plassert ved simuleringsverktøy, ble en maske som genereres fra atom signaler i DAPI kanal i en benmargs histologiske bilde (figur 6A). En verdi på 10 ble bestemt til å være den optimale intensiteten terskelen for å generere de binære bilder (øvre panel, riktig bilde). Terskelen bestemmes av Otsu algoritme ikke fører til full anerkjennelse av alle kjernene i bildet (øvre panel, center image), på samme måte som fast intensitetterskler på 50 eller 150 (nedre panel, venstre og midt bilde) .Den relevansen av kontakter av PC, eosinofile, eller B-celler med stromale celler (Figur 4B) ble testet ved hjelp av simuleringsverktøyet (figur 7). Denne analysen avslørte betydelig høyere kontaktrater i de innspilte bilder i forhold til simulering for PC-er og B-celler (Figur 7A), i tråd med begrepet stromal nisjer som støtter disse populasjonene. Dette ble bekreftet i 5 individuelle fluorescerende kimære mus (figur 7B, D). I motsetning til dette ble ingen klar forskjell bestemmes i tilfelle av eosinofiler (Figur 7A, C).

Figur 1. Oversikt fluorescens bilde av et lengdesnitt av en murin femur cryosectioned med Kawamoto rens tape-metoden. Båndet metoden tillater Cutting seksjoner med en intakt endosteal region, både i diafysile samt i epiphyseal områder, fra undecalcified ben. En 7 mikrometer tykt ben-delen av et naivt C57BL / 6 mus ble farget for det ekstracellulære matriksprotein Laminin (rød), for Sca-1 for å visualisere arterioler (grønn) og for kjerner (blå, DAPI). 47 fliser av 1446 x 1088 mikrometer, oppløsning 1360 x 1024 px ble tatt opp og sydd for å skape oversiktsbildet. Dette bildet ble kjøpt på et bredt felt fluorescens mikroskop, med en 10X objektiv (0,45 NA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Automatisk deteksjon av stromale og hematopoetiske benmargceller. En femoral ben-delen av et rødt fluorescerende chimeric mus på dag 30 etter boost var farget for RFP (grå) for å visualisere stroma, MBP (rød, eosinofile), κ og λ lett kjede (grønn, PC-er) og B220 (blå, B-celler). Venstre: Originalbilde ervervet på en konfokal mikroskop, med en 20X objektiv (0,8 NA) og et synsfelt på 708,15 x 708,15 mikrometer. Høyre: segmentert bilde. Konturene av de anerkjente objekter er markert. De hvite rektangler markere området vist i de nederste bildene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Validering av automatiserte bildeanalyse av opplært raters. (A) Totalt areal av stromale strukturer og totale antall celler av hematopoetiske celler telles av utdannet raters i en (stromale strukturer), 10 (PC), to (eosinofile) og ett bilde (B-celler) i forhold til celle tall innhentet av automatisert bildeanalyse. Prikker representerer individuelle raters (n = 5 - 6). Linjene indikerer gjennomsnittsverdier eller automatisk bestemte verdier. (B) Object størrelsesfordeling av manuelt telles gjenstander i forhold til gjennomsnittet objekt størrelse bestemmes av automatisert analyse. For å ta hensyn til de forskjellige frekvenser for de forskjellige celletyper, ble tellet i PC-10, eosinofiler i to og B-celler i et bilde. Prikker representerer enkeltobjekter. Linjene indikerer gjennomsnittet. (C) Manuell skisserte av stromale strukturer av opplært raters. Venstre: originalbildet. Midten: eksempler på analysert manuelt bilder. Høyre:. Stromale strukturer som oppdages ved automatisert analyse Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"Figur 4" src = "/ files / ftp_upload / 52544 / 52544fig4highres.jpg" width = "700" />
Figur 4. Automatisert samlokalisering analyse av PCer, eosinofile, B-celler og stromale celler i lårbens benmarg. (A) Venstre: Frekvens av PC-er i direkte kontakt med stromal strukturer, eosinofile, B-celler eller andre PCer i fluorescerende kimerisk mus på dag 30 etter boost. Midtre og høyre: Frekvens av PCer i 10 mikrometer nærhet eller 20 mikrometer nærhet av stromale strukturer, eosinofile, B-celler eller andre PCer. Deler av denne figur (direkte kontakt, 10 um omegn) er modifisert fra Zehentmeier et al., ⁹ (B) Frekvens av PC'er, eosinofiler og B-celler er i direkte kontakt med stromale strukturer. 52-515 PCer, 918-3179 eosinofile, 4146-13063 B celler i 10-21 bildene ble regnet fra 5 fluorescerende kimære mus på dag 30 etter boost, samlet fra to uavhengige eksperimenter. Prikker representerer individuelle mus. Linjene indikerer median.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Bestemmelse av cellestørrelsesfordelingen av benmarg PCer, eosinofile celler og B-celler. (A) Skjermbilde av det grafiske brukergrensesnittet (GUI) av simuleringsverktøy. (B) Cellestørrelsesfordeling (område i px) av PCer (κ og λ lett kjede, grønn), eosinofile (MBP, rød) og B-celler (B220, blå) er vist i histogrammet som målt etter at gjenstanden gjenkjennelse av Volocity programvare (øvre panel). I femoral beinmargs bilder (nedre panel), oppdaget PCer er merket med rødt (overlay gul), eosinofile i blått (overlay fiolett) og B-celler i gul (overlappe grå). Bildesegmentering ble utført ved å sette en minimumsstørrelse terskel på 180 px for PC-er,300 px for eosinofile og 220 px for B-celler. 250 gjenstander ble målt til PC, 650 objekter for eosinofile og 3000 gjenstander for B-celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. generasjon av masken for simulert tilfeldig celle posisjonering. (A) Den opprinnelige DAPI kanal (gul) samt overlegg av DAPI med binære bilder generert ved å anvende forskjellige terskler er vist. Masken generert fra binært bilde (terskel satt til 10) vises under (nedre panel, høyre bilde). Sorte områder representerer no-go områder, hvite områder representerer områder der cellene får lov til å bli plassert. (B) bilde (venstre) og den tilsvarende simulerte bildet (til høyre) viser høy visuelllikheten. Eosinofile (MBP), PC (κ og λlight kjede), B-celler (B220) og stromale celler (RFP) vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7. Direkte kontakt av blodkreft celletyper med stromal strukturer i registrerte vs. simulerte bilder. (A) Frekvens av PCer, eosinofile og B-celler i direkte kontakt med stroma i simulert sammenlignet med innspilte bilder av fluorescerende kimert mus på dag 30 etter boost. Linjer kobler tilsvarende simulert og registrert bilder (prikker). Bilder av en representant mus er vist i hver tomt. (B) Frekvenser av PCer, eosinofile og B-celler i direkte kontakt med stroma i simulert i forhold til bildeopptak av 5 individuelle mus fra to uavhengige forsøk. Wilcoxon signert rank test, to-tailed (PC: *** p = 0,0001; * p = 0,0371; * p = 0,0161; ** p = 0,0012; **** p <0,0001, eosinofile: *** p = 0,0007 ; p = 0,1055; * p = 0,0161, p = 0,4143, *** p = 0,0007, B-celler: **** p <0,0001; ** p = 0,0020; *** p = 0,0005; ** p = 0,0012 ; **** p <0,0001). Prikker representerer enkeltbilder. Linjene indikerer gjennomsnittet. P-verdier på 0,05 er ansett signifikante forskjeller. Stjernene i tallene viser følgende P verdier: ns: p> 0,05; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001; ****: P 0,0001. Deler av dette tallet (direkte kontakt av PCer med stromal strukturer) er endret fra Zehentmeier et al. ⁹ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

700 "/>
. Figur 8. Komplett arbeidsflyten til kvantifisering tilnærming for blodkreft celle - stromal celle interaksjoner i murine benmarg Tilnærmingen er delt i tre hoveddeler: 1. murine benmargs seksjoner er forberedt og raw data samles inn av laser scanning konfokalmikroskopi, 2 . automatisert analyse av innspilte bilder og simulering av tilfeldig plassering av benmargceller utføres, 3. kontakt og nabolaget teller hentet fra registrerte og simulerte bildene blir sammenlignet. Input (bildefiler) og utgang (tekstfil) av automatiserte analyser er angitt i blått, blir inngangs (bildefiler) og utgang (tekstfiler og eventuelt bildefiler) av simuleringsverktøy angitt i grønt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Til tross for fremgang i moderne optiske avbildningsmetoder, er analysen av histologiske data fortsatt ofte hindret av mangel på skikkelig kvantifisering verktøy og metoder, eller av forutinntatte analyser som fokuserer på et lite område av interesse. Den synergistisk tilnærming som presenteres her kombinerer bildeanalyse som dekker hele benmargen regionen, automatisert segmentering og objekt anerkjennelse av ulike blodkreft og stromal celletyper, samlokalisering analyse, og til slutt en valideringsverktøyet av ikke-tilfeldig forekommende kontakter som tilbys av en ny Custom- designet simuleringsprogram.

Histologi av hele ben, inkludert benmargen har vært vanskelig å utføre på grunn av de forskjellige tettheter vev som er tilstede i en seksjon - på den ene side den meget hard, mineralisert ben, på den annen side ekstremt skjøre marg, som blir lett brutt når kuttet sammen med benet. Som et alternativ, tapen metode for å kutte bein seksjoner presented ^14,15 her har den fordel at det stabiliserer vev, og derved forlater endosteal områdene intakt (figur 1). Foruten å være rik på osteoblaster, har disse områdene blitt foreslått å spille en rolle i stamcelle vedlikehold ^20.

Det avgjørende rolle stromalceller i utviklingsprosesser og cellulær vedlikehold i beinmargen blir stadig tydeligere. Imidlertid har analysen av disse sjeldne, skjøre cellene vist seg å være vanskelig av to grunner: For det første, er de vanskelig å isolere fra benmargen; sekund, blir graden av heterogenitet blant stromal populasjon ikke kjent, og derfor kan man savner en viktig populasjon ved å bruke visse markører som har blitt beskrevet for stromale celler. Metoden for å generere fluorescerende benmarg chimeras er nyttig å fluorescently mark og deretter analysere benmargen stromal celle befolkningen som helhet. Imidlertid bør det bemerkes at i disse miCE Alle mesenchymale celler i benmargen blir visualisert, inkludert endotelceller og osteoblaster. Dette må tas i betraktning hvis data fra slike kimære mus blir analysert. Selv om det er også en risiko for hematopoetiske celler av mottakersted overlevende bestrålingen, disse cellene vanligvis bare dekker et meget lite område per synsfelt i forhold til giveren CD45 ⁺ celler, og dermed ikke påvirke histologisk analyse ^9. Åpenbart bør denne fremgangsmåte kombineres i et etterfølgende trinn med en mer spesifikk påvisning av stromale (sub) populasjoner. For tiden, er analysen av disse cellene for det meste gjort med histologi på grunn av årsakene nevnt over, å pålegge en begrensning på antall parametere som kan analyseres samtidig. Utviklingen av multiparameter Analyser i mikros vil bidra til å overvinne disse begrensningene.

Ved bildeanalyse ble utført ved hjelp av segmenter opprinnelige Otsu algoritme. Hovedsak, Bestemmer denne gruppering baserte terskelmetoden automatisk intensitetsterskel for optimal separasjon av forgrunnen (signal) og bakgrunn (støy) bildeelementer i to grupper med lavest statistiske avvik i en gitt kanal, noe som resulterer i et binært bilde ^17. Her ble Otsu metode påført den naturlige logaritmen versjon av originalbildet, er at:

Inngangsbildet for Otsu = ln (Input bilde)

Dette fungerer bedre for fluorescens bilder siden Otsu metode kan identifisere dim celler som bakgrunn. Tilsetning av den logaritmiske funksjon muliggjør en bedre separasjon av cellene og bunn i to forskjellige klasser av Otsu algoritme. Men er intensiteten thresholding alene ikke nok til nettopp oppdage enkeltobjekter. Det fungerer effektivt når det oppdages godt separerte objekter i bilder, men det er ikke tilstrekkelig til å skille enkeltceller som ligger innenfor klynger. Ettersom noen av de celletyper somble det av interesse for oss, slik som eosinofiler eller B-celler, blir ofte gruppert sammen i vevet, ble deres kjerner i DAPI kanal segmentert ved hjelp av en algoritme basert på k-betyr gruppering av intensiteten histogram med k = 10 ^21. Den celle segmentering algoritme vil plotte de lyseste til dimmest piksler (gruppert i 10 binger) og hele tiden lete etter dannelsen av celle likner stedene. Disse formål vil da bli definert som celler. Når alle bildeelementer er blitt anvendt, er de resulterende kjerner utvidet for å generere en maske som påføres deretter til de øvrige kanaler for klyngeseparasjon.

Det bør bemerkes at denne analysen fungerer godt for hematopoetiske celler som er kompakt, men at det er begrenset med hensyn til stromale celler, så det ikke er mulig å bestemme grensene til disse store, spredt ut cellene på grunn av sammenkoblingen av sin dendrittiske utvidelser som danner en retikulære nettverk. Dermed teller celle for stromalcellerkan ikke gis. Merking enkeltceller via skjebne-mapping reportere under kontroll av stromaceller spesifikke arrangører vil løse dette problemet, i henhold til det som er blitt publisert for nevroner (ved hjelp av "Brainbow" system ²²⁾ og for merking av follikkeldendrittceller i lymfeknutene ^23.

I tillegg til å anvende en støyreduksjons trinn til alle kanaler ved å utelate gjenstander under 30 px, ble størrelseseksklusjonskromatografi anvendt i prosessen med objektgjenkjennings for hematopoietisk men ikke stromale celler. Små fragmenter av celler som ble kuttet ved seksjonering kan utelukkes; imidlertid, kan tapet bli neglisjert i dette tilfelle i favør av en entydig gjenkjennelse av cellene. Utvidelse av analyse og simulering fra to til tre dimensjoner vil overvinne denne begrensning. Utvikling av metoder for å studere cellulære distribusjon i hele mounts, for eksempel ved multi foton mikroskopi eller lys ark mikroskopi / SPIM, vil sikkert hjelpe i ther respekt. For å studere den komplekse cellulære sammensetning av flerkomponent-nisjer, vil det også være nødvendig å utvide antallet av parametere som blir analysert in situ. Lovende tilnærminger for multiparameter analyse av histologisk informasjon i kombinasjon med cytometrisk kvantifisering er det publisert ^{24, 25.}

Kontakten analyse ble utført ved å tallfeste overlapping av to objekter. Direkte kontakt ble definert som en overlapping av minst en piksel. Viktigere er denne analysen begrenset av oppløsningen av mikros bilder og derfor er avhengig av bølgelengden, og modusen for eksitasjon, så vel som på den numeriske apertur for objektivlinsen som brukes i mikroskopet, og pinhole størrelse. I analysen er vist her, en 0,8 NA, 20X objektiv med fluorokromkonjugerte kombinasjoner spent med 488, 561, 594, og 633 nm ved hjelp av ett foton eksitasjon ble brukt. Derfor verds lateral oppløsning mellom0,372 og 0,483 mikrometer ble oppnådd. Dette gjør at påstander skal gjøres om sidestilling av ulike celle undergrupper; Men, betyr det ikke gi noen informasjon om mulige molekylære mekanismene som er involvert i cellulære interaksjoner. I tillegg er andre metoder som for eksempel 2-foton intravital mikros nødvendig for å forbedre karakteriseringen av disse intercellulære kontakter ^9. Förster-resonant energioverføring (FRET) -baserte systemer kan bidra til å bekrefte om disse interaksjonene er faktisk funksjonell ^26.

For å bedømme den cellulære mikromiljøet av vev nisjer, er det ikke bare viktig å analysere den direkte celle-kontakter, men også for å kvantifisere celletyper i området av en bestemt celletype av interesse ("nærhet analyse"). Tidligere publiserte undersøkelser målte avstander mellom celler og vev strukturer så som skip, basert på posisjonen av kjernen ^27. Siden vi var interessert i determining avstanden til forskjellige celletyper, i en del med varierende forhold av atom til cytoplasmatisk volum, vi ønsket å måle avstanden mellom flatene. For å oppnå dette, beregnet vi nærheten radius ved å bestemme den euklidiske avstand fra cellens grense etter å ha konvertert verdiene fra um til px. Euklids avstand er den lineære avstanden mellom to piksler og kan beskrives ved formelen ^28:

Celler med piksler på sine grenser innenfor et Euklidsk avstand fra f.eks 10 mikrometer fra pikslene i et mål celle grenser ble regnet som nabo denne cellen.

I sin nåværende form, bare bestemmer analysen vidt en celle bringes i kontakt eller kontaktet av en annen celle i den samme eller forskjellig type, og dermed gi bare en binær JA / NEI karakterisering. Det faktiske antallet celles som kontakt cellen av interesse eller er innenfor en viss radius fra det er ikke beregnet. Det neste skritt vil være å utvide dagens analyse på en måte at gruppestørrelsen for å kontakte eller nabocellene kan oppdages og sammenlignet mellom ulike målgrupper celler av samme type. Dette vil føre til viktige tilleggsinformasjon om sammensetningen av benmarg nisjer som overlevelsen nisje for benmargplasmaceller, hvor en varierende bidrag av hematopoetiske hjelpeceller har vært diskutert ^29-33.

Objektgjenkjenning algoritmer ble optimalisert sammen med spesialister fra Wimasis bruker deres kommersielt tilgjengelig tilpasset løsning service, og er tilgjengelig på forespørsel. Et annet alternativ er å bruke enten kommersielt tilgjengelig programvare for bildeanalyse, for eksempel Definiens, Volocity, eller Imaris, eller freeware som CellProfiler.

De automatiserte celle segmentering og bilde analyseverktøy vire validert ved å sammenligne resultatene med analyseres manuelt data levert av seks trent bilde raters med hensyn til to parametre, nemlig gjenstanden størrelse og antall celler i forskjellige cellepopulasjoner. Som vist i figur 3B, den gjennomsnittlige objektstørrelse for hematopoetiske celler (PC-er, eosinofiler, og B-celler) var lik for begge metoder, med en høyere varians for manuell størrelsesbestemmelse for plasmaceller og eosinofile celler, sannsynligvis på grunn av deres mer uregelmessig form sammenlignet til B-celler. Automatisert deteksjon av celle tall ga noe lavere verdier enn de manuelt oppdaget de. Spesielt, var de fremdeles innenfor området av de manuelle verdier i tilfelle av eosinofiler og PC-er, mens de var under disse verdiene i tilfelle av B-celler, sannsynligvis på grunn av en høyere heterogenitet av ekspresjon av B220, som ble anvendt som en markør for B-celler. B220 er kjent for å være oppregulert ved B-celledifferensiering i benmargen, og B-celler med lav så vel som høy intensity farging for B220 kan observeres. B-celler med lave B220 signaler falt under den anvendte terskel, noe som kan ha ført til utelukkelse av de tidligste stadium B-celler. Kan løse en lavere terskel for automatisert deteksjon dette problemet. For stromale celler, som er vanskeligere å oppdage på grunn av deres mindre kompakt, mer dendrittiske og strukket ut morfologi, resulterte manuell deteksjon i høye variasjoner mellom de enkelte raters. Interessant var den gjennomsnittlige totale arealet av stroma var lik det totale areal bestemmes automatisk, noe som indikerer at analysen er godt egnet til å kompensere for individuelle forspenning av raters. Samlet utgjør disse dataene viser at de automatiserte resultatene generelt representerer gjennomsnittsverdiene av manuelle analyser og er godt egnet til å redusere inter variabilitet i analysen.

For å diskriminere tilfeldig og ikke-tilfeldig plassering av cellene i de strukturelle begrensninger av vevet, ble et simuleringsverktøy utviklet. During simuleringen, er et kunstig bilde med tilfeldig plasserte hematopoetiske celler opprettet for hver innspilt benmarg histologisk bilde. For det første er det stroma-kanalen bilde benyttes i sin opprinnelige format. En maske er generert fra DAPI bilde ved å påføre et fast intensitetsbasert terskel, og dermed konvertere bildet i binært format; det binære maske og deretter gjennomgår flere trinn i pikselbasert dilatasjon og erosjon. Masken definerer områder i bildefeltet hvor simulerte celler får lov til å bli plassert. Koordinatene til sentrene av de simulerte celler blir levert av en ensartet generator for tilfeldige tall, de grenser som der bestemmes av bildestørrelsen. Informasjon om mobilnummer og gjennomsnittlig cellestørrelse for hver populasjon bestemmes av automatisert bildeanalyse av opptaket av bildene brukes til å definere de simulerte blodkreft celle populasjoner. Den simulerte cellediameter antas å følge en endimensjonal gaussisk fordeling for den faktiskecelle diameter blir valgt tilfeldig: Diameteren blir så modifisert slik at cellen størrelse avskjær for minstekravet til objektstørrelse er innført. I tilfelle den simulerte celle ville være plassert slik at en eller flere piksler lapper med en no-go området eller ville være innenfor et forhåndsdefinert avstand fra en annen allerede plassert celle (4 mikrometer fra senter til senter som bestemmes i innspilte bilder), nye tilfeldige koordinater vil bli valgt, mens diameteren blir stående uforandret. Dette vil bli gjentatt til antall simulerte celler lik antall celler i det innspilte bildet.

Verktøyet er basert på den antagelse at hematopoetiske celler kan plasseres fritt inne i benmargen, mens stromale strukturer opptrer som en fast matriks i vevet. Verktøyet ble optimalisert til situasjonen i benmargen der parenkymatøs områdene er krysset av et komplekst system av sinusoids. En tilsvarende modellering tilnærming ble nylig publisert av Frenette og medarbeidere for åanalysere posisjonering av hematopoetiske stamceller i forhold til stromale celler og vaskulære strukturer, som utgjør ca 30% av den totale femoral benmarg volum ^25. For å korrigere for denne effekten, er simuleringsverktøyet presentert her er basert på en maske av områder ble celler tillatt å bli plassert. Dette ble oppnådd ved anvendelse av en nukleær flekkbildet, der objektene som representerer kjerner ble utvidet ved en 5-trinns dilatasjon (se figur 6) etter todelingen. Områder med lav celletetthet, dvs. lav tetthet av kjerner som ben og sinusformer, vil ikke bidra til masken, og derfor blir no-go områder. For å unngå en kunstig reduksjon av disse no-go områder etter strekkingsprosedyren ble en 5-trinns erosjon påføres senere, således gjenåpning større utelukkelses områder, mens man overlater den høye atomtetthet (derav "lov") områder uforandret. Denne metoden kan enkelt tilpasses for andre lymfoide organer. I de tproblemene var denne metoden kanskje ikke fungerer (for eksempel i områder der celler med en høy cytoplasma / kjerne-forhold er til stede), andre metoder som cytoplasmic merking kan brukes til å lage masken.

Hematopoetiske celler ble simulert som sirkulære gjenstander, hvis størrelse er bestemt ved hjelp av en Gaussisk tilfeldighetsgenerator, middelverdien av disse avtalt med den beregnede gjennomsnittlige diameter av hver celletype. Bredden på fordelingen var basert på målte cellestørrelsesfordelingen i innspilte bilder fastslått ved en bildeanalyse programvare. For å ta hensyn til at små cellulære fragmenter ble utelukket i automatisert bildeanalyse, ble cellestørrelse cut-offs innført som bestemt fra de målte cellestørrelsesfordelingene for hver celletype (se figur 5).

Naturligvis fungerer bra for celletyper som er relativt ensartet i størrelse og form, men kan føre til problemer når det gjelder celler som are sterkt heterogen med hensyn til disse parametre. Det bør bemerkes at denne analysen er optimalisert for de store hematopoetiske celletyper i benmargen (granulocytter, hematopoetiske stamceller og lymfocytter), som har til felles at de har en vanlig, nesten avrundet form. Imidlertid har denne fremgangsmåte ikke blitt testet for dendrittiske celler eller makrofager, celletyper med sterkt uregelmessige cellelegemer. Analysere slike celler vil gi nye utfordringer til vår automatiske bildeanalyse samt til simulering tilnærming, herunder behovet for bedre celle klaseseparasjons algoritmer ²⁴ samt detaljert form-analyse og simulering av ikke bare forskjellig størrelse, men også ulikt formede celler. Et alternativ ville være en simulering tilnærming som fungerer med de nøyaktige figurer som registreres. Det må imidlertid bemerkes at denne fremgangsmåte vil i betydelig grad øke den deterministiske oppførselen til modellsystemet.

For den simulerte experiments, ble 1000 repetisjoner av simuleringen for hver bildeopptak generert. Ved hjelp av dette mange repetisjoner vil redusere den relative feilen bidro med simuleringsprosessen i seg selv til omtrent 3%. Nemlig, hvis de celle-celle ko-lokalisering beregnes fra simuleringer som er tilfeldig, og deretter simuleringsprosessen i seg selv vil være kjennetegnet ved en N ^-1/2 feilfunksjon, hvor N er antall simuleringer pr målt bilde. Dette er bidraget av simuleringsprosessen i seg selv til den akkumulerte feil i de målte co-lokaliseringsverdier. Således, for N = 1000 innskutt feilen er 3.16%. Simuleringene vist her kjørte i 20 til 60 minutter per bilde per tusen repetisjoner når bare sparer de simulerte bilder som .rect filer (en enkel tekstformat) snarere enn som faktiske bilder i .jpeg eller .tiff format (også et alternativ i programvaren ).

Til sammen gjør denne tilnærmingen for en objektiv, high-throughput analyse av histologisk bildes og muliggjør genereringen av statistisk relevante data. Dette kan være nyttig å sammenligne cellulær lokalisering under forskjellige betingelser. Videre har den tidsbestemte komponenten kan i fremtiden bli integrert inn i en modelleringsmetode av benmargcellebevegelser, etter hvert som flere data på motiliteten av forskjellige celletyper i benmargen blir tilgjengelig. Denne fremgangsmåten kan så brukes til å simulere perturbasjoner av systemet, slik som mobilisering av celler fra benmargen til sirkulasjonen, for eksempel, nøytrofiler i tilfelle av en akutt betennelse ^34. For ytterligere å belyse funksjon av benmargen som en lagringsplass for immunminneceller, kan man også tenke seg å utvide det til å modellere konkurransen om overlevelsesfaktorer. Dessuten kunne det mulig krysstale mellom forskjellige nisjer tas opp, så vel som induksjon av nisjene. Sammen, vil dette bidra til å forstå de fysiologiske forandringer (f.eks utløser for regenerativ oppførsel i stamceller) som well som de patologiske forstyrrelser av systemet som en helhet, for eksempel når det gjelder autoimmune sykdommer, neoplasier eller akutt betennelse. Som en del av en iterativ begrepet eksperiment og modellering, nye hypoteser kan genereres basert på simuleringer, som i sin tur igjen kan bli testet eksperimentelt, og dermed bidra til ytterligere å forstå funksjon og interaksjon av forskjellige celletyper i kompleksiteten av vev.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)	Science Services	15713	EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Dry ice
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM embedding medium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. and N. Lee		available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium	DAKO	S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocal microscope			equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow	Wimasis, Munich		The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime	Microsoft		free download
Simulation tool for random cell positioning			available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions			We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software			free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).